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Hintergrund
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Die Bildung von Aminolävulinsäure (ALA) ist der erste Schritt in der Biosynthese von Tetrapyrrolen oder Porphyrinen wie Chlorophyll, Vitamin B12 oder Häme. Weiterhin wird ALA in der photodynamischen Krebsbehandlung eingesetzt. Bisher wurde ALA in E. coli erzeugt. Hierzu wird jedoch Glukose benötigt (Zhang et al, Scientific Reports, 2015, Nr. 5, Artikelnr. 8584, doi:10.1038/srep/08584).
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Bacillus methanolicus ist ein Gram-positives Bakterium. Ein Wildtyp von B. methanolicus (PB1) ist unter der Accession No. ATCC 51375 beim American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt. B. methanolicus Stamm MGA3 ist ein besonders temperaturtoleranter Stamm, der zuerst aus Erdproben aus Minnesota isoliert wurde und unter Accession No. ATCC 53907 beim ATCC hinterlegt wurde (Heggeset et al, Applied and Environmental Microbiology August 2012, Vol. 78 Nr 15, Seiten 5170–5181).
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B. methanolicus kann C1-Verbindungen, z. B. Methanol, als alleinige Kohlenstoffquelle nutzen. So wurde z. B. genetisch modifiziertes B. methanolicus zur Synthese von 1,5-diaminopentane (Cadaverin) aus Methanol verwendet (Naerdal et al, Microbial Biotechnology, 2015, Nr. 8, Seiten 342–350).
US 6,110,713 beschreibt die Erzeugung von Glutaminsäure aus Methanol mittels B. methanolicus,
EP 2 297 329 beschreibt die fermentative Produktion von Lysin mittels B. methanolicus.
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Methanol als Kohlenstoffquelle hat gegenüber Glukose und anderen Verbindungen, die traditionell als Kohlenstoffquelle in der Biotechnologie eingesetzt werden, den Vorteil nicht in Konkurrenz zur Nahrungsmittelerzeugung für Menschen und Tiere zu stehen und der Preis ist zudem nicht von Faktoren wie Wetter und Agrokulturpolitik abhängig. Zudem kann Methanol auf verschiedenen Wegen einfach hergestellt werden.
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Wie in den meisten Bakterien wird davon ausgegangen, dass die ALA Synthese in B. methanolicus ähnlich wie in B. subtilis, gemäß dem C5-Syntheseweg erfolgt. Dabei wird auf der einen Seite Glutamat mittels Glutamat-tRNA Ligase (GltX) zu Glutamyl-tRNA umgesetzt, gefolgt von der Umsetzung mittels Glutamyl-tRNA Reductase (HemA) zu Glutamat-1-semialdehyd, gefolgt von der Umsetzung mittels Glutamat-1-semialdehyd Aminomutase zu Aminovälurinsäure (ALA). Im Folgenden wird ALA zu Häme umgesetzt.
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Diese Biosynthese erfordert unter anderem in einem ersten Schritt die Kondensation von zwei ALA Molekülen mittels ALA Dehydrogenase (HemB) zu Porphobilinogen (PBG). Aus jeweils vier PBG entsteht im Weiteren mittels PBG Desaminase das Tetrapyrrol Hydroxymethylbilan welches dann durch weitere Schritte zu Vitamin B12, Protohäme oder Chlorophyll umgesetzt werden kann.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von ALA aus anderen Quellen als Glukose. Ein derartiges Verfahren bietet den Vorteil einer einfachen Kohlenstoffquelle, die zudem nicht mit der Nahrungsmittelproduktion konkurriert, wie es z. B. bei Glukose der Fall ist.
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Zusammenfassung
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Ein Aspekt 1 richtet sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Aminolävulinsäure (ALA) aus Methanol in rekombinanten B. methanolicus, wobei das Genom des rekombinanten B. methanolicus mindestens eine rekombinante Nukleotidsequenz umfasst, wovon ein Teil dieser rekombinante Nukleotidsequenz für mindestens ein HemA-Protein kodiert und welches in diesem rekombinanten B. methanolicus produziert wird. Das so produzierte HemA-Protein sollte natürlich HemA-Aktivität aufweisen, also aktiv sein.
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Eine Ausführungsform richtet sich auf ein Verfahren gemäß Aspekt 1 und seiner Ausführungsformen, wobei B. methanolicus Stamm MGA3 ist.
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Eine Ausführungsform richtet sich auf ein Verfahren gemäß Aspekt 1 und seiner Ausführungsformen, umfassend den Schritt Inkubieren von diesen rekombinanten B. methanolicus in einem Nährmedium bei mindestens 40°C, bevorzugt 45°C, wobei das Nährmedium Methanol als Kohlenstoffquelle umfasst.
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Eine Ausführungsform richtet sich auf ein Verfahren gemäß Aspekt 1 und seiner Ausführungsformen, wobei die Nukleotidsequenz eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO. 1 ist, oder
eine Nukleotidsequenz, die mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO. 1 aufweist, oder
eine Nukleotidsequenz, die mit dem Komplemetär von SEQ ID NO. 1 unter hochstringenten Konditionen (0,1 × SSC, 0,1% SDS, 65°C und Waschkonditionen 2 × SSC, 0,1% SDS, 65°C, gefolgt von 0,1 × SSC, 0,1% SDS, 65°C) hybridisiert, oder
die für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 kodiert, oder
für eine Aminosäure kodiert, die mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO. 2 aufweist, mehr bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität mit SEQ ID NO. 2 aufweist, und deren kodierte Aminosäuresequenz dabei die Aktivität einer Glutamyl-tRNA Reductase aufweist
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Eine Ausführungsform richtet sich auf ein Verfahren gemäß Aspekt 1 und seiner Ausführungsformen, wobei die Nukleotidsequenz eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO. 3 ist, oder
eine Nukleotidsequenz, die mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO. 3 aufweist, oder
eine Nukleotidsequenz, die mit dem Komplemetär von SEQ ID NO. 3 unter hochstringenten Konditionen (0,1 × SSC, 0,1% SDS, 65°C und Waschkonditionen 2 × SSC, 0,1% SDS, 65°C, gefolgt von 0,1 × SSC, 0,1% SDS, 65°C) hybridisiert, oder
die für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 4 kodiert, oder
für eine Aminosäure kodiert, die mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO. 4 aufweist, mehr bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität mit SEQ ID NO. 2 aufweist, und deren kodierte Aminosäuresequenz dabei die Aktivität einer Glutamyl-tRNA Reductase aufweist.
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Eine Ausführungsform richtet sich auf ein Verfahren gemäß Aspekt 1 und seiner Ausführungsformen, wobei die mindestens eine rekombinante Nukleotidsequenz einen Promotor-Nukleotidsequenz umfasst und wobei die Promotor-Nukleotidsequenz operativ mit der Nukleotidsequenz, die für mindestens ein HemA-Protein kodiert, verbunden ist.
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Eine Ausführungsform richtet sich auf die vorhergehende Ausführungsform, wobei der Promoter ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus einem Methanol Dehydrogenase Promotor, einem Xylose induzierbaren Promotor und einem Mannitol induzierbaren Promotor.
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Eine Ausführungsform richtet sich auf die vorhergehende Ausführungsform, in dem der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methanol Dehydrogenase Promotor mp gemäß der SEQ ID No.: 20, Xylose induzierbaren Promotor xpx gemäß der SEQ ID No.: 18 und Mannitol induzierbaren Promotor m2p gemäß der SEQ ID No.: 19.
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Eine Ausführungsform richtet sich auf ein Verfahren gemäß Aspekt 1 und seiner Ausführungsformen, wobei die Konzentration an Methanol in dem Nährmedium mindestens 100 mM, bevorzugt im Bereich von 100 mM und 500 mM, beträgt.
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Eine Ausführungsform richtet sich auf ein Verfahren gemäß Aspekt 1 und seiner Ausführungsformen, wobei die Konzentration an Zink-Ionen im Nährmedium im Bereich von 0,002 μM und 0,2 μM liegt.
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Eine Ausführungsform richtet sich auf ein Verfahren gemäß Aspekt 1 und seiner Ausführungsformen, wobei die Inkubationstemperatur mindestens 45°C beträgt.
