DE102007021001A1 - Expressionssystem zur antibiotikafreien Produktion von Polypeptiden - Google Patents

Expressionssystem zur antibiotikafreien Produktion von Polypeptiden Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Expressionssystem zur Produktion eines oder mehrerer Zielpolypeptids/Zielpolypeptide, umfassend eine Wirtszelle, in deren Genom die DNA-Sequenz, die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, inaktiviert oder teilweise oder vollständig deletiert ist und die mit einem extrachromosomalen Element, das eine DNA-Sequenz, die das bzw. die Zielpolypeptid(e) und Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, umfasst, transformiert worden ist, wobei sowohl das Wirtszellengenom als auch das extrachromosomale Element kein Antibiotikaresistenzgen tragen, sowie eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenaseaktivität codiert, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz ausgewählt ist aus a) DNA-Sequenzen, eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1, umfassen, b) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, wiedergegeben durch die Nukleotide 1338 bis 2375 von SEQ ID NO:1, umfassen, c) DNA-Sequenzen, die von dem Plasmid pTP01 mit der Plasmidkarte gemäß Figur 4 und hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer DSM 18890 codiert werden, d) DNA-Sequenzen, die für die Proteinsequenz gemäß SEQ ID NO:2 codieren, e) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einer der DNA-Sequenzen gemäß a), b), c) oder d) hybridisieren, f) DNA-Sequenzen, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes mit den DNA-/Nukleotidsequenzen gemäß a), b), c), d) oder e) verwandt sind, und g) komplementären Strängen zu den Sequenzen gemäß a) bis f), und das ...

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrobielles Expressionssystem zur Produktion von Polypeptiden basierend auf der Nutzung von extrachromosomaler DNA, wobei zur Selektion der Wirtszellen keine Antibiotikamarkergene (Gene, deren abgeleiteten Proteine der Zelle Resistenz gegen ein Antibiotikum verleihen, auch Antibiotikaresistenzgene, Resistenzgene, Antibiotikamarker oder Antibiotika-Selektionsmarker genannt), sondern DNA-Sequenzen, die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase (auch NAD(P)H-abhängige Dihydroxyacetonphosphatreduktase, NAD(P)H-abhängige Glycerin-3-Phosphatdehydrogenase, Glycerin-3-Phosphatdehydrogenase (NADP), Glycerin-3-phosphatsynthase, biosynthetische Glycerin-3-phosphatdehydrogenase, L-Glycerin-3-Phosphat:NAD(P) oxidoreduktase genannt) codieren, verwendet werden und so die Produktion des gewünschten Polypeptids, z. B. der Xylanase, vollständig ohne Zugabe von Antibiotika auskommt. Das Expressionssystem ist frei von Antibiotikaresistenzgenen. Die Erfindung betrifft ferner eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenaseaktivität codiert sowie ein Polypeptid mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenaseaktivität.
  • In großer Menge benötigte Polypeptide und Enzyme werden heutzutage meist durch Fermentation von Mikroorganismen gewonnen. Hierbei kommen zwei Gruppen von Mikroorganismen zur Anwendung – i) solche Mikroorganismen, die die interessierenden Proteine natürlicherweise bilden, und ii) gentechnisch modifizierte Mikroorganismen. Die zur Modifikation der Mikroorganismen notwendigen gentechnischen Verfahren sind im Stand der Technik seit langem bekannt. Das Prinzip hierfür besteht darin, dass Gene, die für die interessierenden Proteine codieren, in die Wirtszellen eingebracht werden und von den Wirtszellen transkribiert, translatiert, eventuell posttranslational modifiziert und gegebenenfalls durch die betreffenden Membranen in das Periplasma beziehungsweise das umgebende Medium sekretiert werden. Die interessierenden Polypeptide sind dann aus den betreffenden Zellen beziehungsweise den Kulturüberständen isolierbar.
  • Bei technischen Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden werden zunächst die natürlichen Fähigkeiten der zur Produktion eingesetzten Mikroorganismen zur Synthese und gegebenenfalls zur Sekretion der Proteine ausgenutzt. Grundsätzlich werden als Systeme zur Herstellung von Polypeptiden solche ausgewählt, die kostengünstig in der Fermentation sind, die eine hohe Produktbildungsrate aufweisen und die eine korrekte Faltung, Modifizierung etc. des herzustellenden Polypeptids versprechen. Die hierzu etablierten Mikroorganismen sind entweder eukaryontischen Ursprungs wie z. B. filamentöse Pilze (Aspergillen, Trichoderma, Penicillium) und Hefen (z. B. Saccharomyces, Hansenula, Pichia), oder es werden Prokaryonten verwendet wie z. B. E. coli, Bacillen, Lactobacillen, Staphylococcen, Streptomyceten oder Pseudomonaden.
  • Die Wirtschaftlichkeit eines biotechnologischen Verfahrens hängt entscheidend von der erzielten Ausbeute des Polypeptids ab. Diese Ausbeute wird neben dem verwendeten Expressionssystem vom eingesetzten Herstellungsverfahren, insbesondere von den Fermentationsparametern und den Nährmedien bestimmt. Durch Optimierung des Expressionssystems und des Fermentationsprozesses können das Potential und die erreichbare Ausbeute deutlich gesteigert werden.
  • Genetisch modifizierte Mikroorganismen enthalten die neue genetische Information entweder in das Genom integriert, wie dies bei filamentösen Pilzen oder Hefen häufig der Fall ist, oder auf extrachromosomalen Elementen wie z. B. Plasmiden, die oft in Prokaryonten oder auch Hefen zur Anwendung kommen. Erstere Konstrukte, bei denen die neue genetische Information in das Wirtsgenom integriert wird, sind auch ohne Selektionsdruck sehr stabil. Der Nachteil dieser Methode bei Prokaryonten ist, dass nach der Transformation nur eine Kopie des Gens im Wirt vorhanden ist und sich die Integration weiterer Kopien desselben Gens zur Erhöhung der Produktbildungsrate über den Gendosiseffekt methodisch sehr aufwändig gestaltet. Eine Lösung zu diesem Ansatz findet sich in EP 0 284 126 B1 , das das Problem der stabilen Mehrfachintegration eines Gens darüber löst, dass die Kopien des exogenen Gens, die in das Wirtszellgenom integriert werden sollen, durch für die Zelle lebenswichtige endogene, chromosomale DNA voneinander getrennt vorliegen. Aus der Patentanmeldung DD 277467 A1 geht ein Verfahren zur Herstellung von extrazellulären Enzymen hervor, das auf der stabilen, vorteilhafterweise mehrfachen Integration der für das interessierende Polypeptid codierenden Gene in das Bakterienchromosom beruht. Die Integration erfolgt hierbei durch Rekombination über homologe Bereiche. Zur Kontrolle erfolgreicher Integrationsereignisse dient ein auf dem Plasmid, mit dessen Hilfe die Gene in die Zelle eingeschleust werden, enthaltenes Erythromycin-Gen, das bei erfolgreicher Integration inaktiviert wird.
  • In der Anmeldung WO 96/23073 A1 wird ein auf Transposition basierendes System zur Integration von mehreren Kopien eines interessierenden Gens in das Bakterienchromosom offenbart, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Markergene des Vektors während oder nach der Integration deletiert werden, und die erhaltenen Stämme somit frei von einem Markergen sind. Nach dieser Schrift wird ein Marker nur während der Konstruktion des betreffenden Bakterienstammes benötigt.
  • Ein System zur Erhöhung der Kopienzahl von bestimmten, in ein bakterielles Chromosom integrierten Genen wird in der Anmeldung WO 01/90393 A1 offenbart.
  • Bei der Nutzung von extrachromosomaler DNA zur Erzeugung eines genetisch modifizierten Mikroorganismus wird das interessierende Gen auf ein autonom replizierendes Element, zum Beispiel ein Plasmid, übertragen und episomal im Wirtsorganismus gehalten. Vorteilhaft für die Ausbeute des vom interessierenden Gen codierten Polypeptids wirkt sich dabei der Gendosis-Effekt über die üblicherweise hohe Zahl von Plasmidkopien pro Zelle aus. Nachteilig ist die Tatsache, dass über die gesamte Kulturzeit hinweg ein Selektionsdruck ausgeübt werden muss, um die extrachromosomalen Elemente stabil in den Zellen zu halten. Standardmäßig er folgt dies über den Zusatz von Antibiotika in das Kulturmedium. Da sich das Gen, mit dem der Mikroorganismus Resistenz gegen das Antibiotikum erhält, auf dem extrachromosomalen Element befindet, können nur die Zellen, die ein solches Element aufweisen, wachsen. Das interessierende Gen wird in hoher Kopienzahl in den Zellen gehalten, indem es auf dem gleichen Plasmid, mit dem die Wirte Resistenz gegen das Antibiotikum/die Antibiotika erhalten, lokalisiert ist. Durch den Einsatz von Antibiotika als Selektionsdruck kann der Verlust des Plasmids aufgrund segregativer oder struktureller Instabilität verhindert werden (Bron und Luxen, 1985, Plasmid 14, 235–244). Auf diese Weise können auch größere Plasmide stabil in der Zelle gehalten werden, und die Zelle behält die Fähigkeit, das gewünschte Polypeptid zu produzieren. Generell findet ein Verlust von extrachromosomaler DNA sehr leicht statt, besonders wenn es sich um für diesen Organismus fremde DNA handelt. Auch bei Bakterien, die natürlicherweise Plasmide enthalten, ist die Anwendung von Selektionsdruck oft sinnvoll, da die natürlich vorkommenden, extrachromosomalen Elemente häufig nur in niedrigen Kopienzahlen vorliegen, für eine wirtschaftlich hohe Produktionsrate aber eine hohe Kopienzahl notwendig ist. Diese hohe Kopienzahl kann jedoch üblicherweise nur über einen Selektionsdruck aufrechterhalten werden.
  • Der Einsatz von Antibiotikaresistenzen als Selektionsmarker wird in den letzten Jahren zunehmend kritisch betrachtet. Zum einen ist der Einsatz von Antibiotika recht teuer, insbesondere wenn die Resistenz auf einem das Antibiotikum abbauenden Enzym beruht, so dass das Antibiotikum während der gesamten Kultivierung zugeführt werden muss. Zum anderen trägt ihr weitverbreiteter Einsatz, der sich auch auf andere Technik-Gebiete und auf die Medizin erstreckt, zur Ausbreitung der Resistenzgene auf andere, auch pathogene Stämme bei, was negative Folgen in der Krankheitsbekämpfung haben könnte.
  • Im Stand der Technik sind inzwischen auch antibiotikafreie Selektionssysteme entwickelt worden. So werden beispielsweise in der Publikation von Herrero et al. (1990, J. Bacteriol. 172, 6557–6567) Resistenzen gegen Herbizide und Schwerme talle als Selektionsmarker beschrieben. Gegen den Einsatz dieser Verbindungen sprechen jedoch dieselben Bedenken wie gegen Antibiotika.
  • Eine andere angewendete Methode, um Plasmide stabil in der Zelle zu halten, besteht in der episomalen Komplementierung auxotropher Stämme. In diesem Fall werden Gene vom Genom des Produktionsstammes entfernt oder inaktiviert, die für essentielle Stoffwechselfunktionen codieren. Die dadurch auxotrophen Wirtsstämme können nur dann wachsen, wenn die Stoffwechselfunktion alternativ wiederhergestellt wird. So können z. B. das notwendige Stoffwechselprodukt dem Medium zugegeben werden, wenn der Stamm in der Lage ist, diesen Metaboliten aufzunehmen, oder das Gen, das auf dem Wirtsgenom ausgeschaltet ist und das die essentielle Funktion codiert, episomal zur Verfügung gestellt werden. Vorteilhafterweise geschieht dies auf dem Plasmid, das auch das interessierende Gen für eine Polypeptidproduktion trägt. Das Patent EP 0 284 126 B1 nennt für Auxotrophie-Selektionsmarker die Stoffwechselgene leu, his, trp oder ähnliche, insbesondere solche aus Am inosäuresynthesewegen.
