KR20200010285A - 증가된 nadph를 유도하는 생합성 경로의 게놈 공학 - Google Patents

증가된 nadph를 유도하는 생합성 경로의 게놈 공학 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산을 증가시키는 변형된 NADPH 이용 가능성을 갖는 숙주 세포 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. NADPH 이용 가능성은 숙주 세포에서 변형된 GAPDH의 발현, 변이체 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 발현, 신규 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소의 발현, 신규 트레오닌 알돌라제의 발현 및 피루베이트 카복실라제의 발현 또는 발현의 조절에 의해 변형된다.

Description

증가된 NADPH를 유도하는 생합성 경로의 게놈 공학
본 발명은 일반적으로 미생물 세포에서 NADPH 이용 가능성을 증가시키는 미생물 공학적 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 숙주 세포에서 변형된 GAPDH, 변이체 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB), 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh), 트레오닌 알돌라제(ltaE), 피루베이트 카복실라제(pyc) 및 신규 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소의 하나 이상을 발현함으로써 NADPH 이용 가능성을 증가시키기 위해 숙주 세포를 조작하는 것에 관한 것이다.
환원 당량으로서 NADPH는 당과 같은 산업적으로 중요한 화합물 및 L-리신 및 L-트레오닌과 같은 아미노산의 합성을 위한 많은 중요한 생물 공정에 관여한다. 그러나, NADPH의 정상적인 세포 공급은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산에 제한 요소가 될 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, C. 글루타미쿰에서 산업적 규모로 L-리신을 생산할 때 NADPH는 제한 인자일 수 있다(Becker et al. (2005), Appl. Environ. Microbiol., 71(12):8587-8596).
따라서, 예를 들어 L-리신 또는 L-트레오닌을 생성하기 위해 사용된 세포와 같이 NADPH를 사용하여 제조된 화합물을 생산하는 데 사용된 세포에서 NADPH의 이용 가능성에 대한 한계를 극복하기 위한 산업 미생물을 조작하는 새로운 방법에 대한 당업계에는 큰 요구가 있다.
본 발명은 숙주 세포에서 NADPH 이용 가능성에 대한 한계를 극복하기 위한 적어도 6가지 전략에 관한 것으로, 이는 L-리신, L-트레오닌, L-아이소류신, L-메티오닌 또는 L-글리신 생산을 증가시킨다: (1) 내인성 해당 효소 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 조효소 특이성을 확장시킴으로써 NADPH를 생산하는 해당 경로를 조작하여 효소가 NADP 및 NAD에 대한 이중 특이성을 갖는다; (2) NADH로부터 NADPH를 생성하는 숙주 세포에서 수소전달 효소를 발현시킨다; (3) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소의 상동체를 발현시킴으로써 리신 합성을 위한 DAP-경로를 재프로그래밍한다; (4) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh 및 asd 효소의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 위한 thrABC-경로를 재프로그래밍한다; (5) 트레오닌의 글리신으로의 분해를 감소시키거나 역전시키는 내인성 L-트레오닌 알돌라제(ltA)의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 재프로그래밍한다; 및 (6) 이종 피루베이트 카복실라제(pyc) 또는 이의 상동체를 발현시켜 옥살로아세테이트의 합성을 증가시키거나 내인성 pyc의 발현을 증가시킨다.
특정 실시태양에서, NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 세포의 이용 가능한 NADPH를 변경시키는 단계를 포함한다.
특정 실시태양에서, 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 확장된 조효소 특이성을 갖는 변형된 GAPDH를 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 숙주 세포는 변형된 GAPDH가 없는 상대 숙주 세포에 비해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산을 개선시킨다.
특정 실시태양에서, 코리네박테리움 종 균주를 배양하는 단계 및 배양된 코리네박테리움 종 균주 또는 배양액으로부터 L-리신을 회수하는 단계를 포함하는 L-리신의 생산 방법이 제공되며, 코리네박테리움 종 균주는 조효소로서 NADP를 사용하는 변형된 GAPDH를 발현하며, 코리네박테리움 종 균주는 L-리신의 개선된 생산성을 갖는다.
특정 실시태양에서, GAPDH를 변형시켜 변형된 GAPDH가 조효소 NADP 및 NAD에 대해 이중 특이성을 갖게 하는 단계를 포함하여 GAPDH의 조효소 특이성을 확장시키는 방법이 제공된다.
특정 실시태양에서, 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법이 제공되며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타낸다.
특정 실시태양에서, 효소 gdh, asd, dapB 및 ddh의 하나 이상의 변이체를 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 변이체는 조효소 NADH 및 NADPH에 대해 이중 특이성을 나타낸다.
특정 실시태양에서, 숙주 세포에서 신규한 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소를 발현시키는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법이 제공된다.
특정 실시태양에서, 다음 단계 중 둘 이상을 포함하여 숙주 세포에 의한 L-리신 생산 효율을 개선시키는 방법이 제공된다:
내인성 GAPDH를 변형시켜 변형된 GAPDH가 상응하는 자연 발생 GAPDH에 비해 조효소 NADP에 대해 증가된 특이성을 갖게 하는 단계;
숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계로서, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내는 단계; 및
숙주 세포에서 신규한 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소를 발현시키는 단계.
특정 실시태양에서, 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh) 및 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd)의 하나 또는 둘 다의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법이 제공되며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타낸다.
특정 실시태양에서, 숙주 세포에서 트레오닌 알돌라제의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의한 L-트레오닌 생산 효율을 개선시키는 방법이 제공되며, 변이체 효소는 대장균 트레오닌 알돌라제(ltaE)와 상이한 기질 선호도 또는 효소 동역학을 나타낸다.
특정 실시태양에서, 숙주 세포에서 효소 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소 효소(gapA), 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 트레오닌 알돌라제(ltaE) 및 피루베이트 카복실라제(pyc)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의한 L-트레오닌 생산을 증가시키는 방법이 제공된다.
특정 실시태양에서, 각각 하나 이상의 합성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 thrA 유전자, thrB 유전자 및 thrC 유전자를 포함하는 다중-카피 복제 플라스미드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
특정 실시태양에서, 다음 단계 중 둘 이상을 포함하여 숙주 세포에 의해 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법이 제공된다: (1) 내인성 해당 효소 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 조효소 특이성을 확장시킴으로써 NADPH를 생산하는 해당 경로를 조작하여 효소가 NADP 및 NAD에 대한 이중 특이성을 갖게 하는 단계; (2) NADH로부터 NADPH를 생성하는 숙주 세포에서 수소전달 효소를 발현시키는 단계; (3) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소의 상동체를 발현시킴으로써 리신 합성을 위한 DAP-경로를 재프로그래밍하는 단계; (4) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh 및 asd 효소의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 위한 thrABC-경로를 재프로그래밍하는 단계; (5) 트레오닌의 글리신으로의 분해를 감소시키거나 역전시키는 내인성 L-트레오닌 알돌라제(ltA)의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 재프로그래밍하는 단계; 및 (6) 이종 피루베이트 카복실라제(pyc) 또는 이의 상동체를 발현시켜 옥살로아세테이트의 합성을 증가시키거나 내인성 pyc의 발현을 증가시키는 단계.
특정 실시태양에서, 절단된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소 (gapA) 유전자를 암호화하는 인공 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 290, 291, 292, 및 293으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
특정 실시태양에서, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 재조합 단백질 단편이 제공되며, 재조합 단백질 단편은 SEQ ID NO: 233, 234, 235, 236, 및 298로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함한다.
특정 실시태양에서, NADPH를 생산하는 숙주 세포의 능력을 증가시키는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의한 L-리신 또는 L-트레오닌 생산 효율을 개선시키는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 본 방법은 이의 조효소 특이성이 넓도록 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)를 변형시키는 단계를 포함한다. 특정 경우에, 변형된 GAPDH는 상응하는 자연 발생 GAPDH에 비해 조효소 NADP에 대한 특이성이 증가된다. 특정 양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 특정 양태에서, 숙주 세포는 코리네박테리움 종이다. 일부 양태에서, 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 대장균이다. 일부 실시태양에서, 자연 발생 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양태에서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시태양에서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 다른 실시태양에서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 36 및 37에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 특정 양태에서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치의 트레오닌은 리신으로 대체되었다. 다른 양태에서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 36에 해당하는 위치의 류신은 트레오닌으로 대체되었고, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치의 트레오닌은 리신으로 대체되었다.
특정 실시태양에서, 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 L-리신 생산의 효율을 개선시키는 방법이 제공되며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타낸다. 특정 양태에서, 모든 4개의 효소가 숙주 세포에서 동시에 발현된다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh) 및 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd)의 하나 또는 둘 모두의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 L-트레오닌 생산 효율을 개선시키는 방법이 제공되며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 변이체 효소는 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용한다. 특정 실시태양에서, 상기 방법은 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 변이체 효소는 SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열에 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하며, 변이체 효소는 SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 변이체 효소는 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열에 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 방법은 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하며, 변이체 효소는 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 dapB의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하며, 변이체 효소는 SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 ddh의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하며, ddh 효소는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시태양에서, gdh의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, asd의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, dapB의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시태양에서, 코리네박테리움 종 또는 대장균 균주를 배양하는 단계 및 배양된 코리네박테리움 종 또는 대장균 균주 또는 배양액으로부터 L-리신 또는 L-트레오닌을 회수하는 단계를 포함하여 L-리신 또는 L-트레오닌의 생산 방법이 제공되며, 코리네박테리움 종 또는 대장균 균주는 조효소로서 NADP를 사용하는 변형된 GAPDH를 발현하고, 코리네박테리움 종 또는 대장균 균주는 L-리신 또는 L-트레오닌의 개선된 생산성을 갖는다.
또 다른 실시태양에서, GAPDH를 변형시킴으로써 GAPDH의 조효소 특이성을 넓히는 방법이 제공되며, 변형된 GAPDH는 조효소 NADP 및 NAD에 대한 이중 특이성을 갖는다. 특정 양태에서, 변형된 GAPDH는 NAD에 비해 조효소 NADP에 대한 특이성이 증가된다. 다른 양태에서, 변형된 GAPDH는 NAD보다 NADP를 더 효과적으로 사용한다.
일부 실시태양에서, 변형된 GAPDH를 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치의 트레오닌은 리신으로 대체되었다. 특정 양태에서, 숙주 세포는 C. 글루타미쿰이다.
다른 실시태양에서, 변형된 GAPDH를 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, SEQ ID NO: 58의 아미노산 36에 해당하는 위치의 류신은 트레오닌으로 대체되었고, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치의 트레오닌은 리신으로 대체되었다. 특정 양태에서, 숙주 세포는 C. 글루타미쿰이다.
추가의 실시태양에서, 하나 이상의 효소 gdh, asd, dapB 및 ddh의 변이체를 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 변이체는 조효소 NADH 및 NADPH에 대해 이중 특이성을 나타낸다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법을 교시하며, 상기 방법은 세포의 이용 가능한 NADPH를 변경시키는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력를 개선시키는 방법을 교시하며, 이용 가능한 NADPH는 세포에서 된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)를 발현시킴으로써 변형되고, 변형된 GAPDH는 이의 조효소 특이성이 확장되도록 변형된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법을 교시하며, 변형된 GAPDH는 상응하는 자연 발생 GAPDH에 비해 조효소 NADP에 대한 특이성이 증가된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법을 교시하며, 숙주 세포는 코리네박테리움 종이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법을 교시하며, 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법을 교시하며, 자연 발생 GAPDH는 gapA이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법을 교시하며, gapA는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 가진다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법을 교시하며, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법을 교시하며, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법을 교시하며, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 36 및 37에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법을 교시하며, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치의 트레오닌은 리신으로 대체되었다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법을 교시하며, SEQ ID NO: 58의 아미노산 36에 해당하는 위치의 류신은 트레오닌으로 대체되었고, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치의 트레오닌은 리신으로 대체되었다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법을 교시하며, 화합물은 폴리케타이드(예를 들어, 피크로마이신, 에리트로마이신 A, 클라리트로마이신, 아지트로마이신, 아버멕틴, 이버멕틴, 스피노사드, 젤다나마이신, 맥베신, 리파마이신, 암포테리신, 나이스타틴, 피마리신, 모넨신, 독시사이클린, 불라타신, 스쿠아모신, 몰비자린, 우바리신, 아노나신, 타크롤리무스, 시롤리무스, 라디시콜, 로바스타틴, 디스코더몰리드, 아플라톡신, 우스닌산 및 안트라마이신); 카테킨(예를 들어, 에피카테킨, 에피갈로카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피아프젤레친, 피세티니돌, 구이보우리티니돌, 메스퀴톨 및 로빈에티니돌); 테르펜(예를 들어, 프레놀, 아이소발레르산, 게라니올, 테르피네올, 리모넨, 마이르센, 리날로울, 피넨, 휴뮬렌, 파르네센, 파네솔, 카페스톨, 카올, 셈브렌, 탁사다이엔, 레티놀, 레티날, 피톨, 제라닐파네솔, 스쿠알렌, 라노스테롤, 사이클로아테놀, 콜레스테롤, 페루지카다이올, 테트라프레닐커쿠멘, 리코펜, 감마-카로틴, 알파-및 베타-카로틴, 3-옥소-α-이온올, 7,8-다이하이드로이오논, 메가스티그만-3,9-다이올 및 3-옥소-7,8-다이하이드로-α-이온올); 지방산(예를 들어, 미리스톨레산, 팔미톨레산, 사피엔산, 올레산, 엘라이드산, 바센산, 리놀레산, 리노에라이드산, α-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 에루크산, 도코사헥사엔산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 리그노세르산 및 세로산); 아미노산 또는 이의 유도체(예를 들어, S-아데노실 메티오닌, 아이소류신, 류신, 발린, 메티오닌, 트레오닌, 리신, 글루타메이트, 트립토판, 티로신, L-리신 및 페닐알라닌); 코리스메이트 경로로부터의 화합물(예를 들어, 인돌, 코리스메이트, 시키메이트, 살리실산, 2,3-다이하이드록시벤조산, 파라-아미노벤조에이트, 비타민 k 및 엽산); 및 알칼로이드(예를 들어, 에페드린, 호모하링토닌, 갈란타민, 빈카민, 퀴니딘, 모르핀, 첼에르트린, 피페린, 카페인, 니코틴, 테오브로민 및 퀴닌)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 방법을 교시하며, 화합물은 표 2로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 확장된 조효소 특이성을 갖는 변형된 GAPDH를 포함하는 숙주 세포를 교시하며, 숙주 세포는 변형된 GAPDH가 없는 상대 숙주 세포에 비해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산을 개선시켰다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 확장된 조효소 특이성을 갖는 변형된 GAPDH를 포함하는 숙주 세포를 교시하며, 변형된 GAPDH는 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 NADP에 대한 증가된 특이성을 가졌다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 확장된 조효소 특이성을 갖는 변형된 GAPDH를 포함하는 숙주 세포를 교시하며, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 확장된 조효소 특이성을 갖는 변형된 GAPDH를 포함하는 숙주 세포를 교시하며, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하며 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 위치 36, 37 또는 둘 다에서 아미노산에 대한 치환을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 확장된 조효소 특이성을 갖는 변형된 GAPDH를 포함하는 숙주 세포를 교시하며, 화합물은 폴리케타이드(예를 들어, 피크로마이신, 에리트로마이신 A, 클라리트로마이신, 아지트로마이신, 아버멕틴, 이버멕틴, 스피노사드, 젤다나마이신, 맥베신, 리파마이신, 암포테리신, 나이스타틴, 피마리신, 모넨신, 독시사이클린, 불라타신, 스쿠아모신, 몰비자린, 우바리신, 아노나신, 타크롤리무스, 시롤리무스, 라디시콜, 로바스타틴, 디스코더몰리드, 아플라톡신, 우스닌산 및 안트라마이신); 카테킨(예를 들어, 에피카테킨, 에피갈로카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피아프젤레친, 피세티니돌, 구이보우리티니돌, 메스퀴톨 및 로빈에티니돌); 테르펜(예를 들어, 프레놀, 아이소발레르산, 게라니올, 테르피네올, 리모넨, 마이르센, 리날로울, 피넨, 휴뮬렌, 파르네센, 파네솔, 카페스톨, 카올, 셈브렌, 탁사다이엔, 레티놀, 레티날, 피톨, 제라닐파네솔, 스쿠알렌, 라노스테롤, 사이클로아테놀, 콜레스테롤, 페루지카다이올, 테트라프레닐커쿠멘, 리코펜, 감마-카로틴, 알파-및 베타-카로틴, 3-옥소-α-이온올, 7,8-다이하이드로이오논, 메가스티그만-3,9-다이올 및 3-옥소-7,8-다이하이드로-α-이온올); 지방산(예를 들어, 미리스톨레산, 팔미톨레산, 사피엔산, 올레산, 엘라이드산, 바센산, 리놀레산, 리노에라이드산, α-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 에루크산, 도코사헥사엔산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 리그노세르산 및 세로산); 아미노산 또는 이의 유도체(예를 들어, S-아데노실 메티오닌, 아이소류신, 류신, 발린, 메티오닌, 트레오닌, 리신, 글루타메이트, 트립토판, 티로신, L-리신 및 페닐알라닌); 코리스메이트 경로로부터의 화합물(예를 들어, 인돌, 코리스메이트, 시키메이트, 살리실산, 2,3-다이하이드록시벤조산, 파라-아미노벤조 에이트, 비타민 k 및 엽산); 및 알칼로이드(예를 들어, 에페드린, 호모하링토닌, 갈란타민, 빈카민, 퀴니딘, 모르핀, 첼에르트린, 피페린, 카페인, 니코틴, 테오브로민 및 퀴닌)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 확장된 조효소 특이성을 갖는 변형된 GAPDH를 포함하는 숙주 세포를 교시하며, 화합물은 표 2로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 확장된 조효소 특이성을 갖는 변형된 GAPDH를 포함하는 숙주 세포를 교시하며, 변형은 트레오닌에 의한 SEQ ID NO: 58의 아미노산 36에 해당하는 위치에서 류신의 대체 및 리신에 의한 SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치에서 트레오닌의 대체를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 확장된 조효소 특이성을 갖는 변형된 GAPDH를 포함하는 숙주 세포를 교시하며, 숙주 세포는 C. 글루타미쿰이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 코리네박테리움 종 균주를 배양하는 단계 및 배양된 코리네박테리움 종 균주 또는 배양액으로부터 L-리신을 회수하는 단계를 포함하는 L-리신의 생산 방법을 교시하며, 코리네박테리움 종 균주는 조효소로서 NADP를 사용하는 변형된 GAPDH를 발현하며, 코리네박테리움 종 균주는 L-리신의 개선된 생산성을 갖는다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 GAPDH를 변형시켜 변형된 GAPDH가 조효소 NADP 및 NAD에 대해 이중 특이성을 갖게 하는 단계를 포함하여 GAPDH의 조효소 특이성을 확장시키는 방법을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 GAPDH를 변형시켜 변형된 GAPDH가 조효소 NADP 및 NAD에 대해 이중 특이성을 갖게 하는 단계를 포함하여 GAPDH의 조효소 특이성을 확장시키는 방법을 교시하며, 변형된 GAPDH는 NAD에 비해 조효소 NADP에 대한 특이성이 증가된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 GAPDH를 변형시켜 변형된 GAPDH가 조효소 NADP 및 NAD에 대해 이중 특이성을 갖게 하는 단계를 포함하여 GAPDH의 조효소 특이성을 확장시키는 방법을 교시하며, 변형된 GAPDH는 NAD보다 NADP를 더 효과적으로 사용한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시하며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타낸다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시하며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내며, 화합물은 폴리케타이드(예를 들어, 피크로마이신, 에리트로마이신 A, 클라리트로마이신, 아지트로마이신, 아버멕틴, 이버멕틴, 스피노사드, 젤다나마이신, 맥베신, 리파마이신, 암포테리신, 나이스타틴, 피마리신, 모넨신, 독시사이클린, 불라타신, 스쿠아모신, 몰비자린, 우바리신, 아노나신, 타크롤리무스, 시롤리무스, 라디시콜, 로바스타틴, 디스코더몰리드, 아플라톡신, 우스닌산 및 안트라마이신); 카테킨(예를 들어, 에피카테킨, 에피갈로카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피아프젤레친, 피세티니돌, 구이보우리티니돌, 메스퀴톨 및 로빈에티니돌); 테르펜(예를 들어, 프레놀, 아이소발레르산, 게라니올, 테르피네올, 리모넨, 마이르센, 리날로울, 피넨, 휴뮬렌, 파르네센, 파네솔, 카페스톨, 카올, 셈브렌, 탁사다이엔, 레티놀, 레티날, 피톨, 제라닐파네솔, 스쿠알렌, 라노스테롤, 사이클로아테놀, 콜레스테롤, 페루지카다이올, 테트라프레닐커쿠멘, 리코펜, 감마-카로틴, 알파-및 베타-카로틴, 3-옥소-α-이온올, 7,8-다이하이드로이오논, 메가스티그만-3,9-다이올 및 3-옥소-7,8-다이하이드로-α-이온올); 지방산(예를 들어, 미리스톨레산, 팔미톨레산, 사피엔산, 올레산, 엘라이드산, 바센산, 리놀레산, 리노에라이드산, α-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 에루크산, 도코사헥사엔산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 리그노세르산 및 세로산); 아미노산 또는 이의 유도체(예를 들어, S-아데노실 메티오닌, 아이소류신, 류신, 발린, 메티오닌, 트레오닌, 리신, 글루타메이트, 트립토판, 티로신, L-리신 및 페닐알라닌); 코리스메이트 경로로부터의 화합물(예를 들어, 인돌, 코리스메이트, 시키메이트, 살리실산, 2,3-다이하이드록시벤조산, 파라-아미노벤조 에이트, 비타민 k 및 엽산); 및 알칼로이드(예를 들어, 에페드린, 호모하링토닌, 갈란타민, 빈카민, 퀴니딘, 모르핀, 첼에르트린, 피페린, 카페인, 니코틴, 테오브로민 및 퀴닌)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시하며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내며, 화합물은 표 2로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시하며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내며, 변이체 효소는 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시하며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내며, 방법은 gdh의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하며, 변이체 효소는 SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시하며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내며, 방법은 asd의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하며, 변이체 효소는 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시하며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내며, 방법은 dapB의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하며, 변이체 효소는 SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시하며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내며, 방법은 ddh를 발현하는 단계를 포함하며, ddh 효소는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시하며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내며, gdh의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시하며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내며, asd의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시하며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내며, dapB의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시하며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내며, 모든 4개의 효소의 변이체는 숙주 세포에서 동시에 발현된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 효소 gdh, asd, dapB 및 ddh의 변이체를 포함하는 숙주 세포를 교시하며, 변이체는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타낸다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 신규한 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소를 발현시키는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 L-리신의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 다음 단계 중 둘 이상을 포함하여 숙주 세포에 의해 L-리신의 생산 효율을 개선시키는 방법을 교시한다: (1) 내인성 GAPDH를 변형시켜 변형된 GAPDH가 상응하는 자연 발생 GAPDH에 비해 조효소 NADP에 대해 증가된 특이성을 갖게 하는 단계; (2) 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계로서, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내는 단계; 및 (3) 숙주 세포에서 신규한 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소를 발현시키는 단계.
일부 실시태양에서, 본 발명은 (1) 내인성 해당 효소 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 조효소 특이성을 확장시킴으로써 NADPH를 생산하는 해당 경로를 조작하여 효소가 NADP 및 NAD에 대한 이중 특이성을 갖게 하는 단계; (2) NADH로부터 NADPH를 생성하는 숙주 세포에서 수소전달 효소를 발현시키는 단계; (3) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소의 상동체를 발현시킴으로써 리신 합성을 위한 DAP-경로를 재프로그래밍하는 단계; (4) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh 및 asd 효소의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 위한 thrABC-경로를 재프로그래밍하는 단계; (5) 트레오닌의 글리신으로의 분해를 감소시키거나 역전시키는 내인성 L-트레오닌 알돌라제(lTA)의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 재프로그래밍하는 단계; 및 (6) 이종 피루베이트 카복실라제(pyc) 또는 이의 상동체를 발현시켜 옥살로아세테이트의 합성을 증가시키거나 내인성 pyc의 발현을 증가시키는 단계의 둘 이상에 의해 L-리신, L-트레오닌, L-아이소류신, L-메티오닌 또는 L-글리신을 증가시키는 방법을 교시한다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 박테리아 리신 생합성 경로를 도시하고, 박테리아에서 L-리신의 수율 및 생산성을 개선시키기 위해 본 출원에 사용된 전략을 개괄한다. 숙주 세포에 의한 L-리신의 생산 효율은 하나 이상의 다음 단계에 의해 개선될 수 있다: (1) 내인성 GAPDH를 변형시켜 변형된 GAPDH가 상응하는 자연 발생 GAPDH에 비해 조효소 NADP에 대해 증가된 특이성을 갖게 하여, NADPH의 생산을 초래하는 단계; (2) 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계로서, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내어, NADPH의 이용성을 감소시키는 단계; 및 (3) 숙주 세포에서 신규한 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소를 발현시켜 NADH로부터 NADPH의 생산을 초래하는 단계.
도 2는 실시예 1에 기술된 바와 같이 변형된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)를 발현하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서의 L-리신 생산성을 나타낸다. 각각의 다음의 돌연변이 중 하나 이상을 보유하는 gapA 효소를 발현하는 C. 글루타미쿰의 여러 균주가 생성되었다: D35G, L36T, T37K 및 P192S. 그런 후에, 균주를 천연 gapA를 갖는 부모 균주와 비교하여 L-리신을 생산하는 능력에 대해 테스트하였다. NADP에 대한 변형된 조효소 특이성을 부여하는 특정 돌연변이를 갖는 GAPDH의 도입은 L-리신의 생산성을 상당히 개선시켰다. T37K 단독 및 L36T를 갖춘 T37K는 2가지 배경에서 생산성을 크게 향상시킨다. 균주 7000182994 및 7000184348은 각각 T37K를 함유하며 각 부모 Parent_1 및 Parent_2보다 성능이 우수하다. 균주 7000182999 및 7000184352는 각각 T37K 및 L36T를 함유하며 각 부모 Parent_1 및 Parent_2보다 성능이 우수하다.
도 3은 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 변이체 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소를 발현시킴으로써 코리네박테리움 글루타미쿰에서 리신 합성을 위한 DAP-경로를 재프로그래밍하는 전략을 예시한다. C. 글루타미쿰 효소 gdh 및 dapB는 각각 NADH를 NADPH보다 더 효과적으로 사용하는 클로스트리디움 심비오섬 및 대장균에서 공지된 상동체를 가지고 있다. C. 글루타미쿰 adh 및 ddh의 변이체를 찾기 위해 숙주 세포에서 게놈-전체 상동성 검색을 수행하였다. 상동성 검색은 각 효소에 대해 9개의 변이체를 산출하였다. C. 글루타미쿰 gdh 및 dapB의 공지된 상동체뿐만 아니라 C. 글루타미쿰 asd 및 ddh의 9개의 변이체는 코돈 최적화되고 C. 글루타미쿰에서의 발현을 위해 플라스미드로 복제되었다.
도 4는 C. 글루타미쿰에서 변이체 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소의 다양한 조합을 발현하기 위한 전략을 예시한다. 상이한 버전의 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소 각각의 하나의 복제물은 다양한 조합으로 카나마이신 내성 마커 유전자를 함유하는 플라스미드에 복제하였다. 그런 후에, 각각의 플라스미드는 C. 글루타미쿰에 도입되었고 효소 유전자는 표준 상동성 재조합 기술에 의해 효소 유전자를 C. 글루타미쿰 염색체에 통합되었다. 효소 유전자를 이의 게놈에 성공적으로 통합시킨 클론은 카나마이신을 함유하는 배지에서 배양함으로써 선택하였다. 모든 4개의 효소는 C. 글루타미쿰에서 동시에 발현되었다.
도 5a-b는 C. 글루타미쿰에서 상이한 버전의 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소의 다양한 조합의 발현 효과를 나타낸다. 도 5a는 2개의 C. 글루타미쿰 재조합 균주, 7000186960 및 7000186992에 대한 데이터를 나타내며, 각각은 ddh에 대한 천연 효소 및 각각의 부모 Parent_3 및 Parent_4에 비해 L-리신의 현저하게 개선된 생산성을 나타내는 gdh, asd 및 dapB에 대해 동일한 3개의 이종 효소(NADH를 사용하는 공지된 버전의 gdh 및 dapB, 및 락토바실러스 아길리스로부터의 asd의 변이체)를 함유한다. 7000186960 및 7000186992 각각은 gdh, asd 및 dapB에 대해 동일한 3개의 이종 효소와 ddh에 대한 천연 효소를 포함한다. 도 5b는 gdh 및 dapB에 대한 이종 효소는 또한 테스트된 3개 배경 중 2개에서 수율을 약간 증가시킨다는 것을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 형질전환 플라스미드의 조립 및 숙주 유기체 속으로 이의 통합을 도시한다. 삽입체 DNA는 하나 이상의 합성된 올리고를 어셈블리 반응에서 결합함으로써 생성된다. 원하는 서열을 함유하는 DNA 삽입체는 게놈의 표적 부위와 상 동성을 갖는 DNA 영역에 인접해있다. 이런 상동성 영역은 게놈 통합을 용이하게 하고, 일단 통합되면, 후속 단계에서 벡터 백본 DNA를 루핑 아웃(looping-out)하기 위해 디자인된 직접 반복 영역을 형성한다. 조립된 플라스미드는 삽입체 DNA 및 임의적으로, 하나 이상의 선택 마커를 함유한다.
도 7은 숙주 균주로부터 DNA의 선택된 영역을 루핑 아웃하기 위한 절차를 도시한다. 삽입된 DNA 및 숙주 미생물 게놈의 직접 반복 영역은 재조합 이벤트에서 "루프 아웃(loop out)"될 수 있다. 선택 마커에 대해 선택된 세포 계수기는 직접 반복 영역에 의해 인접된 루프 DNA의 결실을 함유한다.
도 8a-b는 대장균 K-12, W3110에서 thrLABC 레귤론(도 8a) 또는 thrABC 오페론(도 8b)을 사용하는 대장균 W3110 트레오닌 기본 균주 구축 단계 1에 사용된 플라스미드 디자인을 나타낸다.
도 9는 리신 및 트레오닌에 대한 박테리아 생합성 경로를 예시하고, 박테리아에서 L-리신 또는 L-트레오닌의 수율 및 생산성을 개선시키기 위해 본 출원에서 사용된 전략을 개략적으로 설명한다. (1) 내인성 해당 효소 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 조효소 특이성을 확장시킴으로써 NADPH를 생산하는 해당 경로를 조작하여 효소가 NADP 및 NAD에 대한 이중 특이성을 갖게 하여 NADPH의 생산을 초래한다. (2) NADH로부터 NADPH를 생성하는 숙주 세포에서 수소전달 효소를 발현시켜 NADPH의 생산을 초래한다. (3) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소의 상동체를 발현시킴으로써 리신 합성을 위한 DAP-경로를 재프로그래밍하여 NADPH 이용성을 감소시킨다. (4) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh 및 asd 효소의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 위한 thrABC-경로를 재프로그래밍하여 NADPH 이용성을 감소시킨다. (5) 트레오닌의 글리신으로의 분해를 감소시키거나 역전시키는 내인성 L-트레오닌 알돌라제(ltA)의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 재프로그래밍하여 확장된 NADPH의 단위당 증가된 트레오닌 생산을 초래한다. (6) 이종 피루베이트 카복실라제(pyc) 또는 이의 상동체를 발현시켜 옥살로아세테이트의 합성을 증가시키거나 내인성 pyc의 발현을 증가시킨다.
도 10a-c는 이종 트레오닌 알돌라제 라이브러리(TAlib)의 발현에 의해 실현될 수 있는 시나리오를 보여주는 트레오닌 생합성의 대사 경로 지도를 도시한다. 도 10a는 천연 대장균 ltaE에 의해 선호되는 반응(트레오닌의 아세트알데하이드 및 글리신으로의 전환)을 보여주는 트레오닌 생합성의 대사 경로 지도를 도시한다. 도 10b는 트레오닌과 아세트알데하이드와 글리신 사이의 전환이 이종 TA 효소의 발현과 보다 균형을 이루는 개선된 시나리오를 나타내는 부분 경로를 도시한다. 도 10c는 아세트알데하이드 및 글리신의 트레오닌으로의 전환이 이종 TA 효소의 발현에 유리한 방향인 바람직한 시나리오를 나타내는 부분 경로를 도시한다.
도 11a-c는 코리네에서 테스트된 개별 유전자 또는 gapA, gsd, asd, ltaE의 천연 또는 변이체의 조합을 발현할 때 대장균 thrABC 배경 균주(W3110 pMB085thrABCㅿtdh; thrABC)에 의해 생산된 L-트레오닌의 역가(mg/L)를 나타낸다. 야생형 대장균 K12 W3110, tdh 결실을 갖는 W3110(tdh_del) 및 W3110 pMB085thrLABCㅿtdh(thrLABC) 균주의 역가도 비교를 위해 도시된다. 도 11a는 gapA에 대한 결과를 나타낸다. 본 발명자들이 테스트한 3개 gapA 변이체(gapAv5, gapAv7 및 gapAv8)는 대장균 gapA(Ec_gapA)의 여분의 복제물을 발현하는 균주를 포함하여 대조군에 비해 현저하게 높은 L-트레오닌 역가를 초래하였다. 도 11b는 asd에 대한 결과를 나타낸다. 락토바실러스 아길리스 asd는 제 2 복제물을 발현하는 동일한 기본 균주보다 현저하게 높은 역가를 초래하였다. 도 11c는 gdh에 대한 결과를 보여준다. 이 경우, 클로스트리디움 gdh(Csy_gdh)는 대장균 gdh의 두 번째 복제물을 발현하는 동일한 기본 균주와 유의미하게 다르지 않았지만, 부모 균주(thrABC)보다 더 잘 수행된 균주를 괴롭혔다.
도 12는 asd, gdh 및 ltaE 라이브러리 변이체의 발현에 사용되는 플라스미드를 구축하는 데 사용된 조절 요소(pMB038 프로모터(SEQ ID NO: 237) 및 thrL 터미네이터(SEQ ID NO: 238) 및 골격(p15A)(SEQ ID NO: 239)의 디자인을 나타낸다.
도 13은 pMB038 프로모터(SEQ ID NO: 237)와 터미네이터(SEQ ID NO: 238); 대조군 플라스미드) 사이에 복제된 라이브러리 변이체가 없는 p15A 빈 벡터(원형화된 p15A 플라스미드(SEQ ID NO: 239)로 형질전환된 야생형 대장균 K12 W3110 및 부모, 대조군 균주-트레오닌 기본 균주 THR02(W3110 pMB085thrABCㅿtdh)와 비교하여 L-트레오닌의 개선된 역가(mg/L)를 나타낸다. asd_13(SEQ ID NO: 108) 및 asd_18(SEQ ID NO: 118)을 발현하는 균주는 층이 개선되었지만 대조군 균주와 유의미한 차이는 없었다. 7개의 gdh 변이체: gdh_1(SEQ ID NO: 136) gdh_8(SEQ ID NO: 150), gdh_14(SEQ ID NO: 162), gdh_16(SEQ ID NO: 166), gdh_18(SEQ ID NO: 170), gdh_20(SEQ ID NO: 174) 및 gdh_22(SEQ ID NO: 178)는 모두 스튜던트의 평균 수단의 T 비교에 의해 결정된 현저하게 더 높은 L-트레오닌 역가를 초래하였다. 회색 원과 라벨은 대조군 균주보다 유의하게 실행되는 샘플을 나타낸다.
도 14는 pMB038 프로모터(SEQ ID NO: 237)와 터미네이터(SEQ ID NO: 238); 대조군 플라스미드) 사이에 복제된 라이브러리 변이체가 없는 p15A 빈 벡터(원형화된 p15A 플라스미드(SEQ ID NO: 239)로 형질전환된 야생형 대장균 K12 W3110 및 부모, 대조군 균주-트레오닌 기본 균주 THR02(W3110 pMB085thrABCㅿtdh)와 비교하여 트레오닌 알돌라제(ltaE) 라이브러리 변이체를 발현하는 균주로부터 생성되는 L-트레오닌의 개선된 역가(mg/L)를 나타낸다. ltaE_6(SEQ ID NO: 196), ltaE_11(SEQ ID NO: 206), ltaE_18(SEQ ID NO: 220), ltaE_20(SEQ ID NO: 224), lta_24(SEQ ID NO: 232) 모두는 평균의 스튜던트 T 비교에 의해 결정된 현저하게 더 높은 L-트레오닌 역가를 초래하였다. 회색 원과 레이블은 대조군 균주보다 유의하게 실행된 샘플을 나타낸다.
도 15는 개별적으로 발현될 때 각각 역가를 개선시킨 단일 asd, gdh 또는 ltaE 라이브러리 변이체와 Csy_gdh, gapAv5 또는 gapAv7의 조합을 발현하는 균주로부터 생성되는 개선된 트레오닌 역가를 나타낸다. W3110을 제외한 모든 균주는 pMB085-thrABC tdh 결실 배경에 있다. 이들 실험에서, 가장 관련성 있는 대조군은 빈 p15A 대조군 플라스미드(각각 7000349886, 7000349887 및 7000349885; Csy_gdh+p15A(-), gapAv5+p15A(-) 및 gapAv7+p15A(-))로 형질전환된 부모 균주(Csy_gdh, gapAv5 및 gapAv7)이다.
도 16은 NNK 라이브러리로부터 외인성 gapA 대립 유전자를 발현하는 C. 글루 타미쿰에 의한 리신의 생산을 위한 2개의 플레이트 모델에서의 라이브러리 성능을 도시한다. 각 모델의 평균 성능이 도시된다. 대부분의 구성 요소(회색 원)는 부모(검은색 다이아몬드)와 같거나 그보다 더 나쁘게 실행된다. 특정 gapA 대립 유전자는 두 플레이트 모델(검은색 원)에서 리신의 높은 역가를 초래한다.
다음의 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 잘 이해되는 것으로 생각되지만, 다음 정의는 본 발명에 개시된 주제의 설명을 용이하게 하기 위해 제시된다.
용어 하나("a" 또는 "an")는 그 실체 중 하나 이상을 의미하며, 즉 복수의 지시대상을 의미할 수 있다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"라는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용된다. 또한, 부정관사에 의한 "한 요소"에 대한 언급은, 내용이 분명하게는 요소의 하나 및 단지 하나가 존재하는 것을 요구하지 않는 한, 하나 이상의 요소가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다.
문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 및 청구 범위 전체에서, "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 단어 "포함하다" 및 그 변형은 "포함하나 이에 제한되지 않는" 개방적이고 포괄적인 의미로 해석되어야 한다.
본 명세서 전체에서 "한 실시태양" 또는 "일 실시태양"에 대한 언급은 실시 예와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시태양에 포함될 수 있음을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체의 여러 곳에서 "한 실시태양에서" 또는 "일 실시태양에서"라는 문구가 모두 동일한 실시태양을 지칭할 필요는 없다. 명확성을 위해, 별도의 실시태양과 관련하여 설명된 본 발명의 특정 특징들은 또한 단일 실시태양에서 조합하여 제공될 수 있다는 것이 이해된다. 반대로, 간결하게, 단일 실시태양과 관련하여 설명된 본 발명의 다양한 특징들은 또한 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 제공될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "세포 생물", "미세유기체"또는 "미생물"은 광범위하게 이해되어야 한다. 이 용어들은 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 두 원핵생물 영역인 박테리아와 고세균뿐만 아니라 특정 진핵생물 균류 및 원생 생물을 포함하나 이에 제한되지 않을 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 목록/표 및 도면의 "미세유기체" 또는 "세포유기체" 또는 "미생물"을 의미한다. 이런 특성화는 표와 도면의 확인된 분류학적 속과 확인된 분류학적 종뿐만 아니라 상기 표 또는 도면의 임의의 유기체의 다양한 신규하고 새로운 확인된 또는 디자인된 균주를 의미할 수 있다. 동일한 특성화는 실시예에서와 같이, 명세서의 다른 부분에서 이런 용어의 인용에 대해서도 마찬가지이다.
용어 "원핵 생물"은 당업계에 공지되어 있으며 핵 또는 다른 세포 기관을 함유하지 않는 세포를 의미한다. 원핵생물은 일반적으로 두 영역, 박테리아와 고세균의 하나로 분류된다. 고세균과 박테리아 영역의 유기체 사이의 명확한 차이는 16S 리보솜 RNA에서 뉴클레오타이드 염기 서열의 근본적인 차이에 기초한다.
용어 "고세균"은 전형적으로 특이한 환경에서 발견되고 세포벽에서 리보솜 단백질의 수 및 뮤라민산의 부족을 포함하는 몇몇 기준에 의해 나머지 원핵 생물과 구별되는 멘도시쿠테스(Mendosicutes) 문의 유기체의 범주를 의미한다. ssrRNA 분석에 기초하여, 고세균은 두 계통발생학적으로 다른 그룹으로 구성된다: 크렌고세균(Crenarchaeota) 및 유리고세균(Euryarchaeota). 생리학을 기초로, 고세균은 세 가지 유형으로 구성될 수 있다: 메테인 생성균(methanogens)(메테인을 생성하는 원핵 생물); 고염성 세균(extreme halophiles)(매우 높은 농도의 염(NaCl)에서 사는 원핵 생물; 및 고온성(초고온성) 세균(extreme(hyper) thermophilus)(초고온에서 사는 원핵 생물). 박테리아와 구별되는 통일된 고세균의 특징(즉, 세포벽, 에스터-연결 막 지질 등에 뮤레인 없음)이외에, 이런 원핵 생물은 이들의 특정한 서식 환경에 적응시키는 특이한 구조 또는 생화학적 특성을 나타낸다. 크렌고세균은 주로 초고온성 황 의존성 원핵 생물로 이루어지며 유리고세균은 메테인 생성균과 고염성 세균을 함유한다.
"박테리아" 또는 "진정세균(eubacteria)"는 원핵 생물의 영역을 의미한다. 박테리아는 다음과 같이 적어도 11개의 구별된 그룹을 포함한다: (1) 그람 양성 (그람+) 박테리아, 2개위 주요 세부구분이 존재한다: (1) 높은 G+C 그룹(액티노마이세테스, 마이코박테리아, 마이르코콕커스, 기타) (2) 낮은 G+C 그룹(바실러스, 클로스트리디아, 락토바실러스, 스타필로콕키, 스트렙토콕키, 마이코플라스마스); (2) 프로테오박테리아, 예를 들어, 보라색 광합성 + 비 광합성 그람 음성 박테리아 (대부분의 "일반적인" 그람 음성 박테리아 포함); (3) 사이아노박테리아, 예를 들면, 산소성 광영양생물; (4) 스피로체테스 및 관련 종; (5) 플랭크토마이세스; (6) 박테로이데스, 플라보박테리아; (7) 클라마이디아; (8) 녹색 황 박테리아; (9) 녹색 비 황 박테리아(또한 혐기성 광영양식물); (10) 방사성 저항성 마이크로콕키 및 동족; (11) 써모토가(Thermotoga) 및 써모시포 써모필레스(Thermosipho thermophiles).
"진핵 생물"은 세포가 막 내에 둘러싸인 핵 및 다른 소기관을 함유하는 임의의 유기체이다. 진핵 생물은 분류군(Eukarya 또는 Eukaryota)에 속한다. 진핵 생물 세포를 원핵 생물(박테리아와 고세균)와 구분시키는 정의하는 특징은 막으로 둘러싸인 유전자 물질, 특히 유전자 물질을 함유하고 핵막에 의해 둘러싸인 핵을 가진다는 것이다.
용어 "유전자 변형된 숙주 세포", "유전자 변형된 미생물", "재조합 미생물", "재조합 숙주 세포" 및 "재조합 균주"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용될 수 있고 유전자 변형된 미생물을 의미할 수 있다. 따라서, 이 용어는 유전자 변경, 변형 또는 조작되어, 숙주 세포가 유도된 자연 발생 미생물과 비교하여 변경, 변형 또는 상이한 유전자형 및/또는 표현형을 나타내는(예를 들어, 유전자 변형이 미생물의 핵산 서열 암호화에 영향을 미칠 때) 미생물(예를 들어, 박테리아, 효모 세포, 곰팡이 세포 등)을 포함한다. 이 용어는 문제의 특정 재조합 미생물뿐만 아니라 이런 미생물의 자손 또는 잠재적 자손을 의미하는 것으로 이해된다.
