KR101694461B1

KR101694461B1 - 분자 진화에 의해 수득된 안전성 균주 유래 효소 및 그를 포함하는 안전성 코리네박테리움 글루타미쿰

Info

Publication number: KR101694461B1
Application number: KR1020150056001A
Authority: KR
Inventors: 김필; 나윤아
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2015-04-21
Filing date: 2015-04-21
Publication date: 2017-01-23
Also published as: KR20160125170A

Abstract

본 발명은 안전성이 보장된 GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래의 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(Phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPck 또는 PCK)의 ADP 매개 활성을 증가시키는 분자 진화, 그에 의해 수득된 세포내 ATP 수준이 증가된 고에너지 코리네박테리움 글루타미쿰 균주, 및 그를 이용한 안전성이 보장된 목적 산물의 생산 방법 및 세포의 성장 속도를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

분자 진화에 의해 수득된 안전성 균주 유래 효소 및 그를 포함하는 안전성 코리네박테리움 글루타미쿰{GRAS strain-derived enzyme obtained by molecular evlution and GRAS Corynebaterium glutamicum having the same}

본 발명은 한국연구재단 글로벌프론티어 사업의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다.

[과제고유번호: NRF-2012M3A6A8054887, 과제명: GRAS기준 세포에너지 활용한 선충퇴치제 내성 바이오시스템의 개발]

포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제 (Phosphoenolpyruvate carboxykinase, PCK)는 옥살아세트산(Oxalacetate)을 포스포에놀피루브산(Phosphoenolpyruvate)으로 전환시키는 가역 반응을 매개하는 효소로, 이때 조효소로 아데노신 삼인산(Adenosine-5' triphosphate, ATP) 혹은 구아노신 삼인산(Guanosine-5' triphosphate, GTP)을 사용한다. 도 1은 PCK가 매개하는 가역 반응을 도시한다. PCK에 의해 촉매되는 반응은 가역적이므로, CO₂가 존재하는 조건에서 PCK는 PEP로부터 OAA를 생성하는 반응을 촉매하면서 1 분자의 ATP 또는 GTP를 생산한다. 따라서, 해당(glycolysis) 경로에서 동일한 반응을 촉매하는 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase, PPC)와 달리, PCK에 의한 반응이 증가되면 세포내 ATP 또는 GTP 생산 및 농도가 높아질 수 있다. PCK가 GDP가 아닌 ADP를 조효소로 사용하도록 개량하고, 세포 내에서 PCK를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나, 또는 PCK를 코딩하는 유전자가 해당 경로에서 발현될 수 있도록 조절 서열을 변화시키거나, 또는 PCK의 활성을 증가시키는 것에 의해 PCK에 의한 ATP 생성을 증가시킬 수 있다.

해당(glycolysis) 경로에 관여하는 효소는 본래 포도당이 부족할 때 포도당 신생합성을 촉진하기 위해 발현되는 효소이다. 이전에 본 발명자들은 대장균에서 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 인위적으로 과발현시키고 고농도의 포도당을 제공하면 역반응 활성으로 작용하여 세포 내 ATP가 50% 증가함을 발견하였다 (Yeong-Deok Kwon, Sang Yup Lee, Pil Kim. 2008. 72(4):1138-41). 또한, 이러한 방식으로 구축한, 세포내 ATP 농도가 높은 고에너지 세포에서 숙신산과 외래 단백질의 생산성이 증가함을 밝혔다(Pil Kim, Maris Laivenieks, Claire Vieille, J Gregory Zeikus. 2004. Applied and Environmental Microbiology. 70(2):1238-41; Hye-Jung Kim, Yeong Deok Kwon, Sang Yup Lee, Pil Kim. 2011. Applied Microbiology and Biotechnology; 94(4):1079-86).

그러나, 대장균은 그에 의해 제조된 목적 산물에 LPS(lipopolysaccharide) 등의 세균성 항원이 잔존할 수 있어 추가적인 안전성 검증이 요구되는 비 GRAS 균주이다. 균주에 의해 생산된 유용한 목적 산물을 추가적인 과정 없이 사람을 포함한 동물에서 이용할 수 있기 위해서는 안전성이 인정되는 GRAS 균주에서의 생산이 요구된다. 이에, 본 발명자들은 GRAS 균주로 안전성이 보장된 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하여 목적 산물을 효율적으로 생산할 수 있는 균주 및 목적 산물의 생산 방법에 대한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 GRAS 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 야생형 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)의 GDP 의존성 포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 전환 활성이 ADP 의존성으로 변경된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 높은 세포내 ATP 농도를 갖는, 안전성이 보장된 GRAS 코리네박테리움 글루타미쿰을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 높은 세포내 ATP 농도를 갖는, GRAS 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하여, 안전성이 보장된 목적 물질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 야생형 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)의 GDP 의존성 포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 전환 활성이 ADP 의존성으로 변경된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 도입에 의해 세포의 성장 속도를 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

전술된 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 양태는 야생형에 비해, 포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 ADP(Adenosine diphosphate) 의존성 전환 활성이 증가된, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)를 제공한다.

포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 도 2에 기재된 바와 같이, 해당(glycolysis)에서 글루코오스로부터 생성된 포스포에놀피루베이트(PEP)를 옥살로아세테이트로 전환시키는 단계를 매개하는 효소로서, 이 과정에서 GDP 또는 ADP를 조효소로 사용한다. 목적 물질의 생산을 위해, 세포 내의 ATP 생산 수율 및 농도를 증가시키기 위해서는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제가 ADP를 조효소로 이용하는 ADP 의존성이 요구된다. GRAS 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 포스포에놀피루브산에서 옥살아세트산으로의 반응 매개 시 조효소로 GDP를 우세하게 사용하는 효소이며, GDP에 대한 활성이 ADP 대비 5배 정도 높다. 따라서, 세포내 ATP 생산수율 또는 농도를 증가시키기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 GDP 의존성을 ADP 의존성을 개선하는 분자 진화(molecular evolution)를 수행하여, ADP 의존성이 높은, 즉, ADP를 주로 조효소로 이용하는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 수득하였다.