  • In der Praxis ist der Einsatz solcher Auxotrophien als Selektionsmarker aber bisher sehr schwierig, da insbesondere in industriellen Fermentationsmedien fast alle notwendigen Substanzen wie Aminosäuren und Vitamine in ausreichenden Mengen verfügbar sind, und die betreffenden Zellen die Unfähigkeit zur Synthese eines bestimmten Metaboliten über die Aufnahme dieses Metaboliten aus dem Nährmedium ausgleichen können.
  • Die industriell genutzten Fermentationsmedien enthalten in der Regel Bestandteile, die Abfallstoffe anderer, oft fermentativer Prozesse sind, z. B. Rückstände von Getreide aus der Ethanolherstellung (distillers spent grain), Rückstände von Mais aus der Stärkegewinnung (Maisquellpulver oder Maisquellwasser) oder Rückstände von Kartoffeln aus der Stärkegewinnung (Kartoffelschlempe). Diese Bestandteile dienen sowohl als Kohlenstoff-(C-) als auch als Stickstoff-(N-)Quellen und sind oft reich an z. B. Vitaminen oder Aminosäuren aufgrund der mikrobiellen Fermentation, die bei ihrer Gewinnung beteiligt war. Die industriell genutzten Fermen tationsmedien sind folglich sehr komplex. Es ist daher schwierig, wenn nicht sogar unmöglich, auch bei Nutzung von auxotrophen Stämmen in diesen Medien einen Selektionsdruck aufrecht zu erhalten.
  • Ausnahmen sind bisher nur Auxotrophien für das essentielle Thymidin und das für Bacillen und gram-positive Mikroorganismen notwendige D-Alanin, die in industriellen Fermentationsmedien lediglich in Spuren oder gar nicht vorkommen und deshalb von den Mikroorganismen selber gebildet werden müssen. So bietet die Anmeldung EP 0 251 579 A1 die Lösung an, als Wirtsstämme solche einzusetzen, die hinsichtlich des für den Nucleotidstoffwechsei essentiellen Gens für die Thymidylat-Synthase defizient sind. Über einen Vektor kann demnach das Gen für eben diese Funktion (thyA aus Escherichia coli K12) zur Verfügung gestellt werden und den Gen-Defekt kurieren. Das Patent EP 0 185 512 B1 löst das Problem über die Insertion des dal-Gens (D,L-Alanin-Racemase) in das Plasmid unter Nutzung dal-defizienter Wirtsstämme.
  • Eine weitere Lösung dieses Problems wurde in der Anmeldung WO 2004/078953 beschrieben. In ihr wurde erkannt, dass die an der Sekretion beteiligten essentiellen Faktoren für eine Selektion geeignet sind. Zur Selektion dient ein Gen, dessen abgeleitetes Protein als ein für die betreffende Zelle essentieller Faktor an der Protein-Translokation beteiligt ist, z. B. bei Bacillus die Proteine SecA, SecY, SecE, b-SRP, FtsY oder PrsA. Das bedeutet, dass der Ausfall eines solchen Faktors letal ist und damit eine Antibiotikum-ähnliche Selektion der rekombinanten Mikroorganismen erlaubt.
  • Insgesamt muss festgestellt werden, dass trotz jahrelanger Erfahrung zur Produktion von Polypeptiden durch biotechnologische Verfahren bisher kein praktikables System vorhanden ist, bei dem ohne Selektion über teure oder ökologisch bedenkliche Substanzen wie Antibiotika mit hoher Kopienzahl des interessierenden Gens produziert werden kann. Auch die verschiedenen Ansätze zur Selektion über Auxotrophiemarker haben wegen den in der Industrie verwendeten komplexen Nährmedien bisher zu dürftigen Ergebnissen geführt ( WO 2004/078953 ) oder die Systeme enthalten auch weiterhin Antibiotikaresistenzgene.
  • Die Nutzung von definierten Medien aus gereinigten Bestandteilen (reine C- und N-Quellen als auch Vitamine, Aminosäuren und Mineralstoffe) ist für die Herstellung von industriell genutzten Polypeptiden, wie z. B. Enzymen in der Nahrungs-, Tierfutter- oder Waschmittelindustrie aus Kostengründen nicht machbar.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Expressionssystem zur Produktion von Polypeptiden bereitzustellen, bei dem keine Selektion über teure und/oder umwelt- und/oder gesundheitsschädliche Stoffe erfolgt. Insbesondere soll eine Selektion nicht über Antibiotikaresistenzen erfolgen. Das erfindungsgemäße Expressionssystem soll einfach handhabbar sein und sich universell zur Expression beliebiger Zielpolypeptide eignen. Das erfindungsgemäße Expressionssystem soll sich auch zur Etablierung in beliebigen Wirtszellen eignen. Das erfindungsgemäße Expressionssystem soll ferner eine Selektion in industriell üblichen bzw. kostengünstigen Kulturmedien erlauben.
  • Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Expressionssystem zur Produktion eines oder mehrerer Zieipolypeptids/Zielpolypeptide, umfassend eine Wirtszelle, in deren Genom die DNA-Sequenz, die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, inaktiviert oder teilweise oder vollständig deletiert ist, und die mit einem extrachromosomalen Element, das eine DNA-Sequenz, die das bzw. die Zielpolypeptid(e) und Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, umfasst, transformiert worden ist, wobei sowohl das Wirtszellengenom als auch das extrachromosomale Element kein Antibiotikaresistenzgen tragen.
  • Überraschenderweise wurde gefunden, dass ein auf einem extrachromosomalen Element bereitgestelltes Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen in diesbezüglich auxotrophen Wirtszellen zur Selektion der entsprechenden Wirtszellen genutzt werden kann. Das extrachromosomale Element, das das Glycerin-3- phosphatdehydrogenasegen trägt, trägt ferner das Gen für das interessierende, zu produzierende Polypeptid.
  • Das Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen dient somit als Selektionsmarker zur Stabilisierung des extrachromosomalen Elements in den auxotrophen Wirtszellen. Diese Stabilisierung des extrachromosomalen Elements, das eine DNA-Sequenz, die das bzw. die Zielpolypeptid(e) und Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, umfasst, beruht auf der episomalen Komplementierung der auxotroph gemachten Wirtszelle. In dem Genom des Wirtsstammes wird eine DNA-Sequenz, die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert bzw. ein entsprechendes Gen inaktiviert. Dieses Gen codiert das Enzym Glycerin-3-phosphatdehydrogenase (auch NAD(P)H-abhängige Dihydroxyacetonphosphatreduktase; Glycerin-3-phosphatsynthase, biosynthetische Glycerin-3-phosphatdehydrogenase; Morbidoni et al., 1995, J. Bacteriol. 177 (20), 5899–5905; EC-Nummern 1.1.1.8, 1.1.1.94, hier auch u. a. NAD(P)H-abhängige Glycerin-3-Phosphatdehydrogenase, Glycerin-3-Phosphatdehydrogenase (NADP), L-Glycerin-3-Phosphat:NAD(P) oxidoreduktase). Die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase katalysiert die Umsetzung von Dihydroxyacetonphosphat zu sn-Glycerin-3-phosphat unter Kopplung von NAD(P)H. sn-Glycerin-3-phosphat wiederum ist Ausgangsstoff für die Phospholipidsynthese der Zelle und damit zentraler Metabolit für die Zellmembransynthese. Je nach Organismus wird das Gen für die NAD(P)H-abhängige Glycerin-3-phosphatdehydrogenase unter anderem als gpsA (auch gol, gly, glyc genannt), gpd (gpd 1/2/3/A/A1/A2/h) oder dar1 bezeichnet. Generell handelt es sich um das Enzym, das unter physiologischen Bedingungen die Synthese von Glycerin-3-phosphat katalysiert und als Kofaktor üblicherweise NAD(P)H verwendet. Denkbar wäre auch ein entsprechendes Enzym, das einen anderen Kofaktor verwendet, z. B. FAD. Je nach Wirtsstamm werden das entsprechende Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codierende Gen bzw. die Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegene inaktiviert.
  • Durch die Deletion des Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegens in dem Genom des Wirtsstammes wird dieser auxotroph für Glycerin-3-phosphat (G3P), kann a ber wachsen, wenn das Nährmedium entsprechend supplementiert wird (mit G3P oder Glycerin) oder das entsprechende Gen episomal geliefert wird. Durch Insertion des Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegens in das Plasmid, das auch die DNA-Sequenz für das interessierende Polypeptid trägt, wird das Plasmid stabil in der auxotrophen Wirtszelle gehalten. Gleichzeitig werden die auf Plasmiden üblicherweise vorkommenden Antibiotikaresistenzgene eliminiert. Ferner werden auch gegebenenfalls im Genom einer Wirtszelle vorhandene Antibiotikaresistenzgene eliminiert. Die Eliminierung der Antibiotikaresistenzgene erfolgt in an sich bekannter Weise, zum Beispiel vom Genom durch homologe Rekombination (s. u.) oder vom Plasmid durch Ausschneiden mit Hilfe geeigneter Restriktionsenzyme und anschließende Ligation.
  • Im Genom der Wirtszelle des erfindungsgemäßen Expressionssystems wird die jeweilige DNA-Sequenz, die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, deletiert. Die Deletion kann teilweise oder vollständig sein. Jedenfalls muss die Deletion derart vorliegen, dass das Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen inaktiviert ist. Die Inaktivierung dieses Gens im Wirtsstamm erfolgt beispielsweise über homologe Rekombination mit einer inaktivierten oder (teilweise) deletierten Genkopie. Als Ergebnis dieses Rekombinationsereignisses wird die chromosomale Kopie des Gens funktionsunfähig. Bevorzugte Systeme sind darüber hinaus dadurch gekennzeichnet, dass die Inaktivierung des Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegens auf dem Chromosom so erfolgt, dass eine spätere Rekombination zwischen der inaktivierten chromosomalen Genkopie und den homologen Bereichen auf dem kurierenden Komplementierungsvektor verhindert wird, vorzugsweise unter vollständigem Verlust eines in dem betreffenden chromosomalen Locus enthaltenen Gens oder Genabschnittes. Eine Rekombination und Integration des Komplementierungsvektors in das Genom des Wirtes, mit dem der Zelle die essentielle Funktion episomal zur Verfügung gestellt wird, würde die Inaktivierung wieder kurieren und somit den Selektionsdruck, über den das Plasmid stabil in der Zelle gehalten wird, aufheben. Dadurch könnte über die nachfolgenden Zellteilungen das eigentlich interessierende, zu exprimierende Gen verloren gehen oder nur noch in einer oder wenigen Kopien auf dem Chromosom vorliegen. Eine weitreichende oder vollständige Deletion während des Inaktivierungsschritts, die theoretisch auch stromaufwärts und stromabwärts liegenden DNA-Abschnitte mit einbinden kann, verhindert dies. Dabei ist zu beachten, dass die Bereiche stromaufwärts und stromabwärts vom gpsA-Gen Funktionen im Wirtsstamm aufweisen können, die für den Wirt ebenfalls essentiell sind.