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Eine Ausführungsform richtet sich auf ein Verfahren gemäß Aspekt 1 und seiner Ausführungsformen, wobei die Inkubationszeit nach Zugabe des Methanol im Bereich von 12 Stunden und 72 Stunden liegt.
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Ein weiter Aspekt 2 richtet sich auf einen Vektor umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein HemA-Protein kodiert, und die operativ verbunden ist mit einer Promotor-Nukleotidsequenz.
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Eine Ausführungsform richtet sich auf einen Vektor gemäß Aspekt 2 umfassend eine Nukleotidsequenz gemäß einer der Ausführungsformen für das Verfahren gemäß Aspekt 1 und ein Nukleotidsequenz gemäß einer der Ausführungsformen für das Verfahren gemäß Aspekt 1, die operativ miteinander verbunden sind.
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Ein weiterer Aspekt richtet sich auf die Verwendung eines rekombinanten B. methanolicus Stamm MGA3 zur Produktion von ALA oder Heme, wobei das Genom des rekombinanten B. methanolicus mindestens eine rekombinante Nukleotidsequenz umfasst, wovon ein Teil dieser rekombinante Nukleotidsequenz für mindestens ein HemA-Protein kodiert und welches exprimiert wird.
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Definitionen
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Der Begriff „überexprimiert” wie hierin verwendet bedeutet, dass die Expression eines Gens (z. B. für ein HemA-Protein kodierend) in einem rekombinanten Mikroorganismus im Vergleich zum Level der Expression des Gens im vergleichbaren, bezogen auf dieses Gen nicht-rekombinanten Mikroorganismus erhöht ist. Ein Beispiel für einen auf HemA-Protein bezogenen nicht-rekombinanten Mikroorganismus ist B. methanolicus Stamm MGA3. Ein anderes Beispiel für einen auf HemA-Protein bezogenen nicht-rekombinanten Mikroorganismus ist z. B. ein rekombinanter Stamm MGA3, dessen Genom jedoch einen bezogen auf eine HemA-Nukleotidsequenz lehren Vektor aufweist. Der Ausdruck „überexprimiert” umfasst in einer Ausführungsform auch die Möglichkeit, dass eine Überexprimierung durch das Einbringen mehrerer Kopien einer HemA-Nukleotidsequenz oder das Einbringen eines oder mehrerer HemA-Nukleotidsequenzen, die nicht einer transkriptionalen Repression unterliegen, z. B. hervorgerufen durch Mutation oder Eliminierung von Erkennungselementen zur transkriptionalen Repression, oder Verwendung von Promotoren, die nicht einer transkriptionalen Regulation unterliegen, die normalerweise in einem Mikroorganismus die Expression von HemA-Genen kontrollieren.
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Genexpression ist hier im Hinblick auf die zusätzlich produzierte Menge Protein zu verstehen, die durch die Verwendung vom im Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden kann. Ein Verfahren zur Bestimmung der Promotoraktivität ist z. B. die Verwendung von Konstrukten umfassend green fluorescence protein (GFPuv), das operativ mit einem Promotor verbunden ist. Die Konstrukte können in B. methanolicus Zellen transformiert werden und mittels flow cytometry die entstehende Menge an GFPuv bestimmt werden. Die so gemessene Fluoreszenzintensivität korrespondiert mit der Genexpressionsrate in den entsprechenden Zellen, die mit dem entsprechenden Promotor operativ verbunden ist. Die Expression kann auch durch Bestimmung und Vergleichen der HemA-Proteinaktivität einer bezogen auf die Produktion von HemA-Protein rekombinanten und einer bezogenen auf die Produktion von HemA-Protein nicht-rekombinanten Kultur bestimmt werden. Z. B. kann nach Extraktion die entstandene Menge an ALA aus beiden Kulturen bestimmt werden. Ggf. muss in einem derartigen Assay HemB inhibiert werden. Alternativ kann nach Extraktion durch Vergleich der Aktivitäten von HemA-Protein des rekombinanten Mikroorganismus mit der des bezogen auf HemA nicht-rekombinanten Mikroorganismus die zusätzliche Aktivität bestimmt werden und so jeweils auf die Expression rückgeschlossen werden.
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Ein Gen oder Gene sind „operativ verbunden” mit einem Promotor, wenn die Expression dieses Gens oder diese Gene durch diesen Promotor ausgelöst wird.
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Der Begriff „Überproduktion” bezieht sich auf die Produktion eines Proteins, die zurückzuführen ist auf die Überexprimierung eines dieses Protein kodierenden, rekombinanten Gens.
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Der Ausdruck „rekombinanter” Mikroorganismus bezieht sich im Sinn der vorliegenden Erfindung auf einen Mikroorganismus, in den durch gentechnische Methoden Nukleotidsequenzen eingebracht wurde.
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Unter „rekombinante” Nukleotidsequenzen im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Nukleotidsequenzen verstanden, die durch gentechnische Methoden in einen (dann rekombinanten) Mikroorganismus eingebracht wurden. In anderen Worten, eine „rekombinante Nukleotidsequenz” im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein artifizielles DNA-Molekül, das in vitro mittels gentechnischer Methoden zusammengesetzt wurde. Ein Beispiel für eine rekombinante Nukleotidsequenz ist ein Plasmid, das z. B. zunächst aus Bakterienzellen isoliert wurde und in das weitere Nukleotidsequenzen eingebaut wurden. Die weiteren Nukleotidsequenzen können dabei aus verschiedenen Organismen stammen oder in vitro synthetisiert worden sein (z. B. mittels chemischer Oligonukleotidsynthese, oder enzymatisch mittels Polymerasekettenreaktion (PCR)). Ein rekombinantes Protein entsteht aus rekombinanter DNA.
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Unter einem „rekombinanten” Protein im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Protein verstanden, dass durch eine rekombinante Nukleotidsequenz kodiert wird und in einem rekombinanten Mikroorganismus (über)exprimiert wird.
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Der Ausdruck „nicht-native Promoter wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Promotor, der nicht ein für B. methanolicus nativer Promotor für ein in B. methanolicus natives HemA-Protein kodierendes Gen (HemA-Gen) ist (also kein nativer, funktionell mit einem nativen HemA-Gen verbundener Promotor). Die Verwendung eines nicht-nativen Promotors kann den positiven Effekt haben, dass transkriptionale Repressionen der Expression von für HemA-Protein kodierenden-Gen(en) nicht zur Geltung kommen, da zumindest einige der Erkennungselemente für eine transkriptionale Repression in dem nativen Promotor liegen können. Ein derartiger Promotor, der Teil einer rekombinanten Nukleotidsequenz ist, kann aus einem anderen Organismus stammen oder aus B. methanolicus stammen, solange er in B. methanolicus als nativer Promotor funktionell nicht mit einem HemA-Gen verbunden ist, also als nativer Promotor in B. methanolicus andere Gene als ein HemA-Gen kontrolliert (nicht nativ bezogen auf ein HemA-Gen in B. methanolicus).
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Ein „HemA-Protein” im Sinn der vorliegenden Erfindung ist ein Protein, dass Glutamyl-tRNA Reduktaseaktivität aufweist. Die Quelle dieses Enzyms bzw. die Quelle für die entsprechende, dieses Enzym kodierende Nukleotidsequenz kann aus jeder bekannten Quelle stammen, einschließlich aus der Literatur bekannter Enzyme und Organismen, die Nukleotidsequenzen aufweisen, die für ein HemA-Protein kodiert. Nicht limitierende Beispiele für HemA-Proteine sind die in hierin verwendeten Proteine mit der SEQ ID No.: 1 und SEQ ID No.: 3.
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Dem Fachmann ist bekannt, dass jegliche Ausführungsformen der hierin beschriebenen Verfahren, Vektoren, Mikroorganismen und Verwendungen untereinander frei kombinierbar sind, solange eine derartige Kombination nicht den Naturgesetzen widerspricht.