본 명세서에서 사용된 용어, "GRAS(Generally Recognized As Safe)"는 경험과 훈련을 거친 전문가들이 과학적 절차를 통해 물질의 의도된 사용조건 하에서 안전성을 평가하였을 때 안전하다고 판단하는 물질을 의미하며, 안전성과 동의어로 사용될 수 있다. GRAS 제도는 미국만이 가지고 있는 독특한 제도로서 안전성이 높은(일정한 사용 조건하에서) 식품·식품화학물질에 적용되지만 그 인식이 미국 내 뿐만 아니라, 국제적으로도 인식되고 점차적으로 확산되고 있다.

본 명세서에서 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제와 관련하여 사용된 용어, "GDP 의존성" 및 "ADP 의존성"은 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제가 포스포에놀피루베이트 카르복시산을 옥살아세트산으로 전환시키는 반응에서 각각 GDP 및 ADP를 조효소로 이용하는 것을 의미하며, "GDP 매개" 및 "ADP 매개"와 동의어로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "분자 진화"는 유전정보를 갖는 DNA의 염기서열이나 단백질의 아미노산 서열 등 분자 구조의 특징에 기반한 진화를 의미하며, 인위적으로 유전자나 단백질에 변화를 유발하는 과정 및 그에 의한 결과를 포함한다.

본 명세서에서 세포 또는 균주와 관련하여 사용된 용어, "고에너지"는 세포내 ATP 농도가 높다는 것을 의미한다.

코리네박테리움 글루타미쿰의 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 조효소로 GDP를 우세적으로 사용하는 GDP 의존성 효소이나, ADP 의존성을 갖도록 개량하기 위해 실수 유발 중합효소연쇄반응(Error-prone PCR)을 이용한 무작위 돌연변이유발(Random mutagenesis)을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 이들 돌연변이들 중 ADP 매개 효소 비활성(Specific activity)이 유의성 있게 높아진 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 선별하는 분자 진화를 통해 개량된 PCK, 52-C10, 13-C4, 및 52-G5를 수득하였다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 서열번호 1의 136번 위치의 T(thymine)가 C(cytosine)로 치환되고, 588번 위치의 A(adenine)가 G(guanine)로 치환된 서열에 의해 코딩되고, 서열번호 2의 46번 Trp(tryptophan)가 Arg(arginine)으로 치환된 서열을 갖는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 서열번호 1의 733번 위치의 G가 A로 치환된 서열에 의해 코딩되고, 서열번호 2의 245번 Gly(glycine)이 Arg(arginine)으로 치환된 서열을 갖는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 서열번호 1의 342번 위치의 C가 결실된 서열에 의해 코딩된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 야생형에 비해 ADP 의존성이 증가된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 도 1에 도시된 바와 같이, 포스포에놀피루베이트 카르복시산의 옥살아세트산으로의 전환에서 ADP를 ATP로 전환시키므로 세포내 ATP 생산수율이나 농도의 증가에 기여할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 야생형 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 서열번호 1에 코딩된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제일 수 있다.

본 발명의 일 양태는 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖도록 변형시키는 단계를 포함하는, 세포의 성장 속도를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포는 모세포 대비 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)를 코딩하는 유전자의 발현이 세포내 ATP 농도를 증가시키도록 변형된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포에서 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)를 코딩하는 유전자의 발현은 모세포에 비해 과발현되거나 또는 해당 경로에서 발현되도록 조절되어 세포내 ATP 농도를 증가시키도록 변형된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키거나 또는 상기 유전자의 발현 조절 서열 또는 코딩 서열을 변형시키는 것에 의해 세포내 ATP 농도를 증가시키도록 변형된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포는 야생형 대비, 포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 ADP(Adenosine diphosphate) 의존성 전환 활성이 증가된, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자를 세포에 도입하는 것에 의해 변형된 것일 수 있다.

포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 ADP 의존성 활성이 증가된, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자를 도입한 재조합 세포는 유전자를 도입하기 전의 모세포(parent cell)에 비해 세포내 ATP 농도가 높고, 증가된 성장 속도를 보인다.

상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 서열번호 1의 136번 위치의 T(thymine)가 C(cytosine)로 치환되고, 588번 위치의 A(adenine)가 G(guanine)로 치환된 서열에 의해 코딩되고, 서열번호 2의 46번 Trp(tryptophan)가 Arg(arginine)으로 치환된 서열을 갖는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포는 박테리아, 효모, 진균, 식물 세포 또는 동물 세포일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 도입은 형질전환 또는 형질감염을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 일 양태는 야생형 대비, 포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 ADP 의존성 전환 활성이 증가된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 갖는, 모균주에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 제공한다.

본 명세서에서, "모균주"는 돌연변이 또는 재조합 방법과 같은 분자생물학 기법에 의해 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)를 코딩하는 유전자가 변형되어, 모균주에 비해 그의 활성이 변화되어, 예를 들면, ADP 의존성이 강화되어, 세포내 ATP 생성 수율 또는 농도가 증가되기 전의 균주를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 야생형 대비, 포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 ADP 의존성 전환 활성이 증가된, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자가 형질전환 또는 형질도입을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 외래 유전자를 도입하는 방법에 의해 도입된 균주일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 서열번호 1의 136번 위치의 T가 C로 치환되고 서열번호 1의 588번 위치의 A가 G로 치환된 서열(cgl2863-52-C10)에 의해 코딩된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 갖는 것인 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 서열번호 1의 733번 위치의 G가 A로 치환된 서열(cgl2863 -13- C4)에 의해 코딩된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 갖는 것인 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 서열번호 1의 342번 위치의 C가 결실된 서열(cgl2863 -52- G5)에 의해 코딩된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 갖는 것인 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 모균주에 비해, 개량된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 cgl2863 -52-C10의 발현 증가에 의해, 또는 상기 발현에 의해 생성된 효소 활성의 증가에 의해, 세포 내 ATP 양이 증가하는 효과를 보일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 모균주에 비해, 개량된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 cgl2863 -13-C4의 발현 증가에 의해, 또는 상기 발현에 의해 생성된 효소 활성의 증가에 의해, 세포 내 ATP 양이 증가하는 효과를 보일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 모균주에 비해, 개량된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 cgl2863 -52-G5의 발현 증가에 의해, 또는 상기 발현에 의해 생성된 효소 활성의 증가에 의해, 세포 내 ATP 양이 증가하는 효과를 보일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 모균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032일 수 있다.