  • Um nun eine homologe Rekombination zwischen dem durch das extrachromosomale Element bereitgestellten Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen und einem eventuell noch vorhandenen chromosomalen Gen auszuschließen, ist es notwendig, das Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen auf dem Wirtsgenom nicht nur durch einzelne Punktmutationen zu inaktivieren, sondern es weitgehend oder vollständig zu entfernen. Die Elimination des Gens vom Wirtsgenom erfolgt beispielsweise über homologe Rekombination mithilfe eines Deletionsvektors, der nur einen inaktiven Teil des Gens oder besser, nur die flankierenden Bereiche des Gens ohne das Gen selbst enthält, so dass die Genkopie auf dem Wirtsgenom gegen die auf dem Deletionsvektor vorhandene trunkierte Kopie ausgetauscht oder vollständig deletiert wird. Es ist wesentlich, dass dabei keine Antibiotikamarkergene zurückgelassen werden. Um das Gen vollständig vom Genom des Wirtes zu eliminieren, ist es notwendig, die das Gen stromaufwärts und stromabwärts flankierenden Bereiche aus dem Wirtsgenom zu isolieren und diese flankierenden Regionen ohne das Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen selbst in einen Deletionsvektor zu inserieren. Die homologe Rekombination findet dann statt zwischen den das Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen flankierenden Sequenzen, wobei das Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen vollständig vom Genom entfernt wird.
  • Erfindungsgemäß wird das auf dem Wirtschromosom deletierte bzw. inaktivierte Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen auf einem extrachromosomalen Element, das auch eine ein interessierendes Polypeptid codierende DNA-Sequenz trägt, der Zelle wieder zur Verfügung gestellt. Dabei kann sowohl dasselbe Gen, das in der jeweiligen Wirtszelle deletiert wurde, als auch ein entsprechendes Gen, das für NAD(P)H-abhängige Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, der Wirtszelle wieder zur Verfügung gestellt werden.
  • Die Erfindung betrifft somit auch einen Vektor zur Kompiementierung des Genoms einer Wirtszelle, in dem die DNA-Sequenz, die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, deletiert ist, umfassend eine DNA-Sequenz, die das bzw. die Zielpolypeptide codiert, sowie eine Expressionskassette, die eine DNA-Sequenz, die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, umfasst, wobei der Vektor keine Antibiotikaresistenzgene enthält. Der Vektor kuriert somit die Inaktivierung der Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codierenden DNA („Komplementierungsvektor"), d. h. er liefert extrachromosomal eine aktive Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-codierende Genkopie. Die Ausdrücke Vektor und Plasmid werden im Wesentlichen austauschbar verwendet. Als Vektoren können auch andere extrachromosomale Elemente wie z. B. Phagen, Phagmide oder Transposons dienen.
  • Als Vektor wird ein Plasmid bevorzugt, das eine hohe Kopienzahl in der Wirtszelle aufrecht erhält: Besonders vorteilhaft ist es, wenn es sich bei dem Plasmid um eines sich in mehrfacher (beispielsweise 10 bis 30 Plasmide pro Zelle), vorzugsweise in vielfacher Kopienzahl (mehr als 30 Plasmide pro Zelle) etablierendes Plasmid handelt. Je mehr Plasmidkopien vorliegen, desto höher ist aufgrund des Gendosiseffekts die Ausbeute an dem gewünschten Proteinprodukt.
  • Der Komplementierungsvektor soll erfindungsgemäß keine Antibiotikaresistenzgene enthalten. Des Weiteren enthält der Komplementierungsvektor neben den interessierenden Sequenzen für eine Polypeptidproduktion eine Expressionskassette mit dem Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen.
  • Hierbei wird vorzugsweise die endogen in den Wirtszellen vorhandene, deletierte Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-codierende Sequenz verwendet. Es können aber auch ein Enzym gleicher Funktion codierende Sequenzen aus anderen Organismen, vorzugsweise aus verwandten Stämmen eingesetzt werden, sofern sie in der Lage sind, den betreffenden Defekt zu kurieren und dabei ein System bereitzustellen, das ohne weiteren Selektionsdruck eine hohe Produktivität des inte ressierenden Proteins gewährleistet. Ein Verlust dieser extrachromosomalen DNA wäre bei Wachstum in Minimalmedium für die auxotrophe Wirtszelle letal, so dass eine solche Zelle gezwungen ist, bei jeder Zellteilung dieses extrachromosomale Element an die Folgegeneration weiterzugeben. Bei dem erfindungsgemäßen System herrscht ein endogener Selektionsdruck, solange der rekombinante Stamm in einem Medium ohne Bereitstellung von Glycerin-3-phosphat oder Glycerin wächst. Die Gabe eines Antibiotikums ist nicht notwendig, um den Verlust des Vektors mit dem zu exprimierenden Gen zu verhindern.
  • Die Expressionskassetten, die zur erfindungsgemäßen Einschleusung der eine Aktivität einer Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-codierenden DNA-Sequenz bzw. eines offenen Leserasters in eine Wirtszelle verwendet werden können, umfassen bevorzugt eine Transkriptionsstartregion, die mit dem offenen Leseraster verknüpft ist. Eine derartige Expressionskassette kann eine Vielzahl von Restriktionsschnittstellen zur Insertion des offenen Leserasters und/oder anderer DNA, z. B. einer Transkriptions-Regulationsregion enthalten. Die Transkriptionskassette umfasst in der 5'→3'-Richtung der Transkription eine Transkriptions- und Translationsstartregion, die DNA-Sequenz, die für die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität codiert, und eine Translations- und Transkriptionsstoppregion, die in einer mikrobiellen Zelle funktionell ist. Die Terminationsregion kann bezüglich der Transkriptioninitiationsregion nativ sein, kann bezüglich der DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder kann von einer beliebigen anderen Quelle abgeleitet sein.
  • Der Ausdruck „offenes Leseraster" (ORF) bezeichnet die Aminosäuresequenz, die zwischen den Translationsstart- und -stop-Codons einer codierenden Sequenz codiert wird. Die Ausdrücke „Start-Codon" und „Stop-Codon" bezeichnen eine Einheit aus drei benachbarten Nucleotiden (Codons) in einer codierenden Sequenz, die den Kettenstart und -stop der Proteinsynthese (mRNA-Translation) spezifizieren.
  • „Funktionelle Verknüpfung” bezeichnet im Zusammenhang mit einer Nucleinsäure eine Verbindung als Teil des gleichen Nucleinsäuremoleküls in geeigneter Positionierung und Orientierung zum Transkriptionsstart des Promotors. DNA in funktioneller Verknüpfung an einen Promotor befindet sich unter der Transkriptions-Initiations-Regulation des Promotors. Codierende Sequenzen können funktionell mit der Regulatorsequenz in Sense- oder Antisense-Orientierung verknüpft sein. Bei Bezugnahme auf Polypeptide bedeutet funktionelle Verknüpfung die Verbindung als Teil desselben Polypeptids, d. h. über Peptidylbindungen.
  • Erfindungsgemäß können beliebige Promotoren verwendet werden, solange sie das erfindungsgemäße System stabil halten. In der bevorzugten Ausführungsform werden schwache und konstitutive Promotoren genommen. Promotor bezeichnet die Nucleotidsequenz üblicherweise stromaufwärts (5') bezüglich der codierenden Sequenz und kontrolliert die Expression der codierenden Sequenz, indem die Erkennung für die RNA-Polymerase und anderer Faktoren, die für die richtige Transkription erforderlich sind, bereitgestellt wird. Der erfindungsgemäß verwendete Promotor kann einen Minimalpromotor umfassen, d. h. eine kurze DNA-Sequenz aus einer TATA-Box und anderen Sequenzen, die die Transkriptionsstartstelle spezifizieren, an die Regulatorelemente zur Kontrolle der Expression angefügt sind.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Expressionssystem kann das interessierende Polypeptid mit höherer, mindestens jedoch gleicher Ausbeute produziert werden, ohne dass Antibiotika zu irgendeinem Zeitpunkt der Produktion zugegeben werden müssen, und ohne dass Antibiotikamarkergene vorhanden sind, und ohne dass Antibiotika oder Antibiotikaresistenzgene im Proteinprodukt vorkommen. Durch den Einsatz des erfindungsgemäßen Expressionssystems können die Produkte daher auch in Applikationen eingesetzt werden, in denen die Anwesenheit von ganzen oder Anteilen von Antibiotikamarkergenen nicht zulässig oder nicht erwünscht ist.
  • Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Expressionssystems zur antibiotikafreien Produktion des Zielpolypeptids. Dabei wird das Expressionssystem in einem Medium, das frei von Glycerin-3-phosphat bzw. Glycerin-3-phosphatliefernden Verbindungen ist, gezüchtet. Beispiele für solche Medien sind vorstehend ausgeführt. Die Züchtung des Expressionssystems erfolgt in an sich bekannter Weise.
  • Das erfindungsgemäße Expressionssystem eignet sich für beliebige Wirtszellen. Generell kann das erfindungsgemäße Expressionssystem für praktisch alle industriell zur fermentativen Proteinherstellung bedeutenden Wirtszellen verwendet werden. Beispiele sind gram-positive Wirtsorganismen, zum Beispiel der Gattung Staphylococcus, Corynebacterium oder Bacillus, insbesondere die Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. brevis, B. globigii, B. megaterium, B. clausii oder B. lentus, und ganz besonders Derivate der Stämme B. licheniformis oder B. amyloliquefaciens.
  • Bevorzugt ist die Verwendung von Bacillus-Stämmen als Wirtszellen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Bacillus amyloliquefaciens. In Bacillus amyloliquefaciens liegt das Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen als gpsA vor. Überraschenderweise wurde gefunden, dass sich das erfindungsgemäße Expressionssystem in Bacillus amyloliquefaciens etablieren lässt, ohne dass sich die Kopienzahl des Produktionsplasmids im Vergleich zu dem analogen Antibiotikamarkergen-haltigen Plasmid (pUB110-Derivat) verringert. Vielmehr konnte mit einem derart transformierten B. amyloliquefaciens Wirtsstamm (GpsA–) sogar im Vergleich zu dem mit dem Ausgangsplasmid mit Antibiotikamarkergen (pIK91 abgeleitet aus pUB110, siehe EP 0 585 617 B1 ) transformierten Wirtsstamm (GpsA+) eine höhere Produktivität erreicht werden.
  • Es wurde ferner gefunden, dass das endogene gpsA-Gen von Bacillus amyloliquefaciens am besten durch Verwendung der dieses Gen flankierenden Sequenzen aus dem Genom von Bacillus amyloliquefaciens entfernt werden kann. Ferner ist es vorteilhaft, wenn das endogene gpsA-Gen als solches episomal zur Verfügung gestellt wird. Dazu wurde das bisher unbekannte gpsA-Gen aus B. amyloliquefaciens isoliert. Obwohl Sequenz-Datenbanken wie z. B. EMBL (European Bioinformatics Institute (EBI), Cambridge, Großbritannien; http://www.ebi.ac.uk) oder GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) gpsA-Gendaten enthalten, zeigt ein Vergleich des erfindungsgemäßen Gens mit gpsA-Genen aus anderen Organismen nur eine 76%-Identität auf DNA-Ebene mit dem für Bacillus subtilis beschriebenen Gen bzw. 71% Identität mit dem Gen von Bacillus licheniformis.
  • Das Enzym Glycerin-3-phosphatdehydrogenase liefert in Bacillen sn-Glycerin-3-phosphat (G3P), einen essentiellen Metaboliten der Zellmembransynthese. Morbidoni et al. (1995) beschreiben, dass der G3P-Gehalt in der Bacillus subtilis Zelle überaus fein reguliert werden muss und dass das Gleichgewicht zwischen Synthese und Abbau von G3P in der Zelle überaus kritisch ist. Experimente von Freese et al. (1972. In: Halverson et al. (Hg.) Spores V, 212–221) zeigten, dass B. subtills Zellen, in denen sich Glycerinphosphat aufgrund eines Defektes der katabolischen Glycerinphosphatdehydrogenase (Gof) ansammelt, schlechter wachsen als normale Zellen und dass die Sporulation unterdrückt wird.