용어 "야생형 미생물"은 자연에서 발생하는 세포, 즉 유전자 변형되지 않은 세포를 기술할 수 있다.
용어 "유전자 조작된"은 (예를 들어, 핵산의 삽입 또는 결실에 의한) 미생물의 게놈의 임의적 조작을 의미할 수 있다.
용어 "대조군" 또는 "대조군 숙주 세포"는 유전자 변형 또는 실험적 치료의 효과를 측정하기 위한 적절한 비교기 숙주 세포를 의미한다. 일부 실시태양에서, 대조군 숙주 세포는 야생형 세포이다. 다른 실시태양에서, 대조군 숙주 세포는 치료 숙주 세포를 분화시키는 유전자 변형(들)을 제외하고, 유전자 변형된 숙주 세포와 유전적으로 동일하다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 대조군 숙주 세포(예를 들어, 균주 개량 프로그램의 기초로 사용된 S1 균주)로서의 부모 균주의 사용을 교시한다.
본 발명에 사용된 용어 "대립 유전자(들)"은 유전자의 하나 이상의 대안 형태의 임의의 것을 의미할 수 있으며, 이의 모두 대립 유전자는 적어도 하나의 형질 또는 특성과 관련된다. 이배체 세포에서, 소정의 유전자의 2개의 대립 유전자는 한 쌍의 상동성 염색체에서 상응하는 유전자좌를 점유할 수 있다. 본 발명의 실시태양은, QTL, 즉 하나 이상의 유전자 또는 조절 서열을 포함할 수 있는 게놈 영역에 관한 것이기 때문에, 일부 경우에 대신 "일배체형(haplotype)"(즉, 염색체 분절의 대립 유전자)을 지칭하는 것이 더 정확하나, 이러한 경우에, "대립 유전자"라는 용어는 "유전자형"이라는 용어를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자좌"(복수 유전자좌)는 예를 들어 유전자 또는 유전자 마커가 발견되는 염색체 상의 특정 장소 또는 장소들 또는 위치를 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "유전적으로 연결된"은 교차를 통해 분리하기가 어려워 번식 동안 높은 비율로 공동유전되는 2개 이상의 형질을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "재조합" 또는 "재조합 사건"은 염색체 교차 또는 독립된 분류를 의미할 수 있다. 용어 "재조합"은 재조합 사건의 결과로서 발생하는 새로운 유전자 구성을 갖는 유기체를 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "표현형"은 개체의 유전적 구성(즉, 유전자형)과 환경 사이의 상호작용으로부터 기인하는 개별 세포, 세포 배양, 유기체 또는 유기체의 그룹의 관찰 가능한 특성을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 핵산 서열 또는 단백질 서열을 기술할 때 용어 "키메라" 또는 "재조합체"는 적어도 2개의 이종 폴리뉴클레오타이드 또는 2개의 이종 폴리펩티드를 단일 거대분자 속에 연결하거나 적어도 하나의 천연 핵산 또는 단백질 서열의 하나 이상의 요소를 재배열할 수 있는 핵산 또는 단백질 서열을 의미할 수 있다. 예를 들어, 용어 "재조합체"는 예를 들어, 화학적 합성 또는 유전 공학 기술에 의한 핵산의 분리된 단편의 조작에 의해 서열의 두 개의 분리된 단편의 인공적 조합을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "합성 뉴클레오타이드 서열"또는 "합성 폴리뉴클레오타이드 서열"은 자연에서 발생하는 것으로 알려지지 않았거나 자연 발생적이지 않은 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 일반적으로, 이런 합성 뉴클레오타이드 서열은 임의의 다른 자연 발생 뉴클레오타이드 서열과 비교할 때 적어도 하나의 뉴클레오타이드 차이를 포함할 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "핵산"은 임의의 길이의 중합체 형태의 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 이의 유사체를 의미할 수 있다. 이 용어는 분자의 1차 구조를 의미할 수 있으며, 따라서 이중 나선 및 단일 가닥의 DNA뿐 아니라 이중 및 단일 가닥의 RNA를 포함한다. 또한, 메틸화 및/또는 캡핑된 핵산과 같은 변형된 핵산, 변형된 염기를 함유하는 핵산, 골격 변형 등과 같은 변형 핵산을 포함할 수 있다. 용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드 서열"은 상화 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "유전자"는 생물학적 기능과 관련된 DNA의 임의의 단편을 의미할 수 있다. 따라서, 유전자는 암호화 서열 및/또는 그의 발현에 요구되는 조절 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 유전자는 또한, 예를 들어, 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비 발현 DNA 단편을 포함할 수 있다. 유전자는 관심 공급원으로부터의 클로닝 또는 공지되거나 예측된 서열 정보로부터의 합성을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있고, 원하는 파라미터를 갖도록 디자인된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "상동 기관(homologous)"또는 "상동체 (homologue)"또는 "오르쏘로그(ortholog)"는 당업계에 공지되어 있고 공통 조상 또는 가족 구성원을 공유하고 서열 동일성의 정도에 기초하여 결정되는 관련 서열을 의미할 수 있다. 용어 "상동성", "상동 기관", "실질적으로 유사" 및 "상응하게 실질적으로"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 이들은 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기의 변화가 유전자 발현을 중재하거나 특정 표현형을 생성시키는 핵산 단편의 능력에 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 의미할 수 있다. 이런 용어는 또한 초기의 변형되지 않은 단편에 비해 생성된 핵산 단편의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변형을 의미할 수 있다. 따라서, 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 특정 예시적인 서열 이상을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 이런 용어는 한 종, 아종, 품종, 품종 또는 균주에서 발견된 유전자 및 다른 종, 아종, 품종, 품종 또는 균주에서 상응하는 또는 동등한 유전자 사이의 관계를 기술한다. 본 발명을 위해서, 상동성 서열이 비교될 수 있다. "상동 서열" 또는 "상동체" 또는 "오르쏘로그"는 기능적으로 관련이 있다고 생각되고, 믿거나 알려질 수 있다. 기능적 관계는 (a) 서열 동일성 및/또는 (b) 동일하거나 유사한 생물학적 기능을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 방식 중 임의의 하나로 표시될 수 있다. 바람직하게는, (a) 및 (b) 모두가 표시된다. 상동성은 Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, 섹션 7.718, 표 6.71에서 논의된 바와 같은 당해 분야에서 용이하게 이용 가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 정렬 프로그램은 맥벡터(MacVector)(Oxford Molecular Ltd, Oxford, U.K.), ALIGN 플러스(Plus)(Scientific and Educational Software, Pennsylvania) 및 AlignX(Vector NTI, Invitrogen, Carlsbad, CA)이다. 다른 정렬 프로그램은 기본 매개변수를 사용하여 시퀀처(Sequencher)(Gene Codes, Ann Arbor, Michigan)이다.
본 발명에 사용된 용어 "변이체 효소" 또는 "변이체"는 변이체가 발현되는 유기체에서 천연 효소와 비교하여 상이한 아미노산 서열을 갖나, 천연 효소에 의해 촉매화된 것과 동일 또는 유사하게 반응을 촉매화하는 능력을 갖는 효소를 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "내인성" 또는 "내인성 유전자"는 숙주 세포 게놈 내에서 자연적으로 발견되는 위치에서 자연 발생 유전자를 의미한다. 본 발명과 관련하여, 이종 프로모터를 내인성 유전자에 작동 가능하게 연결시키는 것은 이 유전자가 자연적으로 존재하는 위치에서 기존 유전자 앞에 이종성 프로모터 서열을 유전적으로 삽입하는 것을 의미한다. 본 발명에 기재된 내인성 유전자는 본 발명의 방법 중 어느 하나에 따라 돌연변이된 자연 발생 유전자의 대립 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "외인성"는 용어 "이종성(heterologous)"과 상호 교환적으로 사용되고, 자연 공급원 이외의 일부 공급원으로부터 유도하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 용어 "외인성 단백질" 또는 "외인성 유전자"는 비 자연 공급원 또는 위치의 단백질 또는 유전자 및 생물학적 시스템에 공급된 단배질 또는 유전자를 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "뉴클레오타이드 변화"는 당업계에서 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어 뉴클레오타이드 치환, 결실 및/또는 삽입을 의미할 수 있다. 예를 들어 돌연변이는 침묵 치환, 추가 또는 결실을 생성하나 암호화된 단백질의 특성 또는 활성 또는 단백질이 어떻게 만들어지는지를 변형하지 않는 변경을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "단백질 변형"은 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어 아미노산 치환, 아미노산 변형, 결실 및 또는 삽입을 의미할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 핵산 또는 폴리펩타이드의 "적어도 일부" 또는 "단편"은 전장 분자를 포함하는 전장 분자의 이런 서열 또는 임의의 더 큰 단편의 최소 크기 특성을 갖는 부분을 의미할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 단편은 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분을 암호화할 수 있다. 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분은 유전자 조절 요소를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 중 하나의 일부를 분리하고 본 발명에 기재된 바와 같은 활성을 평가함으로써 제조될 수 있다. 유사하게, 폴리펩타이드의 일부는 전장 폴리펩타이드까지 이르는 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산 등일 수 있다. 사용될 부분의 길이는 특정 용도에 따라 다를 수 있다. 하이브리드화 프로브로서 유용한 핵산의 일부는 12개 뉴클레오타이드 정도로 짧을 수 있으며; 일부 실시태양에서, 이것은 20개 뉴클레오타이드이다. 에피토프로서 유용한 폴리펩티드의 일부는 4개의 아미노산 정도로 짧을 수 있다. 전장 폴리펩타이드의 기능을 수행하는 폴리펩타이드의 일부는 일반적으로 4개 이상의 아미노산보다 길 수 있다.
변이체 폴리뉴클레오타이드는 또한 DNA 셔플링과 같은 돌연변이 및 재조합 절차로부터 유도될 수 있는 서열을 포함한다. 그러한 DNA 셔플링을 위한 전략은 당업계에 공지되어있다. 예를 들어, Stemmer(1994) PNAS 91:10747-10751; Stemmer(1994) Nature 370:389-391; Crameri et al.(1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al.(1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al.(1997) PNAS 94:4504-4509; Crameri et al.(1998) Nature 391:288-291; 및 미국 특허 제5,605,793호 및 제5,837,458호 참조.
본 발명에 개시된 폴리뉴클레오타이드의 PCR 증폭을 위해, 임의의 관심 유기체로부터 추출된 cDNA 또는 게놈 DNA로부터의 상응하는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 PCR 반응에 사용하기 위해 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 디자인될 수 있다. PCR 프라이머 및 PCR 클로닝을 디자인하기 위한 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, Sambrook et al.(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). See also Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); and Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)에 개시된다. PCR의 공지된 방법은 쌍을 이룬 프라이머, 네스티드 프라이머, 단일 특이적 프라이머, 축퇴성 프라이머, 유전자 특이적 프라이머, 벡터 특이적 프라이머, 부분적 불일치 프라이머 등을 사용하는 방법을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "프라이머"는 DNA 중합효소를 부착시키는 증폭 표적에 대한 어닐링을 행할 수 있어, 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에 놓일 때, 즉, 뉴클레오타이드 및 DNA 중합효소와 같은 중합화제의 존재하에서 및 적절한 온도 및 pH에서 DNA 합성의 개시점으로서 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. (증폭) 프라이머는 증폭 효율을 최대화하기 위해 바람직하게는 단일 가닥이다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드이다. 프라이머는 폴리머화제의 존재하에서 증량 생성물의 합성을 시작하기에 충분히 길어야한다. 프라이머의 정확한 길이는 프라이머의 온도 및 조성(A/T 대 G/C 함량)을 포함하는 많은 요소에 따라 달라질 것이다. 한 쌍의 양방향성 프라이머는 PCR 증폭과 같은 DNA 증폭 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 하나의 순방향 및 역방향 프라이머로 구성된다.
본 발명에 사용된 용어 "프로모터" 또는 "프로모터 폴리뉴클레오타이드"는 암호화 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수있는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터 서열은 근위 및 더 원위 상류 요소로 구성되고, 후자의 요소는 종종 인핸서로 불릴 수 있다. 따라서, "인핸서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열일 수 있으며, 프로모터의 선천적인 요소 또는 프로모터의 수준 또는 조직 특이성을 향상시키기 위해 삽입된 이종성 요소일 수 있다. 프로모터는 천연 유전자로부터 완전히 유도되거나 자연계에서 발견되는 다른 프로모터로부터 유도된 상이한 요소로 구성되거나 심지어 합성 DNA 단편을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형, 또는 상이한 발달 단계 또는 상이한 환경 조건에 대한 반응으로 유전자의 발현을 지시할 수 있음은 당업자에게 이해된다. 또한, 대부분의 경우에, 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 일부 변이체의 DNA 단편은 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것이 추가로 인식된다.
본 발명에서 사용된 용어 "재조합 구조체", "발현 구조체", "키메라 구조체", "구조체" 및 "재조합 DNA 구조체"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 재조합 구조체는 천연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 암호화 서열과 같은 핵산 단편의 인위적인 조합을 포함한다. 예를 들어, 키메라 구조체는 상이한 공급원으로부터 유도된 조절 서열 및 암호화 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유도되지만 자연계에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 암호화 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 키메라 구조체는 복수의 조절(예를 들어, 프로모터) 및 암호화 서열(예를 들어, gapA/수소전달 효소/gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자)을 포함하는 재조합 구조체일 수 있다. 복수의 암호화 서열을 포함하는 키메라 구조체에서의 각각의 암호화 서열은 별개의 조절 서열에 의해 제어되거나 기능적으로 연결될 수 있다. 이러한 구조체는 그 자체로 사용되거나 벡터와 함께 사용될 수 있다. 벡터가 사용되는 경우 벡터의 선택은 당업자에게 주지된 바와 같이 숙주 세포를 형질 전환하는데 사용될 방법에 의존할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명의 분리된 핵산 단편을 포함하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환, 선별 및 증식시키기 위해 벡터 상에 존재해야 하는 유전자 요소를 잘 알고 있다. 당업자는 또한 상이한 독립적인 형질전환 사건이 발현의 상이한 수준 및 패턴을 유도한다는 것을 인식할 것이며(Jones et al., (1985) EMBO J. 4 : 2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen Genetics 218 : 78-86), 따라서 다수의 사건은 원하는 발현 수준 및 패턴을 나타내는 라인을 수득하기 위해 선별돼야한다. 이러한 선별은 다른 것들 중에서, DNA의 서던 분석, mRNA 발현의 노던 분석, 단백질 발현의 면역 블로팅 분석 또는 표현형 분석에 의해 실행될 수 있다. 벡터는 자율적으로 복제하거나 숙주 세포의 염색체에 통합될 수 있는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스, 파지미드, 트랜스포존, 인공 염색체 등일 수 있다. 벡터는 또한 자율적으로 복제하지 않는 네이키드 RNA 폴리뉴클레오타이드, 네이키드 DNA 폴리뉴클레오타이드, 동일한 가닥 내의 DNA 및 RNA 모두로 구성된 폴리뉴클레오타이드, 폴리-리신-컨쥬게이드된 DNA 또는 RNA, 펩타이드-컨쥬게이드된 DNA 또는 RNA, 리포좀-컨쥬게이드된 DNA 등일 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "발현"은 기능적 최종 산물, 예를 들어 mRNA 또는 단백질(전구체 또는 성숙)의 생산을 의미한다.
"작동 가능하게 연결된" 또는 "기능적으로 연결된"은 추가 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, gapA/수소전달 효소/gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자)의 전사를 초래하는 추가의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, gapA/수소전달 효소/gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자)에 의한 본 발명에 따른 프로모터 폴리뉴클레오타이드의 순차적 배열을 의미할 수 있다. 다시 말하면, "작동 가능하게 연결된" 또는 "기능적으로 연결된"은 프로모터가 이 프로모터에 인접한 또는 하류인 또는 3' 유전자(예를 들어, gapA/수소전달 효소/gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자)의 전사를 제어한다는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "관심 생성물" 또는 "생체분자"는 원료로부터 미생물에 의해 생성된 임의의 생성물을 의미한다. 일부 경우에, 관심 생성물은 소분자, 효소, 펩타이드, 아미노산, 유기산, 합성 화합물, 연료, 알코올 등일 수 있다. 예를 들어, 관심 생성물 또는 생체분자는 임의의 1차 또는 2차 세포외 대사산물일 수 있다. 1차 대사산물은 특히 에탄올, 시트르산, 락트산, 글루탐산, 글루탐산염, 리신, 트레오닌, 트립토판 및 다른 아미노산, 비타민, 폴리사카라이드 등일 수 있다. 2차 대사산물은 특히 페니실린과 같은 항생물질 또는 사이클로스포린 A와 같은 면역 억제제, 지베렐린과 같은 식물 호르몬, 로바스타틴과 같은 스타틴 약물, 그리세오풀빈과 같은 살균제 등일 수 있다. 관심 생성물 또는 생체분자는 또한 카탈라아제, 아밀라아제, 펙티나아제, 글루코오스 아이소머라제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 리파아제, 락타아제, 스트렙토 키나아제 및 여러 다른 것을 포함하는 미생물 효소와 같은 미생물에 의해 생성된 임의의 세포내 성분일 수 있다. 세포내 성분은 또한 인슐린, B형 간염 백신, 인터페론, 과립구 콜로니-자극 인자, 스트렙토키나아제 및 기타와 같은 재조합 단백질을 포함할 수 있다.
용어 "탄소원"은 일반적으로 세포 성장을 위한 탄소원으로 사용되기에 적합한 물질을 의미할 수 있다. 탄소원은 바이오매스 가수분해물, 전분, 수크로오스, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 자일로오스 및 리그닌뿐만 아니라 이들 기질의 단량체 성분을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 탄소원은 폴리머, 탄수화물, 산, 알코올, 알데하이드, 케톤, 아미노산, 펩타이드 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 다양한 유기 화합물을 포함할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 글루코오스, 덱스트로스(D-글루코오스), 말토오스, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 포화 또는 불포화 지방산, 숙시네이트, 락테이트, 아세테이트, 에탄올 등, 또는 이의 혼합물과 같은 다양한 모노사카라이드를 포함할 수 있다. 광합성 유기체는 광합성의 산물로서 탄소원을 추가로 생산할 수 있다. 일부 실시태양에서, 탄소원은 바이오매스 가수분해물 및 글루코오스로부터 선택될 수 있다.
용어 "공급원료"는 미생물 또는 발효 공정에 공급되는 원료 또는 원료의 혼합물로서 다른 생성물이 제조될 수 있는 것으로 정의될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스 또는 바이오매스에서 유도된 탄소 화합물과 같은 탄소 공급원은 발효 공정에서 관심 생성물(예를 들어, 소분자, 펩타이드, 합성 화합물, 연료, 알코올 등)을 생산하는 미생물의 공급원료일 수 있다. 그러나, 공급원료는 탄소 공급원 이외의 영양분을 함 유할 수 있다.
용어 "체적 생산성" 또는 "생산 속도"는 단위 시간당 매질의 부피당 형성된 생성물의 양으로 정의될 수 있다. 체적 생산성은 시간당 리터 당 그램(g/L/h)으로 보고될 수 있다.
용어 "비 생산성"은 생성물의 형성 속도로 정의될 수 있다. 발효 과정이 아닌 미생물의 고유 파라미터로서 생산성을 기술하기 위해서, 생산성은 본 발명에서 시간당 세포 건조 중량의 그래당 그램 생성물(g/g CDW/h)의 비 생산성으로서 더 정의될 수 있다. 소정의 미생물에 대한 OD600에 대한 CDW의 관계를 사용하여, 비 생산성은 시간당 600nm(OD)(g/L/h/OD)에서 배양액의 광학 밀도당 배양 배지당 그램 생성물로 표현될 수 있다.
용어 "수율"은 원료의 단위 중량당 수득된 생성물의 양으로 정의될 수 있고 g 기질당 g 생성물(g/g)로 표현될 수 있다. 수율은 이론적 수율의 백분율로 표현될 수 있다. "이론적 수율"은 생성물을 제조하는데 사용된 신진대사 경로의 화학양론에 따라 결정된 소정량의 기질당 생성될 수 있는 최대 생성물로 정의된다.
용어 "역가(titre 또는 titer)"는 용액의 강도 또는 용액 속의 물질의 농도로 정의될 수 있다. 예를 들어, 발효액에서 관심 생성물(예를 들어, 소분자, 펩타이드, 합성 화합물, 연료, 알코올 등)의 역가는 발효액 1 리터당 용액 속 관심 제품의 g(g/L)로 기술될 수 있다.
용어 "총 역가"는 용액 속의 관심 생성물, 적용 가능한 경우 기체상의 관심 생성물, 공정으로부터 제거되고 공정에서 최초 부피 또는 공정에서 작동 부피에 따라 회수된 임의의 관심 생성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 공정에서 생산된 모든 관심 생성물의 합으로 정의될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "HTP 유전 디자인 라이브러리" 또는 "라이브러리"는 본 발명에 따른 유전자 교란의 집합을 의미한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 라이브러리는 i) 데이터베이스 또는 다른 컴퓨터 파일에서 서열 정보의 집합, ii) 상기한 일련의 유전자 요소를 암호화하는 유전자 구조체의 집합, 또는 iii) 상기 유전자 요소를 포함하는 숙주 세포 균주로서 입증될 수 있다.
유전자 디자인 및 HTP 미생물 공학 플랫폼에서 NADPH를 증가시키기 위해 유전자 다양성 풀 생성
일부 실시태양에 있어서, 본 발명의 방법은 유전자 디자인으로서 특징화된다. 본 발명에 사용된 용어 유전자 디자인은 새로운 우수한 숙주 세포를 디자인하고 생성하기 위해 특정 유전자, 유전자의 일부, 프로모터, 종결 코돈, 5'UTR, 3'UTR 또는 다른 DNA 서열의 가장 최적의 변이체의 확인 및 선택을 통한 숙주 유기체 게놈의 재구성 또는 변형을 의미한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 유전자 디자인 방법의 제 1 단계는 새로운 숙주 게놈이 재구성될 수 있는 복수의 서열 변형을 갖는 초기 유전자 다양성 풀 집단을 얻는 것이다.
현존하는 야생형 균주로부터의 다양성 풀 사용하기
일부 실시태양에서, 본 발명은 소정의 야생형 집단의 미생물 중에서 존재하는 서열 다양성을 확인하는 방법을 교시한다. 따라서, 다양성 풀은 분석을 위해 사용된 소정의 수 n개의 야생형 미생물일 수 있으며, 상기 미생물의 게놈은 "다양성 풀"을 나타낸다.
일부 실시태양에서, 다양성 풀은 상기 야생형 미생물 중 자연적 유전자 변이에 존재하는 현존하는 다양성의 결과일 수 있다. 이 변이는 소정의 숙주 세포의 균주 변이체로부터 얻을 수 있고 미생물이 완전히 다른 종인 결과일 수도 있다. 유전자 변이는 자연 발생 여부와 상관없이 균주의 유전자 서열에서 어떠한 차이도 포함할 수 있다. 양태에서, 본 발명은 신규한 트레오닌 알돌라제를 유도하기 위해 독점적인 미생물 라이브러리를 사용한다. 알 수 있는 바와 같이, 본 출원은 이 트레오닌 알돌라제 라이브러리를 이용하여 이 귀중한 아미노산의 균주 생산을 최적화하는 방법을 교시한다.
현존하는 산업용 균주 변이체로부터의 다양성 풀 사용하기
본 발명의 다른 실시태양에서, 다양성 풀은 전통적인 균주 개량 과정 동안 생성된 균주 변이체(예를 들어, 무작위 돌연변이를 통해 생성되고 수년 동안 개량된 수율을 위해 선택된 하나 이상의 숙주 유기체 균주)이다. 따라서, 일부 실시태양에서, 다양성 풀 또는 숙주 유기체는 역사적 생산 균주의 집합을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 다양성 풀은 특정 시점(S1Gen1)에서 "기준선" 유전자 서열을 갖는 본래의 부모 균주(S1) 및 상기 S1 균주로부터 유도/성장되고 S1의 기준선 게놈과 관련하여 다른 게놈(S2- n Gen2 - n )을 갖는 임의의 수의 후속 자손 균주(S2- n 로 일반화될 수 있는 S2, S3, S4, S5, 등)일 수 있다.
돌연변이유발을 통해 다양성 풀 만들기
일부 실시태양에서, 세포의 소정의 다양성 집단에서 관심 돌연변이는 돌연변이유발 화학물질 또는 방사선을 포함하는 돌연변이 균주를 위한 임의의 수단에 의해 인위적으로 생성될 수 있다. 용어 "돌연변이유발"은 본 발명에서 세포질 핵산 물질에서 하나 이상의 유전자 변형을 유도하는 방법을 의미하기 위해 사용된다.
용어 "유전자 변형"은 DNA의 임의의 변경을 말한다. 대표적인 유전자 변형은 뉴클레오타이드 삽입, 결실, 치환 및 이들의 조합을 포함하며, 단일 염기만큼 작거나 수만 염기만큼 클 수 있다. 따라서, 용어 "유전자 변형"은 뉴클레오타이드 서열의 역전 및 염색체의 영역을 포함하는 DNA의 위치 또는 배향이 변경되는 다른 염색체 재배열을 포함한다. 염색체 재배열은 염색체 내 재배치 또는 염색체 간 재배치를 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 현재 청구된 주제에 사용된 돌연변이유발 방법은 실질적으로 무작위라서 유전자 돌연변이가 돌연변이유발될 핵산 물질 내의 임의의 이용 가능한 뉴클레오타이드 위치에서 발생할 수 있다. 달리 말하면, 한 실시태양에서, 돌연변이유발은 특정 뉴클레오타이드 서열에서 발생의 우선성성 또는 증가 빈도를 나타내지 않는다.
본 발명의 방법은 자외선, X-레이 방사선, 감마선 방사선, N-에틸-N-나이트로소우레아(ENU), 메틸나이트로우레아(MNU), 프로카바진(PRC), 트라이에틸렌 멜라민(TMS), 아크릴아마이드 모노머(AA), 클로람부실(CHL), 멜팔란(MLP), 사이클로포스파미드(CPP), 다이에틸 설페이트(DES), 에틸 메테인 설포네이트(EMS), 메틸 메테인 설포네이트(MMS), 6-머캡토퓨린(6-MP), 마이토마이신-C(MMC), N-메틸-N'-나이트로-N-나이트로소구아니딘(MNNG), 3H2O 및 우레탄(UR)(예를 들어, Rinchik, 1991; Marker et al., 1997; and Russell, 1990 참조). 추가적인 돌연변이유발 인자는 http://www.iephb.nw.ru/~spirov/hazard/mutagen_lst.html에 기재된 것을 포함하여 당업자에게 주지되어 있다.
용어 "돌연변이유발"은 또한 세포 기능을 변경(예를 들어, 표적화된 돌연변이에 의해) 또는 세포 기능을 조절하여 돌연변이유발의 속도, 품질 또는 범위를 향상시키는 방법을 포함한다. 예를 들어, 세포는 DNA 수리, 돌연변이원 대사, 돌연변이원 감수성, 게놈 안정성 또는 이들의 조합에서 기능장애 또는 결핍이 되도록 변형되거나 조절될 수 있다. 따라서 정상적으로 게놈 안정성을 유지하는 유전자 기능의 파괴는 돌연변이유발을 향상시키는데 사용될 수 있다. 파괴의 대표 표적은 DNA 리가아제 I(Bentley et al, 2002) 및 카제인 키나아제 I(미국 특허 제6,060,296 호)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, 부위-특이적 돌연변이유발(예를 들어, 변형기 부위 유도 돌연변이유발 키트(Clontech)와 같은 상업적으로 구입할 수 있는 키트를 사용한 프라이머-유도 돌연변이유발)를 사용하여 핵산 서열 전체에 걸쳐 순서대로 다수의 변화를 일으킨다 본 발명의 절단 효소를 암호화하는 핵산을 생성한다.
하나 이상의 돌연변이유발 인자에 노출시 유전자 돌연변이의 빈도는 치료의 투여량 및/또는 반복을 변화시킴으로써 조절될 수 있으며, 특정 용도에 맞게 조절될 수 있다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명에 사용된 "돌연변이유발"은 본 발명에 기술된 기술의 임의의 것에 의한 오류 경향성 PCR 돌연변이유발, 올리고뉴클레오타이드 유도 돌연변이유발, 부위 유발성 돌연변이유발 및 반복적인 서열 재조합을 포함하는 돌연변이를 유도하기 위한 기술 분야에 공지된 모든 기술을 포함한다.
NADPH를 증가시키는 유전자 디자인의 개요
본 발명은 생체 분자 또는 관심 생성물의 생산을 증가시킬 수 있는 미생물(예를 들어, 박테리아)을 생성하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 본 발명에 제공된 바와 같은 임의의 생체 분자를 생산하는 데 사용하기 위한 미생물을 생성하는 방법은 하나 이상의 표적 유전자를 상기 숙주 미생물 내로 도입하여 숙주 미생물을 유전적으로 변형시켜 상기 미생물의 게놈 조작된 균주를 생성하는 단계, 생체 분자 또는 관심 생성물을 생산하기에 적합한 조건하에서 상기 조작된 균주를 배양하는 단계, 및 상기 조작된 균주가 증가된 양의 생체 분자 또는 관심 생성물을 생산하는 경우 상기 조작된 균주를 선택하는 단계를 수반할 수 있다. 증가된 양은 숙주 미생물의 야생형 균주와 비교될 수 있다. 증가된 양은 표적 유전자 라이브러리의 구성원을 함유하지 않는 숙주 미생물의 균주와 비교될 수 있다. 표적 유전자는 벡터 내의 단일 표적 유전자, 또는 동일한 벡터 상의 다중 표적 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시태양 중 하나의 예시적인 워크플로우는 표적 유전자를 식별하고, 표적 유전자에 대한 핵산(예를 들어, DNA)을 획득 또는 합성하고, 상기 획득되거나 합성된 표적 유전자를 적합한 벡터로 복제하는 것을 수반한다. 당업계에 공지되고/되거나 본 발명에 제공된 임의의 방법을 사용하여 표적 유전자 또는 표적 유전자를 적합한 벡터 속에서 조립 또는 복제할 수 있다. 벡터는 당업계에 공지되고/되거나 이용될 숙주 미생물과 양립할 수 있는 본 발명에서 제공된 임의의 벡터일 수 있다. 표적 유전자(들)를 포함하는 벡터가 조립되면, 숙주 미생물 내로 도입될 수 있다. 벡터의 도입은 당업계에 공지되고/되거나 본 발명에 제공된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 숙주 미생물은 본 발명에 제공된 임의의 숙주 미생물일 수 있다. 일단 숙주 미생물에 도입되면, 유전자 변형된 숙주가 선택될 수 있고 표적 유전자(들)의 삽입이 평가될 수 있다. 표적 유전자(들)는 숙주 미생물 게놈의 특정 위치에 삽입되도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, 표적 유전자(들)는 숙주 미생물 내에서 의도하지 않은 경로/과정을 방해하지 않으면서 표적 유전자(들)의 발현을 촉진하는 게놈의 중성 부위에 삽입된다. 일부 경우에, 표적 유전자(들)는 숙주 미생물 내의 특정 유전자(들)를 대체한다. 특정 유전자는 숙주 미생물에 정상적으로 존재하는 상동성 표적 유전자일 수 있다. 예를 들어, 중성 통합 부위와 같은 통합 부위는 다양한 부위가 테스트될 수 있도록 실험적으로 결정될 수 있고 숙주 세포에 해를 끼치지 않으면서 통합된 표적 유전자(들)의 발현을 허용하는 부위가 선택될 수 있다. 원하는 부위(예를 들어, 중성 부위)로의 통합은 표적 유전자(들)를 원하는 통합 부위(예를 들어, 상동성 암)와 상동인 서열의 부분을 포함하는 벡터로 복제하고 이어서 숙주에서 재조합 이벤트를 수행함으로써 촉진될 수 있다. 표적 유전자(들)는 상동성 서열의 부분들 사이에 삽입될 수 있다. 특정 실시태양에서, 벡터는 원하는 통합 부위와 상동성인 약 2kb의 서열을 포함한다. 원하는 부위와 상동 성인 서열은 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA), 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및/또는 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh) 유전자의 측면에 있을 수 있어서 서열의 제 1 부분이 유전자 삽입체의 상류(즉, 5')이고 서열의 제 2 부분이 유전자 삽입체의 하류(즉, 3')이다. 다른 실시태양에서, 벡터는 원하는 통합 부위와 상동성인 약 4kb의 서열을 포함한다. 이 실시태양에서, 벡터는 gapA, gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자 삽입체에 대한 원하는 통합 부위 상류(즉, 5')에 상동성인 약 2 kb의 서열 및 gapA, gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자 삽입체에 대한 원하는 통합 부위 하류(즉, 3')에 상동성인 약 2 kb의 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 통합은 단일 크로스 오버 통합 및 벡터 백본에 존재하는 마커 상의 역 선택에 의해 촉진되는 플라스미드 백본의 후속 루프 아웃에 의해 수행된다. 일부 실시태양에서, 표적 유전자는 당업계에 공지되고/되거나 본 발명에 제공된 임의의 gapA 유전자이다. 다른 실시태양에서, 표적 유전자는 당업계에 공지되고/되거나 본 발명에 제공된 임의의 니코틴아미드뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자이다. 또 다른 실시태양에서, 표적 유전자는 당업계에 공지되고/되거나 본 발명에 제공된 임의의 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자이다. 또 다른 실시태양에서, 표적 유전자는 당업계에 공지되고/되거나 본 발명에 제공된 임의의 thrA, thrB, thrC 및/또는 ltaE 유전자이다. 또 다른 실시태양에서, 표적 유전자는 당업계에 공지되고/되거나 본 발명에 제공된 임의의 pyc 유전자이다.
삽입의 평가는, 예를 들어, 유전자 변형 미생물의 게놈 또는 이의 일부의 증폭 및/또는 서열화와 같은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명에 제공된 방법은 또한 본 발명에 기재된 바와 같은 역 선택을 통해 선택 마커의 제거 또는 루핑 아웃을 수반한다. 루핑 아웃은 본 발명에 제공된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
표적 유전자(들)의 삽입 및 선택 마커의 선택적인 제거의 평가 후, 유전자 변형된 균주는 생체 분자 또는 관심 생성물을 생산하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 평가 전에 선택적인 단계는 균주를 확장할 수 있다. 확장은 확장에 적합한 성장 배지에서 다중-웰 플레이트에서 플레이트 상에서 또는 월에서 유전자 변형된 균주를 배양하는 것을 수반할 수 있다. 평가 단계는 생체 분자 또는 관심 생성물을 생성하기 위한 실제 조건을 모방하도록 디자인된 성장 배지/조건을 포함하는 다중-웰 플레이트에서 플레이트 또는 웰에서 유전자 변형된 균주의 배양을 수반할 수 있다. 일부 경우에, 이 단계에서 성장 배지는 글루코오스의 대사 처리로부터 유도된 생체 분자 또는 관심 생성물의 생산에 적합하다. 유전자 변형된 균주가 평가 단계로부터 결정된 바와 같이 원하는 생체 분자 또는 관심 생성물의 원하는 또는 임계 생산률 또는 수율을 갖거나 생성하는 것을 예측되는 경우, 균주는 선택되어 저온 저장될 수 있다. 예측은 균주의 배양 동안 다양한 시점에서 형성된 관심 생성물 및 바이오매스의 양을 측정하고 상기 측정을 사용하여 상기 균주가 확장 또는 더 큰 규모 조건(예를 들어, 발효 조건)하에서 어떻게 수행될지 예측하는 것에 기초될 수 있다. 한 실시태양에서, 예측은 평가 방법 동안 균주의 성능의 선형 회귀 분석에 기초한다.
일부 경우에, 생체 분자 또는 관심 생성물의 원하는 또는 임계 생산률 또는 수율을 갖거나 생성시키는 것으로 예측된 유전자 변형된 균주는 생물 분자 또는 생성물을 생산하기 위한 조건(예를 들어, 발효 조건)하에서 더 큰 배양액으로 옮겨 지거나 더 큰 배양액에서 성장된다. 이 단계는 선택된 균주가 생체 분자 또는 관심 생성물의 생산을 위한 실제 조건하에서 예측된 대로 수행될 수 있는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명에 제공된 것과 같은 표적 유전자의 라이브러리로부터 각각의 표적 유전자의 도입 및 평가를 위해 본 발명에 제공된 단계는 생체 분자 또는 관심 생성물의 원하는 또는 임계 수율 및/또는 생산률을 생성하는 하나 이상의 유전자 변형 미생물 균주를 선택하기 위해 라이브러리로부터의 각각의 표적 유전자에 대해 반복된다.
일부 실시태양에서, 생체 분자 또는 관심 생성물은 미생물에 의한 글루코오스 및 이의 대사 과정으로부터 유도되어 본 발명에 제공된 방법은 균주 또는 균주들에 의한 글루코오스의 대사 처리로부터 유도된 증가된 양의 생체 분자 또는 관심 생성물을 생산하는 미생물 균주 또는 미생물 균주들의 생성을 수반한다. 특정 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법은 리신 생합성과 관련된 하나 이상의 표적 유전자의 도입을 수반한다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법은 숙주 세포에서 NADPH 생산에 관여하는 하나 이상의 표적 유전자의 도입을 수반한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법은 숙주 세포에 의한 NADPH 이용률을 감소시키는 데 관련된 하나 이상의 표적 유전자의 도입을 수반한다. 일부 실시태양에서, 표적 유전자는 gapA 유전자이어서 gapA 유전자는 본 발명에 제공된 방법에서 숙주 미생물 내로 도입된다. gapA 유전자는 숙주 미생물에서 이종 유전자일 수 있다.
다른 실시태양에서, 표적 유전자는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자이어서 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자가 본 발명에 제공된 방법에서 숙주 미생물 내로 도입된다.
많은 유기체에서, 트라이카복실산(TCA) 사이클 중간체는 피루베이트로부터 직접 재생될 수 있다. 예를 들어, 대장균이 아닌 일부 박테리아에서 발견되는 피루 베이트 카복실라제(pyc)는 카복시비오틴을 사용하는 피루베이트의 카복실화에 의한 옥살로아세테이트의 형성을 매개한다.
다른 실시태양에서, 표적 유전자는 피루베이트 카복실라제 유전자이어서 피루베이트 카복실라제(pyc) 유전자가 본 발명에 제공된 방법에서 숙주 미생물 내로 도입된다. pyc 유전자는 숙주 미생물에 대해 이종일 수 있다. 특정 실시태양에서, pyc 유전자는 미국 특허 번호 6,171,833 및 미국 특허 번호 6,171,833에 개시된 서열로부터 선택된다. 한 실시태양에서, pyc 유전자는 R. etli로부터 유래된다. 한 실시태양에서, pyc 유전자는 코리네박테리움으로부터 유래된다. 한 실시태양에서, 표적 유기체는 대장균이다. 한 실시태양에서, 표적 유기체는 코리네박테리움 종이다. 한 실시태양에서, pyc의 이종 변이체는 내인성 pyc가 없는 숙주 세포에서 발현된다. 한 실시태양에서, pyc의 이종 변이체는 내인성 pyc를 갖는 숙주 세포에서 발현된다. 한 실시태양에서, 내인성 pyc의 발현은 pyc에 작동 가능하게 연결된 강한 프로모터를 포함하도록 pyc를 포함하는 유전자 좌를 유전자 변형함으로써 증가된다. 일부 실시태양에서, pyc의 발현은 프로모터 래더로부터 프로모터를 선택함으로써 조절된다. 한 실시태양에서, 천연 PYC의 발현은 천연 pyc 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터 요소를 삽입함으로써 증가된다. 한 실시태양에서, 천연 PYC의 발현은 천연 pyc 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터 래더로부터 여러 프로모터 요소 각각을 삽입함으로써 조정된다. 한 실시태양에서, PYC의 발현은 이종 pyc 유전자의 과발현에 의해 증가된다. 한 실시태양에서, 이종 pyc 유전자는 C. 글루 타미쿰 pyc 유전자이다. 한 실시태양에서, C. 글루타미쿰 pyc는 강력한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 한 실시태양에서, C. 글루타미쿰 pyc는 프로모터 래더로부터 여러 프로모터 요소 각각에 작동 가능하게 연결되고, PYC의 발현은 프로모터 요소의 선택에 의해 조정되어 원하는 생성물, 예를 들어 트레오닌의 최고량을 생성한다.
또 다른 실시태양에서, 표적 유전자는 gdh, asd, dapB 또는 ddh 유전자의 하나 이상이어서 gdh, asd, dapB 또는 ddh 유전자가 본 발명에 제공된 방법에서 숙주 미생물 내로 도입된다. gdh, asd, dapB 또는 ddh 유전자 중 하나 이상은 숙주 미생물에서 이종 유전자일 수 있다. 특정 실시태양에서, 4개의 유전자 gdh, asd, dapB 및 ddh가 모두 본 발명에 제공된 방법으로 숙주 미생물 내로 도입된다.
특정 실시태양에서, gapA 유전자 및 니코틴아미드 뉴클레오타이드 수소전달 효소유전자 둘 다는 본 발명에 제공된 방법에서 숙주 미생물 내로 도입된다.
다른 실시태양에서, gapA 유전자 및 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 본 발명에 제공된 방법에서 숙주 미생물 내로 도입된다. 또 다른 실시태양에서, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자 및 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 본 발명에 제공된 방법에서 숙주 미생물 내로 도입된다.
또 다른 실시태양에서, gapA, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 및 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 본 발명에 제공된 방법에서 숙주 미생물 내로 동시에 도입된다.
한 실시태양에서, gapA 유전자, 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 및/또는 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자, 및/또는 TA 유전자 및/또는 pyc 유전자의 숙주 미생물 내로의 도입이 숙주 미생물에서 NADPH의 양을 증가시킨다. 특정 양태에서, NADPH의 생산은 숙주 미생물에서 증가된다. 다른 양태에서, NADPH의 이용은 숙주 미생물에서 감소된다. 특정 실시태양에서, 숙주 미생물에서 증가된 양의 NADPH는 생체 분자 또는 관심 생성물의 합성을 증가시키는 역할을 한다. 본 발명에 제공된 방법에 의해 생성된 생체 분자 또는 관심 생성물은 글루코오스로부터 생산된 임의의 상업적 생성물일 수 있다. 일부 경우에, 생체 분자 또는 관심 생성물은 소분자, 아미노산, 유기산 또는 알코올이다. 아미노산은 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파르트산, 아스파라긴, 트레오닌, 아이소소류신, 메티오닌 또는 리신일 수 있다. 유기산은 숙시네이트, 락 테이트 또는 피루베이트일 수 있다. 알코올은 에탄올 또는 아이소부탄올일 수 있다. 특정 실시태양에서, 생체 분자 또는 관심 생성물은 아미노산이다. 특정 양태에서, 아미노산은 리신이다. 특정 양태에서, 리신은 L-리신이다. 특정 양태에서, 아미노산은 트레오닌이다. 특정 양태에서, 트레오닌은 L-트레오닌이다.
한 실시태양에서, 숙주 균주는 thrLABC 레귤론(예를 들어, 대장균 K-12 균주 W3110의 thrLABC 레귤론(SEQ ID NO: 76))을 삽입함으로써 변형된 박테리아 균주이다. 한 실시태양에서, 숙주 균주는 thrABC 레귤론(예를 들어, thrL 리더 서열의 삭제에 의해 변형된 대장균 K-12 균주 W3110의 thrLABC 레귤론(SEQ ID NO: 77))을 삽입함으로써 변형된 박테리아 균주이다. 한 실시태양에서, 숙주 균주는 L-트레오닌 3-탈수소 효소(tdh) 또는 이의 상동체(들)를 암호화하는 박테리아 게놈의 영역의 결실에 의해 변형된 박테리아 균주이다.