본 발명의 일 양태는 야생형 대비, 포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 ADP 의존성 전환 활성이 증가된, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 갖는, 모균주에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 목적 물질을 생산하기에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는, 목적 물질을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 배양하는 단계 전에 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰에 목적 물질을 코딩하는 유전자를 외부로부터 도입하거나 또는 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 대사 경로를 목적 물질을 생산하도록 유전적으로 변형시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 물질은 단백질, 아미노산, 핵산, 항생제, 또는 대사산물일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 유래된 것일 수 있다.

본 명세서에서, "목적 물질"은 본 발명의 일 구체예에 따른 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 물질을 의미하며, 단백질, L-아미노산, 핵산, 항생제, 비타민, 생리활성 물질, 대사산물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서, "목적 물질을 생산하도록 유전적으로 변형시키는"은 미생물에 목적 물질의 생합성을 위해 필요한 유전자를 외부로부터 도입시키거나 또는 세포의 게놈 상에 존재하는 목적 물질의 생성에 관여하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 목적 물질의 생성을 방해하거나 또는 목적 물질의 분해에 관여하는 유전자의 발현을 억제 또는 제거하여 세포를 목적 물질을 생산하기에 유리한 상태로 변형시키는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 목적 물질을 생산하는 방법은 재조합 코리네박테리움 속 미생물을 목적 물질을 생산하기에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함한다.

상기 세포를 배양하는 단계는 당업계에 알려진 적합한 배지와 배양 조건 하에 수행될 수 있다. 목적 물질을 생산하기에 적합한 조건은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 목적 물질 및 세포에 따라 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들면, 외부로부터 도입된 목적 물질을 코딩하는 유전자의 발현을 위해 유도(induction)가 필요한 경우, 상기 세포를 배양하는 단계는 유전자의 발현을 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다. 배양은 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 목적 물질을 생산하는 방법은 세포의 배양액으로부터 목적 물질을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 배양물로부터 목적 물질을 회수하는 단계는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 목적 물질의 분리를 위해 원심분리, 여과, 크로마토그래피, 결정화 등의 방법이 이용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 발명의 일 구체예에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 포스포에놀피루베이트의 옥살아세트산으로의 ADP 의존성 반응을 매개하는 활성이 야생형에 비해 높고, 이 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 GRAS 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰에서 발현시켜 수득된, 세포내 ATP 수준이 높은 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하면, 높은 세포내 ATP 농도가 유전자 발현, 생합성, 물질 수송 등을 증진시키므로 단백질, 대사산물 등을 포함한 유용하고, 안전한 목적 물질을 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 반응을 나타낸 모식도이다.
도 2는 대장균에서 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)와 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(PPC)에 의해 촉매되는 반응을 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 고에너지 코리네박테리움 글루타미쿰(+52-C10, +13-C4, 및 +52-G5)과 대조군(C. glutamicum, +WT PEPck)의 세포 내 ATP 농도이다. "+"는 대조군 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)에 각각 WT PEPck, 개량된 PCK 52-C10, 13-C4, 및 52-C5가 도입되었다는 것을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른, 라이신 외부 수송 단백질이 동시 발현된 고에너지 코리네박테리움 글루타미쿰과 대조군의 세포 외부로 수송된 라이신의 농도이다.
도 5a 내지 5e는 각각 플라스미드 pSL360(pSK1CatP180), pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -52-C10), pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -13- C4), pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -52- G5), 및 pSL(P ₁₈₀ - lysE)의 구조를 도시한다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 CgPck52-C10과 대조군의 성장곡선을 도시한다.

실시예 1. 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 분자진화에 의한 개량

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032 유래 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)가 포스포에놀피루베이트의 옥살아세테이트로의 탈인산화 반응시 인산기를 수용하는 조효소로 GDP가 아닌 ADP를 야생형보다 잘 사용하도록, 즉 ADP 의존성을 갖도록 개량하기 위해 PCK를 코딩하는 유전자(cgl2863 , GenBank ID: BA000036.3, 서열번호 1)를 대상으로 분자진화를 수행하였다.

T7 프로모터 조절 하의 pET28a (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)와 조합된 야생형 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 유전자 cgl2863을 주형으로 하여 실수 유발 중합효소연쇄반응(Error-prone PCR)을 이용한 무작위 돌연변이유발(Random mutagenesis)을 수행하였다. 실수 유발율(Error-rate)은 1 kb당 2.7개 염기이며, 중합효소연쇄반응에 사용한 정방향 및 역방향 프라이머는 T7 프로모터(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3': 서열번호 5) 및 T7 터미네이터 프로모터(5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3': 서열번호 6)였다. 실수 유발 PCR을 통해 10,520개로 이루어진 돌연변이 라이브러리를 구축하고, ADP 매개 활성이 개선된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 선별하기 위해, 하기와 같이 ADP 매개 활성의 측정 및 선별을 수행하였다.

분석대상인 돌연변이 단백질을 파쇄하고, 그 용액을 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제 효소 기질인 포스포에놀피루베이트, ADP, MgSO₄와 50 mM의 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES, Acros organics-Thermo Fisher Scientific, Geel, Belgium) (pH 7.0) 완충 용액을 혼합한 용액에 넣고, 10분 동안 반응시켰다. ADP에서 ATP로 전환되는 양이 증가한 돌연변이를 선별하기 위해, 기질 반응이 완료된 용액 100 ㎕와 Adenosine 5'-triphosphate (ATP) Bioluminescent Assay Kit for ATP Quantitation (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, CA)에서 제공하는 ATP 측정 시약 100 ㎕을 혼합하고, 수득된 용액에서, 루미노미터(1420 multilabel counter VICTOR3, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 발광을 측정하였다. 측정된 발광 정도가 야생형과 비교하여 높은 돌연변이를 골라내어, ADP 매개 활성이 높은 돌연변이를 선별하였다.