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Abbildungen
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zeigt die Erhöhung der Fluoreszenz hervorgerufen durch die Überproduktion eines operativ mit einem mp-Promotor verbundenen GFPuv-Proteins (optimiertes Greenfluorescenceprotein) in B. methanolicus Stamm MGA3. MGA3 (pHT1mp) ist ein rekombinanter B. methanolicus Stamm MGA3 ohne ein operativ mit einem rekombinanten mp-Promotor verbundenes Gen. MGA3 (pTH1mp-gfpuv) ist ein rekombinanter B. methanolicus Stamm MGA3 mit einer operativ mit einer rekombinanten mp-Promotor-Nukleotidsequenz verbundenen, für GFPuv kodierenden, Nukleotidsequenz in Anwesenheit von 200 mM Methanol bzw. 50 mM Mannitol. Die bei Anwesenheit von Mannitol gemessene Fluoreszenz ist dabei abzuziehende Hintergrundfluoreszenz.
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zeigt die Erhöhung der Fluoreszenz hervorgerufen durch die Überproduktion eines operativ mit einem xpx-Promotor verbundenen GFPuv-Proteins in B. methanolicus Stamm MGA3. MGA3 (pTH1mp-gfpuv) ist ein rekombinanter B. methanolicus Stamm MGA3 mit einer für ein GFPuv-Protein kodierenden Nukleotidsequenz, die operativ mit einer rekombinanten mp-Promotor-Nukleotidsequenz verbundenen ist, in Anwesenheit von 200 mM Methanol. MGA3 (pTH1xpx-gfpuv) ist ein rekombinanter B. methanolicus Stamm MGA3 mit einer operativ mit einem rekombinanten xpx-Promotor verbundenen für GFPuv-Protein kodierende Nukleotidsequenz in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an Xylose (0 Gew.%, 0,01 Gew.%, 0,05 Gew.%, 0,1 Gew.%, 0,5 Gew.%, 1 Gew.%, 2 Gew.%, 5 Gew.%) (Anzahl der Experimente: n = 3.
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zeigt die Erhöhung der Fluoreszenz hervorgerufen durch die Überproduktion eines operativ mit einem m2p-Promotor verbundenen GFPuv-Proteins in B. methanolicus Stamm MGA3. MGA3 (pTH1m2p-gfpuv) ist ein rekombinanter B. methanolicus Stamm MGA3 mit einer operativ mit einer rekombinanten für einen m2p-Promotor kodierenden Nukleotidsequenz verbundenen, für ein Gfpuv-Protein kodierenden Nukleotidsequenz in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an Mannitol (0 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM). Die Methanol-Konzentration betrug jeweils 200 mM (Anzahl der Experimente n = 3).
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zeigt die Produktionssteigerung von ALA in rekombinanten B. methanolicus Stamm MGA3 mit pTH1mp-hemA(WT) (5,45 ± 0,72 mg/l) bzw. pTH1mp-hemA(M) (3,93 ± 0,47 mg/l) im Vergleich zu einem rekombinanten B. methanolicus Stamm MGA3 ohne eine operativ an den mp-Promotor verbundenen Nukleotidsequenz kodierend für HemA(WT )-Protein oder HemA(M)-Protein (leerer Vektor) (1,82 ± 0,09 mg/l). (Anzahl der Experimente n = 3)
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zeigt die Produktionssteigerung von ALA in rekombinanten B. methanolicus Stamm MGA3 mit pTH1mp-hemA(WT) bei Zink-Ionen Konzentrationen im Bereich unter 1 μM (0,01 μM, 0,1 μM, 1 μM, 10 μM und 100 μM). Für das Beispiel wurde MVcM-Medium verwendet, in dem die Konzentration der Zink-Ionen variiert wurde. Alle anderen Metallionenkonzentrationen in dem MVcM-Medium gemäß Trace Metal 1000 × wurden konstant gehalten. (Anzahl der Experimente n = 3)
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Sequenzen
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SEQ ID NO.: 1 bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz aus einem wild type von B. methanolicus, die für eine Glutamyl-tRNA Reductase kodiert (HemA
(WT)-Sequenz):
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SEQ ID NO.: 2 bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz aus einem wild type von B. methanolicus, kodiert durch SEQ ID NO.: 1:
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SEQ ID NO.: 3 bezieht sich auf eine mutierte Nukleotidsequenz aus B. methanolicus, die für eine Glutamyl-tRNA Reductase kodiert (HemA
(M)-Sequenz):
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SEQ ID No.: 4 bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz aus B. methanolicus, kodiert durch SEQ ID NO.: 3:
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SEQ ID No.: 5 bezieht sich auf Primer 1 gemäß Tabelle 1 (GFAF):
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SEQ ID No.: 6 bezieht sich auf Primer 2 gemäß Tabelle 1 (GFPR):
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SEQ ID No.: 7 bezieht sich auf Primer 3 gemäß Tabelle 1 (P43F):
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SEQ ID No.: 8 bezieht sich auf Primer 4 gemäß Tabelle 1 (P43R):
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SEQ ID No.: 9 bezieht sich auf Primer 5 gemäß Tabelle 1 (XPFW):
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SEQ ID No.: 10 bezieht sich auf Primer 6 gemäß Tabelle 1 (XPRW):
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SEQ ID No.: 11 bezieht sich auf Primer 7 gemäß Tabelle 1 (GXRW):
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SEQ ID No.: 12 bezieht sich auf Primer 8 gemäß Tabelle 1 (GXXF):
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SEQ ID No.: 13 bezieht sich auf Primer 9 gemäß Tabelle 1 (MGAF):
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SEQ ID No.: 14 bezieht sich auf Primer 10 gemäß Tabelle 1 (MGR2):
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SEQ ID No.: 15 bezieht sich auf Primer 11 gemäß Tabelle 1 (HAMF):
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SEQ ID No.: 16 bezieht sich auf Primer 12 gemäß Tabelle 1 (HAMR):
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SEQ ID No.: 17 bezieht sich auf Primer 13 gemäß Tabelle 1 (HMMF):
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SEQ ID No.: 18 bezieht sich auf die Nukleotidsequenz eines Xylose induzierbarer Promotor (xpx) aus B. megaterium:
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SEQ ID No.: 19 bezieht sich auf die Nukleotidsequenz eines mit Mannitol induzierbarer Promotor (m2p):
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SEQ ID No.: 20 bezieht sich auf die Nukleotidsequenz eines Methanol Dehydrogenase Promotors aus B. methanolicus (mp):
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Detaillierte Beschreibung
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Gelöst wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von Aminolävulinsäure (ALA) aus Methanol in rekombinanten Bakterien, bevorzugt in rekombinanten Gram-positiven Bakterien, noch mehr bevorzugt in rekombinanten B. methanolicus, wobei das Genom des rekombinanten Bakteriums, bevorzugt des rekombinanten Gram-positiven Bakteriums, mehr bevorzugt des rekombinanten B. methanolicus, eine rekombinante Nukleotidsequenz umfasst, wovon ein Teil dieser rekombinante Nukleotidsequenz für mindestens ein HemA-Protein kodiert welche in diesen rekombinanten Bakterien, bevorzugt in diesen rekombinanten Gram-positiven Bakterien, noch mehr bevorzugt in diesen rekombinanten B. methanolicus, exprimiert wird.
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Bevorzugt handelt es sich bei dem Verfahren um ein Verfahren zur Herstellung von Aminolävulinsäure (ALA) aus Methanol in rekombinanten Bakterien, bevorzugt rekombinanten Gram-positiven Bakterien, noch mehr bevorzugt in rekombinanten B. methanolicus, welche eine rekombinante Nukleotidsequenz umfassen, wovon ein Teil dieser rekombinante Nukleotidsequenz für ein HemA-Protein kodiert, und in denen dieses rekombinante HemA-Protein produziert wird, umfassend den Schritt Inkubieren von diesen rekombinanten B. methanolicus in einem Nährmedium bei mindestens 40°C (z. B: im Bereich von 40°C und 70°C, mehr bevorzugt im Bereich von 45°C und 65°C, noch mehr bevorzugt im Bereich von 45°C und 60°C wie z. B. 50 ± 5°C oder 50 ± 4°C), wobei das Nährmedium Methanol als Kohlenstoffquelle umfasst.