NADPH를 증가시키기 위해 라이브러리를 이용하는 미생물 유전자 조작
한 실시태양에서, 개시된 미생물 게놈 조작 방법은 gapA 유전자, 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 및/또는 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자, 및/또는 TA 유전자 및/또는 pyc 유전자 및/또는 라이브러리를 이용한다. gapA 유전자는 NAD를 보조 인자로 사용하는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, gapA의 조효소 특이성이 넓어진다. 따라서, 일부 양태에서, gapA는 NAD 및 NADH에 대한 이중 특이성을 갖는다. 일부 양태에서, gapA는 NADH를 NAD보다 우선적으로 사용한다. 다른 양태에서, gapA는 NAD 및 NADH에 대해 동일한 선호도를 갖는다. 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자는 NADH를 NADPH로 전환시키는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. gdh, asd, dapB 또는 ddh는 NADPH를 보조 인자로 사용하는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, gdh, asd, dapB 및/또는 ddh의 조효소 특이성이 넓어진 다. 따라서, 일부 양태에서, gdh, asd, dapB 및/또는 ddh는 NADPH 및 NADP에 대해 이중 특이성을 갖는다. 일부 양태에서, gdh, asd, dapB 및/또는 ddh는 NADP보다 NADPH를 더 우선적으로 사용한다. 다른 양태에서, gdh, asd, dapB 및/또는 ddh는 NADPH 및 NADP에 대해 동일한 선호도를 갖는다. TA 유전자는 트레오닌을 보다 천천히 대사하거나 트레오닌을 생산하는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, TA의 기질 특이성이 넓어진다. 따라서, 일부 양태에서, TA는 글리신 및 세린에 대한 이중 특이성을 갖는다. 일부 양태에서, TA는 글리신보다 세린을 우선적으로 사용한다. 다른 양태에서, TA는 세린 및 글리신에 대해 동일한 선호도를 갖는다. pyc는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 능력에 기초하여 를 선택될 수 있다.
일부 경우에, 미생물은 gapA 라이브러리, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 라이브러리, gdh, asd, dapB 및/또는 ddh, 및/또는 TA 라이브러리 및/또는 pyc 라이브러리 또는 이런 라이브러리의 임의의 조합을 이용하여 조작된다. 일부 실시태양에서, 라이브러리는 복수의 키메릭 구조체 삽입체를 함유하여서 라이브러리 내의 각 삽입체가 gapA 유전자, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 및 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자 및/또는 TA 유전자 및/또는 pyc 유전자를 포함한다. 조작 후, 미생물은 최종 결과, 예를 들어, 본 발명에 제공된 바와 같은 글루코오스로부터 생성물의 생산에 대해 효율적으로 선별되거나 평가될 수 있다. 본 발명에 제공된 라이브러리를 이용하여 특정 게놈 변경을 정의한 다음 변이를 갖는 숙주 미생물 게놈을 테스팅/선별하는 이런 공정은 효율적이고 반복적인 방식으로 구현될 수 있고 숙주 세포에서의 발현이 원하는 또는 임계 수준의 생체 분자 또는 글루코오스 형태의 관심 생성물을 생산하는 gapA 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 및/또는 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자, 및/또는 TA 유전자 및/또는 pyc 유전자의 특정 조합을 확인하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위해 본 발명에 제공된 바와 같은 각각의 gapA 유전자 또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 또는 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자는 본 발명에 제공된 천연 프로모터 또는 프로모터 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 것의 제어하에 있거나 기능적으로 연결된다. "프로모터 폴리뉴클레오타이드" 또는 "프로모터" 또는 "프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드"는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 데옥시리보폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 바람직하게는 데옥시리보핵산 (DNA)을 의미할 수 있으며, 이는 전사될 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결된 경우 코딩 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, gapA 유전자 또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 또는 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자, 및/또는 TA 유전자 및/또는 pyc 유전자)의 전사 개시점 및 빈도를 결정하며, 이에 의해 제어된 폴리뉴클레오타이드의 발현 강도에 영향을 줄 수 있다. 일부 실시태양에서, gapA 유전자 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 및/또는 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자, 및/또는 TA 유전자 및/또는 pyc 유전자를 포함하는 라이브러리에서 각각의 gapA 유전자 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 및/또는 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자, 및/또는 TA 유전자 및/또는 pyc 유전자는 똑같은 또는 동일한 프로모터의 제어하에 있다. 다른 실시태양에서, 글루코오스 gapA 유전자 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 및/또는 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자, 및/또는 TA 유전자 및/또는 pyc 유전자를 포함하는 라이브러리에서 각각의 gapA 유전자 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 및/또는 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자, 및/또는 TA 유전자 및/또는 pyc 유전자는 별개의 또는 상이한 프로모터의 제어하에 있다. 또 다른 실시태양에서, 표적 유전자를 포함하는 키메라 구조체의 라이브러리에서 키메라 구조체의 각 표적 유전자는 똑같은 또는 동일한 프로모터의 제어하에 있다. 추가의 실시태양에서, 표적 유전자를 포함하는 키메라 구조체의 라이브러리에서 키메라 구조체의 각 표적 유전자는 별개의 또는 상이한 프로모터의 제어하에 있다.
프로모터 래더
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 미생물에서 하나 이상의 효소의 발현을 조절하고 전체 숙주 균주 생산성에 유리한 효과를 생성하도록 최적의 발현 특성을 갖는 프로모터를 선택하는 방법을 교시한다.
프로모터는 유전자가 전사되는 속도를 조절하고 다양한 방식으로 전사에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 구조성 프로모터는 내부 또는 외부 세포 조건에 관계없이 일정한 비율로 관련 유전자의 전사를 지시하지만, 조절 가능한 프로모터는 내부 및/또는 외부 세포, 예를 들어, 성장 속도, 온도, 특정 환경 화학물질에 대한 반응 등에 따라 유전자가 전사되는 속도를 증가 또는 감소시킨다. 프로모터는 정상적인 세포 컨텍스트로부터 격리될 수 있으며 사실상 모든 유전자의 발현을 조절하도록 조작되어 세포 성장, 생산 수율 및/또는 기타 관심 표현형의 효과적인 변형을 가능하게 한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하류 유전자 디자인 방법에서 사용하기 위한 프로모터 래더 라이브러리를 생산하는 방법을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 프로모터를 확인하고 및/또는 다양한 발현 강도 또는 우수한 조절 특성을 나타내는 숙주 세포 내 하나 이상의 프로모터의 변이체를 생성하는 방법을 교시한다. 이들 확인된 및/또는 생성된 프로모터의 특정 조합은 프로모터 래더로서 함께 그룹화될 수 있으며, 이는 보다 상세히 후술된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 프로모터 래더의 사용을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 프로모터 래더는 연속 범위의 발현 프로파일을 나타내는 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 프로모터 래더는 자극, 또는 구성성 발현을 통해 다양한 발현 강도를 나타내는 자연, 고유 또는 야생형 프로모터를 확인함으로써 생성된다. 이러한 확인된 프로모터는 프로모터 래더로서 함께 그룹화될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 상이한 조건에 걸쳐 다양한 발현 프로파일을 나타내는 프로모터 래더의 생성을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 발효의 상이한 단계에 전체에서 퍼진 발현 피크를 갖는 프로모터의 래더를 생성하는 것을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 특정 자극에 반응하여 상이한 발현 피크 동역학을 갖는 프로모터의 래더를 생성하는 것을 교시한다. 당업자는 본 발명의 조절 프로모터 래더가 임의의 하나 이상의 조절 프로파일을 나타낼 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 프로모터 래더는 연속적인 범위의 반응에 걸쳐 예측 가능한 방식으로 유전자 발현을 교란시키도록 디자인되었다. 일부 실시태양에서, 프로모터 래더의 연속 특성은 균주 개량 프로그램에 추가의 예측력을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 선택된 대사 경로의 스와핑 프로모터 또는 종결 서열은 가장 최적의 발현 비율 또는 프로파일을 확인하는 숙주 세포 성능 곡선을 생성할 수 있다; 부적절한 환경에서 불필요한 과발현이나 잘못된 발현을 피하면서 표적 유전자가 더 이상 특정 반응이나 유전자 캐스케이드에 대한 제한 요소가 되지 않는 균주를 생산한다. 일부 실시태양에서, 프로모터 래더는 원하는 프로파일을 나타내는 자연, 고유 또는 야생형 프로모터를 확인함으로써 생성된다. 다른 실시태양에서, 프로모터 래더는 자연 발생 프로모터를 돌연변이시켜 다수의 돌연변이 프로모터 서열을 유도함으로써 생성된다. 이들 돌연변이된 프로모터의 각각은 표적 유전자 발현에 대한 효과에 대해 테스트된다. 일부 실시태양에서, 편집된 프로모터는 다양한 조건에 걸쳐 발현 활성에 대해 테스트되어 각 프로모터 변이체의 활성이 문서화/특징화/주석처리되고 데이터베이스에 저장된다. 생성된 편집된 프로모터 변이체는 뒤이어 그 발현의 강도에 기초하여 배열된 프로모터 래더로 조직화된다(예를 들어, 상부 근처의 고도로 발현된 변이체 및 하부 근처의 약화된 발현에 의해, 따라서 "래더"라는 용어를 유도한다).
일부 실시태양에서, 본 발명은 확인된 자연 발생 프로모터 및 돌연변이된 변이체 프로모터의 조합인 프로모터 래더를 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하기 기준을 모두 만족하는: 1) 구조성 프로모터의 래더를 나타내며; 2) 이상적으로 100개 염기쌍 미만의 짧은 DNA 서열에 의해 암호화될 수 있는 자연, 고유 또는 야생형 프로모터를 확인하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 구조성 프로모터는 두 개의 선택된 성장 조건 (전형적으로, 산업용 재배 동안 경험된 조건들 간에 비교됨)에 걸쳐 일정한 유전자 발현을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 프로모터는 ~60 염기쌍 코어 프로모터 및 26-40 염기쌍 길이의 5' UTR로 구성될 것이다.
일부 실시태양에서, 상기 확인된 자연 발생 프로모터 서열 중 하나 이상이 유전자 편집을 위해 선택된다. 일부 실시태양에서, 자연 프로모터는 상기 임의의 돌연변이 방법을 통해 편집된다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 프로모터는 원하는 서열을 갖는 새로운 프로모터 변이체를 합성함으로써 편집된다.
다음 출원의 전체 발명은 참조로 본 발명에 포함된다: U.S. Application No. 15/396,230 (U.S. Pub. No. US 2017/0159045 A1); PCT/US2016/065465 (WO 2017/100377 A1); U.S. App. No. 15/140,296 (US 2017/0316353 A1); PCT/US2017/029725 (WO 2017/189784 A1); PCT/US2016/065464 (WO 2017/100376 A2); U.S. Prov. App. No. 62/431,409; U.S. Prov. App. No. 62/264,232; 및 U.S. Prov. App. No. 62/368,786.
본 발명의 프로모터의 비 제한적인 리스트가 하기 표 1에 제공된다. 프로모터 서열의 각각은 이종 프로모터 또는 이종 프로 프로모터 뉴클레오타이드로 불릴 수 있다.
본 발명의 선택된 프로모터 서열
SEQ ID No. 프로모터 짧은
명칭 		프로모터 명칭
59 P1 Pcg0007_lib_39
60 P2 Pcg0007
61 P3 Pcg1860
62 P4 Pcg0755
63 P5 Pcg0007_265
64 P6 Pcg3381
65 P7 Pcg0007_119
66 P8 Pcg3121
일부 실시태양에서, 본 발명의 프로모터는 상기 표로부터의 프로모터와 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 또는 75% 서열 동일성을 나타낸다.
일부 경우에, 프로모터 래더는 gapA 라이브러리 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 라이브러리, 및/또는 gdh, asd, dapB 및 ddh, 및/또는 TA 라이브러리 및/또는 pyc 라이브러리 또는 이들 라이브러리의 임의의 조합으로부터 선택된 유전자의 앞에서 이용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로모터 래더의 이용은 gapA 라이브러리 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 라이브러리, 및/또는 gdh, asd, dapB 및 ddh, 및/또는 TA 라이브러리 및/또는 pyc 라이브러리 또는 이들 라이브러리의 임의의 조합으로부터 선택된 유전자의 발현을 조절하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 프로모터 래더의 이용은 gapA 라이브러리 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 라이브러리, 및/또는 gdh, asd, dapB 및 ddh, 및/또는 TA 라이브러리 및/또는 pyc 라이브러리 또는 이들 라이브러리의 임의의 조합으로부터 선택된 유전자의 발현을 미세 조절하는 것을 포함한다. 조작 후, 미생물은 최종 결과, 예를 들어, 본 발명에 제공된 바와 같은 글루코오스로부터 생성물의 생산에 대해 효율적으로 선별되거나 평가될 수 있다. 본 발명에 제공된 프로모터 래더를 이용하여 유전자가 특정 발현 수준을 얻는 숙주를 생성한 다음 변이를 갖는 숙주 미생물 게놈을 테스팅/선별하는 것은 효율적이고 반복적인 방식으로 구현될 수 있고 gapA 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 및/또는 gdh, asd, dapB 및 ddh로부터 선택된 하나 이상의 유전자, 및/또는 TA 유전자 및/또는 pyc 유전자의 특정 조합을 확인하는 데 사용될 수 있어서, 숙주 세포에서의 발현이 원하는 또는 임계 수준의 생체 분자 또는 글루코오스 형태의 관심 생성물을 생산한다.
글리세르알데하이드 -3- 포스페이트 탈수소 효소 라이브러리
특정 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 gapA 유전자의 라이브러리가 본 발명에 제공된다. gapA 유전자의 라이브러리는 하나 이상의 gapA 유전자를 포함할 수 있다. 라이브러리의 각 gapA 유전자는 gapA 유전자의 천연 형태 또는 돌연변이 형태일 수 있다. 돌연변이된 형태는 삽입, 결실, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 또는 전위로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 라이브러리의 각 gapA 유전자는 gapA 유전자일 수 있다. gapA 유전자는 당업계에 공지된 원핵 세포(즉, 박테리아 및/또는 고세균)로부터의 임의의 gapA 유전자일 수 있다. gapA 유전자는 당업계에 공지된 진핵 세포(예를 들어, 진균)로부터의 임의의 gapA 유전자일 수 있다. gapA는 NAD- 및/또는 NADH-의존적 GAPDH 활성을 포함하는 임의의 단백질로 간주될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 gapA는 글리세르알데하이드-3-포스페이트를 글리세레이트-1,3-비스포스페이트로 전환시키는 임의의 효소일 수 있다. 숙주 세포는 본 발명에 제공된 임의의 숙주 세포일 수 있다. 일부 실시태양에서, gapA 유전자의 라이브러리는 마이코박테리움(예를 들어, Mycobacterium smegmatis)), 스트렙토마이세스(예를 들어, Streptomyces coelicolor), 자이모모나스(예를 들어, Zymomonas mobilis), 시네코시스티스(예를 들어, Synechocystis sp . PCC6803), 비피도박테리움(예를 들어, Bifidobacterium longum), 에스케리키아(예를 들어, Escherichia coli), 바실러스(예를 들어, Bacillus subtilis), 코리네박테리움(예를 들어, Corynebacterium glutamicum), 사카로마이세스(예를 들어, S. cerevisiae) 또는 이의 조합의 임의의 균주/종/하부종으로부터의 gapA 유전자를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 gapA 효소는 본 발명에 제공된 gapA 효소와 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 또는 75% 서열 동일성을 나타낸다.
라이브러리 내의 각각의 gapA 유전자는 기능적으로 연결되거나 이의 천연 프로모터 또는 돌연변이된 형태의 천연 프로모터의 제어하에 연결될 수 있다. 라이브러리 내의 각각의 gapA 유전자는 본 발명에 제공된 임의의 프로모터에 기능적으로 연결되거나 제어될 수 있다. gapA 유전자 라이브러리 내의 각각의 gapA 유전자는 키메라 구조체에 존재할 수 있어서, 유전자는 숙주 세포의 게놈에 존재하는 서열과 하나 이상의 조절 서열 및/또는 서열에 의해 측면에 위치될 수 있다. 숙주 세포에 존재하는 서열과 상동성인 서열은 상보적 서열을 포함하는 숙주 세포 게놈의 부위 또는 유전자좌 내로의 gapA 유전자의 통합을 촉진할 수 있다. 통합은 재결합 이벤트를 통해 이루어질 수 있다. 조절 서열은 예를 들어 숙주 세포의 유전자 기계에 의해 사용되는 프로모터, 시작, 정지, 신호, 분비 및/또는 종결 서열과 같은 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공된 임의의 조절 서열일 수 있다.
니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 라이브러리
특정 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자의 라이브러리가 본 발명에 제공된다. 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자의 라이브러리는 하나 이상의 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자를 포함할 수 있다. 라이브러리의 각 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자는 수소전달 효소 유전자의 천연 형태 또는 돌연변이 형태일 수 있다. 돌연변이된 형태는 삽입, 결실, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 또는 전위로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 라이브러리의 각 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자는 수소전달 효소 유전자일 수 있다. 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자는 당업계에 공지된 원핵 세포(즉, 박테리아 및/또는 고세균)로부터의 임의의 수소전달 효소 유전자일 수 있다. 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자는 당업계에 공지된 진핵 세포(예를 들어, 진균)로부터의 임의의 수소전달 효소 유전자일 수 있다. 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소는 NAD를 NADPH로 전환시키는 임의의 효소일 수 있다. 숙주 세포는 본 발명에 제공된 임의의 숙주 세포일 수 있다. 일부 실시태양에서, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자의 라이브러리는 마이코박테리움(예를 들어, Mycobacterium smegmatis)), 스트렙토마이세스(예를 들어, Streptomyces coelicolor), 자이모모나스(예를 들어, Zymomonas mobilis), 시네코시스티스(예를 들어, Synechocystis sp . PCC6803), 비피도박테리움(예를 들어, Bifidobacterium longum), 에스케리키아(예를 들어, Escherichia coli), 바실러스(예를 들어, Bacillus subtilis), 코리네박테리움(예를 들어, Corynebacterium glutamicum), 사카로마이세스(예를 들어, S. cerevisiae) 또는 이의 조합의 임의의 균주/종/하부종으로부터의 수소전달 효소 유전자를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소는 본 발명에 제공된 수소전달 효소와 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 또는 75% 서열 동일성을 나타낸다.
라이브러리 내의 각각의 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자는 기능적으로 연결되거나 이의 천연 프로모터 또는 돌연변이된 형태의 천연 프로모터의 제어하에 연결될 수 있다. 라이브러리 내의 각각의 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자는 본 발명에 제공된 임의의 프로모터에 기능적으로 연결되거나 제어될 수 있다. 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자 라이브러리 내의 각각의 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자는 키메라 구조체에 존재할 수 있어서, 유전자는 숙주 세포의 게놈에 존재하는 서열과 하나 이상의 조절 서열 및/또는 서열에 의해 측면에 위치될 수 있다. 숙주 세포에 존재하는 서열과 상동성인 서열은 상보적 서열을 포함하는 숙주 세포 게놈의 부위 또는 유전자좌 내로의 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자의 통합을 촉진할 수 있다. 통합은 재결합 이벤트를 통해 이루어질 수 있다. 조절 서열은 예를 들어 숙주 세포의 유전자 기계에 의해 사용되는 프로모터, 시작, 정지, 신호, 분비 및/또는 종결 서열과 같은 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공된 임의의 조절 서열일 수 있다.
gdh , asd , dapB 및/또는 ddh 라이브러리
특정 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자의 라이브러리가 본 발명에 제공된다. gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자의 라이브러리는 하나 이상의 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자를 포함할 수 있다. 라이브러리의 각 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자는 각각 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자의 천연 형태 또는 돌연변이 형태일 수 있다. 돌연변이된 형태는 삽입, 결실, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 또는 전위로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 라이브러리의 각 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자는 각각 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자일 수 있다. gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자는 당업계에 공지된 원핵 세포(즉, 박테리아 및/또는 고세균)로부터의 각각 임의의 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자일 수 있다. gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자는 당업계에 공지된 진핵 세포(예를 들어, 진균)로부터의 임의의 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자일 수 있다. gdh는 NADPH- 및/또는 NADH-의존적 글루타메이트 탈수소 효소 활성을 포함하는 임의의 단백질로 간주될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 gdh는 옥살로아세테이트를 아스파르테이트로 전환시키는 임의의 효소일 수 있다. asd는 NADPH- 및/또는 NADH-의존적 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소 활성을 포함하는 임의의 단백질로 간주될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 asd는 아스파르틸 포스페이트를 아스파르테이트 세미알데하이드로 전환시키는 임의의 효소일 수 있다. dapB는 NADPH- 및/또는 NADH-의존적 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소 활성을 포함하는 임의의 단백질로 간주될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 dapB는 다이하이드로피콜리네이트를 테트라하이드로피콜리네이트로 전환시키는 임의의 효소일 수 있다. ddh는 NADPH- 및/또는 NADH-의존적 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소 활성을 포함하는 임의의 단백질로 간주될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 ddh는 테트라하이드로피콜리네이트를 메소-다이아미노피멜레이트로 직접 전환에 촉매작용을 미치는 촉매화하는 임의의 효소일 수 있다.
숙주 세포는 본 발명에 제공된 임의의 숙주 세포일 수 있다. 일부 실시태양에서, asd, dapB 또는 ddh 유전자의 라이브러리는 마이코박테리움(예를 들어, Mycobacterium smegmatis)), 스트렙토마이세스(예를 들어, Streptomyces coelicolor), 자이모모나스(예를 들어, Zymomonas mobilis), 시네코시스티스(예를 들어, Synechocystis sp . PCC6803), 비피도박테리움(예를 들어, Bifidobacterium longum), 에스케리키아(예를 들어, Escherichia coli), 바실러스(예를 들어, Bacillus subtilis), 코리네박테리움(예를 들어, Corynebacterium glutamicum), 사카로마이세스(예를 들어, S. cerevisiae) 또는 이의 조합의 임의의 균주/종/하부종으로부터의 asd, dapB 또는 ddh 유전자를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 asd, dapB 또는 ddh 효소는 본 발명에 제공된 asd, dapB 또는 ddh 효소와 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 또는 75% 서열 동일성을 나타낸다.
라이브러리 내의 각각의 asd, dapB 또는 ddh 유전자는 기능적으로 연결되거나 이의 천연 프로모터 또는 돌연변이된 형태의 천연 프로모터의 제어하에 연결될 수 있다. 라이브러리 내의 각각의 asd, dapB 또는 ddh 유전자는 본 발명에 제공된 임의의 프로모터에 기능적으로 연결되거나 제어될 수 있다. asd, dapB 또는 ddh 유전자 라이브러리 내의 각각의 asd, dapB 또는 ddh 유전자는 키메라 구조체에 존재할 수 있어서, 유전자는 숙주 세포의 게놈에 존재하는 서열과 하나 이상의 조절 서열 및/또는 서열에 의해 측면에 위치될 수 있다. 숙주 세포에 존재하는 서열과 상동성인 서열은 상보적 서열을 포함하는 숙주 세포 게놈의 부위 또는 유전자좌 내로의 asd, dapB 또는 ddh 유전자의 통합을 촉진할 수 있다. 통합은 재결합 이벤트를 통해 이루어질 수 있다. 조절 서열은 예를 들어 숙주 세포의 유전자 기계에 의해 사용되는 프로모터, 시작, 정지, 신호, 분비 및/또는 종결 서열과 같은 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공된 임의의 조절 서열일 수 있다.
TA 라이브러리
특정 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 TA 유전자의 라이브러리가 본 발명에 제공된다. TA 유전자의 라이브러리는 하나 이상의 TA 유전자를 포함할 수 있다. 라이브러리의 각 TA 유전자는 TA 유전자의 천연 형태 또는 돌연변이 형태일 수 있다. 돌연변이된 형태는 삽입, 결실, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 또는 전위로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 라이브러리의 각 TA 유전자는 TA 유전자일 수 있다. TA 유전자는 당업계에 공지된 원핵 세포(즉, 박테리아 및/또는 고세균)로부터의 임의의 수소전달 효소 유전자일 수 있다. TA 유전자는 당업계에 공지된 진핵 세포(예를 들어, 진균)로부터의 임의의 TA 유전자일 수 있다. TA 유전자는 트레오닌 알돌라제 활성을 포함하는 임의의 단백질로 간주될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 TA는 트레오닌을 아세트알데하이드 및 글리신으로 전환시키는 임의의 효소일 수 있다. 한 실시태양에서, TA 유전자는 내인성 TA보다 느린 속도로 트레오닌을 아세트알데하이드 및 글리신으로 전환시킨다. 한 실시태양에서, TA 유전자는 아세트알데하이드 및 글리신을 트레오닌으로 전환시킨다.
숙주 세포는 본 발명에 제공된 임의의 숙주 세포일 수 있다. 일부 실시태양에서, TA 유전자의 라이브러리는 마이코박테리움(예를 들어, Mycobacterium smegmatis)), 스트렙토마이세스(예를 들어, Streptomyces coelicolor), 자이모모나스(예를 들어, Zymomonas mobilis), 시네코시스티스(예를 들어, Synechocystis sp . PCC6803), 비피도박테리움(예를 들어, Bifidobacterium longum), 에스케리키아(예를 들어, Escherichia coli), 바실러스(예를 들어, Bacillus subtilis), 코리네박테리움(예를 들어, Corynebacterium glutamicum), 사카로마이세스(예를 들어, S. cerevisiae) 또는 이의 조합의 임의의 균주/종/하부종으로부터의 TA 유전자를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 TA 효소는 본 발명에 제공된 TA 효소와 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 또는 75% 서열 동일성을 나타낸다.
라이브러리 내의 각각의 TA 유전자는 기능적으로 연결되거나 이의 천연 프로모터 또는 돌연변이된 형태의 천연 프로모터의 제어하에 연결될 수 있다. 라이브러리 내의 각각의 TA 유전자는 본 발명에 제공된 임의의 프로모터에 기능적으로 연결되거나 제어될 수 있다. TA 유전자 라이브러리 내의 각각의 TA 유전자는 키메라 구조체에 존재할 수 있어서, 유전자는 숙주 세포의 게놈에 존재하는 서열과 하나 이상의 조절 서열 및/또는 서열에 의해 측면에 위치될 수 있다. 숙주 세포에 존재하는 서열과 상동성인 서열은 상보적 서열을 포함하는 숙주 세포 게놈의 부위 또는 유전자좌 내로의 TA 유전자의 통합을 촉진할 수 있다. 통합은 재결합 이벤트를 통해 이루어질 수 있다. 조절 서열은 예를 들어 숙주 세포의 유전자 기계에 의해 사용되는 프로모터, 시작, 정지, 신호, 분비 및/또는 종결 서열과 같은 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공된 임의의 조절 서열일 수 있다.
pyc 라이브러리
특정 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 pyc 유전자의 라이브러리가 본 발명에 제공된다. pyc 유전자의 라이브러리는 하나 이상의 pyc 유전자를 포함할 수 있다. 라이브러리의 각 pyc 유전자는 pyc 유전자의 천연 형태 또는 돌연변이 형태일 수 있다. 돌연변이된 형태는 삽입, 결실, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 또는 전위로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 라이브러리의 각 pyc 유전자는 pyc 유전자일 수 있다. pyc 유전자는 당업계에 공지된 원핵 세포(즉, 박테리아 및/또는 고세균)로부터의 임의의 수소전달 효소 유전자일 수 있다. pyc 유전자는 당업계에 공지된 진핵 세포(예를 들어, 진균)로부터의 임의의 pyc 유전자일 수 있다. pyc 유전자는 피루베이트 카복실라제 활성을 포함하는 임의의 단백질로 간주될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 pyc는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 임의의 효소일 수 있다.
숙주 세포는 본 발명에 제공된 임의의 숙주 세포일 수 있다. 일부 실시태양에서, pyc 유전자의 라이브러리는 마이코박테리움(예를 들어, Mycobacterium smegmatis)), 스트렙토마이세스(예를 들어, Streptomyces coelicolor), 자이모모나스(예를 들어, Zymomonas mobilis), 시네코시스티스(예를 들어, Synechocystis sp . PCC6803), 비피도박테리움(예를 들어, Bifidobacterium longum), 에스케리키아(예를 들어, Escherichia coli), 바실러스(예를 들어, Bacillus subtilis), 코리네박테리움(예를 들어, Corynebacterium glutamicum), 사카로마이세스(예를 들어, S. cerevisiae) 또는 이의 조합의 임의의 균주/종/하부종으로부터의 pyc 유전자를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 pyc 효소는 본 발명에 제공된 pyc 효소와 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 또는 75% 서열 동일성을 나타낸다.
라이브러리 내의 각각의 pyc 유전자는 기능적으로 연결되거나 이의 천연 프로모터 또는 돌연변이된 형태의 천연 프로모터의 제어하에 연결될 수 있다. 라이브러리 내의 각각의 pyc 유전자는 본 발명에 제공된 임의의 프로모터에 기능적으로 연결되거나 제어될 수 있다. pyc 유전자 라이브러리 내의 각각의 pyc 유전자는 키메라 구조체에 존재할 수 있어서, 유전자는 숙주 세포의 게놈에 존재하는 서열과 하나 이상의 조절 서열 및/또는 서열에 의해 측면에 위치될 수 있다. 숙주 세포에 존재하는 서열과 상동성인 서열은 상보적 서열을 포함하는 숙주 세포 게놈의 부위 또는 유전자좌 내로의 pyc 유전자의 통합을 촉진할 수 있다. 통합은 재결합 이벤트를 통해 이루어질 수 있다. 조절 서열은 예를 들어 숙주 세포의 유전자 기계에 의해 사용되는 프로모터, 시작, 정지, 신호, 분비 및/또는 종결 서열과 같은 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공된 임의의 조절 서열일 수 있다.
gapA 유전자의 돌연변이 형태의 생성
본 발명에 제공된 바와 같이, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 gapA 유전자는 이것이 유래된 유전자의 돌연변이 형태일 수 있다. 돌연변이된 유전자는 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공된 임의의 방식으로 돌연변이될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 게놈 DNA의 선택된 부분을 도입, 결실 또는 대체함으로써 세포 집단을 돌연변이 시키는 것을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 돌연변이를 특정 유전자좌(예를 들어, gapA)로 표적화하는 방법을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 표적 DNA 영역을 선택적으로 편집하기 위해 ZFN, TALENS 또는 CRISPR과 같은 유전자 편집 기술의 사용을 교시한다. 세포 집단의 돌연변이 후, 표적화된 돌연변이는 세포로부터 단리될 수 있고 이어서 gapA 유전자의 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체 외부에서 선택된 DNA 영역(예를 들어, gapA 유전자)을 돌연변이 시키는 것을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 천연 gapA 유전자를 돌연변이 시키는 것을 교시한다.
일부 실시태양에서, DNA의 선택된 영역은 자연 변이체의 유전자 셔플링 또는 합성 올리고체, 플라스미드-플라스미드 재조합, 바이러스 플라스미드 재조합, 바이러스-바이러스 재조합에 의한 셔플링을 통해 시험관 내에서 생성된다. 다른 실시태양에서, 게놈 영역은 에러-유발 PCR(error-prone PCR) 또는 위치-지정 돌연변이를 통해 생성된다.
일부 실시태양에서, gapA 유전자를 함유하는 선택된 유전자 영역에서의 돌연변이 생성은 "재조립 PCR"에 의해 달성된다. 간략하게, 올리고뉴클레오타이드 프라이머(올리고)는 관심 핵산 서열(예를 들어, gapA 유전자)의 단편의 PCR 증폭을 위해 합성되어, 올리고뉴클레오타이드의 서열은 두 단편의 교차점과 겹쳐진다. 겹쳐진 영역은 전형적으로 약 10 내지 100개 뉴클레오타이드 길이이다. 단편의 각각은 이런 프라이머 세트로 증폭된다. 그런 다음 PCR 제품은 재조립 프로토콜에 따라 "재조립"된다. 요약하면, 어셈블리 프로토콜에서, PCR 생성물은 먼저, 예를 들어, 겔 전기영동 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 프라이머로부터 정제된다. 정제된 생성물은 함께 혼합되고 추가 프라이머가 없이 중합 효소 및 데옥시뉴클레오시드 트라이포스페이트(dNTP's) 및 적절한 버퍼 염의 존재하에서 약 1-10 사이클의 변성, 재어닐링 및 확장이 실시된다("셀프-프라이밍"). 유전자에 인접한 프라이머로 후속 PCR이 사용되어 완전히 재조합되고 뒤섞인 유전자의 수율을 증폭시킨다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 위에서 논의한 것과 같은 돌연변이된 gapA DNA 영역이 돌연변이체 서열에 대해 농축되어 다중 돌연변이체 스펙트럼, 즉 돌연변이의 가능한 조합이 보다 효율적으로 표본 추출된다. 일부 실시태양에서, 돌연변이된 서열은 재조립 반응 이전에 시험관 내에서 친화성-정제 물질을 증폭시키는 바람직한 단계 의해 mutS 단백질 친화성 매트릭스를 통해 확인된다(Wagner et al., Nucleic Acids Res. 23(19):3944-3948 (1995); Su et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 83:5057-5061(1986)). 그런 후에 이 증폭된 물질은 조립 또는 재조립 PCR 반응에 투입된다.
일부 실시태양에서, 돌연변이된 gapA DNA 영역은 자연적으로 발견된다.
니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자의 돌연변이 형태의 생성
본 발명에 제공된 바와 같이, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자는 이것이 유래된 유전자의 돌연변이 형태일 수 있다. 돌연변이된 유전자는 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공된 임의의 방식으로 돌연변이될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 게놈 DNA의 선택된 부분을 도입, 결실 또는 대체함으로써 세포 집단을 돌연변이 시키는 것을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 돌연변이를 특정 유전자좌(예를 들어, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소)로 표적화하는 방법을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 표적 DNA 영역을 선택적으로 편집하기 위해 ZFN, TALENS 또는 CRISPR과 같은 유전자 편집 기술의 사용을 교시한다. 세포 집단의 돌연변이 후, 표적화된 돌연변이는 세포로부터 단리될 수 있고 이어서 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자의 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체 외부에서 선택된 DNA 영역(예를 들어, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자)을 돌연변이 시키는 것을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 천연 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자를 돌연변이 시키는 것을 교시한다.
일부 실시태양에서, DNA의 선택된 영역은 자연 변이체의 유전자 셔플링 또는 합성 올리고체, 플라스미드-플라스미드 재조합, 바이러스 플라스미드 재조합, 바이러스-바이러스 재조합에 의한 셔플링을 통해 시험관 내에서 생성된다. 다른 실시태양에서, 게놈 영역은 에러-유발 PCR(error-prone PCR) 또는 위치-지정 돌연변이를 통해 생성된다.
특정 실시태양에서, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자를 함유하는 선택된 유전자 영역에서의 돌연변이 생성은 "재조립 PCR"에 의해 달성된다.
일부 실시태양에서, 위에서 논의한 것과 같은 돌연변이된 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 DNA 영역이 돌연변이체 서열에 대해 농축되어 다중 돌연변이체 스펙트럼, 즉 돌연변이의 가능한 조합이 보다 효율적으로 표본 추출된다. 일부 실시태양에서, 돌연변이된 서열은 재조립 반응 이전에 시험관 내에서 친화성-정제 물질을 증폭시키는 바람직한 단계 의해 mutS 단백질 친화성 매트릭스를 통해 확인된다. 그런 후에 이 증폭된 물질은 조립 또는 재조립 PCR 반응에 투입된다.
일부 실시태양에서, 돌연변이된 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 DNA 영역은 자연적으로 발견된다.
gdh , asd , dapB , 및/또는 ddh 유전자의 돌연변이 형태의 생성
본 발명에 제공된 바와 같이, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 gdh, asd, dapB, 또는 ddh 유전자는 이것이 유래된 유전자의 돌연변이 형태일 수 있다. 돌연변이된 유전자는 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공된 임의의 방식으로 돌연변이될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 게놈 DNA의 선택된 부분을 도입, 결실 또는 대체함으로써 세포 집단을 돌연변이 시키는 것을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 돌연변이를 특정 유전자좌(예를 들어, gdh, asd, dapB, 또는 ddh)로 표적화하는 방법을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 표적 DNA 영역을 선택적으로 편집하기 위해 ZFN, TALENS 또는 CRISPR과 같은 유전자 편집 기술의 사용을 교시한다. 세포 집단의 돌연변이 후, 표적화된 돌연변이는 세포로부터 단리될 수 있고 이어서 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자의 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체 외부에서 선택된 DNA 영역(예를 들어, gdh, asd, dapB, 또는 ddh 유전자)을 돌연변이 시키는 것을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 천연 gdh, asd, dapB, 또는 ddh 유전자를 돌연변이 시키는 것을 교시한다.
일부 실시태양에서, DNA의 선택된 영역은 자연 변이체의 유전자 셔플링 또는 합성 올리고체, 플라스미드-플라스미드 재조합, 바이러스 플라스미드 재조합, 바이러스-바이러스 재조합에 의한 셔플링을 통해 시험관 내에서 생성된다. 다른 실시태양에서, 게놈 영역은 에러-유발 PCR(error-prone PCR) 또는 위치-지정 돌연변이를 통해 생성된다.
특정 실시태양에서, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자를 함유하는 선택된 유전자 영역에서의 돌연변이 생성은 "재조립 PCR"에 의해 달성된다.
일부 실시태양에서, 위에서 논의한 것과 같은 돌연변이된 gdh, asd, dapB, 및/또는 ddh DNA 영역이 돌연변이체 서열에 대해 농축되어 다중 돌연변이체 스펙트럼, 즉 돌연변이의 가능한 조합이 보다 효율적으로 표본 추출된다. 일부 실시태양에서, 돌연변이된 서열은 재조립 반응 이전에 시험관 내에서 친화성-정제 물질을 증폭시키는 바람직한 단계 의해 mutS 단백질 친화성 매트릭스를 통해 확인된다. 그런 후에 이 증폭된 물질은 조립 또는 재조립 PCR 반응에 투입된다.
일부 실시태양에서, 돌연변이된 또는 변이체 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh DNA 영역은 자연적으로 발견된다. 특정 실시태양에서, C. 글루타미쿰 ddh의 자연 발생 변이체는 A. 오리스(A. oris), H. 아키아온(H. archaeon), 코프로바실러스(coprobacillus), M. 하 운디네시아(M. harundinacea), M. 마이크로누시포르미스(M. micronuciformis), A. 데니트리피칸스(A. denitrificans), M. 루테우스(M. luteus), B. 페시움(B. faecium) 및 카노박테리움(carnobacterium)을 포함하나 이에 제한되지 않는 박테리아에서 발견된다. 특정 실시태양에서, C. 글루타미쿰 asd의 자연 발생 변이체는 M. 잔나스키(M. jannaschii), S. 유시타투스(S. usitatus), N. 이너몽골리쿠스(N. innermongolicus), C. 아우랑티쿠스(C. aurantiacus), L. 아길리스(L. agilis), B. 풀루럼(B. pullorum), B. 박테리움(B. bacterium), M. 한수푸스(M. hansupus) 및 P. 사비내(P. sabinae)를 포함하나 이에 제한되지 않는 박테리아에서 발견된다. 일부 실시태양에서, C. 글루타미쿰 gdh의 자연 발생 변이체는 C. 심비오섬(C. symbiosum)을 포함하나 이에 제한되지 않는 박테리아에서 발견된다. 일부 실시태양에서, 대장균을 포함하나 이에 제한되지 않는 박테리아에서 C. 글루타미쿰 dapB의 자연 변이체가 발견된다. 특정 실시태양에서, C. 글루타미쿰 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh의 자연 발생 변이체는 유기체(예를 들어, 박테리아)에서 게놈 전체 상동성 검색을 수행함으로써 발견된다.
TA 유전자의 돌연변이 형태의 생성
본 발명에 제공된 바와 같이, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 TA 유전자는 이것이 유래된 유전자의 돌연변이 형태일 수 있다. 돌연변이된 유전자는 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공된 임의의 방식으로 돌연변이될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 게놈 DNA의 선택된 부분을 도입, 결실 또는 대체함으로써 세포 집단을 돌연변이 시키는 것을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 돌연변이를 특정 유전자좌(예를 들어, TA)로 표적화하는 방법을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 표적 DNA 영역을 선택적으로 편집하기 위해 ZFN, TALENS 또는 CRISPR과 같은 유전자 편집 기술의 사용을 교시한다. 세포 집단의 돌연변이 후, 표적화된 돌연변이는 세포로부터 단리될 수 있고 이어서 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자의 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체 외부에서 선택된 DNA 영역(예를 들어, TA 유전자)을 돌연변이 시키는 것을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 천연 TA 유전자를 돌연변이 시키는 것을 교시한다.
일부 실시태양에서, DNA의 선택된 영역은 자연 변이체의 유전자 셔플링 또는 합성 올리고체, 플라스미드-플라스미드 재조합, 바이러스 플라스미드 재조합, 바이러스-바이러스 재조합에 의한 셔플링을 통해 시험관 내에서 생성된다. 다른 실시태양에서, 게놈 영역은 에러-유발 PCR(error-prone PCR) 또는 위치-지정 돌연변이를 통해 생성된다.
특정 실시태양에서, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자를 함유하는 선택된 유전자 영역에서의 돌연변이 생성은 "재조립 PCR"에 의해 달성된다.
일부 실시태양에서, 위에서 논의한 것과 같은 돌연변이된 TA DNA 영역이 돌연변이체 서열에 대해 농축되어 다중 돌연변이체 스펙트럼, 즉 돌연변이의 가능한 조합이 보다 효율적으로 표본 추출된다. 일부 실시태양에서, 돌연변이된 서열은 재조립 반응 이전에 시험관 내에서 친화성-정제 물질을 증폭시키는 바람직한 단계 의해 mutS 단백질 친화성 매트릭스를 통해 확인된다. 그런 후에 이 증폭된 물질은 조립 또는 재조립 PCR 반응에 투입된다.
일부 실시태양에서, 돌연변이된 또는 변이체 TA DNA 영역은 자연적으로 발견된다. 특정 실시태양에서, C. 글루타미쿰 pyc의 자연 발생 변이체는 A. 오리스(A. oris), H. 아키아온(H. archaeon), 코프로바실러스(coprobacillus), M. 하운디네시아(M. harundinacea), M. 마이크로누시포르미스(M. micronuciformis), A. 데니트리피칸스(A. denitrificans), M. 루테우스(M. luteus), B. 페시움(B. faecium) 및 카노박테리움(carnobacterium)을 포함하나 이에 제한되지 않는 박테리아에서 발견된다. 특정 실시태양에서, C. 글루타미쿰 TA의 천연 발생 변이체는 유기체(예를 들어, 박테리아)에서 게놈 전체 상동성 검색을 수행함으로써 발견된다.
pyc 유전자의 돌연변이 형태의 생성
본 발명에 제공된 바와 같이, 본 발명에 제공된 방법에 사용하기 위한 pyc 유전자는 이것이 유래된 유전자의 돌연변이 형태일 수 있다. 돌연변이된 유전자는 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공된 임의의 방식으로 돌연변이될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 게놈 DNA의 선택된 부분을 도입, 결실 또는 대체함으로써 세포 집단을 돌연변이 시키는 것을 교시한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 돌연변이를 특정 유전자좌(예를 들어, pyc)로 표적화하는 방법을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 표적 DNA 영역을 선택적으로 편집하기 위해 ZFN, TALENS 또는 CRISPR과 같은 유전자 편집 기술의 사용을 교시한다. 세포 집단의 돌연변이 후, 표적화된 돌연변이는 세포로부터 단리될 수 있고 이어서 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자의 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체 외부에서 선택된 DNA 영역(예를 들어, pyc 유전자)을 돌연변이 시키는 것을 교시한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명은 천연 pyc 유전자를 돌연변이 시키는 것을 교시한다.