  • Generell ist es wünschenswert, dass das interessierende Gen, das das zu produzierende Polypeptid codiert, in möglichst hoher Kopienzahl in der Wirtszelle vorliegt, um die Ausbeute über den Gendosiseffekt zu steigern. In einer bevorzugten Ausführung werden daher Plasmide verwendet, die mit zahlreichen Kopien in der Zelle vorliegen, wie z. B. Derivate von pUB110, das mit ca. 50 Kopien pro Zelle vorkommt (Gryczan et al., 1978, J. Bacteriol. 134, 318–329). Die Einführung ebenso zahlreicher Kopien des komplementierenden Gens gpsA in die auxotrophe Wirtszelle könnte allerdings das empfindliche Gleichgewicht zwischen Synthese und Abbau von G3P stören.
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass diese für Bacillus subtilis beschriebenen Probleme bei Bacillus amyloliquefaciens unter den erfindungsgemäßen Bedingungen nicht auftreten. In einer bevorzugten Ausführung wird das gpsA-Gen dabei unter einen schwachen Promotor gestellt. Zyprian und Matzura (1986, DNA 5, 219–225) berichten, dass in dem Vektor pUB110 ein solcher Promotor natürlicherweise vorliegt. Stellt man das gpsA-Gen unter die Regulation dieses Promotors, wird trotz erhöhter Genkopienzahl im Vergleich zu einer nichtmodifizierten Bacillus-Zelle das delikate Gleichgewicht zwischen Synthese und Abbau von G3P in der Zelle offenbar aufrechterhalten. Da der Promotor außerdem konstitutiv ist, wird genügend Glycerin-3-phosphatdehydrogenase zu jedem Zeitpunkt im Zellzyklus von Bacillus zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus kommt es mit diesem System sogar zu einer stabilen Aufrechterhaltung der hohen Kopienzahl in der gpsA-negativen Wirtszelle bei Wachstum in Komplexmedium. Dies erlaubt die Produktion von interessierenden Polypeptiden, die von dem komplementierenden Vektor ebenfalls codiert werden, in hohen Konzentrationen in den von der Industrie üblicherweise verwendeten Nährmedien.
  • Wie bereits ausgeführt, können erfindungsgemäß beliebige Promotoren verwendet werden, solange sie das erfindungsgemäße System stabil halten. Insbesondere sind schwache, konstitutive Promotoren bevorzugt, wie z. B. der o. g. von Zyprian und Matzura (1986) für das Plasmid pUB110 beschriebene Promotor. Auch der ptsH Promotor aus B. subtilis ist ein geeigneter schwacher und konstitutiver Promotor (Stülke und Rillen, 2000, Annu. Rev. Microbiol. 54, 849–80).
  • Wie vorstehend ausgeführt, wird in dem erfindungsgemäßen Expressionssystem das Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen auf dem Wirtschromosom inaktiviert. Die Unfähigkeit zur Synthese von Glycerin-3-phosphatdehydrogenase wird dadurch ausgeglichen, dass das entsprechende Gen episomal zur Verfügung gestellt wird. GpsA-negative-Bacillus subtilis Mutanten wurden durch klassische Mutation bereits früh hergestellt (Mindich, 1970, J. Mol. Biol. 49, 415–432). Bei diesen Mutanten handelt es sich um Allele des gpsA-Gens (Morbidoni et al., 1995), die wahrscheinlich nur Punktmutationen in dem gpsA-Gen oder dessen Regulation haben.
  • Diese Stämme (und dieses Verfahren) sind für eine großtechnische Proteinproduktion nicht brauchbar, da es sowohl zur spontanen Rückmutation zur aktiven Form als auch zur Rekombination des intakten, episomal bereitgestellten gpsA-Gens mit dem defekten chromosomalen Gen auf Grund der langen Homologiebereiche kommen kann (vgl. auch Ostroff et al., 1984, Mol. Gen. Genet. 193, 299–305). Khasanov et al. (1992, Mol. Gen. Genet. 234, 494–497) zeigten, dass es bereits bei Homologien von 70 bp in Bacillus zur homologen Rekombination im Genom kommen kann. In einem solchen Falle könnten die Wirtszellen wieder prototroph werden und wären nicht mehr auf das Plasmid mit dem gpsA-Gen angewiesen. Dies wiederum könnte zur einfachen Integration oder zum Verlust des Plasmids führen, so dass auch das interessierende Polypeptid, dessen Gen ebenfalls auf dem Plasmid vorliegt, nicht mehr oder nur in geringen Mengen von der Wirtszelle gebildet werden kann.
  • Das gpsA-Gen sowie die Regionen stromaufwärts und stromabwärts des Gens. sind für Bacillus amyloliquefaciens nicht beschrieben, es liegen aus den Datenbanken (z. B. EMBL, GenBank, SubtiList (Moszer et al., 1995, Microbiology 141, 261–268; Moszer, 1998, FERS Lett. 430, 28–36; http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/)) nur Daten zu Bacillus subtilis und zu weiter entfernt verwandten Mikroorganismen vor. Auch die Organisation des Genoms von B. amyloliquefaciens ist nicht bekannt. Gene, die auf dem Chromosom von B. subtilis in direkter Nachbarschaft des gpsA-Gens liegen, die also die flankierenden Bereiche darstellen, welche zur Erzeugung des auxotrophen Wirtes benötigt werden, können im Genom von B. amyloliquefaciens an völlig anderen Positionen vorkommen oder auch ganz fehlen. Es ist auch zu beachten, dass die Bereiche stromaufwärts und stromabwärts vom gpsA-Gen Funktionen im Wirtsstamm codieren können, die für den Wirt essentiell sind. Für B. subtilis sind stromaufwärts und stromabwärts Gene mit unbekannten Funktionen beschrieben, während für B. amyloliquefaciens keine Informationen über benachbarte Gene vorliegen. Es empfiehlt sich daher für B. subtilis, aber auch für B. amyloliquefaciens und andere Bacilli die an das gpsA-Gen angrenzenden Bereiche vollständig zu erhalten, um keine weiteren, unbekannten und daher nicht komplementierbaren Funktionen im Genom zu zerstören. Eine vollständige, aber möglichst punktgenaue Deletion des gpsA-Gens, die keine Mutation oder Leserasterverschiebung in den möglicherweise angrenzenden Genen hervorruft, ist daher erfindungsgemäß anzustreben.
  • Eine homologe Rekombination zum präzisen Entfernen eines chromosomalen Gens oder Genfragments wird umso erfolgreicher sein, je länger die homologen Bereiche sind (vgl. Hamilton et al., 1989, J. Bacteriol. 171 (9), 4617–4622). Es wurde gefunden, dass die das gpsA-Gen flankierenden Bereiche aus B. amyloliquefaciens mit den entsprechenden Bereichen aus B. subtilis – wie in der Datenbank SubtiList (Moszer et al., 1995; 1998) beschrieben – nur eine Sequenzidentität von etwa 84% für den Bereich von ca. 1,3 kbp stromaufwärts, und eine Identität von etwa 69% für den Bereich von ca. 1,1 kbp stromabwärts aufweisen. Die Amplifizierung der flankierenden Bereiche auf der chromosomalen DNA des Wirtsstammes B. amyloliquefaciens war daher äußerst schwierig, insbesondere, da möglichst lange homologe Bereiche für die Konstruktion des Deletionsvektors erzeugt werden sollten.
  • Die Deletion des Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegens auf dem Wirtschromosom erfolgt beispielsweise mithilfe von Plasmidvektoren, die einen temperatursensitiven oder nicht in Bacilli funktionierenden Replikationsursprung besitzen und in die zusätzlich die in Frage kommenden (flankierenden) homologen DNA-Bereiche des zu deletierenden Gens eingefügt wurden (Deletionsvektor). Denkbar wäre allerdings auch eine reversible Inaktivierung, beispielsweise über Integration eines mobilen genetischen Elements, zum Beispiel eines Transposons, in das zu inaktivierende Gen.
  • In der Publikation von Vehmaanperä et al. (1991, J. Biotechnol. 19, 221–240) sind Verfahren zur Inaktivierung von Genen über einen Deletionsvektor beschrieben. Der Replikationsursprung dieses Deletionsvektors zeichnet sich durch seine Temperaturabhängigkeit aus. Dadurch ist es möglich, zunächst bei niedrigerer Temperatur auf eine erfolgreiche Transformation zu selektieren und anschließend durch Temperaturerhöhung einen Selektionsdruck auf eine erfolgreiche Integration aus zuüben. Danach wird die Zelle vom Vektor, der jetzt die endogene Genkopie enthält, kuriert, so dass keine funktionierende Genkopie auf dem Chromosom mehr vorliegt. Es bleiben auch keine Vektorsequenzen, d. h. auch keine Antibiotikaresistenzgene in der Zelle zurück.
  • Die Erfindung betrifft somit eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenaseaktivität codiert, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz ausgewählt ist aus a) DNA-Sequenzen, die eine Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 umfassen, b) DNA-Sequenzen, die eine Nucleotidsequenz, wiedergegeben durch die Nucleotide 1338 bis 2375 von SEQ ID NO: 1, umfassen c) DNA-Sequenzen, die von dem Plasmid pTP01 mit der Plasmidkarte gemäß 4 und hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer DSM 18890 codiert werden, d) DNA-Sequenzen, die für die Proteinsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 codieren, e) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einer der DNA-Sequenzen gemäß a), b), c) oder d) hybridisieren, f) DNA-Sequenzen, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes mit den DNA-/Nucleotidsequenzen gemäß a), b), c), d) oder e) verwandt sind, und g) komplementären Strängen zu den Sequenzen gemäß a) bis f), sowie ein Polypeptid mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenaseaktivität ausgewählt aus a) einem Polypeptid, das von dem codierenden Teil der vorstehenden DNA-Sequenz codiert wird, b) einem Polypeptid mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder einer davon abgeleiteten Sequenz, die durch Substitution, Addition und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren daraus erhältlich ist, c) einem Polypeptid mit einer Sequenz, die mindestens 77% Identität zu den Aminosäuren 1 bis 345 von SEQ ID NO: 2 aufweist, d) einem Polypeptid, das von einer Nucleinsäuresequenz codiert wird, die unter stringenten Bedingungen hybridisiert mit (i) den Nucleotiden 1338 bis 2375 von SEQ ID NO: 1, (ii) einer Teilsequenz von (i) aus mindestens 100 Nucleotiden, oder (iii) einem Komplementärstrang von (i) oder (ii), e) einer Variante des Polypeptids mit SEQ ID NO: 2 umfassend eine Substitution, Deletion und/oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren, f) allelischen Varianten zu den Aminosäuresequenzen a) bis e).
  • Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorstehenden DNA-Sequenz zur Herstellung des erfindungsgemäßen Expressionssystems. Überraschenderweise wurde gefunden, dass eine von Bacillus amlyoliquefaciens abgeleitete DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenaseaktivität codiert, besonders vorteilhaft bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Expressionssystems ist.