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Bevorzugt handelt es sich bei einem erfindungsgemäßen Verfahren um ein Verfahren zur Herstellung von Aminolävulinsäure (ALA) aus Methanol in rekombinanten Bakterien, bevorzugt rekombinanten Gram-positiven Bakterien, noch mehr bevorzugt in rekombinanten B. methanolicus, welche eine rekombinante Nukleotidsequenz umfassen, wovon ein Teil dieser rekombinanten Nukleotidsequenz für ein HemA-Protein kodiert, und in denen diese rekombinante Nukleotidsequenz, die für ein HemA-Protein kodiert, exprimiert wird, und dieses rekombinante HemA-Protein produziert wird, umfassend den Schritt Inkubieren von diesen rekombinanten B. methanolicus in einem Nährmedium bei mindestens 40°C (z. B: im Bereich von 40°C und 70°C, mehr bevorzugt im Bereich von 45°C und 65°C, noch mehr bevorzugt im Bereich von 45°C und 60°C wie z. B. 50 ± 5°C oder 50 ± 4°C), wobei das Nährmedium Methanol als Kohlenstoffquelle umfasst.
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Bevorzugt umfasst die rekombinante Nukleotidsequenz der hier beschriebenen Bakterien zusätzlich eine Promotor-Nukleotidsequenz, die operativ mit mindestens einer rekombinanten Nukleotidsequenz, die für ein HemA-Protein kodiert, verbunden ist.
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Bevorzugt ist die für ein HemA-Protein kodierende Nukleinsequenz eine Nukleotidsequenz hergestellt mit Hilfe von Primern 11/12 (hemA(WT)) oder 13/12 (hemA(M)) gemäß Tabelle 1 aus genomischer DNA von B. methanolicus Stamm MGA3.
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Bevorzugt ist die für ein HemA-Protein kodierende Nukleinsequenz in einem erfindungsgemäßen Verfahren eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No.: 1 oder SEQ ID No.: 3.
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Insbesondere umfasst ein erfindungsgemäßes Verfahren, den Schritt
- – Inkubieren von diesen rekombinanten Bakterien, bevorzugt Gram-positiven Bakterien, noch mehr bevorzugt B. methanolicus, in einem Nährmedium bei einer Inkubationstemperatur von mindestens 40°C, wobei das Nährmedium Methanol als Kohlenstoffquelle umfasst.
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Bevorzugt beträgt die Inkubationstemperatur mindestens 45°C.
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Mehr bevorzugt beträgt die Inkubationstemperatur mindestens 47°C.
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Bevorzugt beträgt die Inkubationstemperatur maximal 70°C.
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Bevorzugt liegt der Temperaturbereich in dem die Bakterien, bevorzugt Gram-positiven Bakterien, noch mehr bevorzugt B. methanolicus, inkubiert wird im Bereich von 40°C und 70°C, mehr bevorzugt im Bereich von 45°C und 65°C, noch mehr bevorzugt im Bereich von 45°C und 60°C wie z. B. 50 ± 5°C oder 50 ± 4°C.
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Bevorzugt liegt die Konzentration des Methanols zu Beginn der Inkubation im Bereich von 50 mM und 500 mM, mehr bevorzugt im Bereich von 100 mM und 500 mM, z. B. im Bereich von 150 mM und 500 mM, im Bereich von 150 mM und 300 mM oder im Bereich von 150 mM und 250 mM.
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Besonders bevorzugt ist das rekombinante Bakterium B. methanolicus.
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Bevorzugt wird der rekombinante B. methanolicus für einen Zeitraum im Bereich von 4 bis 48 Stunden, mehr bevorzugt für einen Zeitraum im Bereich von 12 bis 48 Stunden wie für einen Zeitraum im Bereich von 18 und 48 Stunden oder im Bereich von 18 bis 24 Stunden, inkubiert.
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Entsprechend umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von Aminolävulinsäure (ALA) aus Methanol in einem erfindungsgemäßen rekombinanten B. methanolicus, umfassend den Schritt einfügen einer Nukleotidsequenz in diesen B. methanolicus wobei die Nukleotidsequenz eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein HemA-Protein kodiert und überexprimiert wird, und wobei dieses rekombinante HemA-Protein, dass durch diese Nukleotidsequenz kodiert ist, überproduziert wird.
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Bevorzugt erfolgt die Überexpression in allen erfindungsgemäße Verfahren durch einen operativ mit der Nukleotidsequenz, die für ein HemA-Protein kodiert, verbundenen Promotor-Nukleotidsequenz, die zusammen mit der Nukleotidsequenz, die für ein HemA-Protein kodiert, in das B. methanolicus eingeführt wird.
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In einer Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Verfahren die vier Schritte:
- 1) Inkubieren des rekombinanten B. methanolicus im Bereich von 45°C und 65°C in einem Nährmedium mit einer Anfangsmethanol-Konzentration im Bereich von 20 mM und 500 mM.
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Bevorzugt liegt die Temperatur bei diesem ersten Inkubationsschritt im Bereich von 50 ± 5°C.
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Bevorzugt wird in diesem ersten Schritt für 4 bis 48 Stunden inkubiert, wobei die Inkubation zwischenzeitlich auch unterbrochen werden kann um z. B. das Nährmedium zu modifizieren. Mehr bevorzugt wird in einem ersten Schritt im Bereich von 7 und 18 Stunden wie im Bereich von 9 und 18 Stunden inkubiert, noch mehr bevorzugt im Bereich von 9 und 16 Stunden, wie z. B. im Bereich von 10 und 12 Stunden.
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Bevorzugt liegt die Anfangsmethanol-Konzentration in dem Nährmedium im Bereich von 20 mM und 500 mM, mehr bevorzugt im Bereich von 180 mM und 220 mM wie z. B. 200 ± 5 mM.
- 2) Transferieren der Zellen in ein Nährmedium (b) mit einer Anfangsmethanol-Konzentration im Bereich von 150 mM und 500 mM, wobei das Volumen des Nährmediums (b) mindestens genau so groß ist wie das Volumen des Nährmediums aus Schritt 1).
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„Transferieren” in diesem Zusammenhang bedeutet entweder das Zugeben von Nährmedium zu der existierenden flüssigen Bakterienkultur aus 1), das Zugeben der flüssigen Bakterienkultur aus 1) oder eines Teils der flüssigen Bakterienkultur aus 1) zu einem Nährmedium gemäß 2) (z. B. Abtrenne (eines Teils) der Zellen aus der flüssigen Bakterienkultur aus 1) oder Überführen (eines Teils) der flüssigen Bakterienkultur aus 1) in ein Nährmedium). Wenn erforderlich, kann die Konzentration nach Zugabe des neuen Mediums oder nach Zugabe (eines Teils) der Bakterienkultur aus 1) durch dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden (z. B. gaschromatographisch). Die Methanol-Konzentration kann bereits in dem Nährmedium 2) vorgelegt sein oder während oder nach Mischung des Nährmediums aus 2) mit (einem Teil) der Bakterienkultur aus 1) durch Zugabe von Methanol eingestellt werden. Bevorzugt liegt die Anfangskonzentration der Bakterienkultur in dem neuen Medium in Schritt 2 bei einem OD600-Wert im Bereich von 0,02 bis 0,8, mehr bevorzugt im Bereich von 0,05 und 0,6, noch mehr bevorzugt im Bereich von 0,05 bis 0,4, wie z. B. im Bereich von 0,075 bis 0,25 oder 0,1 und 0,2. Bevorzugt sind die Inhaltsstoffe des Nährmediums dieselben wie in dem Nährmedium im ersten Schritt mit der Abweichung, dass die Methanol-Konzentration ggf. höher ist. Bevorzugt liegt die Anfangsmethanol-Konzentration des Nährmediums im zweiten Schritt im Bereich von 200 ± 50 mM, wie 200 mM.
- 3) Inkubieren des rekombinanten B. methanolicus im Bereich von 45°C und 65°C in dem Nährmedium mit einer Anfangsmethanol-Konzentration im Bereich von 150 mM und 500 mM, z. B. 200 ± 50 mM, wie 200 mM, bis eine OD600 von mindestens 1, bevorzugt eine OD600 von mindestens 3, mehr bevorzugt eine OD600 in einem Bereich von 5 und 12 erreicht ist.
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Bevorzugt liegt die Inkubationstemperatur im Bereich von 50 ± 5°C.
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Bevorzugt liegt die Dauer der Inkubation im Bereich von 8 und 48 Stunden, wie z. B. im Bereich von 10 und 28 Stunden oder im Bereich von 24 und 26 Stunden.