일부 실시태양에서, DNA의 선택된 영역은 자연 변이체의 유전자 셔플링 또는 합성 올리고체, 플라스미드-플라스미드 재조합, 바이러스 플라스미드 재조합, 바이러스-바이러스 재조합에 의한 셔플링을 통해 시험관 내에서 생성된다. 다른 실시태양에서, 게놈 영역은 에러-유발 PCR(error-prone PCR) 또는 위치-지정 돌연변이를 통해 생성된다.
일부 실시태양에서, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자를 함유하는 선택된 유전자 영역에서의 돌연변이 생성은 "재조립 PCR"에 의해 달성된다.
일부 실시태양에서, 위에서 논의한 것과 같은 돌연변이된 pyc DNA 영역이 돌연변이체 서열에 대해 농축되어 다중 돌연변이체 스펙트럼, 즉 돌연변이의 가능한 조합이 보다 효율적으로 표본 추출된다. 일부 실시태양에서, 돌연변이된 서열은 재조립 반응 이전에 시험관 내에서 친화성-정제 물질을 증폭시키는 바람직한 단계 의해 mutS 단백질 친화성 매트릭스를 통해 확인된다. 그런 후에 이 증폭된 물질은 조립 또는 재조립 PCR 반응에 투입된다.
일부 실시태양에서, 돌연변이된 또는 변이체 pyc DNA 영역은 자연적으로 발견된다. 특정 실시태양에서, C. 글루타미쿰 pyc의 자연 발생 변이체는 A. 오리스(A. oris), H. 아키아온(H. archaeon), 코프로바실러스(coprobacillus), M. 하운디네시아(M. harundinacea), M. 마이크로누시포르미스(M. micronuciformis), A. 데니트리피칸스(A. denitrificans), M. 루테우스(M. luteus), B. 페시움(B. faecium) 및 카노박테리움(carnobacterium)을 포함하나 이에 제한되지 않는 박테리아에서 발견된다. 특정 실시태양에서, C. 글루타미쿰 pyc의 천연 발생 변이체는 유기체(예를 들어, 박테리아)에서 게놈 전체 상동성 검색을 수행함으로써 발견된다.
gapA 유전자를 포함하는 라이브러리의 생성
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체의 gapA 유전자를 포함하는 DNA 절편을 삽입 및/또는 교체 및/또는 결실하는 것을 교시한다. 일부 양태에서, 본 발명에 교시된 방법은 숙주 유기체의 게놈 속에 포함될 수 있는 관심 올리고뉴클레오타이드(즉, gapA 절편)를 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, gapA DNA 절편은 공지된 주형으로부터의 복제 또는 절단, 돌연변이 또는 DNA 합성을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 얻을 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열(예를 들어, GeneArt™, GeneMaker™,　GenScript™, Anagen™, Blue Heron™, Entelechon™, GeNOsys, Inc., 또는 Qiagen™)을 생산하기 위한 구입가능한 유전자 합성 생성물과 양립 가능하다.
일부 실시태양에서, gapA DNA 절편은 숙주 유기체의 선택된 DNA 영역에 글루코오스 gapA DNA 절편을 포함시키도록(예를 들어, 유용한 GAPDH 활성을 첨가하여) 디자인된다. 특정 실시태양에서, 선택된 DNA 영역은 중성 통합 부위이다. 다른 실시태양에서, gapA DNA 절편은 숙주 유기체의 DNA로부터 천연 gapA 유전자를 제거하도록(예를 들어, 천연 GAPDH 활성을 제거하도록) 디자인된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용된 gapA 유전자는 당업계에 공지된 효소적 또는 화학적 합성 방법 중 임의의 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드로서 여러 단계로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 제어된 공극 유리(CPG), 폴리스티렌 비드 또는 CPG를 함유할 수 있는 열가소성 폴리머로 구성된 막과 같은 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 미세유체역학(Tian et al., Mol. BioSyst., 5, 714-722 (2009)) 또는 둘 다의 조합을 제공하는 공지된 기술(Jacobsen et al., 미국 특허 출원 제2011/0172127호 참조)을 사용하여 병렬 마이크로스케일로 어레이 상에서 합성될 수 있다.
어레이 상에 또는 미세유체역학을 통한 합성은 더욱 낮은 시약 사용을 통해 비용을 감소시킴으로써 통상적인 고체 지지체 합성에 비해 이점을 제공한다. 유전자 합성에 필요한 규모는 작아서, 어레이 또는 미세유체역학을 통해 합성된 올리고뉴클레오타이드 생성물의 규모가 허용가능하다. 그러나, 합성된 올리고뉴클레오타이드는 고체 지지체 합성을 사용할 때보다 품질이 떨어진다(이하의 Tian 참조; 또한 Staehler et al., U.S. Pat. App. No. 2010/0216648 참조).
1980년대에 처음으로 기술되었기 때문에 종래의 4단계 포스포아미다이트 화학에서 많은 발전이 이루어져왔다(예를 들어, Sierzchala, et al.　J. Am. Chem . Soc.,　125, 13427-13441 (2003) using peroxy deprotection; Hayakawa et al., U.S. Pat. No. 6,040,439 for alternative protecting groups; Azhayev et al,　Tetrahedron　57, 4977-4986 (2001) for universal supports; Kozlov et al.,　Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids,　24 (5-7), 1037-1041 (2005) for improved synthesis of longer oligonucleotides through the use of large-pore CPG; and Damha et al.,　NAR,　18, 3813-3821 (1990) for improved derivatization 참조)
합성 유형에 관계없이, 생성된 올리고뉴클레오타이드는 더욱 긴 올리고뉴클레오타이드(즉, gapA 유전자)를 위한 더 작은 빌딩 블록을 형성할 수 있다. 일부 실시태양에서, 더 작은 올리고뉴클레오타이드는 폴리머라제 연쇄 조립(PCA), 리가아제 연쇄 반응(LCR) 및 열역학적으로 균형 잡힌 인사이드-아웃 합성(TBIO)과 같은 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 함께 결합될 수 있다(Czar et al. Trends in Biotechnology, 27, 63-71 (2009) 참조). PCA에서, 원하는 긴 제품의 전체 길이에 걸쳐있는 올리고뉴클레오타이드는 어닐링되고 여러 사이클(일반적으로 약 55 사이클)에서 연장되어 전장 생성물을 최종적으로 얻는다. LCR은 리가아제 효소를 사용하여 제 3 올리고뉴클레오타이드에 모두 어닐링되는 두 올리고뉴클레오타이드에 연결시킨다. TBIO 합성은 목적 생성물의 중심에서 시작하여 유전자의 5' 말단에서 포워드 가닥과 상동성이고 유전자의 3' 말단에서 리버스 가닥과 상동성인 중첩 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로써 점진적으로 양방향으로 연장된다.
더 큰 이중 가닥 DNA 단편을 합성하는 다른 방법은 상위-가닥 PCR(TSP)을 통해 더 작은 올리고뉴클레오타이드를 조합하는 것이다. 이 방법에서, 복수의 올리고뉴클레오타이드는 원하는 생성물의 전체 길이에 걸쳐 있고 인접한 올리고뉴클레오타이드(들)에 중첩 영역을 포함한다. 증폭은 범용 포워드 및 리버스 프라이머로 수행될 수 있으며, 증폭의 다중 사이클을 통해 전장 이중 가닥 DNA 생성물이 형성된다. 이런 생성물은 선택적인 오류 보정 및 원하는 이중 가닥 DNA 단편 최종 생성물을 생성하는 추가 증폭을 진행될 수 있다.
TSP의 한 방법에서, 전장의 원하는 생성물을 형성하도록 결합되어질 더 작은 올리고뉴클레오타이드의 세트는 40-200개 염기 길이이고 적어도 약 15-20개 염기만큼 서로 중첩된다. 실제적인 목적을 위해, 중첩 영역은 올리고뉴클레오타이드의 특정 어닐링을 보장할 만큼 충분히 길어야 하고 사용된 반응 온도에서 어닐링하기에 충분한 높은 용융 온도(Tm)를 가져야 한다. 중첩은 소정의 올리고뉴클레오타이드가 인접한 올리고뉴클레오타이드에 의해 완전히 중첩되는 지점까지 연장될 수 있다. 중첩의 양은 최종 생성물의 품질에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 어셈블리의 첫 번째 및 마지막 올리고뉴클레오타이드 빌딩 블록은 포워드 및 리버스 증폭 프라이머에 대한 결합 위치를 포함해야 한다. 한 실시태양에서, 첫 번째 및 마지막 올리고뉴클레오타이드의 최종 말단 서열은 보편적 프라이머의 사용을 허용하도록 상보성의 동일한 서열을 포함한다.
니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자를 포함하는 라이브러리의 생성
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체의 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자를 포함하는 DNA 절편을 삽입 및/또는 교체 및/또는 결실하는 것을 교시한다. 일부 양태에서, 본 발명에 교시된 방법은 숙주 유기체의 게놈 속에 포함될 수 있는 관심 올리고뉴클레오타이드(즉, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 절편)를 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 DNA 절편은 공지된 주형으로부터의 복제 또는 절단, 돌연변이 또는 DNA 합성을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 얻을 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열(예를 들어, GeneArt™, GeneMaker™,　GenScript™, Anagen™, Blue Heron™, Entelechon™, GeNOsys, Inc., 또는 Qiagen™)을 생산하기 위한 구입가능한 유전자 합성 생성물과 양립 가능하다.
일부 실시태양에서, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 DNA 절편은 숙주 유기체의 선택된 DNA 영역에 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 DNA 절편을 포함시키도록(예를 들어, 유용한 수소전달 효소 활성을 첨가하여) 디자인된다. 특정 실시태양에서, 선택된 DNA 영역은 중성 통합 부위이다. 다른 실시태양에서, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 DNA 절편은 숙주 유기체의 DNA로부터 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자를 제거하도록(예를 들어, 천연 수소전달 효소 활성을 제거하도록) 디자인된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용된 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자는 당업계에 공지된 효소적 또는 화학적 합성 방법 중 임의의 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드로서 여러 단계로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 제어된 공극 유리(CPG), 폴리스티렌 비드 또는 CPG를 함유할 수 있는 열가소성 폴리머로 구성된 막과 같은 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 미세유체역학 또는 둘 다의 조합을 제공하는 공지된 기술을 사용하여 병렬 마이크로스케일로 어레이 상에서 합성될 수 있다.
어레이 상에 또는 미세유체역학을 통한 합성은 더욱 낮은 시약 사용을 통해 비용을 감소시킴으로써 통상적인 고체 지지체 합성에 비해 이점을 제공한다. 유전자 합성에 필요한 규모는 작아서, 어레이 또는 미세유체역학을 통해 합성된 올리고뉴클레오타이드 생성물의 규모가 허용 가능하다. 그러나, 합성된 올리고뉴클레오타이드는 고체 지지체 합성을 사용할 때보다 품질이 떨어진다.
1980년대에 처음으로 기술되었기 때문에 종래의 4단계 포스포아미다이트 화학에서 많은 발전이 이루어져왔다(예를 들어, Sierzchala, et al.　J. Am. Chem . Soc.,　125, 13427-13441 (2003) using peroxy deprotection; Hayakawa et al., U.S. Pat. No. 6,040,439 for alternative protecting groups; Azhayev et al,　Tetrahedron　57, 4977-4986 (2001) for universal supports; Kozlov et al.,　Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids,　24 (5-7), 1037-1041 (2005) for improved synthesis of longer oligonucleotides through the use of large-pore CPG; and Damha et al.,　NAR ,　18, 3813-3821 (1990) for improved derivatization 참조)
합성 유형에 관계없이, 생성된 올리고뉴클레오타이드는 더욱 긴 올리고뉴클레오타이드(즉, 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자)를 위한 더 작은 빌딩 블록을 형성할 수 있다. 일부 실시태양에서, 더 작은 올리고뉴클레오타이드는 폴리머라제 연쇄 조립(PCA), 리가아제 연쇄 반응(LCR) 및 열역학적으로 균형 잡힌 인사이드-아웃 합성(TBIO)과 같은 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 함께 결합될 수 있다.
더 큰 이중 가닥 DNA 단편을 합성하는 다른 방법은 상위-가닥 PCR(TSP)을 통해 더 작은 올리고뉴클레오타이드를 조합하는 것이다. TSP의 한 방법에서, 전장의 원하는 생성물을 형성하도록 결합되어질 더 작은 올리고뉴클레오타이드의 세트는 40-200개 염기 길이이고 적어도 약 15-20개 염기만큼 서로 중첩된다. 실제적인 목적을 위해, 중첩 영역은 올리고뉴클레오타이드의 특정 어닐링을 보장할 만큼 충분히 길어야 하고 사용된 반응 온도에서 어닐링하기에 충분한 높은 용융 온도(Tm)를 가져야 한다. 중첩은 소정의 올리고뉴클레오타이드가 인접한 올리고뉴클레오타이드에 의해 완전히 중첩되는 지점까지 연장될 수 있다. 중첩의 양은 최종 생성물의 품질에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 어셈블리의 첫 번째 및 마지막 올리고뉴클레오타이드 빌딩 블록은 포워드 및 리버스 증폭 프라이머에 대한 결합 위치를 포함해야 한다. 한 실시태양에서, 첫 번째 및 마지막 올리고뉴클레오타이드의 최종 말단 서열은 보편적 프라이머의 사용을 허용하도록 상보성의 동일한 서열을 포함한다.
피루베이트 카복실라제 변형
피루베이트 카복실라제는 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 단편을 함유하는 발현 벡터로부터 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 대안적으로, 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 단편은 숙주의 염색체에 통합될 수 있다. 숙주 세포에 대해 이종성 또는 내인성이든 핵산 서열은, 예를 들어, 상동성 재조합을 사용하여 박테리아 염색체에 도입될 수 있다. 먼저, 관심 유전자 및 약물 내성 마커를 암호화하는 유전자는 관심 유전자가 삽입될 염색체의 영역과 상동성인 DNA 조각을 함유하는 플라스미드에 삽입된다. 다음으로, 이 재조합 DNA가 박테리아에 도입되고, 관심 유전자 및 약물 내성 마커를 함유하는 DNA 단편이 원하는 위치에서 염색체로 재조합된 클론이 선택된다. 유전자 및 약물 내성 마커는 임의의 클로닝 벡터로부터 제조된 선형화된 DNA 조각으로서 또는 박테리아 숙주에서 복제할 수 없는 특수한 재조합 자살 벡터의 일부로서 형질 전환을 통해 박테리아에 도입될 수 있다. 선형화된 DNA의 경우, recD- 숙주가 사용되어 원하는 재조합체가 수득되는 빈도를 증가시킬 수 있다. 이어서, 클론은 삽입 영역에 걸쳐 DNA를 증폭시키는 PCR 및 프라이머를 사용하여 확인된다. 비 재조합 클론의 PCR 생성물은 크기가 더 작고 삽입 이벤트가 발생하는 염색체 영역만을 포함하는 반면, 재조합 클론의 PCR 생성물은 크기가 더 크고 염색체 영역 + 삽입된 유전자 및 약물 내성의 영역을 함유할 것이다.
한 바람직한 실시태양에서, 숙주 세포, 바람직하게는 대장균, C. 글루타미쿰, B. 플라범 또는 B. 락토페르멘텀은 피루베이트 카복실라제 유전자, 바람직하게는 R. 에틸리 또는 P. 플루오레센스로부터 단리된 유전자, 더욱 바람직하게는 R. 에틸리로부터 단리된 pyc 유전자를 포함하는 핵산 단편으로 형질 전환되어, 유전자가 숙주 세포에서 전사되고 발현되어 필적할만한 야생형 세포와 비교하여, 옥살로아세테이트의 생산을 증가시키고, 결과적으로 관심 하류 대사산물의 생산을 증가시킨다.
본 발명의 대사적으로 조작된 세포는 피루베이트 카복실라제를 과발현한다. 다른 방식으로 말하면, 대사적으로 조작된 세포는 필적할만한 야생형 세포에서 발현된 피루베이트 카복실라제의 수준보다 높은 수준으로 피루베이트 카복실라제를 발현한다. 이러한 비교는 당업자에 의해 임의의 여러 방식으로 이루어질 수 있으며 필적할만한 성장 조건하에서 수행된다. 예를 들어, 피루베이트 카복실라제 활성은 페인 및 모리스의 방법을 사용하여 정량화되고 비교될 수 있다(J. Gen. Microbiol., 59, 97-101 (1969)). 피루베이트 카복실라제를 과발현하는 대사적으로 조작된 세포는 이 분석에서 야생형 세포보다 더 큰 활성을 생성할 것이다. 추가로, 또는 대안적으로, 피루베이트 카복실라제의 양은 세포로부터 단백질 추출물을 제조하고, 이를 SDS-PAGE에 적용하여, 이를 웨스턴 블롯으로 옮긴 다음, 웨스턴 블롯 상에서 바이오티닐화된 단백질을 가시화하기 위해, 예를 들어, 피어스 케미칼 컴퍼니(Rockford, Ill.), 시그마 케미칼 컴퍼니(St. Louis, Mo.) 또는 베링거 만하임(Indianapolis, Ind.)으로부터 구입한 검출 키트를 사용하여 바이오티닐화된 피루베이트 카복실라제 단백질을 검출함으로써 정량화하고 비교될 수 있다. 일부 적합한 숙주 세포에서, 조작되지 않은 야생형 세포에서 피루베이트 카복실라제 발현은 검출 가능한 수준 미만일 수 있다.
gdh , asd , dapB 및/또는 ddh 유전자를 포함하는 라이브러리의 생성
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체의 gdh, asd, dapB 또는 ddh 유전자를 포함하는 DNA 절편을 삽입 및/또는 교체 및/또는 결실하는 것을 교시한다. 일부 양태에서, 본 발명에 교시된 방법은 숙주 유기체의 게놈 속에 포함될 수 있는 관심 올리고뉴클레오타이드(즉, gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 절편)를 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh DNA 절편은 공지된 주형으로부터의 복제 또는 절단, 돌연변이 또는 DNA 합성을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 얻을 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열(예를 들어, GeneArt™, GeneMaker™,　GenScript™, Anagen™, Blue Heron™, Entelechon™, GeNOsys, Inc., 또는 Qiagen™)을 생산하기 위한 구입가능한 유전자 합성 생성물과 양립 가능하다.
일부 실시태양에서, gdh, asd, dapB 및/또는 ddh DNA 절편은 숙주 유기체의 선택된 DNA 영역에 하나 이상의 글루코오스 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh DNA 절편을 포함시키도록(예를 들어, 하나 이상의 유용한 글루타메이트 탈수소 효소, 아스파르테이트 세미데하이드 탈수소 효소, 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소 및/또는 meso-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소 활성을 첨가하여) 디자인된다. 특정 실시태양에서, 선택된 DNA 영역은 중성 통합 부위이다. 다른 실시태양에서, gdh, asd, dapB 및/또는 ddh DNA 절편은 숙주 유기체의 DNA로부터 하나 이상의 천연 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자를 제거하도록(예를 들어, 천연 글루타메이트 탈수소 효소, 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소, 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소 및/또는 meso-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소 활성을 제거하도록) 디자인된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용된 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자는 당업계에 공지된 효소적 또는 화학적 합성 방법 중 임의의 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드로서 여러 단계로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 제어된 공극 유리(CPG), 폴리스티렌 비드 또는 CPG를 함유할 수 있는 열가소성 폴리머로 구성된 막과 같은 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 미세유체역학 또는 둘 다의 조합을 제공하는 공지된 기술을 사용하여 병렬 마이크로스케일로 어레이 상에서 합성될 수 있다.
어레이 상에 또는 미세유체역학을 통한 합성은 더욱 낮은 시약 사용을 통해 비용을 감소시킴으로써 통상적인 고체 지지체 합성에 비해 이점을 제공한다. 유전자 합성에 필요한 규모는 작아서, 어레이 또는 미세유체역학을 통해 합성된 올리고뉴클레오타이드 생성물의 규모가 허용 가능하다. 그러나, 합성된 올리고뉴클레오타이드는 고체 지지체 합성을 사용할 때보다 품질이 떨어진다.
1980년대에 처음으로 기술되었기 때문에 종래의 4단계 포스포아미다이트 화학에서 많은 발전이 이루어져왔다(예를 들어, Sierzchala, et al.　J. Am. Chem . Soc.,　125, 13427-13441 (2003) using peroxy deprotection; Hayakawa et al., U.S. Pat. No. 6,040,439 for alternative protecting groups; Azhayev et al,　Tetrahedron　57, 4977-4986 (2001) for universal supports; Kozlov et al.,　Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids,　24 (5-7), 1037-1041 (2005) for improved synthesis of longer oligonucleotides through the use of large-pore CPG; and Damha et al.,　NAR ,　18, 3813-3821 (1990) for improved derivatization 참조)
합성 유형에 관계없이, 생성된 올리고뉴클레오타이드는 더욱 긴 올리고뉴클레오타이드(즉, gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자)를 위한 더 작은 빌딩 블록을 형성할 수 있다. 일부 실시태양에서, 더 작은 올리고뉴클레오타이드는 폴리머라제 연쇄 조립(PCA), 리가아제 연쇄 반응(LCR) 및 열역학적으로 균형 잡힌 인사이드-아웃 합성(TBIO)과 같은 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 함께 결합될 수 있다.
더 큰 이중 가닥 DNA 단편을 합성하는 다른 방법은 상위-가닥 PCR(TSP)을 통해 더 작은 올리고뉴클레오타이드를 조합하는 것이다. TSP의 한 방법에서, 전장의 원하는 생성물을 형성하도록 결합되어질 더 작은 올리고뉴클레오타이드의 세트는 40-200개 염기 길이이고 적어도 약 15-20개 염기만큼 서로 중첩된다. 실제적인 목적을 위해, 중첩 영역은 올리고뉴클레오타이드의 특정 어닐링을 보장할 만큼 충분히 길어야 하고 사용된 반응 온도에서 어닐링하기에 충분한 높은 용융 온도(Tm)를 가져야 한다. 중첩은 소정의 올리고뉴클레오타이드가 인접한 올리고뉴클레오타이드에 의해 완전히 중첩되는 지점까지 연장될 수 있다. 중첩의 양은 최종 생성물의 품질에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 어셈블리의 첫 번째 및 마지막 올리고뉴클레오타이드 빌딩 블록은 포워드 및 리버스 증폭 프라이머에 대한 결합 위치를 포함해야 한다. 한 실시태양에서, 첫 번째 및 마지막 올리고뉴클레오타이드의 최종 말단 서열은 보편적 프라이머의 사용을 허용하도록 상보성의 동일한 서열을 포함한다.
트레오닌 알돌라제 ( TA ) 유전자를 포함하는 라이브러리의 생성
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체의 TA 유전자를 포함하는 DNA 절편을 삽입 및/또는 교체 및/또는 결실하는 것을 교시한다. 일부 양태에서, 본 발명에 교시된 방법은 숙주 유기체의 게놈 속에 포함될 수 있는 관심 올리고뉴클레오타이드(즉, TA 절편)를 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 TA DNA 절편은 공지된 주형으로부터의 복제 또는 절단, 돌연변이 또는 DNA 합성을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 얻을 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열(예를 들어, GeneArt™, GeneMaker™,　GenScript™, Anagen™, Blue Heron™, Entelechon™, GeNOsys, Inc., 또는 Qiagen™)을 생산하기 위한 구입가능한 유전자 합성 생성물과 양립 가능하다.
일부 실시태양에서, TA DNA 절편은 숙주 유기체의 선택된 DNA 영역에 하나 이상의 TA DNA 절편을 포함시키도록(예를 들어, 트레오닌 알돌라제 활성을 갖는 하나 이상의 유용한 유전자를 첨가하여) 디자인된다. 특정 실시태양에서, 선택된 DNA 영역은 중성 통합 부위이다. 다른 실시태양에서, TA DNA 절편은 숙주 유기체의 DNA로부터 하나 이상의 천연 TA 유전자를 제거하도록(예를 들어, 트레오닌 알돌라제 활성을 가진 하나 이상의 유전자를 제거하도록) 디자인된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용된 TA 유전자는 당업계에 공지된 효소적 또는 화학적 합성 방법 중 임의의 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드로서 여러 단계로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 제어된 공극 유리(CPG), 폴리스티렌 비드 또는 CPG를 함유할 수 있는 열가소성 폴리머로 구성된 막과 같은 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 미세유체역학 또는 둘 다의 조합을 제공하는 공지된 기술을 사용하여 병렬 마이크로스케일로 어레이 상에서 합성될 수 있다.
어레이 상에 또는 미세유체역학을 통한 합성은 더욱 낮은 시약 사용을 통해 비용을 감소시킴으로써 통상적인 고체 지지체 합성에 비해 이점을 제공한다. 유전자 합성에 필요한 규모는 작아서, 어레이 또는 미세유체역학을 통해 합성된 올리고뉴클레오타이드 생성물의 규모가 허용 가능하다. 그러나, 합성된 올리고뉴클레오타이드는 고체 지지체 합성을 사용할 때보다 품질이 떨어진다.
1980년대에 처음으로 기술되었기 때문에 종래의 4단계 포스포아미다이트 화학에서 많은 발전이 이루어져왔다(예를 들어, Sierzchala, et al.　J. Am. Chem . Soc.,　125, 13427-13441 (2003) using peroxy deprotection; Hayakawa et al., U.S. Pat. No. 6,040,439 for alternative protecting groups; Azhayev et al,　Tetrahedron　57, 4977-4986 (2001) for universal supports; Kozlov et al.,　Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids,　24 (5-7), 1037-1041 (2005) for improved synthesis of longer oligonucleotides through the use of large-pore CPG; and Damha et al.,　NAR ,　18, 3813-3821 (1990) for improved derivatization 참조)
합성 유형에 관계없이, 생성된 올리고뉴클레오타이드는 더욱 긴 올리고뉴클레오타이드(즉, TA 유전자)를 위한 더 작은 빌딩 블록을 형성할 수 있다. 일부 실시태양에서, 더 작은 올리고뉴클레오타이드는 폴리머라제 연쇄 조립(PCA), 리가아제 연쇄 반응(LCR) 및 열역학적으로 균형 잡힌 인사이드-아웃 합성(TBIO)과 같은 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 함께 결합될 수 있다.
더 큰 이중 가닥 DNA 단편을 합성하는 다른 방법은 상위-가닥 PCR(TSP)을 통해 더 작은 올리고뉴클레오타이드를 조합하는 것이다. TSP의 한 방법에서, 전장의 원하는 생성물을 형성하도록 결합되어질 더 작은 올리고뉴클레오타이드의 세트는 40-200개 염기 길이이고 적어도 약 15-20개 염기만큼 서로 중첩된다. 실제적인 목적을 위해, 중첩 영역은 올리고뉴클레오타이드의 특정 어닐링을 보장할 만큼 충분히 길어야 하고 사용된 반응 온도에서 어닐링하기에 충분한 높은 용융 온도(Tm)를 가져야 한다. 중첩은 소정의 올리고뉴클레오타이드가 인접한 올리고뉴클레오타이드에 의해 완전히 중첩되는 지점까지 연장될 수 있다. 중첩의 양은 최종 생성물의 품질에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 어셈블리의 첫 번째 및 마지막 올리고뉴클레오타이드 빌딩 블록은 포워드 및 리버스 증폭 프라이머에 대한 결합 위치를 포함해야 한다. 한 실시태양에서, 첫 번째 및 마지막 올리고뉴클레오타이드의 최종 말단 서열은 보편적 프라이머의 사용을 허용하도록 상보성의 동일한 서열을 포함한다.
pyc 유전자를 포함하는 라이브러리의 생성
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체의 pyc 유전자를 포함하는 DNA 절편을 삽입 및/또는 교체 및/또는 결실하는 것을 교시한다. 일부 양태에서, 본 발명에 교시된 방법은 숙주 유기체의 게놈 속에 포함될 수 있는 관심 올리고뉴클레오타이드(즉, pyc 절편)를 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 pyc DNA 절편은 공지된 주형으로부터의 복제 또는 절단, 돌연변이 또는 DNA 합성을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 얻을 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 DNA 서열(예를 들어, GeneArt™, GeneMaker™,　GenScript™, Anagen™, Blue Heron™, Entelechon™, GeNOsys, Inc., 또는 Qiagen™)을 생산하기 위한 구입가능한 유전자 합성 생성물과 양립 가능하다.
일부 실시태양에서, pyc DNA 절편은 숙주 유기체의 선택된 DNA 영역에 하나 이상의 pyc DNA 절편을 포함시키도록(예를 들어, 트레오닌 알돌라제 활성을 갖는 하나 이상의 유용한 유전자를 첨가하여) 디자인된다. 특정 실시태양에서, 선택된 DNA 영역은 중성 통합 부위이다. 다른 실시태양에서, pyc DNA 절편은 숙주 유기체의 DNA로부터 하나 이상의 천연 pyc 유전자를 제거하도록(예를 들어, 피루베이트 카복실레이트 활성을 갖는 하나 이상의 천연 유전자를 제거하도록) 디자인된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용된 pyc 유전자는 당업계에 공지된 효소적 또는 화학적 합성 방법 중 임의의 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드로서 여러 단계로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 제어된 공극 유리(CPG), 폴리스티렌 비드 또는 CPG를 함유할 수 있는 열가소성 폴리머로 구성된 막과 같은 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 미세유체역학 또는 둘 다의 조합을 제공하는 공지된 기술을 사용하여 병렬 마이크로스케일로 어레이 상에서 합성될 수 있다.
어레이 상에 또는 미세유체역학을 통한 합성은 더욱 낮은 시약 사용을 통해 비용을 감소시킴으로써 통상적인 고체 지지체 합성에 비해 이점을 제공한다. 유전자 합성에 필요한 규모는 작아서, 어레이 또는 미세유체역학을 통해 합성된 올리고뉴클레오타이드 생성물의 규모가 허용 가능하다. 그러나, 합성된 올리고뉴클레오타이드는 고체 지지체 합성을 사용할 때보다 품질이 떨어진다.
1980년대에 처음으로 기술되었기 때문에 종래의 4단계 포스포아미다이트 화학에서 많은 발전이 이루어져 왔다(예를 들어, Sierzchala, et al.　J. Am. Chem . Soc.,　125, 13427-13441 (2003) using peroxy deprotection; Hayakawa et al., U.S. Pat. No. 6,040,439 for alternative protecting groups; Azhayev et al,　Tetrahedron　57, 4977-4986 (2001) for universal supports; Kozlov et al.,　Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids,　24 (5-7), 1037-1041 (2005) for improved synthesis of longer oligonucleotides through the use of large-pore CPG; and Damha et al.,　NAR ,　18, 3813-3821 (1990) for improved derivatization 참조)
합성 유형에 관계없이, 생성된 올리고뉴클레오타이드는 더욱 긴 올리고뉴클레오타이드(즉, pyc 유전자)를 위한 더 작은 빌딩 블록을 형성할 수 있다. 일부 실시태양에서, 더 작은 올리고뉴클레오타이드는 폴리머라제 연쇄 조립(PCA), 리가아제 연쇄 반응(LCR) 및 열역학적으로 균형 잡힌 인사이드-아웃 합성(TBIO)과 같은 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 함께 결합될 수 있다.
더 큰 이중 가닥 DNA 단편을 합성하는 다른 방법은 상위-가닥 PCR(TSP)을 통해 더 작은 올리고뉴클레오타이드를 조합하는 것이다. TSP의 한 방법에서, 전장의 원하는 생성물을 형성하도록 결합되어질 더 작은 올리고뉴클레오타이드의 세트는 40-200개 염기 길이이고 적어도 약 15-20개 염기만큼 서로 중첩된다. 실제적인 목적을 위해, 중첩 영역은 올리고뉴클레오타이드의 특정 어닐링을 보장할 만큼 충분히 길어야 하고 사용된 반응 온도에서 어닐링하기에 충분한 높은 용융 온도(Tm)를 가져야 한다. 중첩은 소정의 올리고뉴클레오타이드가 인접한 올리고뉴클레오타이드에 의해 완전히 중첩되는 지점까지 연장될 수 있다. 중첩의 양은 최종 생성물의 품질에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 어셈블리의 첫 번째 및 마지막 올리고뉴클레오타이드 빌딩 블록은 포워드 및 리버스 증폭 프라이머에 대한 결합 위치를 포함해야 한다. 한 실시태양에서, 첫 번째 및 마지막 올리고뉴클레오타이드의 최종 말단 서열은 보편적 프라이머의 사용을 허용하도록 상보성의 동일한 서열을 포함한다.
플라스미드 조립/복제
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체의 게놈에 원하는 gapA 유전자, 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소, 및/또는 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자, 및/또는 TA 유전자, 및/또는 pyc 유전자 DNA 부분을 삽입할 수 있는 벡터를 제조하는 방법을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 삽입 DNA(예를 들어, gapA 유전자, 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소, 및/또는 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자, 및/또는 TA 유전자, 및/또는 pyc 유전자), 상동성 암 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 벡터를 복제하는 방법을 교시한다(도 6 참조).
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체로의 형질전환에 적합한 임의의 벡터와 양립가능하다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포와 양립가능한 셔틀 벡터의 사용을 교시한다. 한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 방법에서 사용하기 위한 셔틀 벡터는 대장균 및/또는 코리네박테리움 숙주 세포와 양립가능한 셔틀 벡터이다. 본 발명에 제공된 방법에서 사용하기 위한 셔틀 벡터는 본 발명에 기술된 바와 같은 선택 및/또는 역-선택을 위한 마커를 포함할 수 있다. 표지는 당업계에 공지된 및/또는 본 발명에 제공된 임의의 마커일 수 있다. 셔틀 벡터는 당업계에 공지된 바와 같은 상기 셔틀 벡터의 어셈블리에 유용한 임의의 조절 서열(들) 및/또는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 셔틀 벡터는 예를 들어 대장균 또는 C. 글루 타미쿰과 같은 본 발명에 제공된 바와 같은 숙주 세포에서 증식에 필요할 수 있는 임의의 복제 기점을 추가로 포함할 수 있다. 조절 서열은 숙주 세포의 유전자 기구에 의해 사용된 프로모터, 개시, 중지, 신호, 분비 및/또는 종결 서열과 같은 당업계에 공지되거나 본 발명에 제공되는 임의의 조절 서열일 수 있다. 특정 예에서, 표적 DNA는 상업용 벡터(예를 들어, DNA2.0 맞춤형 또는 GATEWAY® 벡터)와 같은 임의의 저장소 또는 카탈로그 생성물로부터 얻을 수 있는 벡터, 구조체 또는 플라스미드에 삽입될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 조립/복제 방법은 다음 조립 전략: i) II형 통상적인 복제, ii) II형 S-매개 또는 "골든 게이트" 복제(예를 들어, Engler, C., R. Kandzia, and S. Marillonnet. 2008 "A one pot, one step, precision　cloning method with high-throughput capability". PLos One 3:e3647; Kotera, I., and T. Nagai. 2008 "A high-throughput and single-tube recombination of crude PCR products using a DNA polymerase inhibitor and type IIS　restriction enzyme." J Biotechnol 137:1-7.; Weber, E., R. Gruetzner, S. Werner, C. Engler, and S. Marillonnet. 2011 Assembly of Designer TAL Effectors by　Golden Gate　Cloning. PloS One 6:e19722 참조), iii) GATEWAY® 재조합, iv) TOPO® 복제, 엑소뉴클레아제 매개 어셈블리(Aslanidis and de Jong 1990. "Ligation-independent　cloning　of PCR products (LIC-PCR)." Nucleic Acids Research, Vol. 18, No. 20 6069), v) 상동성 재조합, vi) 비 상동성 말단 결합, 또는 이의 조합의 적어도 하나를 사용할 수 있다. 모듈형 IIS 기반 조립 전략은 PCT 공개공보 WO 2011/154147에 개시되며, 그 내용은 본 발명에 참고로 포함된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 선별 마커를 갖는 벡터의 클로닝을 교시한다. 다양한 선택 마커 유전자는 선택적 압력하에서 원핵생물 세포(예를 들어, 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 제오신, 스펙티노마이신/스트렙토마이신) 또는 진핵생물 세포(예컨대, 제네티신, 네오마이신, 하이그로마이신, 푸로마이신, 블라스티시딘, 제오신)에서 선택을 위한 항생제 저항을 암호화하는 것이 당업계에 주지되어 있다. 다른 마커 시스템은 성공적으로 형질유도된 숙주 세포에서 발현된 녹색 또는 적색 형광 단백질과 같은 X-gal 또는 형광 리포터(fluorescent reporter)의 존재하에서 양성 클론을 선택하기 위해 박테리아에서 사용된 주지된 청색/백색 선별 시스템과 같은 원하거나 원하지 않는 세포의 선별 및 확인을 허용한다. 대다수가 원핵생물 시스템에서만 기능하는 선택 마커의 또 다른 부류는 생산자 세포를 죽이는 독성 유전자 생성물을 발현하는 "사멸 유전자"라고도하는 역 선택가능한 마커 유전자에 관한 것이다. 이러한 유전자의 예는 sacB, rpsL (strA), tetAR, pheS, thyA, gata-1 또는 ccdB를 포함하며, 그 기능은 (Reyrat et al. 1998 "Counterselectable Markers: Untapped Tools for Bacterial Genetics and Pathogenesis." Infect Immun. 66(9): 4011-4017)에 설명된다.
일부 실시태양에서, 표적 DNA 절편이 복제되는 벡터는 프로모터 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 프로모터 폴리뉴클레오타이드는 숙주 미생물에서 gapA, 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소, 및/또는 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh, 및/또는 TA 및/또는 pyc를 과발현 또는 과발현하는데 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 이종 gapA 유전자 및/또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 및/또는 하나 이상의 gdh, asd, dapB 및 ddh 유전자, 및/또는 TA 유전자, 및/또는 pyc 유전자를 포함하는 각각의 생성된 균주는 본 발명의 하나 이상의 기준(예를 들어, 생체 분자 또는 관심 생성물의 생산성) 하에서 배양되고 분석된다. 각각의 분석된 숙주 균주로부터의 데이터는 특정 gapA 유전자, 또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 또는 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자, 및/또는 TA 유전자 및/또는 pyc 유전자 또는 gapA/니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소/gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자/TA/pyc 조합과 연관/상관되거나 추후 사용을 위해 기록된다. 따라서, 본 발명은 gapA 유전자, 또는 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소 유전자, 또는 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자 및/또는 TA 유전자, 및/또는 pyc 유전자 또는 gapA/니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소/gdh, asd, dapB 및/또는 ddh/TA/pyc 유전자 조합의 효과 또는 임의의 수의 관심 유전적 또는 표현형적 특성을 식별하는 크고 높은 주석이 달린 유전자 다양성 라이브러리/저장소의 생성을 가능하게 한다.
일부 실시태양에서, 다양성 풀 내의 균주는 "표준 균주"를 참조하여 결정된다. 일부 실시태양에서, 표준 균주는 야생형 균주이다. 다른 실시태양에서, 표준 균주는 임의의 게놈 조작을 받기 전에 원래의 산업용 균주이다. 표준 균주는 실무자에 의해 정의될 수 있으며 원래의 야생형 균주 또는 원래의 산업용 균주일 필요는 없다. 기본 균주는 단순히 "기본", "표준" 또는 원래의 유전자 배경으로 간주 될 수 있는 것의 대표이며, 이로 인해 상기 표준 균주로부터 유도되거나 개발된 후속 균주는 비교될 것이다.
염두에 두어야 할 개념은 부모 균주 및 기준 균주의 차이점이다. 부모 균주는 돌연변이유발의 현재 라운드에 사용된 배경이다. 기준 균주는 특히 플레이트 간의 비교를 용이하게 하기 위해 모든 플레이트에서 사용되는 대조군 균주이며 일반적으로 위에 언급된 "기본 균주"이다. 그러나 기본 균주(예를 들어, 야생형 또는 산업용 균주는 전체 성능을 벤치 마크하는 데 사용된다)는 소정의 라운드의 균주 개량에서 돌연변이유발 표적이라는 의미에서 반드시 "기본"이 아니기 때문에, 보다 설명적인 용어는 "기준 균주"이다.
요약하면, 기본/기준 균주는 제조된 균주의 성능을 벤치 마크하는 데 사용되는 반면, 부모 균주는 관련 유전자 배경에서 특이적 유전자 변화의 성능을 벤치 마크하는 데 사용된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 시작 및/또는 정지 코돈 변이체에 의해 gapA 유전자 및/또는 니코틴아미드 뉴클레오타이드 수소전달 효소, 및/또는 gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자, 및/또는 TA 유전자 및/또는 pyc 유전자를 복제하기 위한 벡터의 사용을 교시하며 복제된 유전자가 시작 및/또는 정지 코돈 변이체를 이용한다. 예를 들어, 에스. 크레비시애(S. cerevisiae) 및 포유동물에 대한 전형적인 정지 코돈은 각각 UAA 및 UGA이다. 단핵구 식물의 전형적인 정지 코돈은 TGA(UGA)인 반면, 곤충과 대장균은 보통 TAA(UAA)를 정지 코돈으로 사용한다(Dalphin et al.(1996) Nucl. Acids Res. 24: 216-218).
코돈 최적화
한 실시태양에서, 제공된 본 발명의 방법은 숙주 유기체에 의해 발현된 하나 이상의 유전자를 최적화하는 코돈을 포함한다. 다양한 숙주에서 발현을 향상시키기 위해 코돈을 최적화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 문헌에 기술된다(그 전체가 본 발명에 참조로 포함된 미국 특허출원 공개공보 제2007/0292918호 참조). 특정 원핵 또는 진핵 숙주(Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res.17 : 477-508 참조)에 의해 선호되는 코돈을 함유하는 최적화된 암호화 서열은, 예를 들어, 번역 속도를 증가시키거나 또는 최적화되지 않은 서열로부터 생산된 전사체와 비교할 때, 더 긴 반감기와 같은 바람직한 특성을 갖는 재조합 RNA 전사체를 생성하도록 제조된다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 gapA 유전자/니코틴아미드 뉴클레오타이드 수소전달 효소/gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자/TA 유전자/pyc 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 대장균 및/또는 C. 글루타미쿰과 같이 본 발명에 제공된 숙주 세포에서 번역을 위해 최적화된 분자 코돈을 포함한다. 유전자 또는 폴리펩타이드는 단리, 합성 또는 재조합 핵산일 수 있다. 코돈 최적화 gapA 유전자/니코틴아미드 뉴클레오타이드 수소전달 효소/gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자/TA 유전자/pyc 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1-50, 67-74, 79-231, 및 232로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 제공된 코돈 최적화 gapA 유전자/니코틴아미드 뉴클레오타이드 수소전달 효소/gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자/TA 유전자/pyc 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, GenScript's OptimumGeneTM 유전자 디지인 시스템 또는 DNA2.0 GeneGPS® 발현 최적화 기술과 같은 코돈 최적화 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
단백질 발현은 전사, mRNA 프로세싱 및 안정성 및 번역 개시에 영향을 미치는 인자를 포함하는 다수의 인자에 의해 지배된다. 따라서 최적화는 임의의 특정 유전자의 많은 서열 특징의 임의의 것을 처리할 수 있다. 특정 예로서, 드문 코돈 유도 번역 일시 중지는 감소된 단백질 발현을 초래할 수 있다. 드문 코돈 유도 번역 일시 중지는 숙주 유기체에서 거의 사용되지 않는 관심 폴리뉴클레오타이드에서 코돈의 존재를 포함하며 이용가능한 tRNA 풀에서의 희소성 때문에 단백질 번역에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
대안적인 번역 개시는 또한 감소된 이종 단백질 발현을 초래할 수 있다. 대안적인 번역 개시는 의도하지 않게 리보솜 결합 부위(RBS)로서 기능할 수 있는 모티프를 함유하는 합성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이런 위치는 유전자 내부 위치로부터 잘린 단백질의 번역을 시작할 수 있다. 정제 과정에서 제거하기 어려울 수 있는 절단된 단백질을 생산할 가능성을 줄이는 한 가지 방법은 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 추정된 내부 RBS 서열을 제거하는 것을 포함한다.