또한, 선별된 돌연변이들의 보다 정확한 활성 측정을 위해 말산 탈수소효소 결합 활성 측정(Malate Dehydrogenase Coupling Assay)를 수행하였다. 이는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 반응에 의해 생성된 옥살아세트산의 양을 정량하기 위한 방법으로서, 말산 탈수소효소는 옥살아세트산을 말산으로 전환하는 효소이다. 이 과정에서 NADH(Diphosphopyridine nucleotide, reduced form)를 조효소로 사용하는데, 이때 일정량의 NADH 조효소를 첨가해 주고, NADH 감소량을 340 nm에서 흡광도를 측정하여 옥살아세트산의 농도를 추정할 수 있다. 전술된 바와 같이 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 효소 기질 반응 후, 기질 반응액 100 ㎕와 Malic dehydrogenase (Malic Dehydrogenase from porcine heart, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, CA) 5 U, NADH(β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, CA) 0.14 mM을 혼합하고 20분간 반응시켰다. 이후, 340nm에서 흡광도를 측정하여 기질 반응액의 옥살아세트산의 양을 추정하였다. 이때 옥살아세트산(Oxaloacetate, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, CA)을 표준 물질로 사용하여 옥살아세트산 농도별로 NADH의 감소량 표준 곡선을 작성하여 추정하였다.

이를 통해, ADP 매개 활성이 개선된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제 52-C10, 13-C4, 및 52-G5을 선별하였다.

52-C10의 ADP 기질에 대한 효소 비활성은 0.231 mmole-옥살아세트산/mg-단백질/min, 13-C4의 ADP 기질에 대한 효소 비활성은 0.221 mmole-옥살아세트산/mg-단백질/min, 52-G5의 ADP 기질에 대한 효소 비활성은 0.201 mmole-옥살아세트산/mg-단백질/min으로 측정되었다. 이는 야생형의 효소 비활성인 0.153 mmole-옥살아세트산/mg-단백질/min에 비해 각각 51%, 44%, 및 15% 증가한 것이다. 하기의 표 1은 활성 측정 결과를 정리한 것이다.

CgPck	ADP 기질	야생형 대비 활성	GDP 기질	야생형 대비 활성
야생형	0.153 ±0.010	1	0.749 ±0.058	1
52-C10	0.231 ±0.021	1.51	0.407 ±0.015	0.54
13-C4	0.222 ±0.010	1.44	0.231 ±0.031	0.31
52-G5	0.201 ±0.017	1.15	0.150 ±0.071	0.20

서열 분석(바이오메딕, 부천, 대한민국)을 통해 52-C10, 13-C4, 및 52-G5의 서열을 확인하였다.

52-C10의 경우 유전자의 서열 변화는 2개로, 서열번호 1의 136번 위치의 T가 C로 치환되고, 588번 위치의 A가 G로 치환되었으며(cgl2863 -52- C10), 아미노산 서열의 변화는 1개로, 서열번호 2의 46번 Trp(tryptophan)이 Arg(arginine)으로 치환되었다.

13-C4의 경우는 유전자의 서열 변화는 1개로, 서열번호 1의 733번 위치의 G가 A로 치환되고(cgl2863 -13- C4), 아미노산의 서열 변화는 1개로, 서열번호 2의 245번 Gly(Glycine)이 Arg(Arginine)으로 치환되었다.

52-G5의 경우는 서열번호 1의 342번 C(Cytosine)가 결실되어 개방 해독 프레임이 변경되었고(cgl2863 -52- G5), 서열번호 3의 아미노산 서열을 가졌다.

실시예 2. 개선된 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 발현을 통한 세포 내 에너지가 증가한 코리네박테리움 글루타미 쿰 제조

세포 내 ATP 양이 증가한 코리네박테리움 글루타미쿰을 제조하기 위해, 실시예 1에서 수득된 개선된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 유전자(cgl2863 -52- C10)를 갖는 플라스미드로 형질전환시킨 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 CgPck52-C10을 하기와 같이 제조하였다. 동일한 방법으로 cgl2863 -13- C4를 갖는 플라스미드로 형질전환시킨 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 CgPck13-C4, cgl2863 -52- G5를 갖는 플라스미드로 형질전환시킨 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 CgPck52-G5를 제조하였다.

2-1. CgPck52 - C10 균주의 제조

(1) cgl2863 -52- C10를 포함하는 재조합 플라스미드 작제

실시예 1에서 수득된, 개선된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 유전자(cgl2863 -52- C10)를 PstI으로 처리하고, 고려대학교 이흥식 교수로부터 기탁받은, P180 프로모터 조절 하의 pSL360(pSK1CatP180) (Park Soo-Dong, Sang-Nam Lee, Ik-Hyun Park, Jong-Su Choi, Wol-Kyu Jeong, Younhee Kim and Heung-Shick Lee, 2004, J. Microbiol. Biotechnol. 14(4), 789-795)을 PstI으로 처리한 후, 이들을 라이게이션하여 pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -52- C10)을 작제하였다. 도 5a 및 5b는 각각 pSL360(pSK1CatP180) 및 pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -52- C10)의 구조를 도시한다.

작제된 재조합 플라스미드 pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -52- C10)를 PstI에 의한 처리에 의해 생성된 DNA 단편(1.9kb와 6.4kb)의 확인 및 서열분석(바이오메딕, 부천, 대한민국)에 의해 확인하였다.

(2) pSL(P ₁₈₀ cgl2863 -52- C10)에 의한 형질전환

상기 (1)에서 작제된 pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -52- C10)를 Electro Cell Manipulator -ECM630(BTX Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, USA)을 이용하여 전기 천공에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 형질전환시켜, cgl2863 -52-C10을 발현하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032/pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -52-C10)를 제조하였다.

2-2. CgPck13 - C4 균주의 제조

(1) cgl2863 -13- C4 를 포함하는 재조합 플라스미드 작제

실시예 1에서 수득된, 개선된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 유전자(cgl2863-13- C4)를 PstI으로 처리하고, P180 프로모터 조절 하의 pSL360(pSK1CatP180) (Park Soo-Dong, Sang-Nam Lee, Ik-Hyun Park, Jong-Su Choi, Wol-Kyu Jeong, Younhee Kim and Heung-Shick Lee, 2004, J. Microbiol. Biotechnol. 14(4), 789-795) 또한 PstI으로 처리한 후, 이들을 라이게이션하여 pSL(P ₁₈₀ -cgl2863-13-C4)을 작제하였다. 도 5c는 pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -13- C4)의 구조를 도시한다.