  • Der Grad der Sequenzidentität wird bezüglich der beanspruchten Sequenzen bevorzugt so bestimmt, dass man die Anzahl der Reste der kürzeren Sequenz, die an dem Vergleich beteiligt ist und die ein „entsprechendes" Gegenstück in der anderen Sequenz besitzt, ermittelt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird die Identität dabei bevorzugt in üblicher Weise unter Verwendung der üblichen Algorithmen bestimmt. Erfindungsgemäß werden zum Vergleich nur die Nucleotide, die die reifen Proteine codieren bzw. die Aminosäuren der jeweiligen reifen Proteine herangezogen. Als homologe Sequenzen wurden erfindungsgemäß ähnliche, bevorzugt identische, Sequenzgegenstücke mit Hilfe von bekannten Computerprogrammen ermittelt. Ein Beispiel für ein derartiges Programm ist das Programm Clone Manager Suite, das den Programmteil Align Plus enthält und von Scientific & Educational Software, Durham, NC, USA vertrieben wird. Dabei wird ein Vergleich zweier oder mehrerer wie vorstehend definierter DNA- bzw. Aminosäuresequenzen durchgeführt unter der Option local alignment entweder nach der Methode FastScan – MaxScore oder nach der Methode Needleman-Wunsch unter Beibehaltung der Defaultwerte. Speziell wurde erfindungsgemäß zur Berechnung der Identität die Programmversion „Clone Manager 7 Align Plus 5" mit den Funktionen „Compare Two Sequences/Local/Fast Scan-Max Score/Compare sequences as DNA bases" bzw. für Aminosäuren „Compare Two Sequences/Local/Fast Scan-Max Score/Compare sequences as Amino Acids" angewendet. Dabei wurden die aus den folgenden Quellen zugänglichen Algorithmen verwendet: Hirschberg (1975, Commun. Assoc. Comput. Mach. 18, 341–343); Myers und Miller (1988, CABIOS 4, 11–17); Chao et al. (1992, CABIOS 8, 481–487).
  • Die Erfindung betrifft ferner Additions- und/oder Deletionsmoleküle der vorstehenden Polypeptide mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität. So kann ein erfindungsgemäß modifiziertes Polypeptid mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität durch Anfügen weiterer Sequenzen am N-terminalen und/oder C-terminalen Ende oder im Molekül erhalten werden, wobei die so erhaltenen Polypeptide noch Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität aufweisen oder Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-defiziente Stämme komplementieren können müssen. Dadurch können Hybridmoleküle hergestellt werden, die weitere vorteilhafte Eigenschaften besitzen.
  • Erfindungsgemäß können auch Sequenzabschnitte des Polypeptids mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität deletiert werden unter Beibehaltung der Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität. Die Mutationen, Elongationen und Verkürzungen können in an sich bekannter Weise nach auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren durchgeführt werden.
  • Die Erzeugung solcher Varianten ist allgemein auf dem Fachgebiet bekannt. Beispielsweise können Aminosäuresequenz-Varianten der Polypeptide durch Mutation in der DNA hergestellt werden. Verfahren zur Mutagenese und Nucleotidsequenzveränderung sind im Stand der Technik gut bekannt (vgl. beispielsweise Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488–492, Kunkel et al., 1987, Methods Enzymol. 154, 367–382, US-Patent Nr. 4873192 , Walker und Gaastra (Hg.), 1983, Techniques in Molecular Biology, Mac Millan Publishing Company, New York). Hinweise über geeignete Aminosäuresubstitutionen, die die biologische Aktivität des Proteins von Interesse nicht beeinträchtigen, finden sich in dem Modell von Dayhoff et al. (1978, Atlas of Protein Sequence and Structure. Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). Konservative Substitutionen wie der Austausch einer Aminosäure gegen eine andere mit ähnlichen Eigenschaften sind bevorzugt. Diese Austausche lassen sich in 2 Hauptgruppen mit zusammen 4 Untergruppen einteilen und ein Austausch in jeder Untergruppe wird als konservativer Austausch bezeichnet, der bevorzugt nicht die Aktivität oder die Faltung des Proteins beeinflusst.
    Aliphatisch Nicht-Polar GAP
    ILV
    Polar und ungeladen CSTMNQ
    Polar und geladen DE
    KR
    Aromatisch HFWY
  • Die Ausdrücke „Protein", „Peptid" und „Polypeptid" werden im Wesentlichen austauschbar verwendet. Ein Polypeptid oder Enzym mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität soll ein Enzym bezeichnen, das die NAD(P)H-gekoppelte Reduktion von Dihydroxyacetonphosphat zu Glycerin-3-phosphat katalysiert. Die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität kann unter Verwendung an sich bekannter, beliebiger Testverfahren, bei denen eines dieser Substrate oder Produkte verwendet wird, bestimmt werden (Morbidoni et al., 1995; Bergmeyer, 1970, Methoden der enzymatischen Analyse. Verlag Chemie, 426–227).
  • Die Erfindung betrifft ferner DNA-Sequenzen, die ein Polypeptid mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität codieren, die Mutationen, Modifikationen bzw. Variationen der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 umfassen. Ferner betrifft die Erfindung auch Sequenzen, die unter relaxierten oder stringenten Bedingungen mit den vorstehenden Sequenzen hybridisieren. Als stringente Bedingungen gelten: Hybridisierung bei 65°C, 18 h in Dextransulfatlösung (GenescreenPlus, DuPont), danach waschen der Filter jeweils 30 min zuerst mit 6 × SSC, zweimal 2 × SSC, zweimal 2 × SSC, 0,1% SDS und anschließend mit 0,2 × SSC bei 65°C (Membrane transfer and detection methods, Amersham).
  • Ferner betrifft die Erfindung auch DNA-Sequenzen, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes mit den vorstehenden erfindungsgemäßen Sequenzen verwandt sind, sowie allelische Varianten davon. Die Degeneriertheit des genetischen Codes kann sich dabei aufgrund natürlicher Degeneriertheit oder aufgrund eines speziell gewählten Codongebrauchs ergeben. Natürlich vorkommende allelische Varianten können unter Verwendung gut bekannter Techniken der Molekularbiologie, wie zum Beispiel der Polymerasekettenreaktion (PCR), Sequenzier- und Hybridisierungstechniken, identifiziert werden.
  • Eine DNA-Sequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kann verwendet werden, um in beliebigen Wirtszellen deletiert zu werden und anschließend auf dem Plasmid, das auch das interessierende Gen trägt, wieder zur Verfügung gestellt werden. Die Wirtszellen zeichnen sich nach der Deletion/Inaktivierung des Glycerin-3-phosphatdehydrogenase Gens durch das Fehlen der essentiellen Funktion der Glycerin-3-phosphatdehydrogenase aus.
  • Die hier beschriebene, erfindungsgemäße Art der Konstruktion von auxotrophen Wirtsstämmen ermöglicht es, einen einmal erzeugten auxotrophen Mikroorganismus-Stamm, dessen chromosomales Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen inaktiviert wurde, für immer neue Transformationen mit ähnlich aufgebauten, komplementierenden Vektoren zu verwenden, die jedes mal dieselbe den Gendefekt kurierende Funktion zur Verfügung stellen, aber jeweils verschiedene Gene für andere interessierende, zu produzierende Polypeptide tragen. Man verfügt somit über ein sehr praktisches und vielseitig einsetzbares Produktionssystem.
  • Der Sinn des erfindungsgemäßen Systems besteht darin, ein genetisches Element, das für die Produktion eines interessierenden Polypeptides gebraucht wird, ohne Antibiotikum-Selektionsdruck über mehrere oder viele Generationen hinweg stabil und in hoher Kopienzahl in der Zelle zu erhalten. Dieses Element ist eben das Plasmid, das sowohl das Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegen trägt als auch das Gen für das zu produzierende Polypeptid.
  • Die Aufrechterhaltung dieses Selektionsdrucks ist für die Aufbewahrung der rekombinanten Produktionsstämme von Vorteil. Die inhärente Stabilität des Systems ist hingegen ausreichend, um im Produktionsprozess die hohe Kopienzahl aufrecht zu erhalten und damit eine hohe Produktivität zu gewährleisten.
  • Bedingt durch die hohe inhärente Stabilität bleibt das System auch ohne Anwendung von Selektionsdruck stabil, d. h. auch bei Anzucht in industriellem Medium (das möglicherweise Spuren von Glycerin enthält) in der Hauptkultur, nimmt die Ausbeute an Zielpolypeptid nicht über die Kultivierungsdauer ab, der Komplementierungsvektor wird also stabil in der Zelle gehalten.
  • Von ganz besonderem Interesse sind erfindungsgemäße Expressionssysteme, die auf bestimmte, durch die Kultivierung der Mikroorganismen hergestellte Produkte ausgerichtet sind, insbesondere Polypeptide oder Proteine wie z. B. hydrolytische Enzyme oder Oxidoreduktasen, besonders bevorzugt alpha-Amylasen, beta-Amylasen, maltogene Amylasen, CGTasen, Xylanasen, alpha-Galactosidasen, beta-Galactosidasen, Phospholipasen, Phosphatasen, Phytasen, Endoglucanasen, insbesondere endo-beta-1,4-Glucanasen, endo-beta-1,3(4)-Glucanasen, endo-1,2-beta-Glucanasen und endo-1,3-alpha-Glucanasen, Cellulasen, Xylosidasen, Galactanasen, insbesondere Arabinogalactan-endo-1,4-beta-Galactosidasen und Arabinogalactan-endo-1,3-beta-Galactosidasen, Pektin-abbauende Enzyme, insbesondere Pektinasen, Pektinesterasen, Pektinlyasen, Polygalacturonasen, Arabananasen, Rhamnogalacturonasen, Rhamnogalacturonanacetylesterasen, Rhamnogalacturonan-alpha-Rhamnosidasen, Pektatlyasen und alpha-Galacturonidasen, Mannanasen, beta-Mannosidasen, Mannanacetylesterasen, Xylanacetylesterasen, andere Xylanasen, Arabinoxylanasen, proteolytische Enzyme wie Proteasen und Peptidasen, lipolytische Enzyme wie Lipasen, Digalactosid-Diglycerid-Esterasen und Cutinasen, und andere Enzyme wie Laccasen und Transglutaminasen.
  • Von besonderer Bedeutung ist daher die Nutzung eines erfindungsgemäßen Systems in großtechnischen Verfahren, vor allem zur Proteinherstellung. Verfahren zur Herstellung eines Proteins durch Kultivierung von Zellen eines Mikroorganismus-Stammes sind im Stand der Technik allgemein bekannt, wenn das Plasmid über einen Selektionsdruck, wie er mit Antibiotika aufgebaut werden kann, beruht.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Produktion eines Polypeptids von Interesse unter Verwendung des erfindungsgemäßen Expressionssystems.
  • Von besonderer Bedeutung sind Proteinherstellungsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass das interessierende Protein ins umgebende Medium sekretiert wird. Denn hierdurch wird die Aufarbeitung des erhaltenen Produkts wesentlich erleichtert. Eine erfindungsgemäß mögliche Alternative besteht jedoch auch darin, die betreffenden das Protein herstellenden Zellen im Anschluss an die eigentliche Produktion aufzuschließen und dadurch das Produkt zu erhalten.
  • Ein besonders vorteilhafter Aspekt besteht darin, dass eine Reihe verwandter Mikroorganismen dadurch erhalten wird, dass immer dieselbe Art der Inaktivierung und Kurierung durchgeführt, auf dem kurierenden Vektor aber jedesmal ein anderes Gen, das für ein anderes interessierendes Polypeptid codiert, bereitgestellt wird. Ein einmal erfolgreich entwickeltes System kann auf diese Weise auf unzählige weitere Produktionsprozesse übertragen werden.
  • Figuren
  • Die beigefügten Figuren erläutern die Erfindung näher. Es zeigen
  • 1: DNA-Sequenz des gpsA-Gens mit flankierenden Bereichen aus Bacillus amyloliquefaciens; Seq-ID Nr. 1
    (kursiv: gpsA-Gen, kursiv-fett: putative RBS, fett: putativer Terminator)
  • 2: Aminosäure-Sequenz codiert durch das gpsA-Gen gemäß 1; Seq-ID Nr. 2
  • 3: Alignment der DNA-Sequenz gemäß 1 mit anderen bekannten Bacillus gpsA-Regionen
    (B. amyloliq.: Bacillus amyloliquefaciens RH 1330; B. subtilis: Bacillus subtilis 168; B. lichenif.: Bacillus licheniformis ATCC 14580)
  • 4: Plasmidkarte von pTP01 mit dem hinterlegten gpsA-Gen
  • 5: Plasmidkarte des Deletionsplasmids
    (ALF: Stromaufwärts des gpsA-Gens liegende Region auf dem Chromosom von B. amyloliquefaciens RH 1330; ARF: Stromabwärts des gpsA-Gens liegende Region auf dem Chromosom von B. amyloliquefaciens RH 1330; ermC: das ermC-Gen codiert eine Adenin-Methylase, die Resistenz gegen Erythromycin verleiht).