반복체-유도된 폴리머라제의 슬리파지(slippage)는 감소된 이종 단백질 발현을 초래할 수 있다. 반복체-유도된 폴리머라제의 슬리파지는 프레임변이 돌연변이를 초래할 수 있는 DNA 폴리머라제의 슬리파지 또는 스터터링(stuttering)을 유발하는 것으로 밝혀진 뉴클레오타이드 서열 반복을 필요로 한다. 이러한 반복체는 또한 RNA 폴리머라제의 슬리파지를 유발할 수 있다. 높은 G+C 함량 편향을 갖는 유기체에서, G 또는 C 뉴클레오타이드 반복체로 구성된 더 높은 등급의 반복체가 존재할 수 있다. 따라서, RNA 폴리머라제의 슬리파지를 유도하는 가능성을 줄이는 한 가지 방법은 G 또는 C 뉴클레오타이드의 연장된 반복체를 변경하는 것을 포함한다.
2차 구조를 간섭하면 또한 감소된 이종 단백질 발현을 초래할 수 있다. 2차 구조는 RBS 서열 또는 개시 코돈을 격리할 수 있고 단백질 발현의 감소와 상관관계가있다. 스템루프 구조는 또한 전사 일시 중지 및 약화에 관여할 수 있다. 최적화 된 폴리뉴클레오타이드 서열은 RBS 내에 최소 2차 구조 및 뉴클레오타이드 서열의 유전자 암호화 영역을 함유하여 개량된 전사 및 번역을 가능하게 한다.
예를 들어, 최적화 공정은 숙주에 의해 발현되는 원하는 아미노산 서열을 확인함으로써 시작될 수 있다. 아미노산 서열로부터 후보 폴리뉴클레오타이드 또는 DNA 서열이 디자인될 수 있다. 합성 DNA 서열의 디자인 동안, 코돈 사용의 빈도는 숙주 발현 유기체의 코돈 사용과 비교될 수 있고 드문 숙주 코돈은 합성 서열로부터 제거될 수 있다. 또한, 합성 후보 DNA 서열은 바람직하지 않은 효소 제한 부위를 제거하고 원하는 신호 서열, 링커 또는 비번역 영역을 추가 또는 제거하기 위해 변형될 수 있다. 합성 DNA 서열은 G/C 반복체 및 스템-루프 구조와 같이 번역 과정을 방해할 수 있는 2차 구조의 존재에 대해 분석될 수 있다.
숙주 세포의 형질전환
일부 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 형질전환, 형질감염, 형질도입, 바이러스 감염, 유전자 총 또는 Ti 매개 유전자 전달을 포함하는 임의의 다양한 기술을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다(Davis, L., Dibner, M., Battey, I. 1986 "Basic Methods in Molecular Biology"). 형질전환의 다른 방법은 예를 들어, 아세트산 리튬 형질전환 및 전기천공을 포함한다. 예를 들어, Gietz et al.,　Nucleic Acids Res.　27:69-74 (1992); Ito et al.,　J. Bacterol.　153:163-168 (1983); and Becker and Guarente,　Methods in Enzymology　194:182-187 (1991) 참조. 일부 실시태양에서, 형질전환된 숙주 세포는 재조합 숙주 균주로 불린다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 96-웰 플레이트 로봇 플랫폼 및 액체 처리 기계를 사용하는 세포의 고 처리량 형질전환을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 상기한 바와 같이 하나 이상의 선택 마커로 형질전환된 세포를 선별하는 것을 교시한다. 이런 한 실시태양에서, 카나마이신 내성 마커(KanR)를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포는 유효량의 카나마이신 항생제를 함유하는 배지 상에 덮인다. 카나마이신-레이스(kanamycin-laced) 배지에서 볼 수 있는 콜로니 형성 단위는 벡터 카세트를 게놈에 통합시킨 것으로 추정된다. 원하는 서열의 삽입은 PCR, 제한 효소 분석 및/또는 관련 삽입 위치의 서열화를 통해 확인될 수 있다.
선택된 서열의 루핑 아웃
일부 실시태양에서, 본 발명은 숙주 유기체로부터 DNA의 선택된 영역을 루핑 아웃하는 방법을 교시한다. 루핑 아웃 방법은 Nakashima et al. 2014 "Bacterial Cellular Engineering by Genome Editing and Gene Silencing." Int. J. Mol. Sci. 15(2), 2773-2793에 기술될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 양성 형질전환 체로부터 선택 마커를 루핑 아웃하는 것을 교시한다. 루핑 아웃 결실 기술은 당해 분야에 공지되어 있으며 (Tear et al. 2014 "Excision of Unstable Artificial Gene-Specific inverted Repeats Mediates Scar-Free Gene Deletions in Escherichia coli." Appl. Biochem. Biotech. 175:1858-1867)에 기술된다. 본 발명에서 제공된 방법에 사용된 루핑 아웃 방법은 단일-교차 상동성 재조합 또는 이중-교차 상동성 재조합을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명에 기술된 바와 같이 선택된 영역을 루핑하는 것은 본 발명에 기술된 바와 같이 단일-교차 상동성 재조합을 사용하는 것을 수반할 수 있다.
먼저, 루프 아웃 벡터가 (예를 들어 상동성 재조합, CRISPR 또는 다른 유전자 편집 기술을 통해) 숙주 유기체의 게놈 내의 선택된 표적 영역 내로 삽입된다. 한 실시태양에서, 단일-교차 상동성 재조합이 도 6에 도시된 바와 같은 원형 플라스미드 또는 벡터를 루프-인시키기 위해 원형 플라스미드 또는 벡터와 숙주 세포 게놈 사이에 사용된다. 삽입된 벡터는 현존하는 또는 숙주 서열 근처에 도입된 직접 반복체인 서열을 갖도록 디자인되어, 직접 반복체가 루핑 및 결실이 예정된 DNA의 영역에 인접하게 된다. 일단 삽입되면, 루프 아웃 플라스미드 또는 벡터는 선택 영역의 결실을 위해 역 선택될 수 있다(예를 들어, 도 7 참조; 선택 유전자에 대한 내성의 결핍).
숙주 미생물
본 발명에 개시된 게놈 조작 방법은 산업용 미생물 세포 배양물로 예시되지만, 원하는 형질이 유전자 돌연변이 집단에서 확인될 수 있는 임의의 유기체에 적용 가능하다.
따라서, 본 발명에 사용된 용어 "미생물"은 광범위하게 해석되어야 한다. 미생물은 두 가지 원핵생물 영역인 박테리아와 고세균뿐만 아니라 특정 진핵생물 균류와 원생 생물을 포함한다. 그러나, 특정 양태에서, 곤충, 식물 및 동물과 같은 "보다 높은" 진핵생물이 본 발명에 교시된 방법에서 이용될 수 있다.
적합한 숙주 세포는 박테리아 세포, 조류 세포, 식물 세포, 균류 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 예시적인 실시태양에서, 적합한 숙주 세포는 대장균(예를 들어, 매사추세츠주, 입스위치의 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs)로부터 구입가능한 SHuffle™ competent E. coli)을 포함한다.
본 발명의 다른 적합한 숙주 유기체는 코리네박테리움 속의 미생물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 바람직한 코리네박테리움 균주/종은 기탁된 유형 균주가 DSM44549인 C. 에피센스(C. efficiens), 기탁된 유형 균주가 ATCC13032인 C. 글루타미쿰(C. glutamicum) 및 기탁된 유형 균주가 ATCC6871인 C. 암모니아게네스(C. ammoniagenes)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 바람직한 숙주는 C. 글루타미쿰이다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 시겔라 플렉네리, 시겔라 디센테리에, 시겔라 보이디 및 시겔라 소네이를 포함하는 시겔라의 숙주 세포를 교시한다.
특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 코리네박테리움 속의 적합한 숙주 균주는 특히 공지된 야생형 균주이다: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806, 코리네박테리움 아세토아시도필럼 ATCC13870, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965, 코리네박테리움 써모아미노게 네스 FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869 및 브레비박테리움 다이바리카툼 ATCC14020; 및 예를 들어, L-리신 생산 균주로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주: 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM P-1708, 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM P 1712, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464, 코리네박테리움 글루타미쿰 DM58-1, 코리네박테리움 글루타미쿰 DG52-5, 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5714 및 코리네박테리움 글루타미 쿰 DSM12866.
용어 "마이크로콕쿠스 글루타미쿠스"는 C. 글루타미쿰에도 사용되어왔다. C. 에피시엔스 종의 일부 대표는 또한 예를 들어, 균주 FERM BP-1539와 같은 종래 기술에서 C. 써모아미노게네스로 불려왔다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 숙주 세포는 진핵생물 세포이다. 적합한 진핵생물 숙주 세포는 곰팡이 세포, 조류 세포, 곤충 세포, 동물 세포 및 식물 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 균류 숙주 세포는 아스코미코타(Ascomycota), 담자균(Basidiomycota), 신생 균주(Deuteromycota), 접합체 진균 (Zygomycota), 진균 무균(Fungi imperfecti)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 바람직한 숙주 세포는 효모 세포 및 사상 균류 세포를 포함한다. 적합한 사상 균류 숙주 세포는 예를 들어 유마이코티나(Eumycotina) 및 오마이코타(Oomycota) 세분의 임의의 섬유상 형태를 포함한다(예를 들어, 참조로 본 발명에 포함된 Hawksworth et al., In Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th　edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK 참조). 사상 균류는 키틴, 셀룰로오스 및 다른 복합 다당류로 구성된 세포벽을 갖는 식물성 균사체를 특징으로 한다. 사상 균류 숙주 세포는 효모와 형태학적으로 구별된다.
특정 예시적이고 비 제한적인 실시태양에서, 사상 균류 숙주 세포는 아칠라(Achlya), 아크레모늄(Acremonium), 아스퍼길루스(Aspergillus), 아우레오바시듐(Aureobasidium), 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리오프시스(Ceriporiopsis), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코칠리오볼루스(Cochliobolus), 코리나스쿠스(Corynascus), 크리포넥트리아(Cryphonectria), 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 코프리누스(Coprinus), 코리오루스(Coriolus), 디플로디아(Diplodia), 엔도디스(Endothis), 프사리움(Fusarium), 지베렐라(Gibberella), 글리오클라디움(Gliocladium), 휴미콜라(Humicola), 하이포크레아(Hypocrea), 마이셀리오프토라(Myceliophthora)(예를 들어, Myceliophthora thermophila), 무코르(Mucor), 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 포도스포라(Podospora), 필레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 피리쿨라리아(Pyricularia), 리히조무코르(Rhizomucor), 리히조푸스(Rhizopus), 스키조필룸(Schizophyllum), 스키탈리듐(Scytalidium), 스포로트리츔(Sporotrichum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티에라비아(Thielavia), 트라마테스(Tramates), 폴리포클라듐(Tolypocladium), 트라이코데마(Trichoderma), 베르티실리움(Verticillium), 볼바리엘라(Volvariella), 또는 텔레오모르프(teleomorphs), 또는 아나모르프(anamorphs), 이의 동의어 또는 분류학적 동등물의 종의 세포일 수 있다.
적합한 효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세누라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces,), 피키아(Pichia), 클루베로마이세스(Kluyveromyces) 및 야로비아(Yarrowia)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 효모 세포는 한세누라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 칼스베르젠시스(Saccaromyces carlsbergensis), 사카로마이세스 다이아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 핀란디카(Pichia finlandica), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피치아 코다매(Pichia kodamae), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 오프니티애(Pichia opuntiae), 피치아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피치아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피치아 쿠에르쿰(Pichia quercuum), 피치아 피제페리(Pichia pijperi), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 안구스타(Pichia angusta), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 일비칸스(Candida albicans), 또는 야로비아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 숙주 세포는 클라미도모나스(Chlamydomonas)(예를 들어, C. 레인하르티(C. Reinhardtii)) 및 포름디움(Phormidium)과 같은 조류(P. sp. ATCC29409)이다.
다른 실시태양에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포이다. 적합한 원핵생물 세포는 그람 양성, 그람 음성 및 그람 가변 박테리아 세포를 포함한다. 상기 숙주 세포는 아그로박테리움(Agrobacterium), 알리시로바실러스(Alicyclobacillus), 아나베아나(Anabaena), 아나시스티스(Anacystis), 아시네토박터(Acinetobacter), 아시도써무스(Acidothermus), 아르쓰로박터(Arthrobacter), 아조박터(Azobacter), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 부티리비브리오(Butyrivibrio), 부케네라(Buchnera), 캠프스트리스(Campestris), 캠필로박터(Camplyobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 크로마티움(Chromatium), 코프로콕쿠스(Coprococcus), 에스체리치아(Escherichia), 엔테로콕쿠스(Enterococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 푸소박테리움(Fusobacterium), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 프란시셀라(Francisella), 플라보박테리움(Flavobacterium), 게오바실루스(Geobacillus), 해모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 락토바실루스(Lactobacillus), 락토콕커스(Lactococcus), 일로박터(Ilyobacter), 마이크로콕쿠스(Micrococcus), 마이크로박테리움(Microbacterium), 메소르히조비움(Mesorhizobium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 네이세리아(Neisseria), 판도에아(Pantoea), 수도모나스(Pseudomonas), 프로클로로콕쿠스(Prochlorococcus), 로도박터(Rhodobacter), 로도수도모나스(Rhodopseudomonas), 로세부리아(Roseburia), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 로도콕쿠스(Rhodococcus), 세네데스무스(Scenedesmus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 시네콕쿠스(Synecoccus), 사카로모노스포라(Saccharomonospora), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 스타필로콕쿠스(Staphylococcus), 세라티아(Serratia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium), 트로페리마(Tropheryma), 툴라렌시스(Tularensis), 테메쿨라(Temecula), 써모시네코콕쿠스(Thermosynechococcus), 써모콕쿠스(Thermococcus), 우레아플라즈마(Ureaplasma), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아(Yersinia) 및 지모모나스(Zymomonas)의 종일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
일부 실시태양에서, 숙주 균주는 박테리아 숙주 균주이다. 일부 실시태양에서, 박테리아 숙주 균주는 산업용 균주이다. 수많은 박테리아 산업용 균주가 알려져 있고 본 발명에 기술된 방법 및 조성물에 적합하다.
일부 실시태양에서, 박테리아 숙주 세포는 아그로박테리움 종(예를 들어, A. radiobacter, A. rhizogenes, A. rubi), 아테로박터 종(예를 들어, A. aurescens, A. citreus, A. globformis, A. hydrocarboglutamicus, A. mysorens, A. nicotianae, A. paraffineus, A. protophonniae, A. roseoparaffinus, A. sulfureus, A. ureafaciens), 바실루스 종(예를 들어, B. thuringiensis, B. anthracis, B. megaterium, B. subtilis, B. lentus, B. circulars, B. pumilus, B. lautus, B. coagulans, B. brevis, B. firmus, B. alkaophius, B. licheniformis, B. clausii, B. stearothermophilus, B. halodurans 및　B. amyloliquefaciens)이다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포는 B. 서브틸리스, B. 푸밀루스, B. 리체니포르미스, B. 메가테륨, B. 클라우실, B. 스테아로써모필루스, 및B. 아밀로리퀴에파시엔스를 포함하나 이에 제한되지 않는 산업용 바실루스일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 클로스트리디움 종(예를 들어, C. acetobutylicum, C. tetani　E88,　C. lituseburense, C. saccharobutylicum, C. perfringens, C. beijerinckii)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 코리네박테리움 종(예를 들어, C. glutamicum, C. acetoacidophilum)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 에스체리아치아 종(예를 들어, E. coli)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 에르위니아 종(예를 들어, E. uredovora, E. carotovora, E. ananas, E. herbicola, E. punctata, E. terreus)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 판토에아 종(예를 들어, P. citrea, P. agglomerans)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 수도모나스 종(예를 들어, P. putida, P. aeruginosa, P. mevalonii)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 산업용 스트렙토콕쿠스 종(예를 들어, S. ambofaciens, S. achromogenes, S. avermitilis, S. coelicolor, S. aureofaciens, S. aureus, S. fungicidicus, S. griseus, S. lividans)일 것이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 자이모모나스 종(예를 들어, Z. mobilis, Z. lipolytica) 등일 것이다.
다양한 실시태양에서, 원핵생물 및 진핵생물 균주 모두를 포함하는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 균주는 American Type Culture Collection(ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH(DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS), 및 Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center(NRRL)와 같은 여러 배양 컬렉션으로부터 대중에게 쉽게 접근될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 다세포 유기체에도 적용 가능하다. 예를 들어, 플랫폼은 작물의 성능을 개량시키는데 사용될 수 있다. 유기체는 그라미니애(Gramineae), 페투코이데애(Fetucoideae), 포아코이데애(Poacoideae), 아그로스티스(Agrostis), 필레움(Phleum), 닥틸리스(Dactylis), 소르검(Sorgum), 세타리아(Setaria), 제아(Zea), 오리자(Oryza), 트라이티쿰(Triticum), 세칼레(Secale), 아베나(Avena), 호르데움(Hordeum), 삭카룸(Saccharum), 포아(Poa), 페스투카(Festuca), 스테노타프룸(Stenotaphrum), 사이노돈(Cynodon), 코익스(Coix), 올리레애(Olyreae), 파레애(Phareae), 콤포시태(Compositae) 또는 레구미노새(Leguminosae)와 같은 복수의 식물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 식물은 옥수수, 쌀, 콩, 면화, 밀, 호밀, 귀리, 보리, 완두콩, 콩, 렌즈콩, 땅콩, 참마콩, 동부, 벨벳콩, 클로버, 알팔파, 자주개자리, 루핀, 살갈퀴, 등나무, 완두콩, 사탕수수, 수수, 해바라기, 카놀라 등일 수 있다. 마찬가지로, 유기체는 비-인간 포유류, 어류, 곤충 등과 같은 복수의 동물을 포함할 수 있다.
대장균 숙주 세포
전술한 바와 같이, 대장균 숙주 세포는 본 발명의 실시태양에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 대장균 종의 적합한 숙주 균주는 장독소성 대장균(ETEC), 장병원성 대장균(EPEC), 장내습성 대장균(EIEC), 장출혈성 대장균(EHEC), 요로병원성 대장균(UPEC), 베로톡신생성 대장균, 대장균 O157:H7, 대장균 O104:H4, 대장균 O121, 대장균 O104:H21, 대장균 K1 및 대장균 NC101을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 대장균 K12, 대장균 B 및 대장균 C의 게놈 조작을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 대장균 균주 NCTC 12757, NCTC 12779, NCTC 12790, NCTC 12796, NCTC 12811, ATCC　11229, ATCC　25922, ATCC　8739, DSM 30083, BC 5849, BC 8265, BC 8267, BC 8268, BC 8270, BC 8271, BC 8272, BC 8273, BC 8276, BC 8277, BC 8278, BC 8279, BC 8312, BC 8317, BC 8319, BC 8320, BC 8321, BC 8322, BC 8326, BC 8327, BC 8331, BC 8335, BC 8338, BC 8341, BC 8344, BC 8345, BC 8346, BC 8347, BC 8348, BC 8863, 및 BC 8864의 게놈 조작을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 균주 BC 4734 (O26:H11), BC 4735 (O157:H-), BC 4736, BC 4737 (n.d.), BC 4738 (O157:H7), BC 4945 (O26:H-), BC 4946 (O157:H7), BC 4947 (O111:H-), BC 4948 (O157:H), BC 4949 (O5), BC 5579 (O157:H7), BC 5580 (O157:H7), BC 5582 (O3:H), BC 5643 (O2:H5), BC 5644 (O128), BC 5645 (O55:H-), BC 5646 (O69:H-), BC 5647 (O101:H9), BC 5648 (O103:H2), BC 5850 (O22:H8), BC 5851 (O55:H-), BC 5852 (O48:H21), BC 5853 (O26:H11), BC 5854 (O157:H7), BC 5855 (O157:H-), BC 5856 (O26:H-), BC 5857 (O103:H2), BC 5858 (O26:H11), BC 7832, BC 7833 (O raw form:H-), BC 7834 (ONT:H-), BC 7835 (O103:H2), BC 7836 (O57:H-), BC 7837 (ONT:H-), BC 7838, BC 7839 (O128:H2), BC 7840 (O157:H-), BC 7841 (O23:H-), BC 7842 (O157:H-), BC 7843, BC 7844 (O157:H-), BC 7845 (O103:H2), BC 7846 (O26:H11), BC 7847 (O145:H-), BC 7848 (O157:H-), BC 7849 (O156:H47), BC 7850, BC 7851 (O157:H-), BC 7852 (O157:H-), BC 7853 (O5:H-), BC 7854 (O157:H7), BC 7855 (O157:H7), BC 7856 (O26:H-), BC 7857, BC 7858, BC 7859 (ONT:H-), BC 7860 (O129:H-), BC 7861, BC 7862 (O103:H2), BC 7863, BC 7864 (O raw form:H-), BC 7865, BC 7866 (O26:H-), BC 7867 (O raw form:H-), BC 7868, BC 7869 (ONT:H-), BC 7870 (O113:H-), BC 7871 (ONT:H-), BC 7872 (ONT:H-), BC 7873, BC 7874 (O raw form:H-), BC 7875 (O157:H-), BC 7876 (O111:H-), BC 7877 (O146:H21), BC 7878 (O145:H-), BC 7879 (O22:H8), BC 7880 (O raw form:H-), BC 7881 (O145:H-), BC 8275 (O157:H7), BC 8318 (O55:K-:H-), BC 8325 (O157:H7), 및 BC 8332 (ONT), BC 8333와 같은 베로톡신생성 대장균(VTEC)을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 균주 BC 8246 (O152:K-:H-), BC 8247 (O124:K(72):H3), BC 8248 (O124), BC 8249 (O112), BC 8250 (O136:K(78):H-), BC 8251 (O124:H-), BC 8252 (O144:K-:H-), BC 8253 (O143:K:H-), BC 8254 (O143), BC 8255 (O112), BC 8256 (O28a.e), BC 8257 (O124:H-), BC 8258 (O143), BC 8259 (O167:K-:H5), BC 8260 (O128a.c.:H35), BC 8261 (O164), BC 8262 (O164:K-:H-), BC 8263 (O164), 및 BC 8264 (O124)와 같은 장침입성 대장균(EIEC)을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 균주 BC 5581 (O78:H11), BC 5583 (O2:K1), BC 8221 (O118), BC 8222 (O148:H-), BC 8223 (O111), BC 8224 (O110:H-), BC 8225 (O148), BC 8226 (O118), BC 8227 (O25:H42), BC 8229 (O6), BC 8231 (O153:H45), BC 8232 (O9), BC 8233 (O148), BC 8234 (O128), BC 8235 (O118), BC 8237 (O111), BC 8238 (O110:H17), BC 8240 (O148), BC 8241 (O6H16), BC 8243 (O153), BC 8244 (O15:H-), BC 8245 (O20), BC 8269 (O125a.c:H-), BC 8313 (O6:H6), BC 8315 (O153:H-), BC 8329, BC 8334 (O118:H12), 및 BC 8339와 같은 장독소성 대장균(ETEC)을 교시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 균주 BC 7567 (O86), BC 7568 (O128), BC 7571 (O114), BC 7572 (O119), BC 7573 (O125), BC 7574 (O124), BC 7576 (O127a), BC 7577 (O126), BC 7578 (O142), BC 7579 (O26), BC 7580 (OK26), BC 7581 (O142), BC 7582 (O55), BC 7583 (O158), BC 7584 (O-), BC 7585 (O-), BC 7586 (O-), BC 8330, BC 8550 (O26), BC 8551 (O55), BC 8552 (O158), BC 8553 (O26), BC 8554 (O158), BC 8555 (O86), BC 8556 (O128), BC 8557 (OK26), BC 8558 (O55), BC 8560 (O158), BC 8561 (O158), BC 8562 (O114), BC 8563 (O86), BC 8564 (O128), BC 8565 (O158), BC 8566 (O158), BC 8567 (O158), BC 8568 (O111), BC 8569 (O128), BC 8570 (O114), BC 8571 (O128), BC 8572 (O128), BC 8573 (O158), BC 8574 (O158), BC 8575 (O158), BC 8576 (O158), BC 8577 (O158), BC 8578 (O158), BC 8581 (O158), BC 8583 (O128), BC 8584 (O158), BC 8585 (O128), BC 8586 (O158), BC 8588 (O26), BC 8589 (O86), BC 8590 (O127), BC 8591 (O128), BC 8592 (O114), BC 8593 (O114), BC 8594 (O114), BC 8595 (O125), BC 8596 (O158), BC 8597 (O26), BC 8598 (O26), BC 8599 (O158), BC 8605 (O158), BC 8606 (O158), BC 8607 (O158), BC 8608 (O128), BC 8609 (O55), BC 8610 (O114), BC 8615 (O158), BC 8616 (O128), BC 8617 (O26), BC 8618 (O86), BC 8619, BC 8620, BC 8621, BC 8622, BC 8623, BC 8624 (O158), 및 BC 8625 (O158)과 같은 장병원성 대장균(EPEC)을 교시한다.
세포 발효 및 배양물
본 발명에 기술된 바와 같이 유전자 조작된 것들을 포함하는 본 발명의 미생물은 임의의 바람직한 생합성 반응 또는 선택을 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 프로모터를 활성화시키기 위해 배지를 유도하는 배양을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 형질전환체(예를 들어, 항생제)의 선택 제제 또는 억제 조건(예를 들어, 높은 에탄올 조건)하에 성장하기에 적합한 유기체의 선택 제제를 포함하는 선택 제제를 갖는 배지를 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 세포 성장을 위해 최적화된 배지에서 세포 배양물을 성장시키는 것을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은, 예를 들어, 글루코오스의 신진대사 처리로부터 유래된 관심 생성물 또는 생분자와 같이 생산 수율에 최적화된 배지에서 세포 배양물을 성장시키는 것을 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 세포 성장을 유도할 수 있는 배지에서 배양 물을 배양하는 것을 교시하며 최종 생성물 생산을 위한 필수 전구체(예를 들어, 에탄올 생산을 위한 높은 수준의 당)를 포함한다.
본 발명에 제공된 방법에 의해 생성된 생체 분자 또는 관심 생성물은 글루코스로부터 생성된 임의의 상업적 생성물일 수 있다. 일부 경우에, 생체 분자 또는 관심 생성물은 소분자, 아미노산, 유기산 또는 알코올이다. 아미노산은 제한 없이 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파르트산, 아스파라긴, 트레오닌, 이소류신, 메티오닌 또는 리신일 수 있다. 특정 실시태양에서, 아미노산은 리신이다. 특정 양태에서, 리신은 L-리신이다. 유기산은 제한 없이 숙시네이트, 락테이트 또는 피루베이트일 수 있다. 알코올은, 제한 없이, 에탄올 또는 아이소부탄올일 수 있다.
온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사용하기에 적합한 것들이며, 당업자에게 명백할 것이다. 언급한 바와 같이, 박테리아, 식물, 동물(포유류 포함) 및 고세균 기원 세포를 포함하는 많은 세포의 배양 및 생산에 대한 많은 참고 자료가 이용될 수 있다. 예를 들어, Sambrook, Ausubel (all supra), as well as Berger, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology　volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA; and　 Freshney (1994)　Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York and the references cited therein; Doyle and Griffiths (1997)　Mammalian Cell Culture: Essential Techniques　John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, fourth edition W.H. Freeman and Company; and Ricciardelle et al., (1989)　In Vitro Cell Dev. Biol.　25:1016-1024, all of which are incorporated herein by reference. For plant cell culture and regeneration, Payne et al. (1992)　Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems　John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.; Gamborg and Phillips (eds) (1995)　Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg N.Y.); Jones, ed. (1984)　Plant Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press, Totowa, N.J. and　Plant Molecular Biology　(1993) R. R. D. Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6 참조하고, 이의 전문은 참조로 본 발명에 포함된다. 일반적으로 세포 배양 배지는 Atlas and Parks (eds.)　The Handbook of Microbiological Media　(1993) CRC Press, Boca Raton, Fla에서 설명되며, 이는 참조로 본 발명에 포함된다. 세포 배양에 대한 추가 정보는 Life Science Research Cell Culture Catalogue　from Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, Mo.) ("Sigma-LSRCCC") 및, 예를 들어,　The Plant Culture Catalogue　and supplement also from Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, Mo.) ("Sigma-PCCS")와 같은 구입가능한 상업용 논문에서 발견되며, 이의 전부는 참조로 본 발명에 포함된다.
사용될 배양 배지 또는 발효 배지는 적절한 방식으로 각각의 균주의 요구를 충족시켜야한다. 다양한 유기체에 대한 배양 배지에 대한 설명은 American Bacteriology Society (Washington D.C., USA, 1981)의 "General Bacteriology Methods for Manual"에 제공된다. 용어 배양 배지 및 발효 배지는 서로 교환 가능하다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 생산된 미생물이 원하는 유기-화학적 화합물을 생산하기 위한, 예를 들어 WO 05/021772에 기술된 바와 같이 연속적으로 또는 배치 공정(배치 배양) 또는 페드 배치(fed-batch) 또는 반복된 페드 배치에서 불연속적으로 배양될 수 있음을 교시한다. 알려진 배양 방법에 관한 일반적인 내용은 Chmiel(Bioprozeβtechnik. 1: Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))에 의한 교과서 또는 Storhas(Bioreaktoren and periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))에 의한 교과서에서 이용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 세포는 배치 또는 연속 발효 조건하에 성장된다. 고전적인 배치 발효는 폐쇄된 시스템이며, 배지의 조성물은 발효의 시작시에 설정되고 발효 동안 인공적인 변형을 겪지 않는다. 배치 시스템의 변형은 본 발명에서 사용되는 페드 배치 발효이다. 이 변형에서, 기질은 발효가 진행됨에 따라 증분으로 첨가된다. 페드 배치 시스템은 이화생성물 억제가 세포의 신진대사를 억제 할 가능성이 있고 배지에 제한된 양의 기질을 갖는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 배치 및 페드 배치 발효는 일반적이고 당업계에 일반적으로 주지되어 있다. 연속 발효는 정의된 발효 배지가 생물 반응기에 연속적으로 첨가되고 동일한 양의 조건 배지가 원하는 단백질의 가공 및 수확을 위해 동시에 제거되는 시스템이다. 일부 실시태양에서, 연속 발효는 일반적으로 세포가 주로 대수기 성장하는 일정한 고밀도로 배양물을 유지시킨다. 일부 실시태양에서, 연속 발효는 일반적으로 정지기 또는 늦은 대수기/정지기 성장시에 배양물을 유지시킨다. 연속 발효 시스템은 정지기 성장 조건을 유지하기 위해 노력한다.
연속 발효 공정을 위한 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법뿐만 아니라 생성물 형성의 속도를 최대화하기 위한 기술은 산업용 미생물학 분야에 잘 알려져 있다.
예를 들어, 본 발명의 배양물에 대한 탄소원의 비 제한적인 목록은 당 및 수화물, 예를 들어 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 프룩토오스, 말토오스, 당밀, 사탕무 또는 사탕수수 가공에 의한 수크로오스-함유 용액, 전분, 전분 가수분해물 및 셀룰로오스; 오일 및 지방, 예를 들어, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 지방; 지방산, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산; 알코올, 예를 들어 글리세롤, 메탄올 및 에탄올; 및 유기산, 예를 들어 아세트산 또는 젖산을 포함한다.
본 발명의 배양물을 위한 질소 공급원의 비 제한적인 목록은 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 콩가루 및 우레아와 같은 유기 질소 함유 화합물; 또는 황산 암모늄, 염화 암모늄, 인산 암모늄, 탄산 암모늄 및 질산 암모늄과 같은 무기 화합물을 포함한다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
본 발명의 배양물을 위한 가능한 인 공급원의 비 제한적인 목록은 인산, 인산 이수소 칼륨 또는 인산 수소 이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 포함한다. 배양 배지는 추가로 성장에 필수적인, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 철과 같은 금속의 염화물 또는 황산염 형태의 염을 포함한다. 마지막으로, 아미노산, 예를 들어 호모 세린 및 비타민, 예를 들어 티아민, 바이오틴 또는 판토텐산과 같은 필수 성장 인자가 상기 언급된 물질에 추가로 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 배양물의 pH는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아; 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 산 또는 염기, 또는 완충 염에 의해 적절한 방식으로 조절될 수 있다. 일부 실시태양에서, pH는 일반적으로 6.0 내지 8.5, 바람직하게는 6.5 내지 8의 값으로 조절된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 배양물은 소포제, 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스터를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 배양물은 예를 들어 항생제와 같은 적합한 선택 물질을 첨가함으로써 배양물의 플라스미드를 안정화시키도록 변형된다.
일부 실시태양에서, 배양은 호기성 조건하에 수행된다. 이러한 조건을 유지하기 위해, 예를 들어 공기와 같은 산소 또는 산소 함유 기체 혼합물이 배양물 내로 도입된다. 과산화수소가 풍부한 액체를 사용하는 것도 가능하다. 발효는, 적절한 경우에, 상승된 압력, 예를 들어 0.03 내지 0.2 MPa의 상승된 압력에서 수행된다. 배양의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 특히 바람직하게는 30℃ 내지 37℃이다. 배치 또는 페드 배치 공정에서, 배양은 바람직하게는 회수하고자 하는 관심의 목적하는 생성물(예를 들어, 유기-화학적 화합물)의 양이 형성될 때까지 계속된다. 이 목표는 일반적으로 10시간 내지 160시간 이내에 달성될 수 있다. 연속 공정에서, 더 긴 배양 시간이 가능하다. 미생물의 활성은 발효 배지 및/또는 상기 미생물의 세포에서 관심 생성물의 농축(축적)을 초래한다.
일부 실시태양에서, 배양은 혐기성 조건하에 수행된다.
선별
일부 실시태양에서, 본 발명은 고 처리량 초기 선별을 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 성능 데이터의 견고한 탱크-기반 검증을 교시한다.
일부 실시태양에서, 고 처리량 선별 공정은 생물 반응기에서의 균주의 성능을 예측하도록 디자인된다. 상기한 바와 같이, 배양 조건은 생물체에 적합하고 생물 반응기 조건을 반영하도록 선택된다. 개별 콜로니를 집어 96웰 플레이트로 옮기고 적당한 시간 동안 배양한다. 이어서 세포를 종자 배양 또는 생산 배양을 위해 새로운 96웰 플레이트로 옮긴다. 배양액은 다양한 시간 동안 배양되어, 다중 측정이 실행될 수 있다. 다중 측정은 생성물, 바이 매스 또는 생물 반응기에서 균주의 성능을 예측하는 다른 특성의 측정을 포함할 수 있다. 고 처리량의 배양 결과는 생물 반응기 성능을 예측하는데 사용된다.
일부 실시태양에서, 탱크-기반 성능 검증은 고 처리량 선별에 의해 분리된 균주의 성능을 확인하기 위해 사용된다. 발효 공정/조건은 상업용 반응기 조건을 모사하도록 디자인된다. 생산성 또는 수율과 같은 관련 균주 성능 특성에 대한 벤치 스케일 발효 반응기를 사용하여 후보 균주를 선별한다.
생성물 회수 및 정량화
관심 생성물의 생산을 위한 선별 방법은 당업자에게 공지되어 있으며 본 명세서 전반에 걸쳐 논의된다. 이러한 방법은 본 발명의 균주를 선별할 때 사용될 수 있다. 본 발명에 제공된 방법에 의해 생성된 생체 분자 또는 관심 생성물은 글루코스로부터 생성된 임의의 상업적 생성물일 수 있다. 일부 경우에, 생체 분자 또는 관심 생성물은 아미노산, 유기산 또는 알코올이다. 아미노산은 제한 없이 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파르트산, 아스파라긴, 트레오닌, 이소류신, 메티오닌 또는 리신일 수 있다. 특정 실시태양에서, 아미노산은 리신이다. 특정 양태에서, 리신은 L-리신이다. 유기산은 제한 없이 숙시네이트, 락테이트 또는 피루베이트일 수 있다. 알코올은, 제한 없이, 에탄올 또는 아이소부탄올일 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 비 분비된 세포내 생성물을 생산하도록 디자인된 균주를 개량시키는 방법을 교시한다. 예를 들어, 본 발명은 세포내 효소, 오일, 약제 또는 다른 가치있는 작은 분자 또는 펩타이드를 생성하는 세포 배양물의 견고성, 수율, 효율 또는 전반적인 바람직함을 개선시키는 방법을 교시한다. 비 분비된 세포내 생성물의 회수 또는 분리는 용해 및 본 발명에 기술된 것을 포함하여 당해 분야에 주지된 회수 기술에 의해 달성될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 세포는 원심 분리, 여과, 침전 또는 다른 방법에 의해 수확될 수 있다. 이어서, 수확된 세포는 동결-해동 사이클링, 초음파 처리, 기계적 파쇄 또는 세포 용해제의 사용, 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 포함하는 임의의 편리한 방법으로 파괴된다.
관심의 생성된 생성물, 예를 들면, 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 다수의 방법 중 임의의 방법에 의해 회수/분리될 수 있으며 임의로 정제될 수 있다. 예를 들어, 생성물 폴리 펩타이드는 원심 분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발, 크로마토 그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성 상호작용, 크로마토포커싱 및 크기 배제) 또는 침전을 포함하나 이에 제한되지 않는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 분리될 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC)가 최종 정제 단계에서 사용될 수 있다. (예를 들어, Purification of intracellular protein as described in Parry et al., 2001, Biochem. J.353:117, and Hong et al., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol.　73:1331, 참조, 모두는 참조로 본 발명에 포함된다).
상기한 참조문헌 이외에, 다양한 정제 방법은, 예를 들어, Sandana (1997)　Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996)　Protein Methods,　2nd　Edition, Wiley-Liss, NY; Walker (1996)　The Protein Protocols HandbookHumana Press, NJ; Harris and Angal (1990)　Protein Purification Applications: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal　Protein Purification Methods: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993)　Protein Purification: Principles and Practice　3rd　Edition, Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998)　Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition, Wiley-VCH, NY; and Walker (1998)　Protein Protocols on CD-ROM, Humana Press, NJ에 개시된 것들을 포함하여 당업계에 주지되어 있으며, 이의 전부는 본 발명에 참조로 포함된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 분비된 생성물을 생산하도록 디자인된 균주를 개량시키는 방법을 교시한다. 예를 들어, 본 발명은 귀중한 작은 분자 또는 펩타이드를 생산하는 세포 배양물의 견고성, 수율, 효율 또는 전반적인 바람직함을 개선시키는 방법을 교시한다.
일부 실시태양에서, 면역학적 방법을 사용하여 본 발명의 세포에 의해 생산된 분비된 또는 분비되지 않은 생성물을 검출 및/또는 정제하는데 사용될 수 있다. 한 예시적 접근법에서, 통상적인 방법을 사용하여 생성물 분자(예를 들어, 인슐린 폴리펩타이드 또는 이의 면역원성 단편에 대해)에 대해 생성된 항체는 비드 상에 고정화되고, 엔도글루카나아제가 결합되고 침전되는 조건하에 세포 배양 배지와 혼합된다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)의 사용을 교시한다.
다른 관련 실시태양에서, 면역크로마토그래피가 미국 특허 제5,002,303호, 미국 특허 제5,591,645호, 미국 특허 제4,855,240호, 미국 특허 제4,435,504호, 미국 특허 제4,980,298호 및 Se-Hwan Paek, et al., "Development of rapid One-Step Immunochromatographic assay, Methods", 22, 53-60, 2000에 개시된 바와 같이 사용되며, 이의 각각은 참조로 본 발명에 포함된다. 일반적인 면역크로마토그래피는 2개의 항체를 사용하여 표본을 검출한다. 제 1 항체는 시험 용액 중에 또는 시험 용액을 떨어뜨린 다공성 막으로 제조된 대략 직사각형 형태의 시험편의 말단 부분에 존재한다. 이 항체는 라텍스 입자 또는 금 콜로이드 입자(이 항체는 이하에서 표지 항체로 불릴 것이다)로 표지한다. 떨어뜨린 시험 용액이 검출될 표본을 포함하는 경우, 표지된 항체는 표본을 인식하여 표본과 결합한다. 표본과 표지된 항체의 복합체는 모세관 현상에 의해 여과지로 만들어지고 표지된 항체를 포함하는 말단의 반대편 말단에 부착된 흡수체를 향하여 흐른다. 이 흐름 동안, 표본과 표지 항체의 복합체가 다공질 막의 중간에 존재하는 제 2 항체(이하에서 태핑 항체로 불릴 것이다)에 의해 인식되어 포획되고, 그 결과, 복합체는 가시광 신호로서 다공성 막 상의 검출부 상에 나타내고 검출된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 선별 방법은 측광 검출 기술(흡수, 형광)에 기초한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 검출은 항체에 결합된 GFP와 같은 형광 단 검출기의 존재에 기초할 수 있다. 다른 실시태양에서, 측광 검출은 세포 배양 물로부터의 원하는 생성물 상의 축적에 기초할 수 있다. 일부 실시태양에서, 생성물은 배양물의 UV 또는 상기 배양물로부터의 추출물을 통해 검출될 수 있다.
일부 실시태양에서, 생성물 회수 방법은 각각의 후보 gapA/수소절달 효소/gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자의 성능에 대한 효과의 정량적 측정을 가능하게 한다. 일부 실시태양에서, 생성물 회수 방법은 각각의 후보 gapA/수소절달 효소/gdh, asd, dapB 및/또는 ddh 유전자 조합의 성능에 대한 효과의 정량적 측정을 가능하게 하여, 각각의 비교 및 최적 조합에 대한 선택을 가능하게 한다.
본 발명의 방법 및 유기체를 통해 생성되고 회수된 생성물의 비 제한적인 목록은 표 2에 제공된다.
본 발명의 생성물(관심 생성물, 생성된 화합물 등으로 불림)
폴리케타이드
피크로마이신 에리트로마이신 A 클라리트로마이신 아지트로마이신
아버멕틴 이버멕틴 스피노사드 젤다나마이신
맥베신 암포테리신 나이스타틴 피마리신
모넨신 독시사이클린 불라타신 스쿠아모신
몰비자린 우바리신 아노나신 타크롤리무스
시롤리무스 라디시콜 로바스타틴 디스코더몰리드
아플라톡신 우스닌산 안트라마이신
카테킨
에피카테킨 에피갈로카테킨 에피카테킨 갈레이트 에피갈로카테킨 갈레이트
에피아프젤레친 피세티니돌 구이보우리티니돌 메스퀴톨
로빈에티니돌
테르펜
프레놀 아이소발레르산 게라니올 테르피네올
리모넨 마이르센 리날로울 피넨
휴뮬렌 파네센 파네솔 카페스톨
카올 셈브렌 탁사다이엔 레티놀
레티날 피톨 제라닐파네솔 스쿠알렌
라노스테롤 사이클로아테놀 콜레스테롤 페루지카다이올
테트라프레닐커쿠멘
 리코펜 감마-카로틴 알파-및 베타-카로틴
3-옥소-α-이온올 7,8-다이하이드로이오논 메가스티그만-3,9-다이올 3-옥소-7,8-다이하이드로-α-이온올
지방산
미리스톨레산 팔미톨레산 사피엔산 올레산
엘라이드산 바센산 리놀레산 리노에라이드산
α-리놀렌산 아라키돈산 에이코사펜타엔산 에루크산
도코사헥사엔산 카프릴산 카프르산 라우르산
미리스트산 팔미트산 스테아르산 아라키드산
베헨산 리그노세르산 세로산
아미노산 또는 이의 유도체
S-아데노실 메티오닌 아이소류신 류신 발린
메티오닌 트레오닌 리신 글루타메이트
트립토판 티로신 L-리신 페닐알라닌
코리스메이트 경로 화합물
인돌 코리스메이트 시키메이트 살리실산
2,3-다이하이드록시벤조산 파라-아미노벤조에이트 비타민 k 엽산
알칼로이드
에페드린 호모하링토닌 갈란타민 빈카민
퀴니딘 모르핀 첼에르트린 피페린
카페인 니코틴 테오브로민 퀴닌
당업자는 본 발명의 방법이 관심 있는 임의의 바람직한 생체분자 생성물을 생성하는 숙주 세포와 양립 가능하다는 것을 인식할 것이다.