작제된 재조합 플라스미드 pSL(P ₁₈₀ cgl2863 -13- C4)를 PstI에 의한 처리에 의해 생성된 DNA 단편(1.9kb와 6.4kb)의 확인 및 서열분석(바이오메딕, 부천, 대한민국)에 의해 확인하였다.

(2) pSL(P ₁₈₀ cgl2863 -13- C4)에 의한 형질전환

상기 (1)에서 작제된 pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -13- C4)를 Electro Cell Manipulator-ECM630(BTX Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, USA)을 이용하여 전기 천공에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 형질전환시켜, cgl2863 -13- C4를 발현하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032/pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -13- C4)를 제조하였다.

2-3. CgPck52 - G5 균주의 제조

(1) cgl2863 -52-G5를 포함하는 재조합 플라스미드 작제

실시예 1에서 수득된, 개선된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제의 유전자(cgl2863-52-G5)를 PstI으로 처리하고, P180 프로모터 조절 하의 pSL360(pSK1CatP180) (Park Soo-Dong, Sang-Nam Lee, Ik-Hyun Park, Jong-Su Choi, Wol-Kyu Jeong, Younhee Kim and Heung-Shick Lee, 2004, J. Microbiol. Biotechnol. 14(4), 789-795) 또한 PstI으로 처리한 후, 이들을 라이게이션하여 pSL(P ₁₈₀ -cgl2863-52-G5)을 작제하였다. 도 5d는 pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -52-G5)의 구조를 도시한다.

작제된 재조합 플라스미드를 PstI에 의한 처리에 의해 생성된 DNA 단편(1.9kb와 6.4kb)의 확인 및 서열분석(바이오메딕, 부천, 대한민국)에 의해 확인하였다.

(2) pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -52-G5)에 의한 형질전환

상기 (1)에서 작제된 pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -52-G5)를 Electro Cell Manipulator- ECM630 (BTX Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, USA)을 이용하여 전기 천공에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 형질전환시켜, cgl2863 -52-G5를 발현하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032/pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -52-G5)를 제조하였다.

2-4. 세포 내 에너지가 증가한 코 리네박테리움 글루타미컴의 배양 및 세포내 ATP 양 비교

600 nm에서 흡광도(O.D.)를 측정하여 바이오매스를 측정하고, 1 O.D. = 0.36 g/l의 흡광계수를 이용하여 건조 세포 중량(dcw)으로 환산하였다.

ATP 농도는 Adenosine 5'-triphosphate (ATP) Bioluminescent Assay Kit for ATP Quantitation, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA , CA)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 결정하였다.

(1) 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양

상기 2-1, 2-2, 및 2-3에 의해 제조된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양을 위해 리터당 37g의 BHI (Brain-Heart Infusion) 배지 및 리터당 9g의 포도당을 첨가하여 제조된 배지를 이용하였다. 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰에 포함된 벡터의 선별 항생제인 카나마이신을 30 ㎍/ml 넣어주었다.

배양하고자 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 단일 콜로니를 BHI에 포도당이 첨가된 배지를 3-ml 담은 15-ml 시험관에 접종하고 회전식 진탕 배양기(30 ℃, 220 rpm)에서 16시간 동안 배양하였다. 수득된 배양액 1 ml를 BHI에 포도당이 첨가된 배지(100 ml)를 담은 500 ml 엘렌마이어 방해판 플라스크(Erlenmeyer baffled-flask)에 접종하여 30℃, 220 rpm으로 배양하였다. 600 nm에서 측정된, 세포 배양액의 광학 밀도(Optical Density)가 1.5에 도달했을 때 세포 배양액을 채취하였다.

도 6 및 하기 표 2는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 CgPck52-C10과 대조군의 성장곡선을 도시한다. CgPck52-C10의 최대 비성장속도(specific grwoth rate)는 0.748 h-1으로, pSL360 공벡터(empty vector)가 도입된 대조군의 0.563 h-1과 비교하여 약 33% 가량 증가한 것으로 나타났다. 이는 대장균 유래의 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제인 EcPck가 도입된 균주의 비성장속도인 0.959 h-1와 비교하여 볼 때, 세포 내 ATP 증가가 성장속도 증가에 기여했다는 것을 보여준다.

균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032	최대 비성장 속도 (μ, h^-1)
+pSL360 (대조군, KmR)	0.563±0.007
+CgPck+WT	0.593±0.014
+CgPck52-C10	0.748±0.003
+EcPck	0.959±0.057

(2) 세포내 ATP 양 측정

채취된 세포 배양액 1-ml으로부터 원심분리(13,000 g, 4℃)에 의해 세포를 수집하여, 1-ml의 20-mM Tris-HCl (pH 7.0)에 현탁하였다. Screw Cap microtube에 0.2 g의 산-세척된 유리 비드(212-300 마이크론)를 채운 후, 균체 현탁액 800 ㎕를 첨가하였다. 균체 현탁액은 얼음 상에서 계속 냉각하면서 Mini-bead beater(Model 607, Biospec product, Bartlesville, USA)를 이용하여 6분간 볼텍싱하였다. 파쇄된 현탁액은 침전물이 완전히 제거될 때까지 4℃, 13,000g에서 여러 번 원심분리를 수행하여 세포 파쇄물을 제거하고, 상층액을 ATP 농도 분석에 사용하였다. ATP 농도는 표준 물질, Adenosine 5'-Triphosphate(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA , CA)을 이용하여, 루미노미터(luminometer)로 발광 정도를 측정하여 추정하였다.

도 3은 그 결과를 도시한다. CgPck52-C10에서 ATP 농도는 1.01 μmol/g-dcw였고, CgPck13-C4에서 ATP 농도는 0.87 μmol/g-dcw, CgPck52-G5에서 ATP 농도는 0.81 μmol/g-dcw 였다. 야생형 cgl2863이 발현된 CgPck_WT의 ATP 농도인 0.46 μmol/g-dcw보다 각각 120%, 89%, 76% 더 높았다. pSL360 공벡터가 도입된 대조군의 세포 내 ATP 농도는 0.31 μmol/g-dcw으로 나타났다.

실시예 3. 세포내 에너지가 증가한 코리네박테리움 글루타미쿰에서 라이신 외부 수송 단백질의 효과 증진

실시예 2에서 수득된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포에너지 증가 및 활용 효과를 검증하기 위해서 라이신을 세포 외부로 수송하는 단백질인 LysE를 함께 발현시켜 그 발현 정도를 조사하였다.