  • 6: Plasmidkarte von pIK91
  • 7: Plasmidkarte des zur Expression des Polypeptids verwendeten Vektors pTP15
  • Die Hinterlegung des Plasmids pTP01 aus 4 und des Stammes RH 1626 erfolgte bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig; http://www.dsmz.de) am 22.12.2006 bzw. am 18.12.2006 unter den Nummern DSM 18890 und DSM 18878. Bei Bacillus amyloliquefaciens RH 1626, der unter der Nummer DSM 18878 hinterlegt worden ist, handelt es sich um den Empfängerstamm mit einer gpsA-Deletion und ohne Plasmid. Die Hinterlegung DSM 18890 betrifft Bacillus subtilis RH 1632, der das Plasmid pTP01 trägt.
  • Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.
  • Beispiele
  • Die molekularbiologischen Arbeiten erfolgten nach Standardmethoden wie zum Beispiel im Handbuch von Sambrook und Russell (2001, Moleular cloning. Cold Spring Harbour Laborstory Press) beschrieben. Verwendete Baukästen (Kits) und Enzyme wurden nach Vorschrift des jeweiligen Herstellers eingesetzt.
  • Beispiel 1: Isolierung des gpsA-Gens aus Bacillus amyloliquefaciens
  • Zur Isolierung des gpsA-Gens wurde chromosomale DNA aus Bacillus amyloliquefaciens (AB Enzymes GmbH Stammsammlung) mittels QIAGEN DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Hilden) präpariert und hierauf das gpsA-Gen über PCR amplifiziert. Hierbei wurden Primer eingesetzt, die stromaufwärts und stromabwärts des gpsA-Gens hybridisieren, so dass das Gen vollständig amplifiziert wurde. Die Primer leiteten sich von den unter Beispiel 2a) über Sequenzierung ermittelten Sequenzen der flankierenden Regionen von gpsA ab. Es wurden für die Amplifizierung folgende Primer verwendet:
    Figure 00270001
  • Das 1591 bp enthaltene DNA-Fragment wurde vollständig über die Methode nach Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) sequenziert. Die verwendeten Sequenzier-Primer sind in Tabelle 1 aufgelistet. Tab. 1: Verwendete Primer für die vollständige Sequenzierung des gpsA-Gens aus Bacillus amyloliquefaciens.
    Figure 00280001
  • Das 1035 bp lange gpsA-Gen und die somit aus 345 Aminosäuren bestehende Glycerin-3-phosphatdehydrogenase ist mit den flankierenden DNA-Regionen in 1 dargestellt.
  • Beispiel 2: Deletion des gpsA-Gens in Bacillus amyloliquefaciens
  • Die Ausschaltung des Gens gpsA auf dem Chromosom von B. amyloliquefaciens wurde mittels eines Deletionsvektors vorgenommen. Die Vorgehensweise folgt der Beschreibung von Vehmaanperä et al. (1991). Als Vektor zur gpsA-Deletion wurde das in derselben Publikation beschriebene Plasmid pE194 ausgewählt. Der Vorteil dieses Vektors besteht darin, dass er einen Temperatur-abhängigen Replikationsursprung besitzt. Bei 28°C kann pE194 in der Zelle replizieren, so dass bei dieser Temperatur zunächst auf eine erfolgreiche Transformation selektiert werden kann. Anschließend werden die Zellen, die den Vektor enthalten, bei 46°C inkubiert. Bei dieser Temperatur repliziert der Vektor nicht mehr und es wird ein Selektionsdruck auf die Integration des Plasmids über einen der beiden homologen Bereiche (stromaufwärts oder stromabwärts von gpsA) in das Chromosom ausgeübt. Eine weitere homologe Rekombination über den anderen (zweiten) homologen Bereich führt dann zur gpsA-Deletion. Möglich wäre auch eine nochmalige Rekombination des ersten homologen Bereichs. Hierbei rekombiniert der Vektor wieder aus dem Chromosom heraus, so dass das chromosomale gpsA-Gen erhalten bliebe.
  • Die Elimination des gpsA-Gens aus dem Genom von Bacillus amyloliquefaciens RH 1330 umfasste folgende Schritte:
  • Schritt 1: Konstruktion des Deletionsvektors
  • Isolation der gpsA flankierenden Regionen aus Bacillus amyloliquefaciens
  • Die chromosomale DNA aus B. amyloliquefaciens RH 1330 wurde nach einer Vorschrift von Sachse (In: Bertram und Gassen, 1991, Gentechnische Methoden. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Jena, New York, 99–100) präpariert.
  • Die gpsA flankierenden Regionen von B. amyloliquefaciens RH 1330 wurden mittels PCR auf chromosomaler DNA amplifiziert. Da die Sequenzen dieser Regionen aus B. amyloliquefaciens nicht zur Verfügung standen, wurden verschiedene Primer aus der bekannten Sequenz der yphC-gpsA-yphE-yphF-Region aus B. subtilis (Datenbank SubtiList (Moszer et al., 1995; 1998) Stand: 18.02.2002) abgeleitet. Die Primer wurden in (in B. subtilis) nicht-codierende Bereiche gesetzt, um die Einführung von Mutationen in Genen innerhalb der flankierenden Regionen des gpsA-Gens zu vermeiden. Aufgrund der besonders niedrigen Sequenzidentität zwischen B. amyloliquefaciens und B. subtilis in diesen nicht-codierenden Bereichen erwies sich die Amplifizierung der das gpsA-Gen flankierenden Regionen durch PCR als schwierig und musste unter sehr milden Bedingungen (niedrige annealing Temperatur, hohe template Konzentration) durchgeführt werden.
  • Für die PCR Amplifizierung der stromaufwärts des gpsA-Gens liegenden Region wurden folgende Primer verwendet:
    Figure 00290001
  • Das PCR Produkt (ALF, 1.4 kbp) wurde in das Plasmid pCR®2.1-TOPO® inseriert (Invitrogen, Carlsbad, US). Das entstandene Plasmid erhielt die Bezeichnung pCC1.
  • Für die PCR Amplifizierung der stromabwärts des gpsA-Gens liegenden Region wurden folgende Primer verwendet:
    Figure 00300001
  • Das PCR Produkt (ARF, 1.2 kbp) wurde in das Plasmid pCR®2.1-TOPO® inseriert.
  • Das entstandene Plasmid erhielt die Bezeichnung pCC2.
  • Einbau der gpsA flankierenden Regionen aus Bacillus amyloliquefaciens in den Vektor pE194
  • Die ALF Region wurde aus dem mit KpnI geschnittenen Plasmid pCC1 isoliert und in das mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnittene Plasmid pCC2 inseriert. In dem entstandenen Plasmid pCC3 liegen die gpsA flankierenden Regionen „head-to-tait" vor.
  • Die gpsA flankierenden Regionen wurden durch Restriktion mit PstI und SacI aus dem Plasmid pCC3 isoliert und in den mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnittenen Vektor pE194 eingebaut. Das entstandene Temperatur-abhängig replizierende Plasmid pCC10 ist der Deletionsvektor. Er wurde durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung bestätigt.
  • Schritt 2: Transformation von B. amyloliquefaciens mit dem Deletionsvektor und Deletion des gpsA-Gens im Chromosom
  • B. amyloliquefaciens RH 1330 wurde mit dem Deletionsvektor über Protoplasten nach der von Chang und Cohen (1979, Mol. Gen. Genet. 168, 111–115) beschriebenen Methode transformiert.
  • Danach erfolgte die Deletion des gpsA-Gens nach dem von Vehmaanperä et al. (1991) beschriebenen Verfahren. Der Deletionsvektor wurde zunächst unter Antibiotikum- und Temperaturdruck durch homologe Rekombination von einer der flankierenden Regionen des gpsA-Gens ins Chromosom integriert. Anschließend wurden die Zellen ohne Selektionsdruck durch Erythromycin gezüchtet, was eine zweite Rekombination zwischen beiden Kopien der zweiten homologen Region ermöglichte und zur Exzision des gpsA tragenden Deletionsvektors führte. Das chromosomal codierte gpsA-Gen wurde auf diese Weise vollständig aus dem Bacillus Genom entfernt.
  • Schließlich wurden die Zellen, bei denen die gewünschten Rekombinationsereignisse stattgefunden hatten, isoliert, indem die Zellen auf ihre Empfindlichkeit gegen Erythromycin und ihre Auxotrophie für Glycerin durch Wachstum auf entsprechenden Agarplatten untersucht wurden.
  • Der isolierte Stamm B. amyloliquefaciens RH 1330 Δ(gpsA) erhielt die Bezeichnung RH 1626. Die Abwesenheit des gpsA-Gens und die Erhaltung der flankierenden Regionen im Chromosom dieses Stammes sowie die Abwesenheit von Antibiotika-Resistenzgenen und anderen Sequenzen aus pE194 wurden durch Sequenzierung und Southern-Blot bestätigt.
  • Beispiel 3: Konstruktion des rekombinanten Expressionssystems
  • Die Konstruktion des rekombinanten Expressionssystems umfasste folgende Schritte:
  • Schritt 1: Insertion des gpsA-Gens in das pUB110-Derivat mit B. amyloliquefaciens Xylanase
  • Das gpsA-Gen wurde mit seiner eigenen ribosomalen Bindungsstelle (RBS) und seinem eigenen Transkriptions-Terminator ausgehend von chromosomaler DNA von B. amyloliquefaciens amplifiziert. Hierzu wurden folgende Primer verwendet:
    Figure 00320001
  • Die Primer wurden so konstruiert, dass stromaufwärts von der RBS eine Ale I-Schnittstelle und stromabwärts des Terminators eine SphI-Schnittstelle in das PCR-Produkt inseriert wurden. Über diese eingeführten Schnittstellen konnte das erhaltene PCR-Fragment anschließend in den Xylanaseexpressionsvektor pIK91 ( EP0585617 ) hinter dem von Zyprian und Matzura (1986) für pUB110 beschriebenen Promotor kloniert werden. Der Vektor pIK91, ein pUB110-Derivat (McKenzie et al., 1986, Plasmid 15, 93–103; McKenzie et al., 1987, Plasmid 17, 83–85), enthält das Gen für die endo-β-1,4-Xylanase (xyl) von Bacillus subtilis, reklassifiziert als Bacillus amyloliquefaciens. Das aus der Klonierung resultierende Plasmid pTP01 (dargestellt in 4) hat eine Größe von 7267 bp und trägt neben den Genen gpsA und xyl ein Kanamycin- und Bleomycin-Resistenzgen. Die Sequenz des entstandenen Plasmids pTP01 wurde durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung bestätigt. Ein Bacillus subtilis-Stamm (1A 247, BGSC; Genotyp: sacU(H), rpsL) wurde mit pTP01 transformiert, wobei zur Transformation kompetente Zellen (Bertram und Gassen, 1991, Gentechnische Methoden. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Jena, New York) verwendet wurden. Der resultierende Stamm erhielt die Bezeichnung RH 1632.