선택 기준 및 목표
이형 gapA/니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소/트레오닌 알돌라제/피루베이트 카복실라제/gdh, asd, dapB 및/또는 ddh를 발현하는 숙주 세포의 특정 균주의 선택은 특정 목표에 기초할 수 있다. 본 발명은 임의의 프로그램 목표를 충족시키도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 프로그램 목표는 즉각적인 시간 제한 없이 반응의 단일 배치 수율을 최대화하는 것일 수 있다. 다른 실시태양에서, 프로그램 목표는 특정 생성물을 생산하거나 특정 비율의 생성물을 생산하기 위해 생합성 수율을 재조정하는 것일 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로그램 목표는 수율, 역가, 생산성, 부산물 제거, 공정 이상현상에 대한 내성, 최적 성장 온도 및 성장율과 같은 성능 특성을 개선하는 것일 수 있다. 일부 실시태양에서, 프로그램 목표는 미생물에 의해 생성된 관심 생성물의 부피 생산성, 비 생산성, 수율 또는 역가에 의해 측정된 바와 같이 개량된 숙주 성능이다.
다른 실시태양에서, 프로그램 목표는 투입량 당 최종 생성물 수율(예를 들어, 수크로오스의 파운드당 생산된 총 에탄올의 양)의 관점에서 상업적 균주의 합성 효율을 최적화하는 것일 수 있다. 다른 실시태양에서, 프로그램 목표는 예를 들어 배치 완료율 또는 연속 배양 시스템에서의 수율로 측정된 합성 속도를 최적화하는 것일 수 있다. 한 실시태양에서, 프로그램 목표는 생체 분자 또는 관심 생성물의 최종 생성물 수율 및/또는 생성률을 최적화는 것이다. 본 발명에 제공된 방법에 의해 생성된 생체 분자 또는 관심 생성물은 글루코스로부터 생성된 임의의 상업적 생성물일 수 있다. 일부 경우에, 생체 분자 또는 관심 생성물은 소분자, 아미노산, 유기산 또는 알코올이다. 아미노산은 제한 없이 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파르트산, 아스파라긴, 트레오닌, 이소류신, 메티오닌 또는 리신일 수 있다. 특정 실시태양에서, 아미노산은 리신이다. 특정 양태에서, 리신은 L-리신이다. 유기산은 제한 없이 숙시네이트, 락테이트 또는 피루베이트일 수 있다. 알코올은, 제한 없이, 에탄올 또는 아이소부탄올일 수 있다.
당업자는 특정 프로젝트 목표를 달성하기 위해 어떻게 균주 선택 기준을 맞춤하는지를 인식할 것이다. 예를 들어, 반응 포화시 균주의 단일 배치 최대 수율의 선택은 높은 단일 배치 수율을 가진 균주를 확인하는데 적절할 수 있다. 다양한 온도 및 조건에서 수율의 일관성에 기반한 선택은 견고성 및 신뢰성이 증가된 균주를 확인하는데 적절할 수 있다.
일부 실시태양에서, 초기 단계 및 탱크-기반 검증에 대한 선택 기준은 동일할 것이다. 다른 실시태양에서, 탱크-기반 선택은 추가 및/또는 상이한 선택 기준하에서 작동할 수 있다.
서열화
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 기재된 유기체의 전체-게놈 서열화를 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 대한 품질 조절제로서의 플라스미드, PCR 생성물 및 다른 올리고의 서열화를 교시한다. 크고 작은 프로젝트를 위한 서열화 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
일부 실시태양에서, 핵산을 서열화하는 임의의 고 처리량 기술이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 전체 게놈 서열화를 교시한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 유전자 변이를 확인하기위한 앰플리콘 서열화 울트라 딥 서열화를 교시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 태그맨테이션 (tagmentation)을 포함하는 신규한 라이브러리 제조 방법을 교시한다(WO/2016/073690 참조). DNA 서열화 기술은 표지된 터미네이터 또는 프라이머를 사용하는 고전적인 다이데옥시 서열화 반응(생거 방법) 및 슬라브 또는 모세관에서의 겔 분리; 가역적으로 종결된 표지된 뉴클레오타이드를 사용하는 합성에 의한 서열화, 열서열화; 454 서열화; 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브의 라이브러리에 대한 대립유전자 특이적 혼성화; 결찰이 뒤따르는 표지된 클론의 라이브러리에 대한 대립유전자 특이적 혼성화를 사용하는 합성에 의한 서열화; 중합 단계 동안 표지된 뉴클레오타이드의 혼입의 실시간 모니터링; 폴로니 서열화; 및 SOLiD 서열화를 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 연속적으로 서열화되는 고체 표면상의 개별 분자를 공간적으로 분리하는 단계를 포함하는 서열화의 고 처리량 방법이 사용된다. 이런 고체 표면은 비다공성 표면(솔렉사 서열화, 예를 들어, Bentley et al, Nature, 456: 53-59 (2008) or Complete Genomics　sequencing, e.g. Drmanac et al, Science, 327: 78-81 (2010)), 비드-또는 입자 결합 주형을 포함할 수 있는 웰의 어레이(454 서열화, 예를 들어, Margulies et al, Nature, 437: 376-380 (2005) or Ion Torrent　sequencing, U.S. patent publication 2010/0137143 or 2010/0304982), 미세가공된 막(SMRT 서열화, 예를 들어, Eid et al, Science, 323: 133-138 (2009)) 또는 비드 어레이(폴로니 서열화 또는 SOLiD 서열화, 예를 들어, Kim et al, Science, 316: 1481-1414 (2007))를 포함할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 분리된 분자가 고체 표면상에서 공간적으로 분리되기 전 또는 후에 분리된 분자를 증폭시키는 단계를 포함한다. 사전 증폭은 에멀젼 PCR, 또는 롤링 써클 증폭과 같은 에멀젼-기초 증폭을 포함할 수 있다. 또한 벤틀레이 등(상기) 및 제조사 지시(예를 들어, TruSeq™ Sample Preparation Kit and Data Sheet,　Illumina, Inc., San Diego, Calif., 2010); 및 추가로 참조로 포함된 다음 참조문헌: 미국 특허 제6,090,592호; 제6,300,070호; 제7,115,400호; 및 EP0972081B1에 기술된 바와 같이 개별 주형 분자가 고체 표면상에서 공간적으로 분리된 후, 브리지 PCR에 의해 평행하게 증촉되어 분리된 클론 집단 또는 클러스터를 형성한 후, 서열화되는 솔렉사-기초 서열화가 교시된다.
한 실시태양에서, 고체 표면상에 배치되고 증폭된 개개의 분자는 cm2당 적어도 105 클러스터의 밀도; 또는 cm2당 적어도 5x105의 밀도; 또는 cm2당 적어도 106 클러스터의 밀도로 클러스터를 형성한다. 한 실시태양에서, 상대적으로 높은 에러율을 갖는 서열화 화학 반응이 사용된다. 이런 실시태양에서, 이런 화학 반응에 의해 생산된 평균 품질 점수는 서열 판독 길이의 단조 감소 함수이다. 한 실시태양에서, 이런 감소는 서열 판독의 0.5%가 1-75 위치에서 적어도 하나의 오차를 가지며; 서열 판독의 1%가 76-100 위치에서 적어도 하나의 오차를 가지며; 서열 판독의 2%가 101-125 위치에서 적어도 하나의 오차를 갖는 것에 상응한다.
서열 변이체
일부 실시태양에서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, gdh 효소의 변이체는 SEQ ID NO: 42 또는 44의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, asd의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 30 또는 40의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, dapB의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 46 또는 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, ddh의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, gdh의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 및 182의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, asd의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 트레오닌 알돌라제의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 및 232의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 다중-카피 복제 플라스미드는 SEQ ID NO: 77의 thrABC 오퍼론 서열에 대해 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, gapA의 재조합 단백질 단편은 SEQ ID NO: 233, 234, 235, 236 및 298로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시태양을 설명하기 위해 제공되며 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 청구항의 범위에 의해 정의된 바와 같이, 본 발명의 취지 내에 포함되는 변경 및 다른 용도는 당업자에 의해 인식될 것이다.
이들 실시예는 NADPH의 이용 가능성에 의해 제한되는 숙주 세포에서 관심 생성물의 생산을 증가시키는 방법을 입증한다. 본 발명의 교시된 방법은 대사 경로에서 NADPH의 이용 가능성에 의존하는 임의의 관심 생성물의 생산을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 L-리신 또는 L-트레오닌과 같은 아미노산의 생산을 증가시키는 방법을 제공하며, 이는 두 가지 관심 생성물이며, 생산은 세포에서 NADPH의 이용 가능성에 의해 제한된다.
NADPH는 박테리아에서 L-리신 및 L-트레오닌 생산의 제한 인자인 것으로 알려져있다. 따라서, 이들 실시예는 숙주 세포에서의 NADPH 이용 가능성에 대한 한계를 극복하기 위한 6가지 전략을 예시하며, 이는 L-리신 또는 L-트레오닌 생산을 증가시킨다. 이들 전략은 다음과 같다: (1) 내인성 해당 효소 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 조효소 특이성을 확장시킴으로써 NADPH를 생산하는 해당 경로를 조작하여 효소가 NADP 및 NAD에 대한 이중 특이성을 갖는다; (2) NADH로부터 NADPH를 생성하는 숙주 세포에서 수소전달 효소를 발현시킨다; (3) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소의 상동체를 발현시킴으로써 리신, 트레오닌, 아이소류신 및 메티오닌에 대한 전구체인 아스파르테이트 세미알데하이드(ASA)의 합성을 재프로그래밍한다; (4) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 dapB 및/또는 ddh 효소의 상동체를 발현시킴으로써 리신 합성을 위한 DAP-경로를 재프로그래밍한다; (5) 트레오닌의 글리신으로의 분해를 감소시키거나 역전시키는 내인성 ltA의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 재프로그래밍한다; 및 (6) 이종 피루베이트 카복실레이트(Pyc) 또는 이의 상동체를 발현시켜 옥살로아세테이트의 합성을 증가시키거나 내인성 pyc의 발현을 증가시킨다. 한 실시태양에서, 표적 유기체는 대장균이다. 한 실시태양에서, 표적 유기체는 코리네박테리움 종이다.
아래에서 단지 독자를 돕기 위해 내용의 간략한 표가 제공된다. 이런 표의 내용의 어떤 것도 본 출원의 실시예 또는 설명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 부분에 대한 내용의 표
실시예 # 제목 간략한 설명
1 글리세롤 알데히드 3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)-리신의 조효소 특이성 확대 NADP를 포함하도록 gapA의 조효소 특이성을 확대시켜 달성한 C. 글루 타미쿰에서 리신 생산성 개선에 대해 설명한다.
2 대장균 K-12 균주의 트레오닌 생성 염기 균주 W3110의 제작 트레오닌 생산에 적합한 대장균 기본 균주 제작에 대해 설명하며, 이는 실시예 3 및 5-7에 사용된다.
3 글리세롤 알데히드 3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)-트레오닌의 조효소 특이성 확대 NADP를 포함하도록 gapA의 조효소 특이성을 확대시켜 달성한 대장균에서 트레오닌 생산성 개선에 대해 설명한다.
4 NADH에 대한 보조 인자 특이성이 있는 변이체 효소를 이용하여 리신 합성을 위한 DAP 경로 재프로그래밍 gdh, asd, dapB 및 ddh를 다른 박테리아의 상동체로 대체하여 달성한 C. 글루타미쿰에서 리신 생산성 개선에 대해 설명한다.
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NADH에 대한 보조 인자 특이성이 있는 변이체 효소를 이용하여 트레오닌 생합성 경로
재프로그래밍		 환경 시료에서 개발된 인-하우스 군유전체학 라이브러리에서 계산된 다른 박테리아의 상동체로 gdh 및 asd를 대체하여 달성한 대장균에서 트레오닌 생산성 개선에 대해 설명한다.
6 다른 기질 선호도 및 효소 동역학을 가진 변형 트레오닌 알돌라제 효소를 활용하여 트레오닌 역가 개선 트레오닌 알돌라제 유전자를 환경 시료에서 개발된 인-하우스 군유전체학 라이브러리로부터 컴퓨터로 확인된 유전자 또는 크로노박테리아 사카자카이 트레오닌 알돌라제로 대체함으로써 달성된 대장균에서의 트레오닌 생산성의 개선을 설명한다.
7 대장균에서 L-트레오닌 생산을 증가시키기 위해 변형 또는 변이 gap A, gdh, asd 및 ltaE 효소의 조합 발현 대장균에서 트레오닌 생산을 크게 개선하기 위해 gapA, gdh/asd 및 TA 전략을 조합하는 것을 설명한다.
8 NADH로부터 NADPH를 생성하는 수소전달 효소 발현 NADP를 NADPH로 전환할 수 있는 수소전달 효소를 발현시켜 C. 글루타미쿰에서 리신 생산성을 개선시키는 방법을 설명한다.
9 피루베이트 카복실라제 발현 피루베이트 카복실라제의 발현에 의한 리신 또는 트레오닌 생산의 개선을 설명한다.
10 L-리신 또는 L-트레오닌 생산을 증가시키기 위해 C.글루타미컴 또는 대장균에서
변형된 gapA, 트랜스 하이드로게나 제 및 변형된 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소의 조합 발현		 실시예 1 내지 9에서 탐구된 전략의 조합에 의해 C.글루타미쿰 또는 대장균에서 리신 또는 트레오닌 생산에서의 추가 개선을 설명한다.
11 신규 글리세르알데하이드 3 포스페이트 탈수소 효소(GAPDH) 대립 유전자의 확인 무작위 돌연변이 유발은 새로운 gapA 대립 유전자를 식별하는 데 사용된다.
실시예 1: 글리세르알데하이드 3- 포스페이트 탈수소 효소( GAPDH )-리신 의 조효소 특이성 확대
글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)는 중심 탄소 대사 경로에 관여하는 효소이다. GAPDH의 가장 일반적인 형태는 지금까지 연구된 모든 유기체에서 발견되는 NAD-의존성 효소 gapA이다. 이 효소는 gapA 유전자에 의해 암호화되어 글리세르알데하이드-3-포스페이트를 글리세레이트-1,3-비스포스페이트로 전환시킨다. C. 글루타미쿰으로부터의 gapA 효소의 아미노산 서열은 다음과 같다:
MTIRVGINGFGRIGRNFFRAILERSDDLEVVAVNDLTDNKTLSTLLKFDSIMGRLGQEVEYDDDSITVGGKRIAVYAERDPKNLDWAAHNVDIVIESTGFFTDANAAKAHIEAGAKKVIISAPASNEDATFVYGVNHESYDPENHNVISGASCTTNCLAPMAKVLNDKFGIENGLMTTVHAYTGDQRLHDAPHRDLRRARAAAVNIVPTSTGAAKAVALVLPELKGKLDGYALRVPVITGSATDLTFNTKSEVTVESINAAIKEAAVGEFGETLAYSEEPLVSTDIVHDSHGSIFDAGLTKVSGNTVKVVSWYDNEWGYTCQLLRLTELVASKL (SEQ ID NO:58).
도 1에 도시된 바와 같이, gapA 효소는 NAD를 조효소로 사용하여 글리세르알데하이드-3-포스페이트를 글리세레이트-1,3-비스포스페이트로 전환시킨다. 이 과정에서 NAD가 NADH로 변환된다. 도 1에 도시된 바와 같이, 해당 경로는 생합성 경로로 공급되어 박테리아에서 L-리신 생산을 초래한다. 그러나, 상기 논의된 바와 같이, C. 글루타미쿰에 의한 L-리신의 생명공학 생산에서 결정적인 인자는 NADPH의 충분한 공급이다. 따라서, C. 글루타미쿰에서 NADPH 생산을 증가시키면 L-리신 생산이 증가할 것이다. 이 목표를 달성하는 한 가지 방법은 C. 글루타미쿰 gapA의 조효소 특이성을 변경하여 변형된 효소가 NADP를 보조 인자로 사용하여 더 많은 양의 NADPH가 세포에서 생성되도록 하는 것이다. 따라서, 이 실험의 목적은 NADP를 포함하도록 gapA의 조효소 특이성을 넓혀 C. 글루타미쿰에서 리신 생산성을 개선하는 것이었다.
이전 연구는 C. 글루타미쿰 gapA에서 D35G, L36T, T37K 및 P192S 돌연변이가 효소의 변경된 조효소 특이성(NAD에서 NADP로)을 초래한다는 것을 보여 주었다 (Bomareddy R.R. et al. (2014), Metab . Eng., 25:30-37). 본 발명자들은 C. 글루타미쿰의 몇 가지 균주를 생성하였으며, 각각은 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 상기 돌연변이 중 하나 이상을 보유하는 gapA 효소를 발현한다.
균주를 천연 gapA를 갖는 기준 균주와 비교하여 L-리신을 생산하는 능력에 대해 테스트하였다. 본 발명자들은 T37K 돌연변이가 단독으로 또는 L36T 돌연변이와 조합하여, C. 글루타미쿰 gapA의 조효소 특이성을 확대시켜, 변형된 효소가 NAD 및 NADP 둘 다에 대한 선호도를 나타냄을 발견하였고 C. 글루타미쿰에서 변형된 효소의 발현은 리신의 생산성을 상당히 개선시켰다(도 2). C. 글루타미쿰 gapA 돌연변이 균주(T37K 및 L36T/T37K)의 구성은 하기에 기재되어 있다.
gapA 유전자는 시판되는 올리고를 사용하는 주형으로서 C.글루타미쿰(ATCC 13032)의 염색체 DNA를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 단편을 코리네박테 리움 클로닝 벡터에 조립하고 표준 부위-지정 돌연변이 유발 기술을 사용하여 돌연변이시켰다. 벡터는 정확하게 조립된 클론을 확인하고 코리네박테리움 형질전환을 위한 벡터 DNA를 증폭시키기 위해 표준 열충격 형질전환 기술을 사용하여 대장균으로 처음에 형질전환시켰다.
확인된 클론을 전기천공을 통해 C. 글루타미쿰 숙주 세포로 형질전환시켰다. 각각의 형질전환에 대해, DNA의 μg당 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 삽입체 크기의 함수로 측정하였다. 코리네박테리움 게놈 통합은 또한 상동성 암 길이의 함수로 분석되었으며, 그 결과는 더 짧은 암은 더 낮은 효율을 가졌다는 것을 나타내었다.
삽입 카세트의 성공적인 통합을 갖는 것으로 확인된 코리네박테리움의 배양 물을 카나마이신-함유 배지에서 배양하여 카나마이신 내성 선택 유전자의 루프 아웃에 대항하기 위해 선택하였다.
루프 아웃 이벤트를 추가로 확인하기 위해, 카나마이신 내성을 나타내는 콜로니를 배양하고 시퀀싱을 통해 분석하였다.
상기 과정에 의해 2개의 상이한 리신 생성 백그라운드 균주 Parent_2 및 Parent_1에서 몇몇 돌연변이 균주가 생성되었다. 표 4는 각 부모 균주에 도입된 특정 돌연변이를 설명한다.
gapA 돌연변이
gapA 돌연변이
돌연변이 명칭 돌연변이 서열 변화
gapAv1 D35G GTC→GCC
gapAv2 L36T GAG→GGT
gapAv3 T37K GGT→CTT
gapAv4 P192S AGG→GGA
gapAv5 D35G L36T GAGGTC→GGTGCC
gapAv6 D35G T37K GGTGAGGTC→CTTGAGGCC
gapAv7 L36T T37K GGTGAG→CTTGGT
gapAv8 D35G L36T T37K GGTGAGGTC→CTTGGTGCC
gapAv9 D35G L36T T37K P192S GGTGAGGTC→CTTGGTGCC; CCT→AGC
각각의 새롭게 생성된 균주 및 이의 부모 균주를 생성물 역가 성능을 평가하도록 디자인된 소규모 배양물(예를 들어, 96웰 플레이트)에서 리신 수율에 대해 테스트하였다. 소규모 배양은 산업용 규모의 배양 배지를 사용하여 수행하였다. 생성물 역가는 표준 비색 분석법으로 탄소 배출(즉, 단일 배치 수율을 나타냄)시 광학적으로 측정되었다. 간단히, 농축 분석 혼합물을 제조하고 발효 샘플에 첨가하여서 시약의 최종 농도는 160 mM 인산 나트륨 완충액, 0.2 mM Amplex Red, 0.2 U/mL 호오스래디쉬 퍼옥시다아제 및 0.005U/mL 리신 옥시다제이었다. 반응을 종점으로 진행시키고 560nm 파장에서 Tecan M1000 플레이트 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도를 측정하였다. 실험 결과는 도 2에 요약된다.
NADP에 대한 변형된 조효소 특이성을 부여하는 특정 돌연변이를 갖는 GAPDH의 도입은 리신의 생산성을 상당히 개선시켰다(도 2). 균주 7000182994 및 7000184348은 각각 T37K를 포함하며 각 부모 Parent_1 및 Parent_2보다 성능이 우수하다. 균주 7000182999 및 7000184352는 각각 T37K 및 L36T를 포함하며 각 부모 Parent_1 및 Parent_2보다 성능이 우수하다. 균주 7000182997 및 7000184349는 각각 P192S를 함유한다. 균주 7000182998 및 7000184347는 각각 L36T를 함유한다.
실시예 2: 대장균 K-12 균주의 트레오닌 생산 기본 균주 W3110의 제작
리신(메티오닌, 아이소류신 및 글리신뿐만 아니라)과 마찬가지로, 트레오닌 합성 경로를 향한 초기 단계는 옥살로아세테이트의 아스파르테이트로의 전환을 포함하며, 글루타메이트 탈수소 효소(gdh)에 의해 2-옥소글루타레이트로부터 재생되는 글루타메이트를 사용한다. 아스파르테이트는 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd)에 의해 아스파르틸 포스페이트를 아스파르테이트 세미알데하이드(ASA)로 후속 환원시키면서 아스파르틸 포스페이트로 전환한다. 이들 단계는 리신, 트레오닌, 아이소류신 및 메티오닌 생합성에 공통적이다. 트레오닌 형성은 아스파르틸 포스페이트를 ASA로 asd 전환하는 것 이상의 3가지 추가 단계를 필요로 한다: (1) 이작용성 아스파토키나제/호모세린 탈수소 효소(thrA)에 의한 ASA의 호모세린으로의 전환, (2) 호모세린 키나아제(thrB)에 의한 호모세린에서 L-호모세린 포스페이트로의 전환 및 마지막으로, (3) 신타아제(thrC)에 의한 L-호모세린 포스페이트의 트레오닌으로의 전환. 이 마지막 3 단계는 NADP/NADH와 독립적으로 작동한다
먼저 야생형 대장균 K-12 균주 W3110을 사용하여 트레오닌 생산 기본 균주를 생성하였다. 이 트레오닌 기본 균주는 2 단계로 생성하였다: 첫째, 본 발명자들은 다음으로 구성된 천연 대장균, thrLABC 레귤론(SEQ ID NO: 76)을 과발현하였다: thrL(트레오닌 및 아이소류신 코돈이 풍부한 리더 서열, 이어서 오페론에서 효소-암호화 유전자의 전사를 방지하도록 작용하는 기능적 전사 종결자); thrA (이작용성 아스파토키나제/호모세린 탈수소 효소 1); thrB(호모세린 키나아제) 및 thrC(트레오닌 신타아제). 이 폴리뉴클레오타이드는 상업적으로 공급되는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 W3110 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭하였다. thrLABC 오페론을 합성 프로모터 pMB085(도 8a; SEQ ID NO: 75)의 제어하에 다중-카피 복제 플라스미드(변형된 pUC19 벡터; SEQ ID NO: 78)에 삽입하였다. 발현의 약화를 완화시키기 위해, 이 플라스미드의 변이체를 제작하였으며, 여기서 thrL 리더 서열이 제거되었다(도 8b; SEQ ID NO: 77). 둘째, L-트레오닌의 2-아미노-3-케토 부티레이트로의 산화에 촉매작용함으로써 트레오닌 생산에 대항하여 작용하는 효소인 L-트레오닌 3-탈수소 효소(tdh)를 암호화하는 대장균 W3110 염색체의 영역을 삭제하였다.
생성된 W3110 트레오닌 염기 균주 W3110 pMB085thrLABCㅿtdh(THR01; 7000336113) 및 W3110 pMB085thrABCㅿtdh(THR02; 7000341282)에서 트레오닌 생산을 평가하기 위해, 각각의 균주 및 이의 부모(W3110; 7000284155)를 생성물 역가 성능을 평가하도록 디자인된 소규모 배양물(예를 들어, 96 웰 플레이트)에서 트레오닌 수율로 테스트하였다. 소규모(300ul) 배양물을 TPM1 배지에서 성장시켰다. TPM1 배지는 리터당: 글루코오스, 50g; 효모 추출물, 2g; MgSO4.7H2O, 2g; KH2PO4, 4g; (NH4)2SO4, 14g; 베타인, 1g; L-메티오닌, 0.149g; L-리신, 0.164g; 미량 금속 용액, 5ml 및 CaCO3, 30g을 함유한다. 미량 금속 용액은 리터당: FeSO4.7H2O, 10g; CaCl2, 1.35g; ZnSO4.7H2O, 2.25g; MnSO4.4H2O, 0.5g; CuSO4.5H2O, 1g; (NH4) 6Mo7O24.4H2O, 0.106g; Na2B4O7.10H2O, 0.23g; 35% HCl, 10ml을 함유한다. 4N KOH를 첨가하여 최종 pH를 7.2로 조정하였다. 클로람페니콜(35μg/ml), 카나마이신(40μg/ml) 및 암피실린 (50μg/ml)을 필요할 때 배지에 첨가하였다. 배양물을 1000rpm에서 일정한 교반과 함께 가습(80% 습도) INFORS HT Multitron Pro 인큐베이터 진탕기에서 37℃에서 약 36시간 동안 성장시켰다.
펩타이드 및 단백질 가수 분해물 아미노산에 대한 AccQ·Tag(Waters Corp.) 프리컬럼 유도체화 및 분석 기술을 사용하여 무세포 배지의 샘플에서 트레오닌 역가를 측정하였다. Waters AccQ·Fluor Reagent를 사용하여 샘플에 존재하는 아미노산을 유도체화하였다. 이어서, 이들 유도체를 역상 HPLC에 의해 분리하고 형광 검출에 의해 정량하였다. 660nm 파장에서 Tecan M1000 플레이트 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 각각의 샘플에 대한 바이오매스 추정치를 결정하고, 표준 색도 분석에 의해 최종 글루코오스 농도를 결정하였다. 간략하게, 농축 된 분석 혼합물을 다음과 같이 최종 농도의 시약으로 제조하였다: 175 mM 인산 나트륨 완충액, pH 7.0; 0.2mM 앰플렉스 레드(Chemodex CDX-A0022); 아스퍼길루스 니거(Sigma G7141)의 16 U/mL 글루코오스 산화 효소 및 0.2 U/mL의 호오스래디쉬 과산화 효소(VWR 0417-25000). 실온에서 30분 동안 암실에서 반응을 진행시키고 560nm 파장에서 Tecan M1000 플레이트 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도를 측정하였다. 상기 배양 조건 및 측정을 사용하여 역가를 계산하고 하기 실시예에 기재된 균주의 수율 및 생산성을 추정하였다.
실시예 3: 글리세르알데하이드 3- 포스페이트 탈수소 효소( GAPDH )-트레오닌의 조효소 특이성 확대
실시예 2에 기술된 기본 균주는 다음 실시예 실험에 대해 사용하였다.
글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)는 중심 탄소 대사 경로에 관여하는 효소이다. GAPDH의 가장 일반적인 형태는 지금까지 연구된 모든 유기체에서 발견되는 NAD-의존성 효소 gapA이다. 이 효소는 gapA 유전자에 의해 암호화되어 글리세르알데하이드-3-포스페이트를 글리세레이트-1,3-비스포스페이트로 전환시킨다.
도 9에 도시된 바와 같이, gapA 효소는 NAD를 조효소로 사용하여 글리세르알데하이드-3-포스페이트를 글리세레이트-1,3-비스포스페이트로 전환시킨다. 이 과정에서 NAD가 NADH로 변환된다. 도 9 및 도 10a-c에 도시된 바와 같이, 해당 경로는 생합성 경로로 공급되어 박테리아에서 L-트로오닌 생산을 초래한다. 그러나, 상기 논의된 바와 같이, 대장균에 의한 L-트레오닌의 생명공학 생산에서 결정적인 인자는 NADPH의 충분한 공급이다. 따라서, 대장균에서 NADPH 생산을 증가시키면 L-트레오닌 생산이 증가할 것이다. 이 목표를 달성하는 한 가지 방법은 C. 글루타미쿰 gapA의 조효소 특이성을 변경하여 변형된 효소가 NADP를 보조 인자로 사용하여 더 많은 양의 NADPH가 세포에서 생성되도록 하는 것이다. 따라서, 이 실험의 목적은 NADP를 포함하도록 gapA의 조효소 특이성을 넓혀 대장균에서 트레오닌 생산성을 개선하는 것이었다.
이전 연구는 C. 글루타미쿰 gapA에서 D35G, L36T, T37K 및 P192S 돌연변이가 효소의 변경된 조효소 특이성(NAD에서 NADP로)을 초래한다는 것을 보여 주었다 (Bomareddy R.R. et al. (2014), Metab . Eng., 25:30-37). C. 글루타미쿰으로부터의 gapA 효소의 아미노산 서열은 다음과 같다:
MTIRVGINGFGRIGRNFFRAILERSDDLEVVAVNDLTDNKTLSTLLKFDSIMGRLGQEVEYDDDSITVGGKRIAVYAERDPKNLDWAAHNVDIVIESTGFFTDANAAKAHIEAGAKKVIISAPASNEDATFVYGVNHESYDPENHNVISGASCTTNCLAPMAKVLNDKFGIENGLMTTVHAYTGDQRLHDAPHRDLRRARAAAVNIVPTSTGAAKAVALVLPELKGKLDGYALRVPVITGSATDLTFNTKSEVTVESINAAIKEAAVGEFGETLAYSEEPLVSTDIVHDSHGSIFDAGLTKVSGNTVKVVSWYDNEWGYTCQLLRLTELVASKL ( SEQ ID NO:58 ).
여기서, 본 발명자는 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 상기 돌연변이 중 하나를 보유하는 이종(C. 글루타미쿰) gapA 효소의 각 변이체: gapAv5(SEQ ID NO:69), gapAv7(SEQ ID NO:71) 또는 gapAv8(SEQ ID NO:73)를 발현하는 대장균의 여러 균주를 생성하였다.
이 연구에서 테스트된 돌연변이 및 천연 gapA 변이체.
gapA 효소
유전자 원료 돌연변이(들) 폴리뉴클레오타이드 Seq . 단백질 Seq .
gapA E. coli 없음
(야생형)		 SEQ ID NO: 68 SEQ ID NO: 67
gapAv5 C. glutamicum D35GL36T SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 69
gapAv7 C. glutamicum L36TT37K SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 71
gapAv8 C. glutamicum D35GL36TT37K SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 73
균주는 천연 대장균 gapA(SEQ ID NO:67)를 갖는 기준 균주 (W3110thrABCㅿtdh)에 비해 L-트레오닌을 생산하는 능력에 대해 테스트되었다. 본 발명자는 모든 세 가지 변이체 - gapAv5(SEQ ID NO:69), gapAv7(SEQ ID NO:71) 및 gapAv8(SEQ ID NO:73)의 발현이 모두 독립적으로 트레오닌 역가를 크게 개선시켰음을 발견하였다(도 11a). 대장균 gapA 돌연변이 균주의 구성은 다음과 같다.
gapA 변이체(gapAv5(SEQ ID NO:69), gapAv7(SEQ ID NO:71) 또는 gapAv8(SEQ ID NO:73))는 상업적으로 공급되는 올리고를 사용하여 코리네박테리움 클로닝 벡터로부터 PCR에 의해 증폭되었다. 천연 대장균 gapA는 W3110 게놈 DNA로부터 증폭되었다. PCR 단편을 대장균 클로닝 벡터-변형된 pUC19 벡터(SEQ ID NO: 70, 72 및 74로 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열을 암호화함)로 조립하고, 정확하게 조립된 클론을 확인하고, 대장균 W3110 트레오닌 염기 균주 THR01 및 THR02로의 형질 전환을 위해 벡터 DNA를 증폭시키기 위해 표준 열 충격 변환 기술을 사용하여 NEB 10-베타 대장균 세포로 처음에 형질전환시켰다.
새로 생성된 각각의 균주 및 이의 부모 균주를 상기한 바와 같이 소규모 배양물(예를 들어, 96 웰 플레이트)에서 트레오닌 생산에 대해 테스트하였다.
NADP에 대해 변경된 조효소 특이성을 부여하는 특정 돌연변이를 갖는 GAPDH의 도입은 트레오닌 역가를 상당히 개선시켰다(도 11a). 균주 7000342726(gapAv5), 7000342720(gapAv7) 및 7000342727(gapAv8)은 모두 부모 균주(7000341282)보다 성능이 우수하고 부모는 대장균 gapA(7000342723)의 두 번째 복제물을 발현한다.
gapA 변이체의 트레오닌 생산성
　
균주 ID 　 역가 STDEV
7000342726 gapAv5 19.04 8.33
7000342720 gapAv7 15.47 9.45
7000342727 gapAv8 8.73 4.18
7000342723 Ec_gapA 0.79 1.37
7000341282 thrABC 0.79 1.37
7000284155 W3110 　0 0　
실시예 4: NADH에 대한 보조 인자 특이성을 갖는 변이체 효소를 이용하여 리신 합성을 위한 DAP -경로 재프로그래밍
박테리아에서 L-리신 생산을 초래하는 생합성 경로는 다이아미노피멜레이트(DAP)-경로(도 1)로 알려져 있다. DAP 경로를 향한 초기 단계는 글루타메이트 탈수소 효소(gdh)에 의해 2-옥소글루타레이트로부터 재생되는 글루타메이트를 사용하는 옥살로아세테이트의 아스파르테이트로의 전환을 포함한다. 아스파르테이트는 아스파르틸 포스페이트로 전환되고, 아스파르틸 포스페이트는 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd)에 의해 아스파르테이트 세미알데하이드(ASA)로 후속 환원된다. 이들 단계는 리신, 트레오닌, 아이소류신 및 메티오닌 생합성에 공통적이다. 리신 생합성을 향한 첫 번째 단계는 ASA를 다이하이드로피콜리네이트(DHDP)로 전환시키는 것이며, 이는 다이하이드로피콜리네이트 합성 효소에 의해 촉매작용을 받는다. 이어서 DHDP는 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB)에 의해 테트라하이드로피콜리네이트(THDPA)로 환원된다. 코리네박테리움 글루타미쿰을 포함한 몇몇 박테리아는 효소 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)를 보유하며, 이는 THDPA를 메소-다이아미노피멜레이트(mDAP) 로의 직접 전환에 촉매작용 한 다음, 다이아미노피멜레이트 디카복실라제에 의해 L-리신으로 전환된다.
도 1에 도시된 바와 같이, 천연 C. 글루타미쿰 효소 gdh, asd, dapB 및 ddh 각각은 그들의 각각의 작용에 대해 조효소로서 NADPH를 필요로 한다. 그러나, NADPH는 C. 글루타미쿰에서 산업적 규모로 글루코오스로부터 L-리신을 생산하는 데 있어서 제한적인 인자 중 하나이다(Becker et al. (2005), Appl . Environ. Microbiol., 71(12):8587-8596). 따라서, C. 글루타미쿰에서 NADPH 생산을 증가시키면 L-리신 생산이 증가할 것이다. 이 목표를 달성하는 한 가지 방법은 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 C. 글루타미쿰 효소 gdh, asd, dapB 및 ddh의 자연 발생 상동체를 이용함으로써 NADPH의 이용을 감소시키는 것이다. 따라서, 이 실험의 목적은 NADPH와 함께 NADH를 포함하도록 gdh, asd, dapB 및 ddh의 조효소 의존성을 넓히는 것이었다.
C. 글루타미쿰 효소 gdh 및 dapB는 각각 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더욱 효과적으로 사용하는 클로스트리디움 심비오섬(Lilley K.S. et al. (1991), Biochim Biophys Acta, 1080(3):191-197) 및 대장균(Reddy S.G. et al. (1995), Biochemistry, 34(11):3492-3501)에 알려진 상동체를 갖는다. C. 글루타미쿰 효소 asd 및 ddh에 대해서는 이러한 상동체가 알려져 있지 않다. 이와 같이, 박테리아에서 게놈 전체 상동성 검색을 수행하여 C. 글루타미쿰 효소, asd 및 ddh의 아미노산 서열 변이체를 발견하였다. 상동성 검색은 asd 및 ddh에 대해 각각 9개의 변이체를 생성하였다. 변이체 및 이들의 서열의 소스는 표 7에 요약되어있다. gdh, asd, dapB 및 ddh에 대한 DNA 서열은 C. 글루타미쿰에 코돈 최적화되어있다.
경로 상동체의 소스 및 순서
경로 상동체
종 상동체 코드 단백질 서열 DNA 서열
A. oris ddh ddh_Aor SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:1
C. glutamicum ddh ddh_Cgl SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:3
H. archaeon ddh ddh_Har SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:5
coprobacillus ddh ddh_Cop SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:7
M. harundinacea ddh ddh_Mha SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:9
M. micronuciformis ddh ddh_Mmi SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:11
A. denitrificans ddh ddh_Ade SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:13
M. luteus ddh ddh_Mlu SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:15
B. faecium ddh ddh_Bfae SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:17
carnobacterium ddh ddh_Car SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:19
M. jannaschii asd asd_Mja SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:21
S. usitatus asd asd_Sus SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:23
N. innermongolicus asd asd_Nin SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:25
C. aurantiacus asd asd_Cau SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:27
L. agilis asd asd_Lag SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:29
B. pullorum asd asd_Bpu SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:31
B. bacterium asd asd_Bba SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:33
M. hansupus asd asd_Mha SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:35
P. sabinae asd asd_Psa SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:37
C. glutamicum asd asd_Cgl SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:39
C. glutamicum gdh gdh_Cgl SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:41
C. symbiosum gdh gdh_Csy SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:43
C. glutamicum dapB dapB_Cgl SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:45
E. coli dapB dapB_Eco SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:47
C. glutamicum aspK aspK10 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:49
C. 글루타미쿰 gdh 및 dapB의 공지된 상동체뿐만 아니라 C. 글루타미쿰 asd 및 ddh의 9개의 변이체는 C. 글루타미쿰에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 도 4에서, 2가지 버전의 gdh 및 dapB 각각의 하나의 복제물 및 10가지 버전의 asd 및 ddh의 각각의 복제물은 카나마이신 내성 마커 유전자를 함유하는 플라스미드에 다양한 조합으로 복제되었다. 이 실시예에서 테스트된 효소의 조합은 표 7에 요약되어있다.
각각의 asd-gdh-dapB-ddh 조합을 플라스미드(SEQ ID NO: 51)로 복제하였다. 도 4는 하나의 예시적인 asd-gdh-dapB-ddh 테스트 조합에 대한 카세트 배열을 도시한다. 조절 서열은 SEQ ID NOs: 52-57이었다. 각 테스트 조합의 최종 카세트는 다음과 같이 5'에서 3'까지 표시될 수 있다.
Figure pct00001
dapB 및 ddh 대립 유전자의 역 보체 배향은 발현 카세트 배열의 결과이며, 상기 대립 유전자에 대한 침묵을 유발하려는 의도를 나타내는 것이 아님에 유의한다.
경로 상동체의 조합
경로 상동체
플라스미드 조합 (개별 플라스미드는 SEQ ID NO: 51의 골격 서열 및 상기에 명시되고 도 4에 나타낸 바와 같이 과발현 프로모터 중 각각의 위치에 삽입된 유전자의 콤보로 구성된다. 유전자는 표 7에서 발견된 바와 같이 이들의 유전자 코드에 의해 참조된다. " RC "는 도 4에 따른 유전자의 역 보체 배치를 나타낸다.)
asd 대립 유전자 gdh 대립 유전자 dapB 대립 유전자 ddh 대립 유전자
asd_Bpu
(SEQ ID NO:31)		 gdh_Cgl
(SEQ ID NO:41)		 RCdapB_Cgl
(SEQ ID NO:45)		 RCddh_Cgl
(SEQ ID NO:3)
asd_Bpu(SEQ ID NO:31) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Cgl
(SEQ ID NO:3)
asd_Cau(SEQ ID NO:27) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Cgl
(SEQ ID NO:3)
asd_Cgl(SEQ ID NO:39) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Ade
(SEQ ID NO:13)
asd_Cgl(SEQ ID NO:39) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Aor
(SEQ ID NO:1)
asd_Cgl(SEQ ID NO:39) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Bfae
(SEQ ID NO:17)
asd_Cgl(SEQ ID NO:39) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Car
(SEQ ID NO:19)
asd_Cgl(SEQ ID NO:39) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Cgl
(SEQ ID NO:3)
asd_Cgl(SEQ ID NO:39) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Cop
(SEQ ID NO:7)
asd_Cgl(SEQ ID NO:39) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Har
(SEQ ID NO:5)
asd_Cgl(SEQ ID NO:39) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Mha
(SEQ ID NO:9)
asd_Cgl(SEQ ID NO:39) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Mlu
(SEQ ID NO:15)
asd_Cgl(SEQ ID NO:39) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Mmi
(SEQ ID NO:11)
asd_Lag(SEQ ID NO:29) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Cgl
(SEQ ID NO:3)
asd_Nin(SEQ ID NO:25) gdh_Cgl
(SEQ ID NO:41)		 RCdapB_Cgl
(SEQ ID NO:45)		 RCddh_Cgl
(SEQ ID NO:3)
asd_Nin(SEQ ID NO:25) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Cgl
(SEQ ID NO:3)
asd_Psa(SEQ ID NO:37) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Cgl
(SEQ ID NO:3)
asd_Sus(SEQ ID NO:23) gdh_Csy
(SEQ ID NO:43)		 RCdapB_eco
(SEQ ID NO:47)		 RCddh_Cgl
(SEQ ID NO:3)
정확하게 조립된 클론을 확인하고 코리네박테리움 형질전환을 위해 벡터 DNA를 증폭시키기 위해 각각의 플라스미드를 표준 열 충격 변형 기술을 사용하여 대장균으로 형질전환시켰다.
검증된 클론을 전기 천공법을 통해 C. 글루타미쿰 숙주 세포로 형질 전환시켰다. 각각의 형질 전환에 대해, DNA 1㎍ 당 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 삽입체 크기의 함수로서 결정하였다. 코리네박테리움 게놈 통합은 상동성 암 길이의 함수로서 분석되었고, 결과는 더 짧은 암이 더 낮은 효율을 가짐을 보여주었다.
삽입 카세트의 성공적인 통합을 갖는 것으로 확인된 코리네박테리움의 배양 물은 카나마이신-내성 선택 유전자의 루프 아웃에 대항하기 위해 카나마이신-함유 배지에서 배양되었다.
루프 아웃 이벤트를 추가로 확인하기 위해, 카나마이신 내성을 나타내는 콜로니를 배양하고 시퀀싱을 통해 분석하였다.
C. 글루타미쿰에서 4가지 효소 모두가 동시에 발현되었다.
각각의 효소의 이종 버전을 함유하는 재조합 균주는 3 개의 상이한 모 균주로부터 제조되었고, 이들 모두는 유전적으로 별개의 리신 생산자 균주이다. 각각의 새롭게 생성된 균주 및 이의 부모 균주를 생성물 역가 성능을 평가하도록 디자인된 소규모 배양물(예를 들어, 96웰 플레이트)에서 리신 수율에 대해 테스트하였다. 소규모 배양은 산업용 규모의 배양 배지를 사용하여 수행하였다. 생성물 역가는 표준 비색 분석법으로 탄소 배출(즉, 단일 배치 수율을 나타냄)시 광학적으로 측정되었다. 간단히, 농축 분석 혼합물을 제조하고 발효 샘플에 첨가하여서 시약의 최종 농도는 160 mM 인산 나트륨 완충액, 0.2 mM Amplex Red, 0.2 U/mL 호오스래디쉬 퍼옥시다아제 및 0.005U/mL 리신 옥시다제이었다. 반응을 종점으로 진행시키고 560nm 파장에서 Tecan M1000 플레이트 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도를 측정하였다. 실험 결과는 표 9 및 도 5a와 5b에 요약된다.