LysE를 코딩하는 유전자 lysE(서열번호 4)를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 Genomic DNA를 주형으로 정방향 프라이머(5'-GT CCT AGG TTA AGT ACT TCC ATA G-3': 서열번호 7)와 역방향 프라이머(5'-CCT AGG CTA ACC CAT CAA CAT CAG-3': 서열번호 8)를 이용한 중합효소연쇄반응에 의해 증폭하였다. 실시예 2의 2-1, 2-2, 및 2-3에서 작제된 재조합 플라스미드를 Avr II를 처리하고, 증폭된 lysE 또한 Avr II로 처리하고, 이들을 라이게이션 하여 pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -52- C10 , lysE), pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -13- C4 , lysE), 및 pSL(P ₁₈₀ - cgl2863 -52- G5 , lysE)를 작제하였다. 작제된 재조합 플라스미드를 Electro Cell Manipulator를 이용한 전기 천공을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 형질전환시켜 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 제조하였다. 수득된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하여 세포 외부의 라이신의 양 변화를 확인하였다.

대조군으로 pSL(P ₁₈₀ - lysE) 플라스미드를 작제하기 위해 pSL360 플라스미드와 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 lysE를 Pst I으로 처리하여 이들을 라이게이션하였다. 도 5e는 pSL(P ₁₈₀ - lysE)의 구조를 도시한다. 수득된 재조합 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 형질전환시켜 LysE 만을 과발현하는 대조군 코리네박테리움 글루타미쿰을 제조하였다.

3-1. 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양

코리네박테리움 글루타미쿰의 배양을 위해 리터당 37g의 BHI (Brain-Heart Infusion) 배지 및 리터당 9g의 포도당을 첨가하여 제조된 배지를 이용하였다. 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰에 포함된 벡터의 선별 항생제인 카나마이신을 30 ㎍/ml 넣어주었다.

배양하고자 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 단일 콜로니를 BHI에 포도당이 첨가된 배지(37 g/L)를 3-ml 담은 15-ml 시험관에 접종하고 회전식 진탕 배양기(30 ℃, 220 rpm)에서 16시간 동안 배양하였다. 수득된 배양액 1 ml를 BHI에 포도당이 첨가된 배지 100 ml를 담은 500 ml 엘렌마이어 방해판 플라스크(Erlenmeyer baffled-flask)에 접종하여 30℃, 220 rpm으로 12시간 배양했다. 바이오매스 양과 라이신 변화량의 분석을 위해 2시간마다 시료를 채취하였다.

3-2. 동시 발현의 효과

라이신 외부 수송 단백질은 수송 과정에 농도 구배를 역행하기 때문에 ATP 에너지를 수송에 사용한다. 따라서, 세포내 ATP 수준이 높은 코리네박테리움이 라이신 외부 수송 단백질의 효과를 증진시켜 줄 것으로 예상되었다.

세포 외부로 수송된 라이신의 양 비교

3-1에서 수득된 세포 배양액을 원심분리(13,000 g, 4℃)하여 수득된 상층액을 분리하여 라이신 분석에 사용하였다. 라이신은 Waters 474 형광 검출기 (Waters Cooperation, Milford, MA, USA)이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography)에 의해 분석하였다. 수득된 상층액 중의 라이신은 o-프탈디알데히드(o-Phthaldialdehyde)를 이용하여 유도체화한 후에 분석하였다. X-Bridge C18 column(Waters Cooperation)을 이용하여 형광 검출기가 장착된 HPLC 장치에서 구배 용리(용매 A: 50 mM 인산나트륨 완충 용액(pH 5.5) 80%, 메탄올 19%, 테트라하이드로퓨란 1% 비율, 용매 B: 50 mM 인산나트륨 완충 용액(pH 5.5) 20%, 메탄올 80%; 0 내지 5분간 100-85% A, 0-15% B, 5 내지 10분간 85-50% A, 15-50% B, 10분 내지 24분간 50-0% A, 50-100% B)에 의해 1.5 mL/분의 유속으로 분리하여 검출하였다(F. R Antoine, C. I. Wei, R.C. Littell and M.R Marshall, 1999, J. Agric. Food Chem. 47, 5100-5107). 여기 파장은 340 nm, 방출 파장은 450 nm이다. 표준 물질인 라이신 염산염(Lysine hydrochloride)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, CA)을 농도별로 준비 후 샘플과 동일한 유도체화 방법을 통해 HPLC 분석을 하여 만들어진 표준 곡선을 이용하여 라이신의 양을 정량하였다.