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Bevorzugt erfolgt die Inkubation bis ein OD600-Wert im Bereich von 1 bis 12, bevorzugt im Bereich von 3 bis 10, mehr bevorzugt im Bereich von 5 und 9 erreicht ist.
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Bevorzugt handelt es sich bei den Bestandteilen des Nährmediums in Schritt 2) und 3) (mit Ausnahme der Methanol-Konzentration) um dieselben Bestandteile des Nährmediums wie in Schritt 1, z. B. ein MVcMY Medium.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Volumen des Nährmediums in Schritt 2) bzw. 3) mindestens doppelt, mindestens dreifach, mehr bevorzugt mindestens vierfach oder mindestens fünffach größer als das Volumen des Nährmediums in Schritt eins.
- 4) Abstoppen der Reaktion, z. B. durch Absinken der Methanol-Konzentration in dem Nährmedium z. B. durch Verbrauch durch die Bakterien oder durch Verdünnung des Mediums.
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Eine bevorzugte Ausführungsform richtet sich auf ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Überexpression von einer für ein HemA-Protein kodierenden Nukleotidsequenz in einem rekombinanten B. methanolicus durch einen mit dieser für ein HemA-Protein kodierenden Nukleotidsequenz operativ verbundenen, bevorzugt für das HemA-Gen in B. methanolicus nicht-nativen, Promoter erreicht wird. Jedoch ist nicht jeder Promotor geeignet HemA-Nukleotidsequenzen in B. methanolicus überzuexprimieren. Promotor p43, ein konstitutiv in B. subtilis exprimierter Promotor, der z. B. mit Hilfe der Primer 3/4 gemäß Tabelle 1 aus pTHp43-gfpuv gewonnen werden kann, ist ein Beispiel für einen ungeeigneten Promotor.
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Bevorzugte Promotoren sind hingegen
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- – Methanol Dehydrogenase Promotoren, z. B. ein Methanol Dehydrogenase Promotor aus B. methanolicus (mp). Plasmide mit einem mp-Promotor (ein die Expression von für Methanol Dehydrogenase kodierende nukleotidsequenzenkontrollierender Promotor in B. methanolicus, der jedoch nicht nativ für HemA-Protein kodierende Nukleotidsequenzen in B. methanolicus ist) können z. B. mit Hilfe des Plasmids pTH1mp-lysC hergestellt werden. pTH1mp-lysC und mittels Pcil hergestellte Vektor pTH1mp sind z B. in Brautaset et al. (2010, Appl. Microbiol Biotechnol 87: 951–964) beschrieben. Ein bevorzugter mp-Promotorweist die SEQ ID No.: 20 auf,
- – mit Xylose induzierbare Promotoren, z. B. ein mit Xylose induzierbarer Promotor (xpx) aus B. megaterium gemäß SEQ ID No.: 18,
- – mit Mannitol induzierbare Promotoren, z. B. ein mit Mannitol induzierbarer Promotor (m2p) gemäß SEQ ID No.: 19
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Besonders bevorzugt sind mit Xylose induzierbare Promotoren wie z. B. ein xpx Promotor gemäß SEQ ID No.: 18.
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Durch Einsatz eines mp Promotors lässt sich in B methanolicus, bevorzugt B. methanolicus Stamm MGA3, bei Anwesenheit von Methanol die Expression eines operativ mit diesem Promotor verbunden Gens, z. B. einer HemA-Nukleotidsequenz oder GFPuv-Nukleotidsequenz, um mindestens einen Faktor 1,5 erhöhen verglichen mit nichtmethanolotropen Bedingungen (siehe auch methanol vs mannitol).
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Bevorzugt liegt die Konzentration von Methanol im Nährmedium in einem erfindungsgemäßen Verfahren bei mindestens 10 mM, mehr bevorzugt bei mindestens 20 mM, noch mehr bevorzugt bei mindestens 30 mM bzw. bei mindestens 100 mM oder mindestens 150 mM.
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Bevorzugt beträgt die Konzentration an Methanol im Nährmedium in einem erfindungsgemäßen Verfahren bei mindestens 10 mM, mehr bevorzugt bei mindestens 100 mM, noch mehr bevorzugt bei mindestens 30 mM und beträgt maximal 800 mM, mehr bevorzugt maximal 500 mM, wie z. B. maximal 300 mM oder maximal 250 mM.
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Durch Einsatz eines mit Xylose induzierbare Promotors, bevorzugt eines xpx Promotors, besonders bevorzugt eines xpx Promotors gemäß SEQ ID No.: 18, lässt sich in B. methanolicus, bevorzugt B. methanolicus Stamm MGA3, bei Anwesenheit von Xylose die Expression eines operativ mit diesem Promotor verbunden Gens, z. B. HemA-Nukleotidsequenz oder GFPuv-Nukleotidsequenz, um mindestens einen Faktor 10 (zehn), mehr bevorzugt um mindestens einen Faktor 30 (dreißig) erhöhen verglichen mit B. methanolicus, bevorzugt B. methanolicus Stamm MGA3, in einem Medien ohne Xylose bzw. verglichen mit einem (rekombinanten) B. methanolicus, bevorzugt B. methanolicus Stamm MGA3, in dem kein Gen operativ mit einem rekombinanten Promotor verbunden ist (siehe auch ).
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Bevorzugt liegt die Konzentration von Xylose in einem Nährmedium für einen rekombinanten B. methanolicus, bevorzugt B. methanolicus Stamm MGA3, umfassend einen Xylose induzierbaren Promotor in einem Bereich von 0,01 Gew.% jeweils bezogen auf das Medium bis 3 Gew.%, mehr bevorzugt in einem Bereich von 0,75 Gew.% und 2,5 Gew.%, noch mehr bevorzugt in einem Bereich von 0,1 Gew.% und 2 Gew.%
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Durch Einsatz eines m2p Promotors lässt sich in B. methanolicus, bevorzugt B. methanolicus Stamm MGA3, bei Anwesenheit von Mannitol die Expression eines operativ mit diesem Promotor verbunden Gens um mindestens einen Faktor 6 erhöhen verglichen mit Medien ohne Mannitol (siehe ).
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Bevorzugt liegt die Konzentration von Mannitol in einem Nährmedium für einen rekombinanten B. methanolicus, bevorzugt B. methanolicus Stamm MGA3, umfassend einen Mannitol induzierbaren Promotor in einem Bereich von 20 mM und 150 mM, mehr bevorzugt von 25 mM und 100 mM.
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Als Nährmedium kann jedes für B. methanolicus geeignete Nährmedium verwendet werden. Nährmedien für Gram-positive Bakterien und insbesondere B. methanolicus sind hinreichend bekannt (siehe z. B. Brautaset et al. ((2007) Appl. Microbiol. Biotechnol., 74: 22–34).
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Bevorzugt umfasst das Nährmedium außer Xylose oder Mannitol maximal 20 Gew.%, mehr bevorzugt maximal 10 Gew.%, noch mehr bevorzugt maximal 5 Gew.% weitere Kohlenstoffquellen bezogen auf die Konzentration an Methanol in dem Nährmedium.
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Bevorzugt umfasst das Nährmedium neben Methanol maximal 5 Gew.%, mehr bevorzugt maximal 3 Gew.%, noch mehr bevorzugt maximal 2,5 Gew.%, besonders bevorzugt maximal 2 Gew.% Xylose oder Mannitol als weitere Kohlenstoffquellen bezogen auf das Nährmedium.
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Durch ein erfindungsgemäßes Verfahren ist eine Produktionssteigerung von ALA in rekombinanten B. methanolicus, bevorzugt B. methanolicus Stamm MGA3, das einen Vektor umfassend einen Promotor Nukleotidsequenz und eine operativ damit verbundene Nukleotidsequenz kodierend für ein HemA-Protein umfasst, zu erreichen (siehe ).
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In einer bevorzugten Ausführungsform liegt dabei die Konzentration an Zink-Ionen in einem Nährmedium, besonders bevorzugt Zn2 +-Ionen, in einem Nährmedium zu Beginn der Inkubationszeit eines rekombinanten B. methanolicus im Sinn der vorliegenden Erfindung im Bereich von 0,002 μM und 0,2 μM, mehr bevorzugt im Bereich von 0,005 μM und 0,15 μM, wie z. B. im Bereich von 0,01 μM und 0,1 μM (siehe ).