  • Die Expression von aktiver Glycerin-3-phosphatdehydrogenase konnte (entgegen früherer Berichte in der Literatur) im pTP01-tragenden Bacillus-Stamm RH 1632 über den von Morbidoni et al. (1995) und Bergmeyer (1970) beschriebenen Enzymaktivitätstest nachgewiesen werden. Bei diesem Aktivitätstest wird die Änderung der NADH-Konzentration während der von Glycerin-3-phosphatdehydrogenase katalysierten NADH-gekoppelten Umsetzung von Dihydroxyacetonphosphat zu sn-Glycerin-3-phosphat photometrisch verfolgt. Die Abnahme der Extinktion bei 340 nm ist der Konzentrationsabnahme des Substrates proportional. Der Bacillus-Stamm RH 1632 wurde hierbei im Schüttelkolben auf LB broth-Medium (1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl, Leitungswasser, Einstellung des pH-Werts vor der Sterilisation auf pH 7,2) angezogen, die Zellen durch Zentrifugation gewonnen und durch Lysozym aufgeschlossen. Das Zelllysat wurde für den Glycerin-3-phosphatdehydrogenase Aktivitätstest eingesetzt. Unter der Verwendung einer analogen Glycerin-3-phosphatdehydrogenase aus Kaninchenmuskel als Standard konnte gezeigt werden, dass der plasmidtragende Bacillus-Stamm RH 1632 im Vergleich zu B. subtilis 1A 247 eine um 2,0 Units g–1 Zellen Feuchtgewicht höhere Aktivität hat. Bei der Transformante wird also zusätzlich zum chromosomal codierten gpsA-Gen das episomal codierte gpsA-Gen exprimiert.
  • Zur Überprüfung der Komplementierung des auxotrophen GpsA– Bacillus amyloliquefaciens-Stammes RH 1626 (Beispiel 2) über pTP01 wurde der Stamm RH 1626 mit dem Plasmid pTP01 über Protoplasten (nach Chang und Cohen, 1979) transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte über Antibiotikumselektion auf TYE-Agarplatten versetzt mit Xylan und Kanamycin (1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,8% NaCl, 1% Xylan, 10 g/l Kanamycin). Die Komplementierung des auxotrophen B. amyloliquefaciens-Stammes über pTP01 wurde über die Kultivierung auf Minimalmedium (Spizizen Salz (Anagnostopoulos und Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81(5), 741–746) mit 0,7% Glucose und 0,4% Glutamin, Wasser aufberei tet über das Millipore Water System, pH-Wert vor der Sterilisation bei pH 7,2) ohne Zugabe von Glycerin oder G3P nachgewiesen.
  • Schritt 2: Deletion der Antibiotikamarkergene
  • Die Antibiotikaresistenzgene kan und ble wurden vom Plasmid pTP01 (Beispiel 3, Schritt 1) entfernt, indem das gesamte Plasmid ohne die Gene kan und ble durch PCR amplifiziert wurde. Es wurden hierbei Primer verwendet, die an jedem Ende des PCR-Produktes eine SacII-Schnittstelle in das PCR-Produkt inserierten:
    Figure 00340001
  • Das erhaltene PCR-Produkt wurde mit SacII geschnitten, und das Restriktionsprodukt wurde religiert. Protoplasten des B. subtilis-Stammes BGSC 61106 (gol (= gpsA) metC trpC2. Morbidoni et al., 1995) wurden mit dem Ligationsprodukt transformiert. Der Stamm BGSC 61106 fungierte als Zwischenwirt. Eine direkte Transformation des Ligationsproduktes in den auxotrophen GpsA– B. amyloliquefaciens-Stamm RH 1626 (Beispiel 2) war nicht möglich. Die Selektion der Bacillus-Transformanten erfolgte auf Agarplatten bestehend aus Spizizen Salz, 0,7% Glucose und 0,2% Glutamin. Das 5864 bp resultierende Plasmid wurde durch Kartierung und Sequenzierung bestätigt und erhielt die Bezeichnung pTP15 (7).
  • Schritt 3: Erstellung des rekombinanten Expressionssystems
  • Die Isolierung des Plasmids pTP15 aus B. subtilis BGSC 61106 erfolgte über QIAGEN Plasmid MiniprepKit. Der B. amyloliquefaciens-Stamm RH 1626 (ΔgpsA; Beispiel 2) wurde über Protoplasten mit dem Plasmid pTP15 transformiert. Das resultierende Wirt-Nektorsystem, welches ohne das Vorhandensein von Antibiotikaresistenzgenen und ohne Antibiotika im Kulturmedium auskommt, wurde unter der Nummer RH 1810 in der AB Enzymes Stammsammlung registriert. Die Kom plementierung des auxotrophen B. amyloliquefaciens-Stammes durch pTP15 wurde über die Kultivierung auf Minimalmedium (Spizizen Salz mit 0,7% Glucose und 0,4% Glutamin, Wasser aufbereitet über das Millipore Water System, pH-Wert vor der Sterilisation bei pH 7,2) nachgewiesen. RH 1810 wächst im Gegensatz zu RH 1626 auf Minimalmedium. Die Abwesenheit des gpsA-Gens auf der chromosomalen DNA von RH 1810 wurde über PCR durch Verwendung von Primern bewiesen, deren Sequenzen sich aus der flankierenden Region des gpsA-Gens ableiteten. Für den Nachweis wurden folgende Primer verwendet:
    Figure 00350001
  • Zur Überprüfung der Expression des xyl-Gens von RH 1810 wurde die Xylanaseaktivität im Kulturüberstand bestimmt. Dabei wurde der Bacillus-Stamm im Schüttelkolben zweistufig auf verschiedenen Medien gezüchtet. In der ersten Stufe erfolgte die Anzucht unter Selektionsdruck im Minimalmedium (Spizizen Salz mit 0,7% Glucose und 0,4% Glutamin, Wasser aufbereitet über das Millipore Water System, pH-Wert vor der Sterilisation bei pH 7,2). In der zweiten Stufe wurde Komplexmedium mit 5% der ersten Kultur beimpft. Das Medium entsprach folgender Zusammensetzung: 9% Glucidex 12, 2% Maisquellpulver, 1,32% (NH4)2HPO4, 0,05% MgSO4·7 H2O, 0,5% CaCO3, Leitungswasser, Einstellung des pH-Werts vor der Sterilisation auf pH 8,0. Die nach 48-ständiger Inkubation erhaltenen Kulturüberstände wurden zur Bestimmung der Xylanaseaktivität nach nachfolgender Methode verwendet.
  • Die durch enzymatische Spaltung von Xylan freigesetzten Xylanbruchstücke werden photometrisch bei 412 nm bestimmt. 1 Unit entspricht der Enzymmenge, die das Äquivalent von 1 μmol Xylose durch Spaltung aus Xylan in einer Minute bei 30°C unter Standardbedingungen freisetzt. Die Enzymverdünnungen werden mit 0,04 M Natriumacetatpufferlösung, pH 4,5 angesetzt. Der Reaktionsansatz für den Hauptwert besteht aus 0,75 ml einer 0,5%-igen Haferspelzenxylanlösung in 0,04 M Natriumacetatpuffer, pH 4,5 und 0,25 ml entsprechend verdünnter Enzymlö sung. Beim Blindwert werden vor Zugabe der Enzymlösung 4 ml einer Lösung aus 0,5% p–Hydroxybenzoesäurehydrazid (PAHBAH, Firma Janssen Chimica), 0,465% Titriplex III (EDTA, Firma Merck) in 0,5 M NaOH zugegeben, um die Reaktion zu stoppen.
  • Nach der Inkubation von 20 min bei 30°C wird die enzymatische Reaktion im Hauptwert durch Zugabe von 4 ml der gleichen Lösung wie beim Blindwert gestoppt, und die Farbentwicklung durch Inkubation bei 75°C für 30 min durchgeführt. Hauptwert und Blindwert werden gegen Wasser im Photometer bei 412 nm gemessen. Die Auswertung erfolgt durch Kalibrierung mit einer Kalibrierkurve, bei der Xylose als Standard verwendet wird.
  • Bei der Doppelbestimmung der Xylanaseaktivitaten aus Kulturüberständen von RH 1810 wurden Aktivitäten von 153,4 XylH g–1 und 151,1 XylH g–1 gemessen. Die Antibiotikaresistenzgen-freie Xylanaseproduktion zeigte im Schüttelkolben somit eine höhere Produktivität als die Produktion mit RH 6000, bei der Kanamycin als Selektionsdruck verwendet wurde. Im Vergleich erzielte der rekombinante Bacillus-Stamm RH 6000 (RH 1330::pIK91) im Schüttelkolben eine Xylanaseaktivität von nur 57,8 XylH g–1 ( EP 0585617 B1 ).
  • Beispiel 4: Bestimmung der Stabilität des Systems
  • Zur Ermittlung der genetischen Stabilität des gpsA-xyl-tragenden Plasmids in den GpsA– B. amyloliquefaciens Zellen wurde der nach Beispiel 3 erhaltene Stamm RH 1810 in einem Schüttelkolben-Experiment ohne Selektionsdruck in Flüssigmedium untersucht. Hierzu wurde eine Vorkultur von RH 1810 unter Selektionsdruck angezogen, d. h. dass ein Medium verwendet wurde, in dem der auxotrophe B. amyloliquefaciens nicht wachsen kann und in dem weder Glycerin oder G3P noch Edukte von Glycerin oder G3P für den Bacillus-Stamm zugänglich sind. Die Anzucht erfolgte im 150 ml-Erlenmeyer-Schüttelkolben mit jeweils 20 ml Medium. Das Medium der Vorkultur bestand aus folgender Zusammensetzung: Spizizen Salz + 7% Glucidex 12 + 2% Caseinhydrolysat (pH-Wert bei pH 7,2). Die erste Vorkultur wur de über 16 h inkubiert und aus dieser die zweite Vorkultur mit gleicher Medienzusammensetzung beimpft. Nach 8-stündiger Inkubation wurde hieraus die Hauptkultur beimpft. Die Anzucht ohne Selektionsdruck erfolgte im 1 l-Erlenmeyer-Schüttelkolben mit jeweils 150 ml Medium der Zusammensetzung: 9% Glucidex 12, 2% Maisquellpulver, 1,32% (NH4)2HPO4, 0,05% MgSO4·7 H2O, 0,5% CaCO3, Leitungswasser, Einstellung des pH-Werts vor der Sterilisation auf pH 8,0. In diesem Medium ist ein Wachstum des GpsA" Bacillus-Stammes ohne das komplementierende Plasmid pTP15 (Beispiel 3: Schritt 2) möglich. Nach 8 bis 16 Stunden wurde die Kultur mit 5% in jeweils zwei Erlenmeyer-Schüttelkolben mit frischem Medium überimpft, wobei der eine Kolben zur Überimpfung des Folgekolbens diente, und aus dem anderen nach 24-stündiger Kultivierung die Xylanaseaktivität des Kulturüberstands ermittelt wurde. Die Kultivierung erfolgte über fünf Tage und Nächte; hierbei wurden die Hauptkulturen viermal überimpft. Nach jeder Beendigung der Kultivierung wurde die Gesamtzellzahl pro ml Medium bestimmt, um die Plasmidstabilität von pTP15 in RH 1810 über die Generationszahl überprüfen zu können. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 dargestellt. Tab. 2: Plasmidstabilität in den pTP15-tragenden Transformanten von GpsA– Bacillus amyloliquefaciens Zellen RH 1626, nachgewiesen anhand der Xylanaseaktivität über die Generationszahl.
    RH 1810: Bacillus amyloliquefaciens Δ(gpsA)::pTP15
    Akkumulierte Kultivierungsdauer der Hauptkultur [h] Überimpfungsanzahl der Hauptkultur Generationszahl Relative Xylanaseaktivität [%]
    24 1 8 100
    40 2 12 96
    48 3 16 97
    64 4 21 111
    72 5 25 111
  • Wie das Ergebnis in Tabelle 2 zeigt, bleibt die Xylanaseaktivität ohne Selektionsdruck über die 5-fache Dauer einer normalen Fermentation stabil. Dies zeigt sich daran, dass die relative Xylanaseaktivität in Bezug auf die erste Kultur ohne Selektionsdruck, konstant bleibt und sogar leicht weiter ansteigt.