각각 C. 글루타미쿰 ddh에 대한 천연 효소 및 gdh, asd 및 dapB에 대한 동일한 3개의 이종 효소(NADH를 사용하는 클로스트리움 심비오섬 gdh 및 대장균 dapB의 공지된 버전 및 락토바실러스 아길리스로부터의 asdd의 변이체)를 함유하는 2개의 C. 글루타미쿰 재조합 균주, 7000186960 및 7000186992는 각각의 부모 Parent_3 및 Parent_4에 비해 L-리신의 생산성이 상당히 개선되었음을 보여 주었다(도 5a). 상이한 효소의 조합의 효과에 대한 데이터가 표 9에 제시되어 있고, 부모와 비교하여 유의미한 개선을 초래하는 효소 조합이 굵게 강조되어 있다.
상동체 조합에 대한 데이터
상동체 조합에 대한 데이터
균주 ZID parent_strain_zid 플라스미드 조합 (부모와 유의하게 다른 성능을 가진 콤보는 굵게 표시됨) 평균 prod_pred_lys 표준
오차 prod_pred_lys 		하위 95% prod_pred_lys 상위 95% prod_pred_lys 평균 yield_pred 표준 오차 yield_pred 하위 95% yield_pred 상위 95% yield_pred
Parent_5 N/A parent 3.98959 0.10425 3.7796 4.1996 55.19853 0.24793 54.7072 55.6898
7000186924 Parent_5 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Mlu 3.39671 0.10425 3.1867 3.6067 55.77395 0.23192 55.3144 56.2335
7000186925 Parent_5 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Aor 3.46936 0.09324 3.2816 3.6572 56.28839 0.20744 55.8773 56.6994
7000186926 Parent_5 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Mha 3.61019 0.09324 3.4224 3.798 55.70273 0.20744 55.2917 56.1138
7000186929 Parent_5 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Ade 4.3899 0.12038 4.1475 4.6324 55.24996 0.23192 54.7904 55.7095
7000186930 Parent_5 asd_Bpugdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cgl 3.9191 0.10425 3.7091 4.1291 55.21564 0.20744 54.8046 55.6267
7000186935 Parent_5 asd_Ningdh_CglRCdapB_CglRCddh_Cgl 3.08749 0.10425 2.8775 3.2975 55.85527 0.23192 55.3957 56.3148
7000186937 Parent_5 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cop 3.13201 0.12038 2.8896 3.3745 56.32266 0.20744 55.9116 56.7337
7000186940 Parent_5 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cgl 3.37994 0.10425 3.17 3.5899 56.52587 0.23192 56.0663 56.9854
7000186941 Parent_5 asd_Susgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cgl 2.27348 0.09324 2.0857 2.4613 54.40485 0.20744 53.9938 54.8159
7000186943 Parent_5 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Car 3.85216 0.10425 3.6422 4.0621 56.28212 0.23192 55.8226 56.7417
7000186945 Parent_5 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Mmi 3.33 0.09324 3.1422 3.5178 55.76764 0.20744 55.3566 56.1787
7000186946 Parent_5 asd_Bpugdh_CglRCdapB_CglRCddh_Cgl 3.86864 0.09324 3.6808 4.0564 55.55222 0.20744 55.1412 55.9633
7000186947 Parent_5 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Bfae 3.58812 0.10425 3.3781 3.7981 56.31604 0.23192 55.8565 56.7756
Parent_4 N/A parent 3.21086 0.08147 3.0498 3.3719 55.01169 0.21589 54.585 55.4384
7000186980 Parent_4 asd_Psagdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cgl 4.14564 0.07287 4.0016 4.2897 55.71775 0.1931 55.3361 56.0994
7000186982 Parent_4 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Mmi 2.73655 0.07287 2.5925 2.8806 55.96255 0.1931 55.5809 56.3442
7000186983 Parent_4 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Ade 3.04197 0.07287 2.898 3.186 55.04775 0.20354 54.6454 55.4501
7000186984 Parent_4 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Mha 3.0087 0.07287 2.8647 3.1527 55.49415 0.1931 55.1125 55.8758
7000186990 Parent_4 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Har 3.08588 0.06652 2.9544 3.2173 55.67801 0.18411 55.3141 56.0419
7000186992 Parent_4 asd_Laggdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cgl 4.47068 0.07287 4.3267 4.6147 55.76648 0.1931 55.3848 56.1482
7000186993 Parent_4 asd_Ningdh_CglRCdapB_CglRCddh_Cgl 3.11677 0.07287 2.9728 3.2608 55.54902 0.1931 55.1674 55.9307
7000186994 Parent_4 asd_Caugdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cgl 3.05097 0.07287 2.907 3.195 55.34768 0.1931 54.966 55.7294
7000186995 Parent_4 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cop 3.06227 0.07287 2.9183 3.2063 55.73684 0.1931 55.3552 56.1185
7000186997 Parent_4 asd_Ningdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cgl 3.2248 0.07287 3.0808 3.3688 55.07264 0.1931 54.691 55.4543
7000186998 Parent_4 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cgl 3.14364 0.06652 3.0122 3.2751 56.02742 0.17627 55.679 56.3758
7000187001 Parent_4 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Car 3.44828 0.07287 3.3043 3.5923 55.90289 0.1931 55.5212 56.2846
7000187003 Parent_4 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Mlu 3.00001 0.07287 2.856 3.144 54.89024 0.1931 54.5086 55.2719
7000187004 Parent_4 asd_Bpugdh_CglRCdapB_CglRCddh_Cgl 3.41613 0.07287 3.2721 3.5601 56.35596 0.1931 55.9743 56.7376
7000187005 Parent_4 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Bfae 2.98817 0.07287 2.8442 3.1322 55.46868 0.1931 55.087 55.8504
Parent_3 N/A parent 3.99663 0.10864 3.7817 4.2115 55.35538 0.20109 54.9579 55.7529
7000186950 Parent_3 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Mha 3.66355 0.0909 3.4838 3.8434 55.40642 0.17986 55.0509 55.762
7000186951 Parent_3 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Aor 3.27925 0.08298 3.1151 3.4434 55.67602 0.17986 55.3205 56.0315
7000186952 Parent_3 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Mmi 3.44824 0.0909 3.2684 3.628 55.65879 0.17986 55.3033 56.0143
7000186955 Parent_3 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Ade 3.58453 0.0909 3.4047 3.7643 55.80398 0.17986 55.4485 56.1595
7000186958 Parent_3 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Har 3.31468 0.0909 3.1349 3.4945 55.38588 0.17986 55.0304 55.7414
7000186960 Parent_3 asd_Laggdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cgl 4.67526 0.0909 4.4955 4.8551 55.26038 0.17986 54.9049 55.6159
7000186961 Parent_3 asd_Ningdh_CglRCdapB_CglRCddh_Cgl 3.93776 0.0909 3.758 4.1176 55.35629 0.17986 55.0008 55.7118
7000186962 Parent_3 asd_Caugdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cgl 3.4915 0.08298 3.3274 3.6556 55.3 0.17149 54.961 55.639
7000186963 Parent_3 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cgl 3.34698 0.0909 3.1672 3.5268 56.16317 0.17986 55.8076 56.5187
7000186965 Parent_3 asd_Ningdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cgl 3.63562 0.10864 3.4207 3.8505 54.98718 0.17986 54.6317 55.3427
7000186966 Parent_3 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Cop 3.17575 0.11734 2.9436 3.4079 55.9921 0.17986 55.6366 56.3476
7000186969 Parent_3 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Car 3.42914 0.0909 3.2493 3.6089 55.79205 0.17986 55.4365 56.1476
7000186971 Parent_3 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Mlu 3.59553 0.0909 3.4157 3.7753 55.0482 0.17986 54.6927 55.4037
7000186972 Parent_3 asd_Bpugdh_CglRCdapB_CglRCddh_Cgl 3.88679 0.10162 3.6858 4.0878 55.59951 0.17986 55.244 55.955
7000186973 Parent_3 asd_Cglgdh_CsyRCdapB_ecoRCddh_Bfae 4.46987 0.11734 4.2377 4.702 55.46628 0.17986 55.1108 55.8218
4-유전자 카세트의 2가지 버전을 코리네박테리움 글루타미쿰 Parent_6에 도입하고 리신의 생산을 모니터링 하였다. 4개의 유전자는 NADPH 대신에 대안적인 보조 인자 NADH의 사용에 기초하여 선택되었다. 4-유전자 카세트 v1(균주 263254)은 C. 글루타미쿰(SEQ ID NO: 39)의 아스파르테이트-세미-알데하이드 탈수소 효소(asd), 클로스트리디움 심비오섬(SEQ ID NO: 43)의 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 대장균(SEQ ID NO: 47)의 4-하이드록시-테트라하이드로다이피콜리네이트 환원 효소(dapB), 및 C. 글루타미쿰(SEQ ID NO: 3)의 메소-다이아미노피멜레이트 D-탈수소 효소(ddh)를 함유한다. 따라서 4-유전자 카세트 v1(균주 263254)은 C. 글루타미쿰(SEQ ID NO: 40)의 아스파르테이트-세미-알데하이드 탈수소 효소(asd), 클로스트리디움 심비오섬(SEQ ID NO: 44)의 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 대장균(SEQ ID NO: 48)의 4-하이드록시-테트라하이드로다이피콜리네이트 환원 효소(dapB), 및 C. 글루타미쿰(SEQ ID NO: 4)의 메소-다이아미노피멜레이트 D-탈수소 효소(ddh)를 암호화한다.
4-유전자 카세트 v2(균주 263264)는 락토바실루스 아길리스(SEQ ID NO: 29)의 아스파르테이트-세미-알데하이드 탈수소 효소(asd), 클로스트리디움 심비오섬(SEQ ID NO: 43)의 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 대장균(SEQ ID NO: 47)의 4-하이드록시-테트라하이드로다이피콜리네이트 환원 효소(dapB), 및 C. 글루타미쿰(SEQ ID NO: 3)의 메소-다이아미노피멜레이트 D-탈수소 효소(ddh)를 함유한다. 따라서 4-유전자 카세트 v2(균주 263264)는 락토바실루스 아길리스(SEQ ID NO: 30)의 아스파르테이트-세미-알데하이드 탈수소 효소(asd), 클로스트리디움 심비오섬(SEQ ID NO: 44)의 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 대장균(SEQ ID NO: 48)의 4-하이드록시-테트라하이드로다이피콜리네이트 환원 효소(dapB), 및 C. 글루타미쿰(SEQ ID NO: 4)의 메소-다이아미노피멜레이트 D-탈수소 효소(ddh)를 암호화한다.
4-유전자 카세트는 플레이트 모델 9에서 리신 생산을 상당히 개선시켰다. 데이터는 표 10에 요약되어 있다.
개선된 리신 생산
유전자 카세트 균주 역가 mM (95% CI) % 부모에 대한 개선
없음 Parent_6 6.45 +/- 0.9 n/a
카세트 v1 263254 12.41 +/- 0.9 92.4
카세트 v2 263264 9.33 +/- 1.1 44.7
실시예 5: NADH에 대한 보조 인자 특이성을 갖는 변이체 효소를 이용하여 트레오닌 생합성 경로를 재프로그래밍
실시예 2에 기재된 기본 균주를 하기 실시예 실험에 사용하였다.
박테리아에서 L-트레오닌 생산을 유도하는 생합성 경로는 thrABC 경로로 알려져 있다(도 9). 리신(및 메티오닌, 아이소류신 및 글리신)과 마찬가지로, 트레오닌 합성 경로를 향한 초기 단계는 옥살로아세테이트의 아스파르테이트로의 전환을 포함하며, 글루타메이트 탈수소 효소(gdh)에 의해 2-옥소글루타레이트로부터 재생되는 글루타메이트를 사용한다. 아스파르테이트는 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd)에 의해 아스파르틸 포스페이트를 아스파르테이트 세미알데하이드(ASA)로 후속 환원시키면서 아스파르틸 포스페이트로 전환된다. 이들 단계는 리신, 트레오닌, 아이소류신 및 메티오닌 생합성에 공통적이다. 트레오닌 형성은 아스파르틸 포스페이트를 ASA로 asd 전환하는 것 이상의 3가지 추가 단계 - 이작용성 아스파토키나제/호모세린 탈수소 효소(thrA)에 의한 ASA의 호모세린으로의 전환, 호모세린 키나아제(thrB)에 의한 호모세린에서 L-호모세린 포스페이트로의 전환 및 마지막으로, (3) 신타아제(thrC)에 의한 L-호모세린 포스페이트의 트레오닌으로의 전환을 필요로 한다. 이 마지막 3 단계는 NADP/NADH와 독립적으로 작동하고 이 경로에서 임의의 잠재적 병목은 thrABC 오페론의 과발현에 의해 트레오닌 염기 균주에서 위험이 제거된다.
도 9에 도시된 바와 같이, 각각의 천연 대장균 효소 gdh 및 asd는 이들의 각각의 작용에 대한 조효소로서 NADPH를 필요로 한다. 그러나 NADPH는 대장균에서 산업적 규모로 글루코오스로부터 L-트레오닌을 생산하는 데 있어서 제한적인 요인 중 하나이다(Becker et al. (2005), Appl . Environ. Microbiol ., 71(12):8587-8596). 따라서 대장균에서 NADPH 생산이 증가하면 L-트레오닌 생산이 증가해야 한다. 이 목표를 달성하는 한 가지 방법은 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 대장균 효소 gdh 및 asd의 자연 발생 상동체를 이용함으로써 NADPH의 이용을 감소시키는 것이다. 따라서, 이 실험의 목적은 gdh 및 asd의 조효소 의존성을 NADPH와 함께 NADH를 포함하도록 넓히는 것이었다.
대장균 효소 gdh는 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 클로스트리디움 심비오섬(Lilley K.S. et al. (1991), Biochim Biophys Acta, 1080(3):191-197)에서 공지된 상동체를 갖는다. 대장균 asd에 대해서는 그러한 상동체가 알려져 있지 않다. 우리는 더 강한 NADH 선호도 및 NADH 선호도를 갖는 asd의 신규한 상동성을 갖는 추가 gdh 상동체를 식별할 수 있는지 조사하기 위해, 환경 샘플로부터 개발된 인-하우스 군유전체학 라이브러리의 게놈 전체 상동성 검색을 수행하였다. 검색은 락토바실러스 아길리스 asd(asd_lag; SEQ ID 30) 및 클로스트리디알레스 gdh(gdh_csy; SEQ ID : 44)의 단백질 서열을 사용한 상기 라이브러리의 BlastP 분석으로 구성되었다. 상동성 검색은 수백 개의 서열을 검색하였지만, 추가의 여과 및 선별 기준을 적용하여 각 효소에 대한 24개의 서열의 라이브러리에 도달하였다. 각각의 효소에 대한 대략 12개의 서열을 쿼리 서열과 <70%의 동일성을 갖는 여과된 결과 서브 세트로부터 선택하였다. 쿼리 서열과 >70%의 동일성을 갖는 서열의 서브 세트로부터 대략 12개의 서열을 선택하였다.
트레오닌 염기 균주를 생성하는 데 사용된 다중 복사 트레오닌 오페론 발현 벡터의 구성에 사용된 부분의 요약 및 폴리뉴클레오타이드 서열.
파트 형태 파트 명칭 SEQ ID
프로모터 pMB085 　75
삽입체
(유전자)		 thrLABC 　76
　삽입체
(유전자)		 thrABC 　77
백본 pUC1벡터 　78
경로 상동체의 소스 및 서열
효소 상동체 라이브러리
종 대장균
유전자 		Gene ID 단백질 서열 DNA 서열
Lactobacillus agilis asd asd_Lag SEQ ID NO: 80 SEQ ID NO: 79
E. coli asd asd_Ec SEQ ID NO: 82 SEQ ID NO: 81
알려지지 않음 asd asd_1 SEQ ID NO: 84 SEQ ID NO: 83
알려지지 않음 asd asd_2 SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 85
알려지지 않음 asd asd_3 SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 87
알려지지 않음 asd asd_4 SEQ ID NO: 90 SEQ ID NO: 89
알려지지 않음 asd asd_5 SEQ ID NO: 92 SEQ ID NO: 91
알려지지 않음 asd asd_6 SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 93
알려지지 않음 asd asd_7 SEQ ID NO: 96 SEQ ID NO: 95
알려지지 않음 asd asd_8 SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 97
알려지지 않음 asd asd_9 SEQ ID NO: 100 SEQ ID NO: 99
알려지지 않음 asd asd_10 SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 101
알려지지 않음 asd asd_11 SEQ ID NO: 104 SEQ ID NO: 103
알려지지 않음 asd asd_12 SEQ ID NO: 106 SEQ ID NO: 105
알려지지 않음 asd asd_13 SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 107
알려지지 않음 asd asd_14 SEQ ID NO: 110 SEQ ID NO: 109
알려지지 않음 asd asd_15 SEQ ID NO: 112 SEQ ID NO: 111
알려지지 않음 asd asd_16 SEQ ID NO: 114 SEQ ID NO: 113
알려지지 않음 asd asd_17 SEQ ID NO: 116 SEQ ID NO: 115
알려지지 않음 asd asd_18 SEQ ID NO: 118 SEQ ID NO: 117
알려지지 않음 asd asd_19 SEQ ID NO: 120 SEQ ID NO: 119
알려지지 않음 asd asd_20 SEQ ID NO: 122 SEQ ID NO: 121
알려지지 않음 asd asd_21 SEQ ID NO: 124 SEQ ID NO: 123
알려지지 않음 asd asd_22 SEQ ID NO: 126 SEQ ID NO: 125
알려지지 않음 asd asd_23 SEQ ID NO: 128 SEQ ID NO: 127
알려지지 않음 asd asd_24 SEQ ID NO: 130 SEQ ID NO: 129
Clostridiales gdh gdh_Csy SEQ ID NO: 132 SEQ ID NO: 131
E. coli gdh gdh_Ec SEQ ID NO: 134 SEQ ID NO: 133
알려지지 않음 gdh gdh_1 SEQ ID NO: 136 SEQ ID NO: 135
알려지지 않음 gdh gdh_2 SEQ ID NO: 138 SEQ ID NO: 137
알려지지 않음 gdh gdh_3 SEQ ID NO: 140 SEQ ID NO: 139
알려지지 않음 gdh gdh_4 SEQ ID NO: 142 SEQ ID NO: 141
알려지지 않음 gdh gdh_5 SEQ ID NO: 144 SEQ ID NO: 143
알려지지 않음 gdh gdh_6 SEQ ID NO: 146 SEQ ID NO: 145
알려지지 않음 gdh gdh_7 SEQ ID NO: 148 SEQ ID NO: 147
알려지지 않음 gdh gdh_8 SEQ ID NO: 150 SEQ ID NO: 149
알려지지 않음 gdh gdh_9 SEQ ID NO: 152 SEQ ID NO: 151
알려지지 않음 gdh gdh_10 SEQ ID NO: 154 SEQ ID NO: 153
알려지지 않음 gdh gdh_11 SEQ ID NO: 156 SEQ ID NO: 155
알려지지 않음 gdh gdh_12 SEQ ID NO: 158 SEQ ID NO: 157
알려지지 않음 gdh gdh_13 SEQ ID NO: 160 SEQ ID NO: 159
알려지지 않음 gdh gdh_14 SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 161
알려지지 않음 gdh gdh_15 SEQ ID NO: 164 SEQ ID NO: 163
알려지지 않음 gdh gdh_16 SEQ ID NO: 166 SEQ ID NO: 165
알려지지 않음 gdh gdh_17 SEQ ID NO: 168 SEQ ID NO: 167
알려지지 않음 gdh gdh_18 SEQ ID NO: 170 SEQ ID NO: 169
알려지지 않음 gdh gdh_19 SEQ ID NO: 172 SEQ ID NO: 171
알려지지 않음 gdh gdh_20 SEQ ID NO: 174 SEQ ID NO: 173
알려지지 않음 gdh gdh_21 SEQ ID NO: 176 SEQ ID NO: 175
알려지지 않음 gdh gdh_22 SEQ ID NO: 178 SEQ ID NO: 177
알려지지 않음 gdh gdh_23 SEQ ID NO: 180 SEQ ID NO: 179
알려지지 않음 gdh gdh_24 SEQ ID NO: 182 SEQ ID NO: 181
대장균 gdh(Clostridiales gdh; SEQ ID NO: 134) 및 락토바실러스 아길리스(SEQ ID NO: 80) 뿐만 아니라 24가지 효소 변이체의 공지된 상동체의 오픈 리딩 프레임(ORFs)은 상업적으로 공급된 올리고를 사용하여 PCR에 의해 증폭되고 도 12에 도시도니 바와 같이 조절 서열, 프로모터 pMB038(SEQ ID NO: 237) 및 전사 종결 자(SEQ ID NO: 238)를 함유하는 다중-카피 플라스미드 p15A 기반 서열(SEQ ID NO: 239)로 복제하였다. asd 버전 26 및 gdh 버전 26 각각은 p15A에 기초한 다중-카피 플라스미드 골격에 다양한 조합으로 바이-시스트로닉 카세트로서 복제되었다(SEQ ID NO: 239).
정확하게 조립된 클론을 확인하고 트레오닌 염기 균주의 형질 전환을 위한 벡터 DNA를 증폭시키기 위해 표준 열 충격 형질 전환 기술을 사용하여 각 플라스미드를 초기에 대장균으로 형질전환시켰다(THR01-02).
검증된 클론을 전기 천공을 통해 대장균 염기 균주 세포로 형질전환시켰다. 새로 생성된 각각의 균주 및 이의 부모 균주를 상기한 바와 같이 소규모 배양에서 트레오닌 수율에 대해 테스트하였다. 실험 결과는 표 13에 제시되어 있다. 대립 유전자 asd_13 (SEQ ID NO: 108) 및 asd_18 (SEQ ID NO: 118)은 더 우수하지만 대조군과 유의하게 다르지 않았다. 대립 유전자 gdh_1 (SEQ ID NO: 136), ghd_8 (SEQ ID NO: 150), gdh_14 (SEQ ID NO: 162), gdh_16 (SEQ ID NO: 166), gdh_18 (SEQ ID NO: 170) gdh_20 (SEQ ID NO: 174) 및 gdh_22 (SEQ ID NO: 178)는 각각 W3110 및 대조군 균주에 비해 트레오닌을 증가시켰다(도 13). 모든 균주가 성공적으로 구축되고 테스트 된 것은 아니다. 성장이 불량하거나 성장하지 않은 복제 샘플 및 통계적 특이치는 도 13에 나타내지 않지만, 표 13에 제시되어 있다.
asd 및 gdh 변이체의 균주 과발현의 역가 요약.
균주 # 　ID 역가 STDEV
7000340960 asd_1 0.00 0.00
7000340968 asd_4 0.00 0.00
7000340961 asd_5 0.00 0.00
7000340977 asd_6 0.79 1.37
7000340972 asd_8 0.00 0.00
7000340950 asd_9 0.00 0.00
7000340979 asd_10 0.00 0.00
7000340945 asd_11 0.00 0.00
7000340949 asd_12 0.00 0.00
7000340981 asd_13 7.14 3.57
7000340980 asd_14 0.00 0.00
7000340955 asd_15 0.00 0.00
7000340940 asd_16 0.00 0.00
7000340967 asd_17 0.00 0.00
7000340970 asd_18 7.54 2.48
7000340975 asd_20 0.00 0.00
7000340978 asd_22 0.00 0.00
7000340987 gdh_1 28.96 5.37
7000340951 gdh_3 0.00 0.00
7000340958 gdh_4 0.00 0.00
7000340959 gdh_5 1.59 2.75
7000340941 gdh_6 0.00 0.00
7000340957 gdh_7 0.00 0.00
7000340962 gdh_8 6.74 8.77
7000340952 gdh_14 14.28 2.06
7000340948 gdh_16 8.73 15.12
7000340966 gdh_18 10.31 9.24
7000340983 gdh_19 0.00 0.00
7000340971 gdh_20 11.50 6.77
7000340936 gdh_21 0.00 0.00
7000340939 gdh_22 3.97 6.87
7000340964 gdh_23 0.00 0.00
7000340944 gdh_24 0.00 0.00
7000347664 thrABC p15A
대조군		 2.38 2.26
7000284155 W3110 0.00 0.00
실시예 6: 상이한 기질 선호도 및 효소 동역학을 갖는 변이체 트레오닌 알 도라제 효소를 이용하여 트레오닌 역가 개선
실시예 2에 기재된 염기 균주를 하기 실시예 실험에 사용하였다.
이 실시예는 이종 트레오닌 알돌라제 유전자를 사용하여 박테리아 숙주 세포에서 L-트레오닌 생산을 증가시키는 방법을 설명한다. 대장균에서, 트레오닌 알돌라제(ltaE)는 L-트레오닌을 아세트알데하이드 및 글리신으로 전환시킴으로써 트레오닌의 축적과 반대로 작용한다. 그러나, 다양한 기질 특이성 및 효소 동역학은 트레오닌 알돌라제 효소(TA)의 광범위한 분류학적 패밀리 내에 존재한다. 이 실시예는 상이한 기질 선호도 또는 효소 동역학을 갖는 이종 TA로 천연 1taE 유전자를 첨가하거나 대체할 수 있게 함으로써, 트레오닌의 수율을 개선시키기 위해 TA 중에서 발견된 다양한 기질 선호도를 이용하는 전략을 예시한다. 그러나, 이 실시예는 전술한 실시예들과 마찬가지로 예시적인 것이며 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
알돌라제는 도너 성분(친핵성)의 억셉터 성분에 가역적인 알돌 첨가를 촉진한다. 대장균 트레오닌 알돌라제(ltaE)는 L-알로-트레오닌 및 L-트레오닌의 글리신 및 아세트알데하이드로의 절단에 촉매작용을 미친다(도 10a). 대장균에서, ltaE는 L-트레오닌을 글리신으로 전환시킴으로써 트레오닌 축적에 반대하여 작용한다. 그러나, 다양한 기질 특이성은 트레오닌 알돌라제 유전자(TA)의 광범위한 분류 학적 패밀리 내에 존재한다. L-트레오닌의 형성에 유리한 기질 선호도(예를 들어, 세린, 알라닌) 및 동역학을 갖는 TA가 기술되었다(Fesko et al., 2015).
트레오닌 생산을 선호하는 기질 선호도 또는 효소 역학으로 대장균의 상동체를 확인할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 환경 샘플로부터 개발된 인-하우스 군유전체학 라이브러리의 게놈 전체 상동성 검색을 수행하였다. 검색은 글리신에 대해 보고된 선호도를 갖는 효소인 크로노박터 사카자카이 트레오닌 알도라제(Csa_ltaE; SEQ ID NO: 183)의 단백질 서열을 사용한 상기 라이브러리의 BlastP 분석으로 구성되었다(Fesko et al., 2015). ltaE 검색은 수백 개의 서열을 검색했지만, 24개의 서열 라이브러리에 도달하기 위해 추가의 필터링 및 선택 기준이 적용되었다. 쿼리 서열과 <70% 동일성을 갖는 결과의 필터링된 서브 세트로부터 약 12개의 서열이 선택되었다. 쿼리 서열과 >70%의 동일성을 갖는 서열의 서브 세트로부터 대략 12개의 서열이 선택되었다.
크로노박터 사카자카이 트레오닌 알돌라제의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 대장균(SEQ ID NO: 183)에 대해 코돈-최적화하고 gBlock 유전자 단편(IDT)으로서 합성하였다. 24 ltaE 변이체는 상업적으로 공급되는 올리고를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고 도 12에 도시된 바와 같이 프로모터 pMB038(SEQ ID NO: 237) 및 천연 대장균 thrL 전사 종결자(SEQ ID NO: 238)를 함유하는 다중-카피 플라스미드 p15A 기반 서열(SEQ ID NO: 239)로 복제하였다.
정확하게 조립된 클론을 확인하고, 대장균 트레오닌 염기 균주로의 형질 전환을 위해 벡터 DNA를 증폭시키기 위해 표준 열 충격 변환 기술을 사용하여 각각의 플라스미드를 초기에 화학적으로 유능한 NEB 10-베타 대장균 세포로 형질전환시켰다.
검증된 클론을 전기 천공을 통해 대장균 염기 균주 세포로 형질 전환시켰다. 새로 생성된 각각의 균주 및 그의 부모 균주를 상기한 바와 같이 소규모 배양에서 트레오닌 수율에 대해 테스트하였다. 실험 결과는 표 14에 제공되어 있다. 대립 유전자 ltaE_6 (SEQ ID NO: 196), ltaE_11 (SEQ ID NO: 206), ltaE_18 (SEQ ID NO: 220), ltaE_20 (SEQ ID NO: 224), lta_24 (SEQ ID NO: 232), 및 각각의 증가된 트레오닌 역가를 thrABC + p15A 빈 벡터 대조군 (대조 플라스미드) 및 W3310 균주와 비교하였다(도 14).
ltaE 변이체의 균주 과발현의 역가 요약.
균주 # 　ID 역가 STDEV
7000342684 ltaE_3 0.00 0.00
7000342681 ltaE_4 0.00 0.00
7000342698 ltaE_6 8.33 7.24
7000342707 ltaE_11 31.34 24.31
7000342713 ltaE_13 0.00 0.00
7000342668 ltaE_14 0.00 0.00
7000342685 ltaE_15 0.79 1.37
7000342682 ltaE_16 0.00 0.00
7000342678 ltaE_17 1.19 2.06
7000342675 ltaE_18 17.85 9.29
7000342694 ltaE_19 0.00 0.00
7000342695 ltaE_20 11.50 2.99
7000342690 ltaE_21 1.98 3.44
7000342710 ltaE_22 0.00 0.00
7000342715 ltaE_24 10.71 18.55
7000347664 thrABC p15A
대조군		 2.38 2.26
7000284155 W3110 0.00 0.00
실시예 7 : L-트레오닌 생산을 증가시키기 위해 대장균에서 변형 또는 변이 체 gapA, gdh, asd 및 ltaE 효소의 조합 발현
실시예 2에 기재된 염기 균주는 하기 실시예 실험에 사용되었다.
상기 전략 중 하나 이상을 조합하여 NADPH 생성을 추가로 증가시켜서 대장균에서 L-트레오닌 수율을 증가시킬 수 있다. gapA, gsd, asd, ltaE의 다양한 조합은 실시예 2에 기재된 대장균 thrABCㅿtdh 배경에 도입되었다. 일부 경우에, 이들 조합은 thrABC 오페론의 폴리시스트로닉 첨가 하류로서 pMB085-thrABC를 함유하는 동일한 변형된 pUC19 벡터 내로 복제되고 상기한 바와 같이 상업적으로 공급되는 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 pAB085 프로모터에 의해 구동되었다. 다수의 유전자가 함께 첨가될 때, 다음의 리보좀 결합 부위(RBS) 링커가 포함되었다: RBS1(agctggtggaatat(SEQ ID NO: 306); thrC 후), RBS2(aggaggttgt (SEQ ID NO: 307); 유전자 1과 2 사이) 및 RBS3(tgacacctattg (SEQ ID NO: 308); 유전자 2와 3 사이). 이들 링커 서열은 올리고뉴클레오타이드 테일에 포함되었고 유전자의 PCR 증폭 동안 도입되었다. gapA, gsd, asd, ltaE의 조합이 thrABC 역가를 갖는 폴리시트로닉 오페론으로 발현될 때, 15mg/L 이상의 트레오닌이 특정 조합에 대해 관찰되었다(도 11a-c) 및 표 15.
pUC19 플라스미드에서 thrABC를 공동 발현하는 균주의 역가 및 gapA, asd, gdh 및 ltaE의 조합 요약.
균주 # 　ID 역가 STDEV
7000284155 W3110 0.00 0.00
7000334740 tdh_del 0.00 0.00
7000336113 thrLABC 0.00 0.00
7000341282 thrABC 0.79 1.37
7000342722 Ec_asd 3.17 3.64
7000342724 Ec_gdh 15.07 8.10
7000342725 Ec_ltaE 0.00 0.00
7000342723 Ec_gapA 0.79 1.37
7000342735 Ec_asd+Ec_gdh 0.00 0.00
7000342736 Ec_gapA+Ec_gdh 16.66 6.73
7000342719 Lag_asd 8.33 4.29
7000342721 Csy_gdh 15.87 4.81
7000342728 Lag_asd+Csy_gdh 0.00 0.00
7000342737 Lag_asd+Csy_gdh+Csa_ltaE 13.09 10.10
7000342742 Lag_asd+Csy_gdh+Csa_ltaE 14.28 2.06
7000342726 gapAv5 19.04 8.33
7000342720 gapAv7 15.47 9.45
7000342727 gapAv8 8.73 4.18
7000342731 gapAv5+Csy_gdh 0.00 0.00
7000342729 gapAv5+Csy_gdh+Csa_ltaE 4.76 8.24
7000342730 gapAv5+Csy_gdh+Lag_asd 0.00 0.00
7000342733 gapAv7+Csy_gdh 10.31 6.87
7000342732 gapAv7+Csy_gdh+Csa_ltaE 1.98 3.44
7000342734 gapAv8+Csy_gdh 1.19 2.06
pUC19 플라스미드에서 폴리시스트로닉적으로 발현된 상기 유전자 조합 이외에, 본 발명자는 또한 상기 균주 중 3개(7000342721, 7000342726 및 7000342720; Csy_gdh(SEQ ID NO: 44), gapAv5(SEQ ID NO: 69) 및 gapAv7(SEQ ID NO: 71), 각각)을 asd, gdh 및 ltaE의 개별 라이브러리 변이체(위에서 기술되고 테스트) 또는 빈 p15A 벡터 대조군(예를 들어, Csy_gdh + p15A (-))을 발현하는 p15A 플라스미드(SEQ ID NO: 239)로 변형시켰다. 이들 균주의 요약 및 이들의 성능(트레오닌 역가)은 표 16에 제공되어 있다. W3110을 제외한 모든 균주는 pMB085-thrABC tdh 결실 배경에 있다. 이들 실험에서, 가장 관련성 있는 대조군은 빈 p15A 대조군 플라스미드(7000349886, 7000349887 및 7000349885; 각각 Csy_gdh + p15A(-), gapAv5 + p15A(-) 및 gapAv7 + p15A(-)로 형질전환된 부모 균주 (Csy_gdh, gapAv5 및 gapAv7)이다. Csy_gdh, gapAv5 또는 gapAv7과 asd, gdh 또는 ltaE 변이체의 특정 조합은 트레오닌 역가를 향상시켰다. asd, gdh 또는 ltaE 라이브러리 변이체를 발현하는 다수의 균주에 대해 하나 이상의 생물학적 복제물이 관련 대조군 균주보다 우수하게 수행되었다(도 15). 본 발명자는 개선된 트레오닌 역가를 초래한 개별적인 생물학적 복제물이 이들 조합으로 인한 개선을 나타내는 것으로 생각한다. 높은 변동성(트레오닌 생성에 실패한 다수의 반복 실험으로 인한 큰 표준 편차)은 균주가 두 개의 플라스미드를 유지하고 있을 때 플라스미드 불안정성 또는 높은 돌연변이율의 결과일 가능성이 있지만 이러한 유전자의 염색체 통합에 의해 완화될 수 있다. 추가적인 p15A 플라스미드의 유지 및 클로람페니칼에서의 성장은 또한 부모에 비해 2개의 플라스미드(예를 들어, 부모에 비해 -p15A(-) 플라스미드)를 유지하는 균주에서 관찰되는 역가가 더 낮아졌다.
asd, gdh 또는 ltaE 라이브러리 변이체와 Csy_gdh, gapAv5 또는 gapAv7의 조합을 발현하는 균주의 역가 요약.
균주 # 균주 표현형 역가 STDEV
7000284155 W3110 0.00 0.00
7000341282 pMB085-thrABC 21.44 14.44
7000342721 Csy_gdh 29.78 26.34
7000349838 Csy_gdh+asd_13 8.74 8.94
7000349878 Csy_gdh+asd_18 11.51 19.94
7000349840 Csy_gdh+gdh_08 16.28 28.20
7000349847 Csy_gdh+gdh_14 0.00 0.00
7000349850 Csy_gdh+gdh_16 19.26 20.92
7000349851 Csy_gdh+gdh_18 0.00 0.00
7000349881 Csy_gdh+gdh_20 0.00 0.00
7000349855 Csy_gdh+gdh_22 25.02 31.15
7000349853 Csy_gdh+ltaE_06 0.00 0.00
7000349867 Csy_gdh+ltaE_11 0.00 0.00
7000349849 Csy_gdh+ltaE_18 0.00 0.00
7000349844 Csy_gdh+ltaE_20 16.68 28.89
7000349869 Csy_gdh+ltaE_24 0.00 0.00
7000349886 Csy_gdh+p15A(-) 8.74 21.40
7000342726 gapAv5 29.78 2.06
7000349870 gapAv5+asd_13 0.00 0.00
7000349880 gapAv5+asd_18 7.15 9.45
7000349864 gapAv5+gdh_08 0.00 0.00
7000349857 gapAv5+gdh_14 19.85 34.39
7000349876 gapAv5+gdh_16 16.68 26.85
7000349872 gapAv5+gdh_18 0.00 0.00
7000349884 gapAv5+gdh_20 0.00 0.00
7000349862 gapAv5+gdh_22 17.87 30.95
7000349874 gapAv5+ltaE_06 0.00 0.00
7000349863 gapAv5+ltaE_11 0.79 1.38
7000349866 gapAv5+ltaE_18 0.00 0.00
7000349861 gapAv5+ltaE_20 6.35 11.00
7000349871 gapAv5+ltaE_24 8.74 15.13
7000349887 gapAv5+p15A(-) 0.79 1.95
7000342720 gapAv7 36.13 1.82
7000349835 gapAv7+asd_13 0.79 1.38
7000349848 gapAv7+asd_18 10.72 13.74
7000349877 gapAv7+gdh_08 0.00 0.00
7000349833 gapAv7+gdh_14 7.45 8.72
7000349875 gapAv7+gdh_16 6.35 7.28
7000349879 gapAv7+gdh_18 0.00 0.00
7000349846 gapAv7+gdh_20 0.00 0.00
7000349842 gapAv7+gdh_22 21.44 29.92
7000349873 gapAv7+ltaE_06 0.00 0.00
7000349839 gapAv7+ltaE_11 0.00 0.00
7000349883 gapAv7+ltaE_18 0.00 0.00
7000349837 gapAv7+ltaE_20 0.00 0.00
7000349843 gapAv7+ltaE_24 0.00 0.00
7000349885 gapAv7+p15A(-) 1.59 3.89
실시예 8: NADH로부터 NADPH를 생성하기 위해 수소전달 효소 발현
C. 글루타미쿰에서 L-리신의 생명공학 생산에 중요한 요소는 충분한 NADPH의 공급이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 막-통합 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소는 NADH의 산화를 통해 NADP+의 환원을 유도하여 NADH로부터 NADPH를 생성할 수 있다. 따라서 수소전달 효소의 발현은 C. 글루타미쿰에서 세포 NADPH 생성 및 L-리신 생성을 증가시키는 효과적인 전략이다.
실시예 9: 피루베이트 카복실라제 발현
피루베이트 카복실레이트는 산업 발효에서 성장 동안 또는 리신 및 글루탐산 생산 동안 생합성을 위해 소비된 옥살로아세테이트를 보충하는 중요한 무응집 효소이다.
피루베이트 카복실라제 유전자는 리조븀 에틀리(Rhizobium etli)(Dunn, F. F., et al.,　J. Bacteriol .　178:5960-5970 (1996), 바실러스 스테아로모필러스(Bacillus stearothermophilus)Kondo, H., et al.,　Gene　191:47-50 (1997), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis)(Genbank accession no. Z97025), 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)(Genbank accession no. Z83018), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mukhopadhyay, B.,　J. Biol . Chem .　273:5155-5166(1998)으로부터 복제되고 서열 분석되었다. 피루베이트 카복실라제 활성은 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)(Tosaka, O., et al.,　Agric . Biol . Chem .　43:1513-1519 (1979)) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Peters-Wendisch, P. G., et al.,　Microbiology　143:1095-1103 (1997)에서 이전에 측정되었다.
연구는 아스파르테이트 아미노산 패밀리의 수율 및 생산성은 보충 경로를 통한 탄소 흐름에 결정적으로 의존한다는 것을 밝혔다(Vallino, J. J., & Stephanopoulos, G.,　Biotechnol . Bioeng .　41:633-646 (1993)). 대사 산물 균형에 기초하여, 리신 생산 속도는 보충 경로를 통한 옥살로아세테이트 합성 속도 이하인 것을 알 수 있다
C. 글루타미쿰의 피루베이트 카복실라제 유전자는 돌연변이체 또는 변이체로 대체될 수 있으며, 바람직하게는 피루베이트 카복실라제는 C. 글루타미쿰 기본 균주에서 이의 발현보다 2 내지 20배 더 높게 발현된다.
대장균은 내인성 피루베이트 카복실라제 유전자가 없는 것으로 생각된다. 이종 피루베이트 카복실라제가 제공될 수 있다. C. 글루타미쿰 또는 다른 미생물로부터의 이종 피루베이트 카복실라제 유전자는, 예를 들어, 실시예 2에 기술된 기본 균주와 같은 임의의 대장균 균주로 도입될 수 있다. 일부 응용분야에서, 내인성 또는 이종 피루베이트 카복실라제의 발현 수준의 정확한 조절 또는 미세 조정은 최적이 아닌 결과가 돌연변이체 또는 변이체 pyc 유전자의 발현 수준 또는 활성 수준에 의한 불충분한 피루베이트 카복실라제 활성 또는 과도한 피루베이트 카복실라제 활성에 의해 달성될 수 있다는 점에서 바람직할 수 있다. 이러한 경우, 프로모터 래더는 발현을 조절하거나 미세 조정하는 데 사용될 수 있다. 다양한 pyc 변이체 또는 돌연변이체와 조합하여 다양한 강도의 프로모터 요소를 테스트함으로써, 최적의 유전자 활성을 초래하는 프로모터 및 pyc 유전자의 조합이 결정될 수 있어, L-트레오닌과 같은 원하는 화합물의 생산이 증가된다.
실시예 10: L-리신 또는 L-트레오닌 생산을 증가시키기 위해 C. 글루타미 쿰 또는 대장균에서 변형된 gapA , 수소전달 효소 및 변형된 gdh , asd , dapB 및 ddh 효소의 조합 발현
상기 전략 중 하나 이상을 NADPH 생산을 추가로 증가시키고 따라서 C. 글루타미쿰 또는 대장균에서 L-리신 또는 L-트레오닌의 수율을 증가시키기 위해 조합하여 사용할 수 있다.
실시예 11: 신규 글리세르알데하이드 3- 포스페이트 탈수소 효소( GAPDH ) 대립 유전자의 확인
gapAv9 (D35G, L36T, T37K, P192S)(SEQ ID NO: 303)를 시작 서열로 사용하여 gapA 유전자의 NNK 라이브러리를 생성하였다. 각각의 돌연변이 유발된 유전자는 내인성 gapA 대립 유전자를 갖는 C. 글루타미쿰에서 천연 gapA 프로모터의 조절하에 중성 통합 유전자좌(cg1504 내지 cg1505 사이)에서 gapA의 제 2 복제물로서 개별적으로 도입되었다. 리신 역가를 개선하는 대립 유전자를 확인하기 위해 1200개 이상의 gapA 구성요소를 2개의 상이한 플레이트 분석에서 스크리닝하였다. 특정 구성요소는 부모 균주(블랙 마름모꼴)와 비교하여 리신(검은색 원)의 발현이 증가된 것으로 나타났다(도 14).