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Eine bevorzugte Ausführungsform richtet sich auf ein Verfahren oder ein rekombinanten B. methanolicus, wobei die rekombinante Nukleotidsequenz, die vom Genom des rekombinanten B. methanolicus umfasst ist,
eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO. 1 ist, oder
eine Nukleotidsequenz, die mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO. 1 aufweist, mehr bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität mit SEQ ID NO. 1 aufweist, und deren kodierte Aminosäuresequenz dabei die Aktivität einer Glutamyl-tRNA Reductase aufweist, oder
eine Nukleotidsequenz, die mit dem Komplemetär von SEQ ID NO. 1 unter hochstringenten Konditionen (0,1 × SSC, 0,1% SDS, 65°C und Waschkonditionen 2 × SSC, 0,1% SDS, 65°C, gefolgt von 0,1 × SSC, 0,1% SDS, 65°C) hybridisiert, oder
für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 kodiert, oder
für eine Aminosäure kodiert, die mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO. 2 aufweist, mehr bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität mit SEQ ID NO. 2 aufweist, und deren kodierte Aminosäuresequenz dabei die Aktivität einer Glutamyl-tRNA Reductase aufweist
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Eine weitere bevorzugte Ausführungsform richtet sich auf ein Verfahren oder ein rekombinantes B. methanolicus, wobei die Nukleotidsequenz, die vom Genom des rekombinanten B. methanolicus umfasst ist, eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO. 3 ist, oder
eine Nukleotidsequenz, die mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO. 3 aufweist, mehr bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität mit SEQ ID NO. 3 aufweist, und deren kodierte Aminosäuresequenz dabei die Aktivität einer Glutamyl-tRNA Reductase aufweist, oder
eine Nukleotidsequenz, die mit dem Komplemetär von SEQ ID NO. 3 unter hochstringenten Konditionen (0,1 × SSC, 0,1% SDS, 65°C und Waschkonditionen 2 × SSC, 0,1% SDS, 65°C, gefolgt von 0,1 × SSC, 0,1% SDS, 65°C) hybridisiert, oder
für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 4 kodiert, oder
für eine Aminosäure kodiert, die mindestens 80% Identität mit SEQ ID NO. 4 aufweist, mehr bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität mit SEQ ID NO. 2 aufweist, und deren kodierte Aminosäuresequenz dabei die Aktivität einer Glutamyl-tRNA Reductase aufweist.
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Bevorzugt beträgt die Glutamyl-tRNA Reductase Aktivität einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität mit SEQ ID NO. 1 kodiert ist, jeweils mindestens 50%, mehr bevorzugt mindestens 60% der Aktivität einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO. 1 kodiert ist.
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Bevorzugt beträgt die Glutamyl-tRNA Reductase Aktivität einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität mit SEQ ID NO. 3 kodiert ist, jeweils mindestens 50%, mehr bevorzugt mindestens 60% der Aktivität einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO. 3 kodiert ist.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt die Glutamyl-tRNA Reductase Aktivität einer Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität mit SEQ ID NO. 2 aufweist, jeweils mindestens 50%, mehr bevorzugt mindestens 60% der Aktivität einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt die Glutamyl-tRNA Reductase Aktivität einer Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität mit SEQ ID NO. 4 aufweist, jeweils mindestens 50%, mehr bevorzugt mindestens 60% der Aktivität einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 4.
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Sequenzidentität kann durch jede bekannte Methode bestimmt werden, jedoch sind für die Bestimmung des Grades der Identität von Sequenzen Computerprogramme nützlich. Vielfältige Sequenzabgleiche und %-Identität Kalkulationen können mit Hilfe von Standard BLAST Parametern durchgeführt werden (Verwendung von Sequenzen aller verfügbarer Organismen, Matrix BLOSUM 62, gap costs: existence 11, extension1). Alternativ kann das Program Align Plus 4, Version 4.10 (Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite) mit folgenden Parametern genutzt werden: DNA comparison: Global comparison, Standfaard Linear Scoring Matrix, Mismatch Penalty = 2, Open Gap Penalty = 4, Extend Gap Penalty = 1/Amino Acid Comparison: Global Comparison, BLOSUM 62 Scoring Matrix.
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Eine weitere bevorzugte Ausführungsform richtet sich auf einen rekombinanten B. methanolicus, wobei die rekombinante Nukleotidsequenz, die vom Genom des rekombinanten B. methanolicus umfasst ist, neben mindestens einer der Nukleotidsequenzen SEQ ID No.: 1 oder 3 eine Promotor-Nukleotidsequenz umfasst, bevorzugt eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No.: 18, 19, oder 20.
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Die gewünschten Nukleotidsequenzen können durch Verfahren zur Einführung von Genen oder Nukleotidsequenzen, die in der der Technik gut bekannt sind und vielfach in der Literatur beschrieben sind, in ein gewünschtes Bakterium, bevorzugt B. methanolicus, eingefügt werden. Das Gen (die Nukleotidsequenz) kann unter Verwendung eines Vektors, der ein autonom-replizierenden Vektor oder ein Vektor, der das Gen (die Nukleotidsequenz) in das Wirtsgenom integriert (z. B. Chromosom). Das Gen (die Nukleotidsequenz) die exprimiert werden soll kann somit zunächst in einen Expressionsvektor eingebracht werden und der Expressionsvektor kann dann in die Wirtszelle eingeführt werden. Verfahren zur Konstruktion von Expressionsvektoren und das Einbringen dieser Expressionsvektoren in Wirtszellen sind in der Technik gut bekannt. Bevorzugt kann eine Nukleotidsequenz kodierend für ein HemA-Protein unter Verwendung eines Plasmidvektors und eines Wirtsmikroorganismus, bevorzugt B. methanolicus, z. B. durch Elektroporation transformiert werden. Verfahren zur Einführung von Nukleotidsequenzen und Vektoren in Mikroorganismen sind allgemein bekannt und vielfach in der Literatur beschrieben. Die Wahl des Verfahrens kann von dem verwendeten Mikroorganismus abhängig. Gemäß Brautaset et al., 2007 (supra) sind Verfahren um Gene in B. methanolicus einzubringen und geeignete Plasmide etc. zur Verwendung in solchen Verfahren bekannt und in der Technik einsetzbar. Insbesondere seien Vektoren basierend auf dem B. subtilis Shuttle-Plasmid pHP13 wie in Jakobsen et al. ((2006) J. Bacterid., 188(8): 3063–3072) beschrieben oder Plasmide PDQ503, PDQ507, PDQ508 und PEN1, wie in Cue et al. ((1997) Appl. Environ. Microbiol., 63: 1406 bis 1420).
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Um ALA durch einen modifizierten (rekombinanten) Wirtsorganismus gemäß dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren zu produzieren kann der Wirtskörper unter Bedingungen vermehrt und kultiviert werden, die es erlauben, dass ALA unter Verwendung eines geeigneten Eduktes wie Methanol zu produzieren. Die Wirtszellen kann also in Gegenwart des Substrats oder einer Quelle für das Substrat, z. B. in einem Wachstumsmedium enthaltend das Substrat oder zu dem das Substrat hinzugefügt wurde, kultiviert werden. Verfahren und Bedingungen für den Anbau von B. methanolicus, sind bekannt und in der Technik beschrieben und sind in der Beispielsektion Beispiel 1 unten veranschaulicht. Das Substrat oder Kohlenstoffquelle, die für die ALA-Produktion verwendet wird, kann jedes geeignete Substrat der Wahl sein und hängt vom Mikroorganismus ab, der verwendet wird. Bevorzugt ist das Substrat kein Zucker sondern C1-Verbindungen (z. B. Methanol oder Methan), organische Säuren (z. B. Acetate), Aminosäuren (z. B. Glutamat) und komplexe Edukte wie Molasse oder Proteinhydrolysate. Somit können geeignete Substrate die in der Technik bekannten Poly- oder Monosaccharide (z. B. Glucose) ersetzen. Das Substrat kann in gereinigter oder ”isoliert” Form oder als Teil eines rohen oder unraffiniertes oder teilweise raffiniertes Gemisch, beispielsweise ein Nebenprodukt eines anderen gewerblichen oder industriellen Verfahrens, bereitgestellt werden. Im Falle eines methylotroph wie B. methanolicus kann Methanol als Substrat verwendet werden.