  • Beispiel 5: Herstellung von Xylanase durch Fermentation in einem Bioreaktor mit dem rekombinanten System
  • a) Vorkultur
  • Der Stamm RH 1810 wurde auf Selektionsplatten (Spizizen Salz mit 0,7% Glucose, 0,4% Glutamin und 1% Agar, Wasser aufbereitet über das Millipore Water System, pH-Wert vor der Sterilisation 7,2) angezogen. Die Inkubation erfolgte bei 37°C für mindestens 32 h.
    • 1. Vorkultur: Ein 1 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen mit 150 ml Medium wurde mit RH 1810 von der Agarplatte beimpft. Die Nährlösung hatte folgende Zusammensetzung:
    (NH4)2SO4 2 g l–1
    K2HPO4 14 g l–1
    KH2PO4 6 g l–1
    Na3citrat × 2 H2O 1 g l–1
    MgSO4 × 7 H2O 0,2 g l–1
    Glucidex 12 70 g l–1
    Caseinhydrolysat 20 g l–1
    pH 7,2; Sterilisation 30 min 121°C
  • Die Kultur wurde für 16 Stunden bei 37°C unter Schütteln (150 Upm) inkubiert.
    • 2. Vorkultur: 1 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen wurden mit 150 ml Medium gleicher Zusammensetzung gefüllt und mit 5% der 1. Vorkultur beimpft. Die Kultivierung erfolgt bei 37°C für 8 Stunden.
  • b) Bioreaktor
  • Hauptkultur: 20 l einer Nährlösung aus
    Glucidex 12 90 g l–1
    Maisquellpulver 20 g l–1
    MgSO4 × 7 H2O 0,5 g l–1
    CaCO3 5 g l–1
    (NHa)2HPO4 13,2 g l–1
    pH = 7,2; Sterilisation 30 min 121°C
  • Der Bioreaktor wird mit 5% der 2. Vorkultur beimpft. Kulturbedingungen: 37°C, Belüftung 0,5 vvm, Rühren mit 450 Upm, 48 Stunden. Die Kulturbrühe wurde durch Zentrifugation geklärt und zur Xylanaseaktivitätsbestimmung verwendet. Im Kulturüberstand konnte eine Xylanaseaktivität von 166 XylH g–1 gemessen werden.
  • c) Backversuch
  • Aus 100 Gewichtsteilen Weizenmehl, 2 Gewichtsteilen Salz, 3 Gewichtsteilen Backhefe, 58–60 Gewichtsteilen Wasser und 40–50 ppm (bez. Teiggewicht) Ascorbinsäure wurde in einem Spiralkneter (Fabrikat Diosna) 2–3 min auf niedriger Stufe I und 3–4 min auf höherer Stufe II ein Teig bereitet. Dem Wasser wurden vor Beginn des Knetvorganges die entsprechenden Enzymmengen zugesetzt. Die Teigtemperatur betrug 25°–28°C. Nach einer Teigruhe von 10 min wurde der Teig zur Herstellung von freigeschobenem Weißbrot in 350 g-Teigstücke geteilt. Nach einer weiteren Teigruhe von 20 min wurden die 350 g-Teigstücke geformt, 70 min bei 32°C und 80% relativer Luftfeuchte gegart und 32 min bei 230°C gebacken.
  • Das Volumen der Brote wurde nach deren Auskühlen mit Hilfe eines TexVol Instruments BVM-L370 per Laserabtastung vermessen. Der Mittelwert aller vier Brote aus einem Teigansatz wird bei der Auswertung berücksichtigt.
  • Ergebnis der Backversuche
  • Für Backversuche wurde Kulturüberstand einer Fermentation von RH 1810, die nach den im Beispiel 5a) und b) beschriebenen Bedingungen durchgeführt wurde, eingesetzt. Brote, die nach der erläuterten Rezeptur mit dem erfindungsgemäß hergestellten Enzym gebacken wurden, zeigten folgende Eigenschaften: Tab 3.: Konzentrationsreihe mit der erfindungsgemäß hergestellten backaktiven Xylanase aus RH 1810 im Vergleich zur Xylanase, produziert mit dem rekombinanten Bacillus-Stamm RH 6000 ( EP 0585617 B1 ). Das Volumen der Brote, denen die backaktive Xylanase aus RH 6000 zugesetzt wurde, ist 100%.
    Dosage UXyl je 100 kg Mehl Volumen [%]
    1800 101
    3600 102
    5400 99
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (30)

  1. Expressionssystem zur Produktion eines oder mehrerer Zielpolypeptids/Zielpolypeptide, umfassend eine Wirtszelle, in deren Genom die DNA-Sequenz, die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, inaktiviert oder teilweise oder vollständig deletiert ist und die mit einem extrachromosomalen Element, das eine DNA-Sequenz, die das bzw. die Zielpolypeptid(e) und Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, umfasst, transformiert worden ist, wobei sowohl das Wirtszellgenom als auch das extrachromosomale Element kein Antibiotikaresistenzgen tragen.
  2. Expressionssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das extrachromosomale Element ein Plasmid, ein Phage, ein Phagmid oder ein Transposon ist.
  3. Expressionssystem nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das extrachromosomale Element eine DNA-Sequenz, die der die endogene Glycerin-3-phosphatdehydrogenase der Wirtszelle codierenden DNA-Sequenz entspricht, eine DNA-Sequenz, die eine verwandte Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert oder eine fremde Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, umfasst.
  4. Expressionssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codierende DNA-Sequenz unter der Kontrolle eines schwachen Promotors steht.
  5. Expressionssystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der schwache Promotor der in 7 stromaufwärts des gpsA-Gens liegende Promotor aus dem Plasmid pUB110 ist.
  6. Expressionssystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der schwache Promotor der ptsH-Promotor aus B. subtilis ist.
  7. Expressionssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die endogene Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codierende DNA-Sequenz im Wesentlichen punktgenau und ohne Mutation oder Leserasterverschiebung in den angrenzenden Bereichen deletiert ist.
  8. Expressionssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle von einer gram-positiven Bakterienzelle abgeleitet ist.
  9. Expressionssystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle von einer Zelle der Gattung Staphylococcus, Coynebacterium oder Bacillus abgeleitet ist.
  10. Expressionssystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeich net, dass die Wirtszelle von Bacillus amyloliquefaciens abgeleitet ist.
  11. Expressionssystem nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle Bacillus amyloliquefaciens RH 1626, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer DSM 18878, ist.
  12. Expressionssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle von einer gram-negativen Bakterienzelle abgeleitet ist.
  13. Expressionssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielpeptid ausgewählt ist aus hydrolytischen Enzymen, Pektin-abbauenden Enzymen, proteolytischen Enzymen oder lipolytischen Enzymen.
  14. Vektor zur Komplementierung des Genoms einer Wirtszelle, in dem die DNA-Sequenz, die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, inaktiviert oder teilweise oder vollständig deletiert ist, umfassend eine DNA-Sequenz, die das bzw. die Zielpolypeptid(e) codiert, sowie eine DNA-Sequenz, die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, wobei der Vektor keine Antibiotikaresistenzgene enthält.
  15. Vektor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz, die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, der DNA-Sequenz entspricht, die die endogene Glycerin-3-phosphatdehydrogenase des zu komplementierenden Genoms der Wirtszelle codiert.
  16. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Genom die DNA-Sequenz, die Glycerin-3-phosphatdehydrogenase codiert, deletiert ist und die mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 14 oder 15 transformiert worden ist.
  17. Verfahren zur antibiotikafreien Produktion eines Zielpolypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Expressionssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder eine Wirtszelle nach Anspruch 16 unter Bedingungen zur Expression des Zielpolypeptids züchtet und das so exprimierte Zielpolypeptid isoliert.
  18. Verwendung eines Expressionssystems nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder einer Wirtszelle nach Anspruch 16 zur antibiotikafreien Produktion eines Zielpolypeptids.
  19. DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenaseaktivität codiert, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS-Sequenz ausgewählt ist aus a) DNA-Sequenzen, eine Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, umfassen, b) DNA-Sequenzen, die eine Nucleotidsequenz, wiedergegeben durch die Nucleotide 1338 bis 2375 von SEQ ID NO: 1, umfassen, c) DNA-Sequenzen, die von dem Plasmid pTP01 mit der Plasmidkarte gemäß 4 und hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer DSM 18890 codiert werden, d) DNA-Sequenzen, die für die Proteinsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 codieren, e) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einer der DNA-Sequenzen gemäß a), b), c) oder d) hybridisieren, f) DNA-Sequenzen, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes mit den DNA-/Nucleotidsequenzen gemäß a), b), c), d) oder e) verwandt sind, und g) komplementären Strängen zu den Sequenzen gemäß a) bis f).
  20. DNA-Sequenz nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Bacillus abgeleitet ist.
  21. DNA-Sequenz nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Bacillus amyloliquefaciens abgeleitet ist.
  22. Nucleinsäuresequenz, umfassend ein Analogon einer der Sequenzen gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz ein Polypeptid mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenaseaktivität codiert und a) mindestens 77% Identität zu einer dieser Sequenzen aufweist, oder b) mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisiert, oder c) eine allelische Variante zu einer dieser Sequenzen ist, oder d) ein komplementärer Strang zu einer der Sequenzen gemäß a) bis c) ist, wobei die Sequenz erhältlich ist durch Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Mutation einer oder mehrerer Nucleinsäuren der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1.
  23. Polypeptid mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenaseaktivität ausgewählt aus a) einem Polypeptid, das von dem codierenden Teil einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 19 bis 22 codiert wird, b) einem Polypeptid mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder einer davon abgeleiteten Sequenz, die durch Substitution, Addition und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren daraus erhältlich ist, c) einem Polypeptid mit einer Sequenz, die mindestens 77% Identität zu den Aminosäuren 1 bis 345 von SEQ ID NO: 2 aufweist, d) einem Polypeptid, das von einer Nucleinsäuresequenz codiert wird, die unter stringenten Bedingungen hybridisiert mit (i) den Nucleotiden 1338 bis 2375 von SEQ ID NO: 1, (ii) einer Teilsequenz von (i) aus mindestens 100 Nucleotiden, oder (iii) einem Komplementärstrang von (i) oder (ii), e) einer Variante des Polypeptids mit SEQ ID NO: 2 umfassend eine Substitution, Deletion und/oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren, f) allelischen Varianten zu den Aminosäuresequenzen a) bis e).
  24. Polypeptid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es von Bacillus amyloliquefaciens stammt.
  25. Expressionskonstrukt, umfassend (i) eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 19 bis 22 oder eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 23 oder 24 codiert, in funktioneller Verknüpfung mit (ii) einer oder mehreren Sequenz(en) zur Steuerung der Expression des Polypeptids mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-Aktivität in einer geeigneten Wirtszelle.
  26. Expressionskonstrukt nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz zur Steuerung der Expression des Glycerin-3-phosphatdehydrogenasegens ein konstitutiver Promotor ist.
  27. Expressionskonstrukt nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz zur Steuerung der Glycerin-3-phosphatdehydrogenase-Expression ein schwacher Promotor ist.
  28. Wirtszelle, umfassend ein Expressionskonstrukt nach Anspruch 25.
  29. Verfahren zur Produktion eines Polypeptids mit Glycerin-3-phosphatdehydrogenaseaktivität, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Wirtszelle nach Anspruch 27 unter für die Expression des Polypeptids geeigneten Bedingungen züchtet und anschließend das Polypeptid gewinnt.
  30. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 19 bis 22 zur Erzeugung eines Expressionssystems nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
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