그 결과가 도 4에 도시된다. 도 4에 도시된 세포 외부로 수송된 라이신의 농도는 Pck52-C10-lysE에서 2.27 mmol/L, Pck13-C4-lysE에서 2.10 mmol/L, 및 Pck52-G5-lysE에서 2.15 mmol/L 였다. lysE만 단독 발현한 대조군의 경우 1.83mmol/L, 야생형 Pck-lysE 발현의 경우 1.84mmol/L였다. 따라서, Pck52-C10-lysE, Pck13-C4-lysE, 및 Pck52-G5-lysE는 라이신의 외부 수송량이 각각 야생형에 비해 24%, 14%, 및17% 증가했다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> GRAS strain-derived enzyme obtained by molecular evlution and GRAS Corynebaterium glutamicum having the same <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1833 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 <220> <221> gene <222> (1)..(1833) <223> cgl2863 <400> 1 atgactactg ctgcaatcag gggccttcag ggcgaggcgc cgaccaagaa taaggaactg 60 ctgaactgga tcgcagacgc cgtcgagctc ttccagcctg aggctgttgt gttcgttgat 120 ggatcccagg ctgagtggga tcgcatggcg gaggatcttg ttgaagccgg taccctcatc 180 aagctcaacg aggaaaagcg tccgaacagc tacctagctc gttccaaccc atctgacgtt 240 gcgcgcgttg agtcccgcac cttcatctgc tccgagaagg aagaagatgc tggcccaacc 300 aacaactggg ctccaccaca ggcaatgaag gacgaaatgt ccaagcatta cgctggttcc 360 atgaaggggc gcaccatgta cgtcgtgcct ttctgcatgg gtccaatcag cgatccggac 420 cctaagcttg gtgtgcagct cactgactcc gagtacgttg tcatgtccat gcgcatcatg 480 acccgcatgg gtattgaagc gctggacaag atcggcgcga acggcagctt cgtcaggtgc 540 ctccactccg ttggtgctcc tttggagcca ggccaggaag acgttgcatg gccttgcaac 600 gacaccaagt acatcaccca gttcccagag accaaggaaa tttggtccta cggttccggc 660 tacggcggaa acgcaatcct ggcaaagaag tgctacgcac tgcgtatcgc atctgtcatg 720 gctcgcgaag aaggatggat ggctgagcac atgctcatcc tgaagctgat caacccagag 780 ggcaaggcgt accacatcgc agcagcattc ccatctgctt gtggcaagac caacctcgcc 840 atgatcactc caaccatccc aggctggacc gctcaggttg ttggcgacga catcgcttgg 900 ctgaagctgc gcgaggacgg cctctacgca gttaacccag aaaatggttt cttcggtgtt 960 gctccaggca ccaactacgc atccaaccca atcgcgatga agaccatgga accaggcaac 1020 accctgttca ccaacgtggc actcaccgac gacggcgaca tctggtggga aggcatggac 1080 ggcgacgccc cagctcacct cattgactgg atgggcaacg actggacccc agagtccgac 1140 gaaaacgctg ctcaccctaa ctcccgttac tgcgtagcaa tcgaccagtc cccagcagca 1200 gcacctgagt tcaacgactg ggaaggcgtc aagatcgacg caatcctctt cggtggacgt 1260 cgcgcagaca ccgtcccact ggttacccag acctacgact gggagcacgg caccatggtt 1320 ggtgcactgc tcgcatccgg tcagaccgca gcttccgcag aagcaaaggt cggcacactc 1380 cgccacgacc caatggcaat gctcccattc attggctaca acgctggtga atacctgcag 1440 aactggattg acatgggtaa caagggtggc gacaagatgc catccatctt cctggtcaac 1500 tggttccgcc gtggcgaaga tggacgcttc ctgtggcctg gcttcggcga caactctcgc 1560 gttctgaagt gggtcatcga ccgcatcgaa ggccacgttg gcgcagacga gaccgttgtt 1620 ggacacaccg ctaaggccga agacctcgac ctcgacggcc tcgacacccc aattgaggat 1680 gtcaaggaag cactgaccgc tcctgcagag cagtgggcaa acgacgttga agacaacgcc 1740 gagtacctca ctttcctcgg accacgtgtt cctgcagagg ttcacagcca gttcgatgct 1800 ctgaaggccc gcatttcagc agctcacgct taa 1833 <210> 2 <211> 610 <212> PRT <213> Corynebaterium glutamicum ATCC 13032 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(610) <223> Phosphenolopyruvate carboxykinase <400> 2 Met Thr Thr Ala Ala Ile Arg Gly Leu Gln Gly Glu Ala Pro Thr Lys 1 5 10 15 Asn Lys Glu Leu Leu Asn Trp Ile Ala Asp Ala Val Glu Leu Phe Gln 20 25 30 Pro Glu Ala Val Val Phe Val Asp Gly Ser Gln Ala Glu Trp Asp Arg 35 40 45 Met Ala Glu Asp Leu Val Glu Ala Gly Thr Leu Ile Lys Leu Asn Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Pro Asn Ser Tyr Leu Ala Arg Ser Asn Pro Ser Asp Val 65 70 75 80 Ala Arg Val Glu Ser Arg Thr Phe Ile Cys Ser Glu Lys Glu Glu Asp 85 90 95 Ala Gly Pro Thr Asn Asn Trp Ala Pro Pro Gln Ala Met Lys Asp Glu 100 105 110 Met Ser Lys His Tyr Ala Gly Ser Met Lys Gly Arg Thr Met Tyr Val 115 120 125 Val Pro Phe Cys Met Gly Pro Ile Ser Asp Pro Asp Pro Lys Leu Gly 130 135 140 Val Gln Leu Thr Asp Ser Glu Tyr Val Val Met Ser Met Arg Ile Met 145 150 155 160 Thr Arg Met Gly Ile Glu Ala Leu Asp Lys Ile Gly Ala Asn Gly Ser 165 170 175 Phe Val Arg Cys Leu His Ser Val Gly Ala Pro Leu Glu Pro Gly Gln 180 185 190 Glu Asp Val Ala Trp Pro Cys Asn Asp Thr Lys Tyr Ile Thr Gln Phe 195 200 205 Pro Glu Thr Lys Glu Ile Trp Ser Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Gly Asn 210 215 220 Ala Ile Leu Ala Lys Lys Cys Tyr Ala Leu Arg Ile Ala Ser Val Met 225 230 235 240 Ala Arg Glu Glu Gly Trp Met Ala Glu His Met Leu Ile Leu Lys Leu 245 250 255 Ile Asn Pro Glu Gly Lys Ala Tyr His Ile Ala Ala Ala Phe Pro Ser 260 265 270 Ala Cys Gly Lys Thr Asn Leu Ala Met Ile Thr Pro Thr Ile Pro Gly 275 280 285 Trp Thr Ala Gln Val Val Gly Asp Asp Ile Ala Trp Leu Lys Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gly Leu Tyr Ala Val Asn Pro Glu Asn Gly Phe Phe Gly Val 305 310 315 320 Ala Pro Gly Thr Asn Tyr Ala Ser Asn Pro Ile Ala Met Lys Thr Met 325 330 335 Glu Pro Gly Asn Thr Leu Phe Thr Asn Val Ala Leu Thr Asp Asp Gly 340 345 350 Asp Ile Trp Trp Glu Gly Met Asp Gly Asp Ala Pro Ala His Leu Ile 355 360 365 Asp Trp Met Gly Asn Asp Trp Thr Pro Glu Ser Asp Glu Asn Ala Ala 370 375 380 His Pro Asn Ser Arg Tyr Cys Val Ala Ile Asp Gln Ser Pro Ala Ala 385 390 395 400 Ala Pro Glu Phe Asn Asp Trp Glu Gly Val Lys Ile Asp Ala Ile Leu 405 410 415 Phe Gly Gly Arg Arg Ala Asp Thr Val Pro Leu Val Thr Gln Thr Tyr 420 425 430 Asp Trp Glu His Gly Thr Met Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Gly Gln 435 440 445 Thr Ala Ala Ser Ala Glu Ala Lys Val Gly Thr Leu Arg His Asp Pro 450 455 460 Met Ala Met Leu Pro Phe Ile Gly Tyr Asn Ala Gly Glu Tyr Leu Gln 465 470 475 480 Asn Trp Ile Asp Met Gly Asn Lys Gly Gly Asp Lys Met Pro Ser Ile 485 490 495 Phe Leu Val Asn Trp Phe Arg Arg Gly Glu Asp Gly Arg Phe Leu Trp 500 505 510 Pro Gly Phe Gly Asp Asn Ser Arg Val Leu Lys Trp Val Ile Asp Arg 515 520 525 Ile Glu Gly His Val Gly Ala Asp Glu Thr Val Val Gly His Thr Ala 530 535 540 Lys Ala Glu Asp Leu Asp Leu Asp Gly Leu Asp Thr Pro Ile Glu Asp 545 550 555 560 Val Lys Glu Ala Leu Thr Ala Pro Ala Glu Gln Trp Ala Asn Asp Val 565 570 575 Glu Asp Asn Ala Glu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Pro Arg Val Pro Ala 580 585 590 Glu Val His Ser Gln Phe Asp Ala Leu Lys Ala Arg Ile Ser Ala Ala 595 600 605 His Ala 610 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphoenolpyruvate carboxykinase 52-G5 <400> 3 Met Thr Thr Ala Ala Ile Arg Gly Leu Gln Gly Glu Ala Pro Thr Lys 1 5 10 15 Asn Lys Glu Leu Leu Asn Trp Ile Ala Asp Ala Val Glu Leu Phe Gln 20 25 30 Pro Glu Ala Val Val Phe Val Asp Gly Ser Gln Ala Glu Trp Asp Arg 35 40 45 Met Ala Glu Asp Leu Val Glu Ala Gly Thr Leu Ile Lys Leu Asn Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Pro Asn Ser Tyr Leu Ala Arg Ser Asn Pro Ser Asp Val 65 70 75 80 Ala Arg Val Glu Ser Arg Thr Phe Ile Cys Ser Glu Lys Glu Glu Asp 85 90 95 Ala Gly Pro Thr Asn Asn Trp Ala Pro Pro Gln Ala Met Lys Asp Glu 100 105 110 Met Ser Ser Ile Thr Leu Val Pro 115 120 <210> 4 <211> 702 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 <220> <221> gene <222> (1)..(702) <223> lysE <400> 4 atggaaatct tcattacagg tctgcttttg ggggccagtc ttttgctgtc catcggaccg 60 cagaatgtac tggtgattaa acaaggaatt aagcgcgaag gactcattgc ggttcttctc 120 gtgtgtttaa tttctgacgt ctttttgttc atcgccggca ccttgggcgt tgatcttttg 180 tccaatgccg cgccgatcgt gctcgatatt atgcgctggg gtggcatcgc ttacctgtta 240 tggtttgccg tcatggcagc gaaagacgcc atgacaaaca aggtggaagc gccacagatc 300 attgaagaaa cagaaccaac cgtgcccgat gacacgcctt tgggcggttc ggcggtggcc 360 actgacacgc gcaaccgggt gcgggtggag gtgagcgtcg ataagcagcg ggtttgggtg 420 aagcccatgt tgatggcaat cgtgctgacc tggttgaacc cgaatgcgta tttggacgcg 480 tttgtgttta tcggcggcgt cggcgcgcaa tacggcgaca ccggacggtg gattttcgcc 540 gctggcgcgt tcgcggcaag cctgatctgg ttcccgctgg tgggtttcgg cgcagcagca 600 ttgtcacgcc cgctgtccag ccccaaggtg tggcgctgga tcaacgtcgt cgtggcagtt 660 gtgatgaccg cattggccat caaactgatg ttgatgggtt ag 702 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 promoter primer <400> 5 taatacgact cactataggg 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for lysE <400> 6 gctagttatt gctcagcgg 19 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for lysE <400> 7 gtcctaggtt aagtacttcc atag 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for lysE <400> 8 cctaggctaa cccatcaaca tcag 24