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Generell können verschiedene Stämme von B. methanolicus neben Methanol auch andere Kohlenstoffquellen benutzen wie Zucker, z. B. Mannit, Glucose, Maltose, Ribose, Acetat, Glutamat, α-Ketoglutarat (Schendel et al. ((1992) Appl. Environ. Microbiol., 58(9): 2806–2814)), Methanol ist jedoch bevorzugt. B. methanolicus strain MGA3 kann jedoch lediglich Mannitol, Glukose, Arabitol und Methanol verwerten. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können Mischungen aus Methanol und Mannitol als Substrat verwendet werden.
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Entsprechend richtet sich eine weitere Ausführungsform auch auf ein erfindungsgemäßes Verfahren, in dem statt Methanol Mannitol als Substrat eingesetzt wird.
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Des Weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf einen Vektor, bevorzugt einen pTH1 Vektor, umfassend ein Insert, wobei das Insert eine Nukleotidsequenz kodierend für einen Promotor gemäß den hierin beschriebenen bevorzugten Promotoren und eine Nukleotidsequenz kodierend für ein HemA-Protein umfasst.
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Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung auch einen rekombinanten Mikroorganismus, bevorzugt ein Gram-positives Bakterium, mehr bevorzugt B. methanolicus, wobei das Genom des rekombinanten B. methanolicus mindestens eine rekombinante Nukleotidsequenz umfasst, wovon ein Teil dieser rekombinante Nukleotidsequenz für mindestens ein HemA-Protein kodiert und welches in dem Mikroorganismus exprimiert wird.
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Bevorzugt umfasst die rekombinante Nukleotidsequenz eine Promotor-Nukleotidsequenz, die operativ mit der rekombinanten Nukleotidsequenz, die für mindestens ein HemA-Protein kodiert, verbunden ist. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um eine bevorzugte Promotor-Nukleotidsequenz wie hierin beschrieben. Beispiel 1 Material und Methoden Verwendete Primer 1:
Nr. | Name | Primer
Sequenz | Annealing
T [°C] | Länge
[bp] | Produkt |
1 | GFAF | SEQ ID No.: 5 | 50 | 791 | Gfpuv (fw) |
2 | GFPR | SEQ ID No.: 6 | 50 | 791 | Gfpuv (rw) |
3 | P43F | SEQ ID No.: 7 | 52 | 100 | Promotor p43 (fw) |
4 | P43R | SEQ ID No.: 8 | 52 | 100 | Promotor p43 (rw) |
5 | XPFW | SEQ ID No.: 9 | 50 | 6072 | pTH1xpx für Gibson Assembly (fw) |
6 | XPRW | SEQ ID No.: 10 | 50 | 6072 | pTH1xpx für Gibson
Assembly (fw) |
7 | GXRW | SEQ ID No.: 11 | 50 | 813 | Gfpuv für pTH1xp (rw) |
8 | GXXF | SEQ ID No.: 12 | 50 | 813 | Gfpuv für pTH1xp (fw) |
9 | MGAF | SEQ ID No.: 13 | 50 | 258 | Promotor m2p (fw) |
10 | MGR2 | SEQ ID No.: 14 | 50 | 258 | Promotor m2p (rw) |
11 | HAMF | SEQ ID No.: 15 | 50 | 1391 | HemA(WT) MGA3 (fw) |
12 | HAMR | SEQ ID No.: 16 | 50 | 1391 | HemA(WT) and HemA(M)
MGA3 (rw) |
13 | HMMF | SEQ ID No.: 17 | 50 | 1397 | HemA(M) MGA3 (fw) |
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Folgende Plasmide wurden hergestellt und in B. methanolicus Zellen transformiert:
Konstrukt | Name | Überexpression | Promotor |
I | pTH1mp-HemA(WT) | hemA(WT) | Methanol induzierter Promotor aus B. methanolicus (nicht nativ für HemA-Protein kodierende Nukleotidsequenzen aus B. methanolicus) |
II | pTH1mp-HemA | hemA | Methanol induzierter Promotor aus B. methanolicus |
III | pTH1mp-gfpuv | gfpuv | Methanol induzierter Promotor aus B. methanolicus |
IV | pTH1p43-gfpuv | gfpuv | P43 aus B. subtilis, konstitutiv in B. subtilis expressioniert |
V | pTH1xpx-gfpuv | gfpuv | Xylose induzierter Promotor mit einer RBS Sequenz aus B. megaterium |
VI | pTH1m2p-gfpuv | gfpuv | Mannitol induzierter Promotor mit einer RBS aus B. methanolicus |
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Plasmid und Konstrukte
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Für alle Tests wurde Vektor pTH1mp verwendet. Der Vektor ist ein modifiziertes pHP13 Plasmid. pHP13 ist in Haima et al., 1987 beschrieben. Der Vektor pTH1mp wurde z. B. in Markert et al. (BMC Microbiology, 2014, 14:7: 1–11) beschrieben. Der Vektor pTH1 mp besitzt ein Resistenzgen gegen Chloramphenicol.
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Plasmidaufreinigung
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Isolierung des Plasmids pTH1mp aus E. coli DH5α Kulturen erfolgte durch GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) bei 25°C. E. coli DH5α mit dem entsprechenden Plasmid wurden mit Lysislösung des Miniprep Kits versetzt und 5 min. inkubiert. Die Lyse wurde durch Zugabe von Neutralisationslösung des Miniprep Kits gestoppt, bei 13.000 rpm zentrifugiert, und der Überstand auf eine Spin-Column des Miniprep Kits gegeben und für 1 min zentrifugiert. Nach zweimaligem Waschen mit Waschlösung wurde die Plasmid DNA mit Wasser eluiert. Die Konzentration der DNA wurde mittels Nanodrop ND-1000 Spektrophotometer bestimmt.
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Amplifizierung der Inserts
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Zum Amplifizieren der Inserts für die Plasmidkonstrukte wurde ein PCR-Kit von Biotechrabbit verwendet. Folgendes Protokoll zur PCR (50 μl Reaktion; 10 μl 5 PCR Helper, 5 μl 10 × Pfu Reaction buffer, 1 μl 10 mM dNTP Mix, je 1,5 μl Forward/Reverse-Primer, 1 μl DNA-Template, 1 μl Pfu DNA Polymerase (2,5 u/μl), 29 μl Wasser) wurde verwendet:
Schritt | Temperatur [°C] | Zeit |
Initiale Denaturierung | 95 | 2 min |
Denaturierung | 95 | 0,5 min |
Primer-Annealing | 45–68 (abhängig von Primern) | 0,75 min |
Extension | 72 | 2 min/kb |
Finale Extension | 72 | 10 min |
Lagerung | 4 | |
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Folgende PCR Produkte zur Konstruktion von Plasmiden wurden hergestellt
Genprodukt (als Insert) | Primer | Template | Länge | Annealing-T
[°C] |
gfpuv | 1/2 (GFAF/GFPR) | pTH1 mp-gfpuv | 791 | 50 |
Promotor p43 | 3/4 (P43F/P43R) | pTH1 p43-gadB | 100 | 52 |
pTH1xpx für Gibson Assembly | 5/6 (XPFW/XPRW) | pTH1xp | 6072 | 50 |
gfpuv für pTH1xpx (RBS like xp) | 7/8 (GXRW/GXXF) | pTH1 mp-gfpuv | 813 | 50 |
Promotor m2p | 9/10 (MGAF/MGR2) | MGA3 gDNA | 258 | 55 |
hemA(WT) | 11/12 (HAMF/HAMR) | MGA3 gDNA | 1391 | 50 |
hemA(M) | 12/13 ((HAMR/HMMF) | MGA3 gDNA | 1397 | 50 |
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Restriktion der Plasmid-DNA
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Die Plasmide wurden mit Restriktionsenzym von Thermo Scientific (2 μl Puffer 10 x, 2 μl Restriktionsenzym, 1 μg Plasmid DNA, 20 l Wasser) bei 37°C für 3 h verdaut. Die folgenden Restriktionsenzyme wurden verwendet
Plasmid | Restriktionsenzym | Puffer | Insert | Produkt |
pTH1mp | BamHI/Pcil | Puffer G | HemA(WT) | pTH1mp-hemA(WT) |
pTH1mp | BamHI/Pcil | Puffer G | HemA(M) | pTH1mp-hemA(M) |
pTH1mp | BamHI/Pcil | Puffer G | gfpuv | pTH1mp-gfpuv |
pTH1mp-gfpuv | HindIII/Spel | Green FD Puffer | Promotor 43 | pTH1p43-gfpuv |
pTH1xp für
Gibson
Assembly | | | gfpuv | pTH1xpx-gfpuv |
pTH1mp-gfpuv mit RBS | | | Promotor
m2p | pTHm2p-gfpuv |
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DNA Aufreinigung
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Die Amplifizierten PCR Produkte, aus Agarosegelen extrahierte DNA und verdaute DNA wurden mit einem Kit von Macherey und Nagel GmbH, Deutschland nach einem Standardverfahren aufgereinigt.