Claims

코리네박테리움 글루타미쿰 유래 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제로서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 서열번호 1의 136번 위치의 T가 C로 치환되고, 588번 위치의 A가 G로 치환된 서열에 의해 코딩된 것;
서열번호 1의 733번 위치의 G가 A로 치환된 서열에 의해 코딩된 것; 및
서열번호 1의 342번 위치 상의 C가 결실된 서열에 의해 코딩된 것 중 선택된 것인 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제.
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청구항 1에 있어서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 야생형 대비, 포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 ADP(Adenosine diphosphate) 의존성 전환 활성이 증가된 것인 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제.
재조합 코리네박테리움 글루타미쿰으로서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 서열번호 1의 136번 위치의 T가 C로 치환되고, 588번 위치의 A가 G로 치환된 서열에 의해 코딩된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제;
서열번호 1의 733번 위치의 G가 A로 치환된 서열에 의해 코딩된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제; 및
서열번호 1의 342번 위치 상의 C가 결실된 서열에 의해 코딩된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제 중 선택된 것을 갖는 것인 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰.
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청구항 5에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 야생형 대비, 포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 ADP 의존성 전환 활성이 증가된 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 갖는, 모균주에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰.
청구항 8에 있어서, 상기 모균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032인 것인 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰.
청구항 5 및 8 중 어느 한 항의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 목적 물질을 생산하기 위하여 배양하는 단계를 포함하는, 목적 물질을 생산하는 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 배양하는 단계 전에 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰에 목적 물질을 코딩하는 유전자를 외부로부터 도입하거나 또는 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰의 대사 경로를 목적 물질을 생산하도록 유전적으로 변형시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 목적 물질은 단백질, 아미노산, 핵산, 항생제, 또는 대사산물인 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 유래된 것인 방법.
청구항 1 및 4 중 어느 한 항의 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자를 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 세포의 성장 속도를 증가시키는 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 세포는 박테리아, 효모, 진균, 식물 세포 또는 동물 세포인 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인 방법.