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Plasmid Ligation und Insert via Gibson Assembly
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Die Reaktion erfolgte bei 50°C für 60 min. in einer Lösung aus 0,64 μl T5 Exonuklease, 20 μl Phusion High Fidelity DNA Polymerase, 160 μl Taq DNA Ligase, 700 μl Wasser und 320 μl IRB (IRB = wässrige Lösung mit 500 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 50 mM DTT, 5 mM NAD, 1 mM dNTPs, 25 Gew.% PEG8000).
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Transformation von Konstrukten in B. methanolicus MGA3
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Herstellung von elektro-kompetenten Zellen von B. methanolicus MGA3
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50 ml B. methanolicus (OD600 0,05) in SOBsuc Medium (0,25 mM Saccharose, 2 Gew.% Tryptone, 0,5 Gew.% Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO4) wurden zentrifugiert (4000 rpm, 25°C, 10 min) in 9 ml EPB (1 mM Hepes, 25 Gew.% PEG 8000) resuspendiert und erneut zentrifugiert. Der EPB Überstand wurde verworfen. Das Pellet aufgeteilt und 20 Aliquots bei –80°C gelagert.
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Transformation von B. methanolicus MGA3 via Elektroporation
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Ein Aliquot kompetenter B. methanolicus MGA3 wurden aufgetaut und in einer Elektroporationsküvette mit 1 μg Plasmid versetzt, 30 min auf Eis gekühlt und anschließend in 10 ml eines auf 50°C vorgewärmten SOBsuc Mediums gegeben. Die Elektroporation erfolgte bei 200 Ω, 25 μF, 2,5 kV mi einer Zeitkonstante von 4,7 bis 5,0 s. Die Zellen wurden für 16 h bei 50°C und 200 rpm inkubiert.
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Anschließend wurden die Zellen in 5 ml SOBsuc Medium für 6 h inkubiert und dann in 50 ml SOBsuc Medium mit 5 μg/ml Chloramphenicol transferiert, und für weitere 16 Stundent inkubiert. Danach werden die Zellen zentrifugiert und auf SOBsuc-Platten mit 5 μg/ml Chloramphenicol ausplatiert und für 24–48 h bei 50°C inkubiert.
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Produktion von ALA aus Methanol
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Gewachsene Kolonien wurden in 10 ml vorgewärmten MVcMY Medium (1 l MVcM Broth Medium, 1 ml MVcM Complete Vitamins 1000 x, 1 ml einer 1 M wässrigen MgSO4-Lösung, 1 ml MVcM BPTI Trace Metals 1000 x) mit Methanol versetzt (Endkonzentration Methanol in MVcMY Medium: 30 mM). Nach 8 h Inkubation bei 50°C und 200 rpm wurden weitere 69 μl Methanol bis zu einer Endkonzentration von 200 mM zugegeben.
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Die Übernachtkultur wurde in 50 ml MVcMY Medium mit 200 mM Methanol weiter inkubiert bis eine OD500 im Bereich von 1,0 und 1,5 erreicht wurde. Je 10 ml Kultur wurden mit 2 ml Glycerol (86%) versetzt, in 1 ml Aliquots aufgeteilt und eingefroren.
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Messung von ALA
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Zur Bestimmung der ALA Konzentration wurde 1 ml Zellkulturüberstand einer entsprechenden Zellkultur mit 1 ml Acetatpuffer und 0,2 ml Ethylacetoacetat versetzt und für 10 min. auf 100°C erhitzt. Dabei kondensieren ALA und Ethylacetoacetat zu 2-Methyl-3-carbethoxy-4-(3-propionsäure)-pyrrol. Nach Abkühlen wurden 3 ml Ethylacetat zugegeben und das Produkt extrahiert. Die Konzentration des Pyrrols wurde nach Zugabe eines modifizierten Ehrlich's Reagenz (P-Dimethylaminobenzaldehyd) kalorimetrisch bei 552 nm bestimmt. Pro Messung wurde jeweils eine Blindprobe mitvermessen. Eine Standardkurve (1 mg/l, 5 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l) wurde mittels einer wässrigen ALA Lösung (Sigma company) erstellt. Die Kalibrierungskurve war im Bereich von 1 mg/l bis 20 mg/l linear. Die Konzentration an Pyrrol entsprach der Konzentration an ALA in den jeweiligen Proben.
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Bestimmung der Promotor Aktivitäten durch flow cytometry
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Zur Bestimmung der Promotoraktivitäten in B. methanolicus wurden Konstrukte aus Promotor und dem GFPuv-Gen verwendet. Die Fluoreszenzintensität von GFPuv in entsprechend präparierten Zellkulturen wurde mittels flow cytometry bestimmt.
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Rekombinante B. methanolicus enthaltend Plasmide mit dem GFPuv-Gen wurden unter dem Einfluss verschiedener Promotoren jeweils in 50 ml MVcMY Medium mit 5 μg/ml Chloramphenicol angeimpft und 12 h inkubiert. Dann wurden die Kulturen in frisches MVcMY Medium transferiert. Das Volumen der Kulturen wurde anschließend so eingestellt, dass die finale OD500 0,15 betrug. Nach Kultivierung für 6 Stunden bei 50°C wurde anschließend bei 37°C für zwei Stunden inkubiert. Proben wurden bei 13000 g für 5 min. bei 4°C zentrifugiert, zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und anschließend darin resuspendiert bis die OD600 0,3 betrug.
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Die Fluoreszenz wurde in einem Flow Cytomete (Becton Dickinson) mittels Kaluza for Gallios Acquisition Software 1.0 bestimmt. Das Fluoreszenz Emissionssignal wurde mit einem 450/50 BP bandpass Filter (FL9) für GFPuv und mit einem 620/30 BP bandpass (FL3) für mCherry gesammelt. Die darauf folgende Datenanalyse wurde mittels Kaluza Analysis Software 1.3 durchgeführt.
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Rekombinante B. methanolicus Stämme mit jeweils den folgenden Inserts wurden hergestellt und vermessen:
pTH1mp |
pTH1mp-hemA(WT) |
pTH1mp-hemA(M) |
pTH1mp-gfpuv |
pTH1p43-gfpuv |
pTH1xpx-gfpuv |
pTH1m2p-gfpuv |
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 6110713 [0003]
- EP 2297329 [0003]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Zhang et al, Scientific Reports, 2015, Nr. 5, Artikelnr. 8584, doi:10.1038/srep/08584 [0001]
- Heggeset et al, Applied and Environmental Microbiology August 2012, Vol. 78 Nr 15, Seiten 5170–5181 [0002]
- Brautaset et al. (2010, Appl. Microbiol Biotechnol 87: 951–964) [0084]
- Brautaset et al. ((2007) Appl. Microbiol. Biotechnol., 74: 22–34 [0093]
- Brautaset et al., 2007 [0106]
- Jakobsen et al. ((2006) J. Bacterid., 188(8): 3063–3072) [0106]
- Cue et al. ((1997) Appl. Environ. Microbiol., 63: 1406 bis 1420) [0106]
- Schendel et al. ((1992) Appl. Environ. Microbiol., 58(9): 2806–2814) [0108]
- Haima et al., 1987 [0114]
- Markert et al. (BMC Microbiology, 2014, 14:7: 1–11) [0114]