몇몇 절단된 gapA 서열은 리신 발현을 증가시켰다. 천연 gapA 서열에 밑줄이 표시된다. 나머지 아미노산은 프레임-시프트 돌연변이의 인공물이다.
gapA 절단은 리신 발현을 증가시킨다
균주 서열 SEQ ID NO
331829 MTIRVGINGFGRIGRNFFRAILERSDDLEVVAVNGTKDNKTLSTLLKFDSIMGRLGQEVEYDDDSINEGLRQHRQGCFLVRQRVGLHLPAPASDRARSFQAL* 233
331831 MTIRVGINGFGRIGRNFFRAILERSDDLEVVAVNGTKDNKTLSTLLKFDSIMGTKDNKTLSTLLKFDSISR* 234
331897 MTIRVGINGFGRIGRNFFRAILERSDDLEVVAVNGTKDNKTLSTLLKFDSIMGRLGQEVEYDDDSITVGGKRIAVYAERDPKNLDWAATTLTS* 235
331904 MTIRVGINGFGRIGRNFFVAGAKKVIISRCKRG* 236
리신 생산을 개선시키는 gapA 유전자에서 새로운 돌연변이 목록
돌연변이 균주 플레이트 모델 역가 mM
(95% CI)		 부모 역가 mM (95% CI) % 부모에 대한 개선
L224S 331772 #2 34.1+/-5.4 31+/-0.36 10
H110D 331828 #1 27.7+/-2.2 23.3+/-0.5 18.9
Trunc (102 aa) SEQ ID NO: 233 331829 #1 26.4+/-1.5 23.3+/-0.5 13.3
Trunc (71 aa) SEQ ID NO: 234 331831 #1 26.8+/-2.3 23.3+/-0.5 15
Trunc (93 aa) SEQ ID NO: 235 331897 #1 29.3+/-3.8 23.3+/-0.5 25.8
Trunc (33 aa) SEQ ID NO: 236 331904 #1 29.6+/-1 23.3+/-0.5 27
K37P 331009 #2 29.3+/-4.8 27.3+/-0.24 7.3
Y140G 331005 #1 21.6+/-0.5 19.7+/-0.3 9.6
SEQ ID 식별자를 갖는 본 발명의 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
본 발명의 번호를 매긴 실시태양
첨부된 조항에도 불구하고, 본 발명은 다음의 번호가 매겨진 실시태양을 설명한다.
NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 개선
1. NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 숙주 세포의 능력을 향상시키는 방법으로서, 세포의 이용 가능한 NADPH를 변경하는 단계를 포함하는 방법.
2. 조항 1에 있어서, 이용 가능한 NADPH는 세포에서 변형된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)를 발현시킴으로써 변경되며, 여기서 변형된 GAPDH는 이의 조효소 특이성이 확장되도록 변형되는 방법.
3. 조항 2에 있어서, 변형된 GAPDH는 상응하는 자연 발생 GAPDH에 비해 조효소 NADP에 대해 증가된 특이성을 갖는 방법.
4. 조항 3에 있어서, 자연 발생 GAPDH는 gapA인 방법.
5. 조항 4에 있어서, gapA는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 갖는 방법.
6. 조항 2-5 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
7. 조항 2-5 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
8. 조항 2-7 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 방법.
9. 조항 2-8 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 36 및 37에 해당하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 방법.
10. 조항 8 또는 9에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 변형된 GAPDH 위치의 잔기는 리신인 방법.
11. 조항 9에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 36에 해당하는 변형된 GAPDH의 위치의 잔기는 트레오닌이고, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 변형된 GAPDH의 위치의 잔기는 리신인 방법.
12. 조항 2-11 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 192에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 방법.
13. 조항 12에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 192에 해당하는 변형된 GAPDH 위치의 잔기는 세린인 방법.
14. 조항 2-58 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 224에 해당하는 변형된 GAPDH 위치의 잔기는 세린인 방법.
15. 조항 2-14 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 110에 해당하는 변형된 GAPDH의 위치의 잔기는 아스파르트산인 방법.
16. 조항 2-15 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 140에 해당하는 변형된 GAPDH의 위치의 잔기는 글리신인 방법.
17. 조항 2-5 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 69, 71, 73, 303, 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
18. 조항 1-17 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 표 2로부터 선택되는 방법.
19. 조항 18에 있어서, 화합물은 리신인 방법.
20. 조항 18에 있어서, 화합물은 트레오닌인 방법.
21. 조항 1-20 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포인 방법.
22. 조항 21에 있어서, 숙주 세포는 아그로박테리움(Agrobacterium), 알리시로바실러스(Alicyclobacillus), 아나베아나(Anabaena), 아나시스티스(Anacystis), 아시네토박터(Acinetobacter), 아시도써무스(Acidothermus), 아르쓰로박터(Arthrobacter), 아조박터(Azobacter), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 부티리비브리오(Butyrivibrio), 부케네라(Buchnera), 캠프스트리스(Campestris), 캠필로박터(Camplyobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 크로마티움(Chromatium), 코프로콕쿠스(Coprococcus), 에스체리치아(Escherichia), 엔테로콕쿠스(Enterococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 푸소박테리움(Fusobacterium), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 프란시셀라(Francisella), 플라보박테리움(Flavobacterium), 게오바실루스(Geobacillus), 해모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 락토바실루스(Lactobacillus), 락토콕커스(Lactococcus), 일로박터(Ilyobacter), 마이크로콕쿠스(Micrococcus), 마이크로박테리움(Microbacterium), 메소르히조비움(Mesorhizobium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 네이세리아(Neisseria), 판도에아(Pantoea), 수도모나스(Pseudomonas), 프로클로로콕쿠스(Prochlorococcus), 로도박터(Rhodobacter), 로도수도모나스(Rhodopseudomonas), 로세부리아(Roseburia), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 로도콕쿠스(Rhodococcus), 세네데스무스(Scenedesmus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 시네콕쿠스(Synecoccus), 사카로모노스포라(Saccharomonospora), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 스타필로콕쿠스(Staphylococcus), 세라티아(Serratia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium), 트로페리마(Tropheryma), 툴라렌시스(Tularensis), 테메쿨라(Temecula), 써모시네코콕쿠스(Thermosynechococcus), 써모콕쿠스(Thermococcus), 우레아플라즈마(Ureaplasma), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아(Yersinia) 및 지모모나스(Zymomonas)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속으로부터인 방법.
23. 조항 22에 있어서, 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰인 방법.
24. 조항 22에 있어서, 숙주 세포는 대장균인 방법.
25. 조항 1-20 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포인 방법.
26. 조항 25에 있어서, 숙주 세포는 아칠라(Achlya), 아크레모늄(Acremonium), 아스퍼길루스(Aspergillus), 아우레오바시듐(Aureobasidium), 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리오프시스(Ceriporiopsis), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코칠리오볼루스(Cochliobolus), 코리나스쿠스(Corynascus), 크리포넥트리아(Cryphonectria), 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 코프리누스(Coprinus), 코리오루스(Coriolus), 디플로디아(Diplodia), 엔도디스(Endothis), 프사리움(Fusarium), 지베렐라(Gibberella), 글리오클라디움(Gliocladium), 휴미콜라(Humicola), 하이포크레아(Hypocrea), 마이셀리오프토라(Myceliophthora)(예를 들어, Myceliophthora thermophila), 무코르(Mucor), 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 포도스포라(Podospora), 필레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 피리쿨라리아(Pyricularia), 리히조무코르(Rhizomucor), 리히조푸스(Rhizopus), 스키조필룸(Schizophyllum), 스키탈리듐(Scytalidium), 스포로트리츔(Sporotrichum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티에라비아(Thielavia), 트라마테스(Tramates), 폴리포클라듐(Tolypocladium), 트라이코데마(Trichoderma), 베르티실리움(Verticillium), 및 볼바리엘라(Volvariella)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속으로부터인 방법.
변형된 GAPDH를 포함하는 숙주 세포
27. 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 확장된 조효소 특이성을 갖는 변형 된 GAPDH를 포함하는 숙주 세포로서, 여기서 숙주 세포는 변형된 GAPDH가 없는 상대 숙주 세포에 비해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산을 개선시키는 숙주 세포.
28. 조항 27에 있어서, 이용 가능한 NADPH는 세포에서 변형된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)를 발현시킴으로써 변경되며, 여기서 변형된 GAPDH는 이의 조효소 특이성이 확장되도록 변형되는 숙주 세포.
29. 조항 27 또는 28에 있어서, 변형된 GAPDH는 상응하는 자연 발생 GAPDH에 비해 조효소 NADP에 대해 증가된 특이성을 갖는 숙주 세포.
30. 조항 29에 있어서, 자연 발생 GAPDH는 gapA인 숙주 세포.
31. 조항 30에 있어서, gapA는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 갖는 숙주 세포.
32. 조항 27-31 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 숙주 세포.
33. 조항 27-31 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 숙주 세포.
34. 조항 27-33 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 숙주 세포.
35. 조항 27-34 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 36 및 37에 해당하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 숙주 세포.
36. 조항 34 또는 35에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 변형된 GAPDH 위치의 잔기는 리신인 숙주 세포.
37. 조항 35에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 36에 해당하는 변형된 GAPDH의 위치의 잔기는 트레오닌이고, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 변형된 GAPDH의 위치의 잔기는 리신인 숙주 세포.
38. 조항 27-37 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 192에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 숙주 세포.
39. 조항 38에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 192에 해당하는 변형된 GAPDH 위치의 잔기는 세린인 숙주 세포.
40. 조항 27-39 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 224에 해당하는 변형된 GAPDH 위치의 잔기는 세린인 숙주 세포.
41. 조항 27-40 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 110에 해당하는 변형된 GAPDH의 위치의 잔기는 아스파르트산인 숙주 세포.
42. 조항 27-41 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 140에 해당하는 변형된 GAPDH의 위치의 잔기는 글리신인 숙주 세포.
43. 조항 27-31 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 69, 71, 73, 303, 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 숙주 세포.
44. 조항 27-43 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 표 2로부터 선택되는 숙주 세포.
45. 조항 44에 있어서, 화합물은 리신인 숙주 세포.
46. 조항 44에 있어서, 화합물은 트레오닌인 숙주 세포.
47. 조항 27-46 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포인 숙주 세포.
48. 조항 47에 있어서, 숙주 세포는 아그로박테리움(Agrobacterium), 알리시로바실러스(Alicyclobacillus), 아나베아나(Anabaena), 아나시스티스(Anacystis), 아시네토박터(Acinetobacter), 아시도써무스(Acidothermus), 아르쓰로박터(Arthrobacter), 아조박터(Azobacter), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 부티리비브리오(Butyrivibrio), 부케네라(Buchnera), 캠프스트리스(Campestris), 캠필로박터(Camplyobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 크로마티움(Chromatium), 코프로콕쿠스(Coprococcus), 에스체리치아(Escherichia), 엔테로콕쿠스(Enterococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 푸소박테리움(Fusobacterium), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 프란시셀라(Francisella), 플라보박테리움(Flavobacterium), 게오바실루스(Geobacillus), 해모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 락토바실루스(Lactobacillus), 락토콕커스(Lactococcus), 일로박터(Ilyobacter), 마이크로콕쿠스(Micrococcus), 마이크로박테리움(Microbacterium), 메소르히조비움(Mesorhizobium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 네이세리아(Neisseria), 판도에아(Pantoea), 수도모나스(Pseudomonas), 프로클로로콕쿠스(Prochlorococcus), 로도박터(Rhodobacter), 로도수도모나스(Rhodopseudomonas), 로세부리아(Roseburia), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 로도콕쿠스(Rhodococcus), 세네데스무스(Scenedesmus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 시네콕쿠스(Synecoccus), 사카로모노스포라(Saccharomonospora), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 스타필로콕쿠스(Staphylococcus), 세라티아(Serratia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium), 트로페리마(Tropheryma), 툴라렌시스(Tularensis), 테메쿨라(Temecula), 써모시네코콕쿠스(Thermosynechococcus), 써모콕쿠스(Thermococcus), 우레아플라즈마(Ureaplasma), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아(Yersinia) 및 지모모나스(Zymomonas)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속으로부터인 숙주 세포.
49. 조항 48에 있어서, 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰인 숙주 세포.
50. 조항 48에 있어서, 숙주 세포는 대장균인 숙주 세포.
51. 조항 27-46 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포인 숙주 세포.
52. 조항 51에 있어서, 숙주 세포는 아칠라(Achlya), 아크레모늄(Acremonium), 아스퍼길루스(Aspergillus), 아우레오바시듐(Aureobasidium), 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리오프시스(Ceriporiopsis), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코칠리오볼루스(Cochliobolus), 코리나스쿠스(Corynascus), 크리포넥트리아(Cryphonectria), 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 코프리누스(Coprinus), 코리오루스(Coriolus), 디플로디아(Diplodia), 엔도디스(Endothis), 프사리움(Fusarium), 지베렐라(Gibberella), 글리오클라디움(Gliocladium), 휴미콜라(Humicola), 하이포크레아(Hypocrea), 마이셀리오프토라(Myceliophthora)(예를 들어, Myceliophthora thermophila), 무코르(Mucor), 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 포도스포라(Podospora), 필레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 피리쿨라리아(Pyricularia), 리히조무코르(Rhizomucor), 리히조푸스(Rhizopus), 스키조필룸(Schizophyllum), 스키탈리듐(Scytalidium), 스포로트리츔(Sporotrichum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티에라비아(Thielavia), 트라마테스(Tramates), 폴리포클라듐(Tolypocladium), 트라이코데마(Trichoderma), 베르티실리움(Verticillium), 및 볼바리엘라(Volvariella)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속으로부터인 숙주 세포.
코리네박테리움 종에서 L-리신 을 생산하는 방법
53. 코리네박테리움 종 균주를 배양하는 단계 및 배양된 코리네박테리움 종 균주 또는 배양액으로부터 L-리신을 회수하는 단계를 포함하여 L-리신을 생산하는 방법으로서, 여기서 코리네박테리움 종 균주는 조효소로서 NADP를 사용하는 변형된 GAPDH를 발현하며, 여기서 코리네박테리움 종 균주는 L-리신의 개선된 생산성을 갖는 방법.
GAPDH의 조효소 특이성을 확장시키는 방법
54. GAPDH를 변형시켜 변형된 GAPDH가 조효소 NADP 및 NAD에 대해 이중 특이성을 갖게 하는 단계를 포함하여 GAPDH의 조효소 특이성을 확장시키는 방법.
55. 조항 54에 있어서, 변형된 GAPDH는 NAD에 비해 조효소 NADP에 대한 증가된 특이성을 갖는 방법.
56. 조항 54 또는 55에 있어서, 변형된 GAPDH는 NAD보다 NADP를 더 효과적으로 사용하는 방법.
NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법
57. 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법으로서, 여기서 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내는 방법.
58. 조항 57에 있어서, 화합물은 표 2로부터 선택되는 방법.
59. 조항 57 또는 58에 있어서, 변이체 효소는 NADPH보다 NADH를 더욱 효과적으로 사용하는 방법.
60. 조항 57-59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 42 또는 44의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
61. 조항 57-60 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 30 또는 40의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
62. 조항 57-61 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 dapB의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 46 또는 48의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
63. 조항 57-62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 ddh의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
64. 조항 57-63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 및 182로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
65. 조항 57-63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
66. 조항 57-63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계, asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계, dapB의 변이체 효소를 발현시키는 단계 및 ddh의 변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하는 방법.
67. 조항 57-66 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 표 2로부터 선택되는 방법.
68. 조항 68에 있어서, 상기 화합물은 리신인 방법.
69. 조항 68에 있어서, 화합물은 트레오닌인 방법.
70. 조항 57-69 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포인 방법.
71. 조항 70에 있어서, 숙주 세포는 아그로박테리움(Agrobacterium), 알리시로바실러스(Alicyclobacillus), 아나베아나(Anabaena), 아나시스티스(Anacystis), 아시네토박터(Acinetobacter), 아시도써무스(Acidothermus), 아르쓰로박터(Arthrobacter), 아조박터(Azobacter), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 부티리비브리오(Butyrivibrio), 부케네라(Buchnera), 캠프스트리스(Campestris), 캠필로박터(Camplyobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 크로마티움(Chromatium), 코프로콕쿠스(Coprococcus), 에스체리치아(Escherichia), 엔테로콕쿠스(Enterococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 푸소박테리움(Fusobacterium), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 프란시셀라(Francisella), 플라보박테리움(Flavobacterium), 게오바실루스(Geobacillus), 해모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 락토바실루스(Lactobacillus), 락토콕커스(Lactococcus), 일로박터(Ilyobacter), 마이크로콕쿠스(Micrococcus), 마이크로박테리움(Microbacterium), 메소르히조비움(Mesorhizobium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 네이세리아(Neisseria), 판도에아(Pantoea), 수도모나스(Pseudomonas), 프로클로로콕쿠스(Prochlorococcus), 로도박터(Rhodobacter), 로도수도모나스(Rhodopseudomonas), 로세부리아(Roseburia), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 로도콕쿠스(Rhodococcus), 세네데스무스(Scenedesmus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 시네콕쿠스(Synecoccus), 사카로모노스포라(Saccharomonospora), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 스타필로콕쿠스(Staphylococcus), 세라티아(Serratia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium), 트로페리마(Tropheryma), 툴라렌시스(Tularensis), 테메쿨라(Temecula), 써모시네코콕쿠스(Thermosynechococcus), 써모콕쿠스(Thermococcus), 우레아플라즈마(Ureaplasma), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아(Yersinia) 및 지모모나스(Zymomonas)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속으로부터인 방법.
72. 조항 71에 있어서, 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰인 방법.
73. 조항 71에 있어서, 숙주 세포는 대장균인 방법.
74. 조항 57-69 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포인 방법.
75. 조항 74에 있어서, 숙주 세포는 아칠라(Achlya), 아크레모늄(Acremonium), 아스퍼길루스(Aspergillus), 아우레오바시듐(Aureobasidium), 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리오프시스(Ceriporiopsis), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코칠리오볼루스(Cochliobolus), 코리나스쿠스(Corynascus), 크리포넥트리아(Cryphonectria), 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 코프리누스(Coprinus), 코리오루스(Coriolus), 디플로디아(Diplodia), 엔도디스(Endothis), 프사리움(Fusarium), 지베렐라(Gibberella), 글리오클라디움(Gliocladium), 휴미콜라(Humicola), 하이포크레아(Hypocrea), 마이셀리오프토라(Myceliophthora)(예를 들어, Myceliophthora thermophila), 무코르(Mucor), 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 포도스포라(Podospora), 필레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 피리쿨라리아(Pyricularia), 리히조무코르(Rhizomucor), 리히조푸스(Rhizopus), 스키조필룸(Schizophyllum), 스키탈리듐(Scytalidium), 스포로트리츔(Sporotrichum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티에라비아(Thielavia), 트라마테스(Tramates), 폴리포클라듐(Tolypocladium), 트라이코데마(Trichoderma), 베르티실리움(Verticillium), 및 볼바리엘라(Volvariella)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속으로부터인 방법.
gdh , asd , dapB 또는 ddh의 변이체를 포함하는 숙주 세포
76. 하나 이상의 효소 gdh, asd, dapB 및 ddh의 변이체를 포함하고, 여기서 변이체는 조효소 NADH 및 NADPH에 대해 이중 특이성을 나타내는 숙주 세포.
새로운 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소를 사용하는 방법
77. 숙주 세포에서 신규 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소를 발현시키는 단계를 포함하여, 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생성된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법.
전략에 의한 L-리신 생산 효율을 개선시키는 방법
78. 둘 이상의 다음 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 L-리신 생산 효율을 개선시키는 방법:
(1) 내인성 GAPDH를 변형시켜 변형된 GAPDH가 상응하는 자연 발생 GAPDH에 비해 조효소 NADP에 대해 증가된 특이성을 갖게 하는 단계;
(2) 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현하는 단계로서, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내는 단계; 및
(3) 숙주 세포에서 신규한 니코틴아마이드 뉴클레오타이드 수소전달 효소를 발현시키는 단계.
gdh 및/또는 asd를 사용하는 방법
79. 숙주 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh) 및 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd)의 하나 또는 둘 다의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법으로서, 여기서 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내는 방법.
80. 조항 79에 있어서, 변이체 효소는 NADPH보다 NADH를 더욱 효과적으로 사용하는 방법.
81. 조항 79 또는 80에 있어서, 상기 방법은 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 및 182로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
82. 조항 81에 있어서, gdh의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 144, 150, 162, 166, 170, 174, 및 178로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
83. 조항 79-82 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
84. 조항 83에 있어서, asd의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 108 및 118로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
트레오닌 알돌라제에 의한 L-트레오닌 생산의 효율을 개선시키는 방법
85. 숙주 세포에서 트레오닌 알돌라제의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의한 L-트레오닌 생산 효율을 개선시키는 방법으로서, 여기서 변이체 효소는 대장균 트레오닌 알돌라제(ltaE)와 상이한 기질 선호도 또는 효소 동역학을 나타내는 방법.
86. 조항 85에 있어서, 변이체 효소는 글리신 생산보다 트레오닌 생산에 유리한 방법.
87. 조항 85 또는 86에 있어서, 상기 방법은 트레오닌 알돌라제의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 및 232로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
88. 조항 87에 있어서, 변이체 효소는 SEQ ID NO:196, 206, 220, 224 및 232로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
89. 조항 85-88 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포인 방법.
90. 조항 89에 있어서, 숙주 세포는 아그로박테리움(Agrobacterium), 알리시로바실러스(Alicyclobacillus), 아나베아나(Anabaena), 아나시스티스(Anacystis), 아시네토박터(Acinetobacter), 아시도써무스(Acidothermus), 아르쓰로박터(Arthrobacter), 아조박터(Azobacter), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 부티리비브리오(Butyrivibrio), 부케네라(Buchnera), 캠프스트리스(Campestris), 캠필로박터(Camplyobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 크로마티움(Chromatium), 코프로콕쿠스(Coprococcus), 에스체리치아(Escherichia), 엔테로콕쿠스(Enterococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 푸소박테리움(Fusobacterium), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 프란시셀라(Francisella), 플라보박테리움(Flavobacterium), 게오바실루스(Geobacillus), 해모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 락토바실루스(Lactobacillus), 락토콕커스(Lactococcus), 일로박터(Ilyobacter), 마이크로콕쿠스(Micrococcus), 마이크로박테리움(Microbacterium), 메소르히조비움(Mesorhizobium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 네이세리아(Neisseria), 판도에아(Pantoea), 수도모나스(Pseudomonas), 프로클로로콕쿠스(Prochlorococcus), 로도박터(Rhodobacter), 로도수도모나스(Rhodopseudomonas), 로세부리아(Roseburia), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 로도콕쿠스(Rhodococcus), 세네데스무스(Scenedesmus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 시네콕쿠스(Synecoccus), 사카로모노스포라(Saccharomonospora), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 스타필로콕쿠스(Staphylococcus), 세라티아(Serratia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium), 트로페리마(Tropheryma), 툴라렌시스(Tularensis), 테메쿨라(Temecula), 써모시네코콕쿠스(Thermosynechococcus), 써모콕쿠스(Thermococcus), 우레아플라즈마(Ureaplasma), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 예르시니아(Yersinia) 및 지모모나스(Zymomonas)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속으로부터인 방법.
91. 조항 90에 있어서, 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰인 방법.
92. 조항 90에 있어서, 숙주 세포는 대장균인 방법.
93. 조항 85-88 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포인 방법.
94. 조항 93에 있어서, 숙주 세포는 아칠라(Achlya), 아크레모늄(Acremonium), 아스퍼길루스(Aspergillus), 아우레오바시듐(Aureobasidium), 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리오프시스(Ceriporiopsis), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코칠리오볼루스(Cochliobolus), 코리나스쿠스(Corynascus), 크리포넥트리아(Cryphonectria), 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 코프리누스(Coprinus), 코리오루스(Coriolus), 디플로디아(Diplodia), 엔도디스(Endothis), 프사리움(Fusarium), 지베렐라(Gibberella), 글리오클라디움(Gliocladium), 휴미콜라(Humicola), 하이포크레아(Hypocrea), 마이셀리오프토라(Myceliophthora)(예를 들어, Myceliophthora thermophila), 무코르(Mucor), 네우로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 포도스포라(Podospora), 필레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 피리쿨라리아(Pyricularia), 리히조무코르(Rhizomucor), 리히조푸스(Rhizopus), 스키조필룸(Schizophyllum), 스키탈리듐(Scytalidium), 스포로트리츔(Sporotrichum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티에라비아(Thielavia), 트라마테스(Tramates), 폴리포클라듐(Tolypocladium), 트라이코데마(Trichoderma), 베르티실리움(Verticillium), 및 볼바리엘라(Volvariella)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속으로부터인 방법.
변이체 효소에 의한 L-트레오닌 생산의 효율을 개선시키는 방법
95. 숙주 세포에서 효소 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소 효소(gapA), 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 트레오닌 알돌라제(ltaE) 및 피루베이트 카복실라제(pyc)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하여 숙주 세포에 의한 L-트레오닌 생산을 증가시키는 방법.
96. 조항 95에 있어서, gdh의 변이체 효소 또는 asd의 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대해 이중 특이성을 나타내는 방법.
97. 조항 95에 있어서, gapA의 변이체 효소, gdh의 변이체 효소 또는 asd의 변이체 효소는 NADPH보다 NADH를 더욱 효과적으로 사용하는 방법.
98. 조항 95-97 중 어느 한 항에 있어서, 트레오닌 알돌라제의 변이체 효소는 글리신 생산보다 트레오닌 생산에 유리한 방법.
99. 조항 95-98 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 및 182로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
100. 조항 99에 있어서, gdh의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 144, 150, 162, 166, 170, 174, 및 178로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
101. 조항 95-100 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
102. 조항 101에 있어서, asd의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 108 및 118로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
103. 조항 95-102 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 트레오닌 알돌라제의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 및 232로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
104. 조항 103에 있어서, 트레오닌 알돌라제의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 196, 206, 220, 224 및 232로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
105. 조항 94-104 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 gapA의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 gapA의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 69, 71, 73, 303, 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
106. 조항 95-105 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 gapA의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 gapA의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
107. 조항 95-105 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 gapA의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 gapA의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
108. 조항 106 또는 107에 있어서, gapA의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 방법.
109. 조항 106 또는 107에 있어서, gapA의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 36 및 37에 해당하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 방법.
110. 조항 108 또는 109에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 gapA의 변이체 효소의 위치의 잔기는 리신인 방법.
111. 조항 109에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 36에 해당하는 gapA의 변이체 효소의 위치의 잔기는 트레오닌이고, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 gapA의 변이체 효소의 위치의 잔기는 리신인 방법.
112. 조항 106-111 중 어느 한 항에 있어서, gapA의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 192에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 방법.
113. 조항 112에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 192에 해당하는 gapA의 변이체 효소의 위치의 잔기는 세린인 방법.
114. 조항 106-113 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 224에 해당하는 gapA의 변이체 효소의 위치의 잔기는 세린인 방법.
115. 조항 106-114 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 110에 해당하는 gapA의 변이체 효소의 위치의 잔기는 아스파르트산인 방법.
116. 조항 106-115 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 140에 해당하는 gapA의 변이체 효소의 위치의 잔기는 글리신인 방법.
117. 조항 95-105 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 gapA의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서 gapA의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 69, 71, 73, 303, 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
트레오닌 기본 균주
118. 각각 하나 이상의 합성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 thrA 유전자, thrB 유전자 및 thrC 유전자를 포함하는 다중-카피 복제 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
119. 조항 118에 있어서, 숙주 세포는 tdh 결실(Δtdh) 세포인 숙주 세포.
120. 조항 118 또는 119에 있어서, 다중-카피 복제 플라스미드는 SEQ ID NO: 77의 thrABC 오페론 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 숙주 세포.
트레오닌 알돌라제 및 피루베이트 카복실라제를 포함하는 전략에 의해 화합물 생산의 효율을 개선시키는 방법
121. 다음 단계 중 둘 이상을 포함하여 숙주 세포에 의해 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법: (1) 내인성 해당 효소 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 조효소 특이성을 확장시킴으로써 NADPH를 생산하는 해당 경로를 조작하여 효소가 NADP 및 NAD에 대한 이중 특이성을 갖게 하는 단계; (2) NADH로부터 NADPH를 생성하는 숙주 세포에서 수소전달 효소를 발현시키는 단계; (3) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소의 상동체를 발현시킴으로써 리신 합성을 위한 DAP-경로를 재프로그래밍하는 단계; (4) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh 및 asd 효소의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 위한 thrABC-경로를 재프로그래밍하는 단계; (5) 트레오닌의 글리신으로의 분해를 감소시키거나 역전시키는 내인성 L-트레오닌 알돌라제(ltA)의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 재프로그래밍하는 단계; 및 (6) 이종 피루베이트 카복실라제(pyc) 또는 이의 상동체를 발현시켜 옥살로아세테이트의 합성을 증가시키거나 내인성 pyc의 발현을 증가시키는 단계.
122. 조항 122에 있어서, 내인성 해당 효소 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 조효소 특이성을 확장시킴으로써 NADPH를 생산하는 해당 경로를 조작하여 효소가 NADP 및 NAD에 대한 이중 특이성을 갖게 하는 단계는 SEQ ID NO: 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 gapA의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
123. 조항 121 또는 122에 있어서, 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh 및 asd 효소의 상동체를 발현시킴으로써 리신 합성을 위한 DAP-경로를 재프로그래밍하는 단계는 다음 단계 중 하나 이상을 포함하는 방법:
i) SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 및 182로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계;
ii) SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계;
iii) SEQ ID NO: 46 및 48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 dapB의 변이체 효소를 발현시키는 단계; 및
iv) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 ddh의 변이체 효소를 발현시키는 단계.
124. 조항 121-123 중 어느 한 항에 있어서, 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh 및 asd 효소의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 위한 thrABC-경로를 재프로그래밍하는 단계는 다음 단계 중 하나 이상을 포함하는 방법:
i) SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 및 182로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계; 및
ii) SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계.
125. 조항 121-124 중 어느 한 항에 있어서, 트레오닌의 글리신으로의 분해를 감소시키거나 역전시키는 내인성 L-트레오닌 알돌라제(ltA)의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 재프로그래밍하는 단계는 SEQ ID NO: 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 및 232로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 ltA의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
126. 조항 121-125 중 어느 한 항에 있어서, 이종 피루베이트 카복실라제(pyc) 또는 이의 상동체를 발현시켜 옥살로아세테이트의 합성을 증가시키거나 내인성 pyc의 발현을 증가시키는 단계는 SEQ ID NO: 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 및 289로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 pyc의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
새로운 gapA 변이체 - 폴리뉴클레오타이드
127. 절단된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA) 유전자를 암호화하는 인공 폴리뉴클레오타이드로서, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 290, 291, 292, 및 293으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 인공 폴리뉴클레오타이드.
128. 조항 127에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 290, 291, 292 및 293으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인공 폴리뉴클레오타이드.
129. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 조항 127 또는 128의 인공 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
새로운 gapA 변이체 - 단백질
130. 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 재조합 단백질 단편으로서, 여기서 재조합 단백질 단편은 SEQ ID NO: 233, 234, 235, 236, 및 298로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하는 재조합 단백질 단편.
131. 조항 130에 있어서, 재조합 단백질 단편은 SEQ ID NO: 233, 234, 235, 236, 및 298로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질 단편.
132. 조항 130 또는 131에 있어서, 재조합 단백질 단편은 gapA 활성이 결여되는 재조합 단백질 단편.
133. 조항 130-133 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질 단편은 숙주 세포가 gapA 활성을 갖는 다른 단백질을 포함할 때 숙주 세포에 의해 표 2로부터 선택된 화합물의 생산성을 증가시키는 재조합 단백질 단편.
다른 실시태양
134. NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 미생물 세포의 능력을 향상시키는 방법으로서, 세포의 이용 가능한 NADPH를 변경하는 단계를 포함하는 방법.
135. 제 134 항에 있어서, 이용 가능한 NADPH는 세포에서 변형된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)를 발현시킴으로써 변경되며, 여기서 변형된 GAPDH는 이의 조효소 특이성이 확장되도록 변형되는 방법.
136. 제 134 항에 있어서, 세포의 이용 가능한 NADPH는 미생물 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현시킴으로써 변경되며, 여기서 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대해 이중 특이성을 나타내는 방법.
137. 제 135 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 상응하는 자연 발생 GAPDH에 비해 조효소 NADP에 대해 증가된 특이성을 갖는 방법.
138. 제 134 항 내지 제 137 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 세포는 박테리아 세포인 방법.
139. 제 138 항에 있어서, 박테리아 세포는 코리네박테리움 종, 에스케리키아 종, 바실러스 종 또는 게오바실루스 종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아로부터인 방법.
140. 제 138 항에 있어서, 박테리아는 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 대장균인 방법.
141. 제 134 항 내지 제 137 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 세포는 효모 세포인 방법.
142. 제 141 항에 있어서, 효모 세포는 사카로마이세스 종으로부터의 세포인 방법.
143. 제 137 항에 있어서, 자연 발생 GAPDH는 gapA인 방법.
144. 제 143 항에 있어서, gapA는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 갖는 방법.
145. 제 134 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
146. 제 134 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
147. 제 145 항 또는 제 146 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 방법.
148. 제 147 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 36 및 37에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 방법.
149. 제 147 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치의 트레오닌은 리신으로 치환되는 방법.
150. 제 148 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 36에 해당하는 위치의 류신은 트레오닌으로 치환되고, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치의 트레오닌은 리신에 의해 치환되는 방법.
151. 제 135 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 192에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 방법.
152. 제 135 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 172에 해당하는 위치의 프롤린은 세린으로 치환되는 방법.
153. 제 135 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 224에 해당하는 위치의 류신은 세린으로 치환되는 방법.
154. 제 135 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 110에 해당하는 위치의 히스티딘은 아스파르트산으로 치환되는 방법.
155. 제 135 항에 있어서, SEQ ID NO: 58의 아미노산 140에 해당하는 위치의 티로신은 글리신으로 치환되는 방법.
156. 제 146 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 69, 71, 73, 303, 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
157. 제 134 항 내지 제 137 항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 표 2로부터 선택되는 방법.
158. 제 157 항에 있어서, 화합물은 L-리신 또는 L-트레오닌인 방법.
159. 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 확장된 조효소 특이성을 갖는 변형된 GAPDH를 포함하는 미생물 세포로서, 미생물 세포는 변형된 GAPDH가 결여된 상대 미생물 세포에 비해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산을 개선시키는 미생물 세포.
160. 제 159 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 NADP에 대한 증가된 특이성을 갖는 미생물 세포.
161. 제 160 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 미생물 세포.
162. 제 160 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 미생물 세포.
163. 제 160 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 위치 36, 37 또는 둘 다의 아미노산에 대한 치환을 포함하는 미생물 세포.
164. 제 160 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 69, 71, 73, 303, 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 미생물 세포.
165. 제 159 항에 있어서, 화합물은 표 2로부터 선택되는 미생물 세포.
166. 제 165 항에 있어서, 화합물은 L-리신 또는 L-트레오닌인 미생물 세포.
167. 제 159 항에 있어서, 미생물 세포는 박테리아로부터인 미생물 세포.
168. 제 167 항에 있어서, 박테리아는 코리네박테리움 종, 에스케리키아 종, 바실러스 종 또는 게오바실루스 종인 미생물 세포.
169. 제 168 항에 있어서, 박테리아는 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 대장균인 미생물 세포.
170. 제 165 항에 있어서, 미생물 세포는 효모 세포인 미생물 세포.
171, GAPDH를 변형시켜 변형된 GAPDH가 조효소 NADP 및 NAD에 대해 이중 특이성을 갖게 하는 단계를 포함하여 GAPDH의 조효소 특이성을 확장시키는 방법.
172. 제 171 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 NAD에 비해 조효소 NADP에 대한 증가된 특이성을 갖는 방법.
173. 제 172 항에 있어서, 변형된 GAPDH는 NAD보다 NADP를 더 효과적으로 사용하는 방법.
174. 제 136 항에 있어서, 상기 방법은 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 42 또는 44의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
175. 제 136 항에 있어서, 상기 방법은 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 30 또는 40의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
176. 제 136 항에 있어서, 상기 방법은 dapB의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 46 또는 48의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
177. 제 136 항에 있어서, 상기 방법은 ddh의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 ddh 효소는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
178. 제 136 항에 있어서, 상기 방법은 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 및 182로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
179. 제 136 항에 있어서, 상기 방법은 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 변이체 효소는 SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
180. 제 136 항에 있어서, 모든 4개 효소의 변이체는 미생물 세포에서 동시에 발현되는 방법.
181. 하나 이상의 효소 gdh, asd, dapB 및 ddh의 변이체를 포함하는 미생물 세포로서, 여기서 변이체는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내는 미생물 세포.
182. 제 178 항에 있어서, gdh의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 144, 150, 162, 166, 170, 174, 178로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
183. 제 179 항에 있어서, asd의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 108 및 118로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
184. 제 134 항 내지 제 137 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 세포에서 트레오닌 알돌라제의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 더 포함하는 방법으로서, 트레오닌 알돌라제의 변이체 효소는 대장균 트레오닌 알돌라제(ltaE)와 상이한 기질 선호도 또는 효소 동역학을 나타내는 방법.
185. 제 184 항에 있어서, 변이체 트레오닌 알돌라제는 글리신 생산보다 트레오닌 생산에 유리한 방법.
186. 제 184 항에 있어서, 변이체 트레오닌 알돌라제는 SEQ ID NO: 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 및 232로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
187. 제 186 항에 있어서, 변이체 트레오닌 알돌라제는 SEQ ID NO: 196, 206, 220, 224 및 232로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
188. 제 184 항에 있어서, 화합물은 L-트레오닌인 방법.
189. 제 140 항에 있어서, 박테리아는 대장균이고 상기 방법은 대장균 세포에서 pyc를 발현시키는 단계를 더 포함하는 방법.
190. 제 189 항에 있어서, 상기 방법은 pyc의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 여기서 pyc의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 및 289로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
191. 각각 하나 이상의 합성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 thrA 유전자, thrB 유전자 및 thrC 유전자를 포함하는 다중-카피 복제 플라스미드를 포함하는 미생물 세포.
192. 제 191 항에 있어서, 미생물 세포는 tdh 결실(Δtdh) 세포인 미생물 세포.
193. 제 191 항에 있어서, 다중-카피 복제 플라스미드는 SEQ ID NO: 77의 thrABC 오페론 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 미생물 세포.
194. 다음 단계 중 둘 이상을 포함하여 미생물 세포에 의해 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법: (1) 내인성 해당 효소 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 조효소 특이성을 확장시킴으로써 NADPH를 생산하는 해당 경로를 조작하여 효소가 NADP 및 NAD에 대한 이중 특이성을 갖게 하는 단계; (2) NADH로부터 NADPH를 생성하는 박테리아에서 수소전달 효소를 발현시키는 단계; (3) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소의 상동체를 발현시킴으로써 리신 합성을 위한 DAP-경로를 재프로그래밍하는 단계; (4) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh 및 asd 효소의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 위한 thrABC-경로를 재프로그래밍하는 단계; (5) 트레오닌의 글리신으로의 분해를 감소시키거나 역전시키는 내인성 L-트레오닌 알돌라제(ltA)의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 재프로그래밍하는 단계; 및 (6) 이종 피루베이트 카복실라제(pyc) 또는 이의 상동체를 발현시켜 옥살로아세테이트의 합성을 증가시키거나 내인성 pyc의 발현을 증가시키는 단계.
195. 제 194 항에 있어서, 화합물은 표 2로부터 선택되는 방법.
196. 제 195 항에 있어서, 화합물은 L-트레오닌인 방법.
197. 제 194 내지 제 196 항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 해당 효소 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 조효소 특이성을 확장시킴으로써 NADPH를 생산하는 해당 경로를 조작하여 효소가 NADP 및 NAD에 대한 이중 특이성을 갖게 하는 단계는 SEQ ID NO: 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 gapA의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
198. 제 194 항 내지 제 196 항 중 어느 한 항에 있어서, 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소의 상동체를 발현시킴으로써 리신 합성을 위한 DAP-경로를 재프로그래밍하는 단계는 다음 단계 중 하나 이상을 포함하는 방법:
i) SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 및 182로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계;
ii) SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계;
iii) SEQ ID NO: 46 및 48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 dapB의 변이체 효소를 발현시키는 단계; 및
iv) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 ddh의 변이체 효소를 발현시키는 단계.
199. 제 194 항 내지 제 196 항 중 어느 한 항에 있어서, 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh 및 asd 효소의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 위한 thrABC-경로를 재프로그래밍하는 단계는 다음 단계 중 하나 이상을 포함하는 방법:
i) SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 및 182로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계; 및
ii) SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계.
200. 제 194 항 내지 제 196 항 중 어느 한 항에 있어서, 트레오닌의 글리신으로의 분해를 감소시키거나 역전시키는 내인성 L-트레오닌 알돌라제(ltA)의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 재프로그래밍하는 단계는 SEQ ID NO: 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 및 232로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 ltA의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
201. 제 194 항 내지 제 196 항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 피루베이트 카복실라제(pyc) 또는 이의 상동체를 발현시켜 옥살로아세테이트의 합성을 증가시키거나 내인성 pyc의 발현을 증가시키는 단계는 SEQ ID NO: 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 및 289로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 pyc의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
202. 절단된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA) 유전자를 암호화하는 인공 폴리뉴클레오타이드로서, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 290, 291, 292, 및 293으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 인공 폴리뉴클레오타이드.
203. 제 202 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 290, 291, 292 및 293으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인공 폴리뉴클레오타이드.
204. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제 202 항 또는 제 203 항의 인공 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
205. 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 재조합 단백질 단편으로서, 여기서 재조합 단백질 단편은 SEQ ID NO: 233, 234, 235, 236, 및 298로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 재조합 단백질 단편.
206. 제 205 항에 있어서, 재조합 단백질 단편은 SEQ ID NO: 233, 234, 235, 236, 및 298로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질 단편.
207. 제 205 항 또는 제 206 항에 있어서, 재조합 단백질 단편은 gapA 활성이 결여되는 재조합 단백질 단편.
208. 제 207 항에 있어서, 재조합 단백질 단편은 미생물 세포가 gapA 활성을 갖는 다른 단백질을 포함할 때 미생물 세포에 의해 표 2로부터 선택된 화합물의 생산성을 증가시키는 재조합 단백질 단편.
209. 제 159 항 내지 제 169 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 세포는 변이체 트레오닌 알돌라제, pyc 단백질 또는 둘 다를 더 포함하는 미생물 세포.
본 발명에 인용된 모든 참고문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다.
그러나 본 발명에 언급된 모든 참고문헌, 기사, 출판물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원은 세계 어느 나라에서든 유효한 선행 기술을 구성하거나 보통의 일반 지식의 일부를 구성한다는 인정 또는 어떠한 형태의 제안으로 간주되어서는 안 된다. 특히, 다음의 출원은 그 전문이 본 발명에 참조로 포함된다: 2016년 12월 30일에 출원된 미국 출원 제15/396,230호; 2016년 12월 7일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2016/065465; 2016년 4월 27일에 출원된 미국 출원 제15/140,296호; 2016년 7월 29일에 출원된 미국 가출원 제62/368,786호; 및 2015년 12월7일에 출원된 미국 가출원 제62/264,232호.
SEQUENCE LISTING <110> Zymergen Inc. Manchester, Shawn <120> GENOMIC ENGINEERING OF BIOSYNTHETIC PATHWAYS LEADING TO INCREASED NADPH <130> ZYMR-011/01WO 327574-2057 <150> US 62/508,589 <151> 2017-05-19 <160> 308 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 969 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized ddh from A. Oris <400> 1 atgattcgcg ttgcgatcaa tggatatggc aacctgggac ggggtgtcga acaagcgatt 60 acgaagaacg cggacatgga agtcgcggtc gtgtttacgc gccgcgaccc agctacggtg 120 actacccagg gcgcccccgt cgcccatgtt gatgacatgg ccgcttgggc cgataaagtg 180 gatgtctgtc ttaactgcgg cggatcagcg accgacttga ttgaacaaac gcccgctgcg 240 gcagctcttt tcaacaccgt agattcgttc gatacgcatg cccggattcc tgagcatttc 300 gccgcggtgg acgccgcagc gaaggcatca ggccatgtgg cgttgatttc agcgggctgg 360 gacccaggac ttttttccat gctccgggtc ctcggcgaag cagtcctccc agacggtgct 420 accacgacct tctggggccc cggagtttcg cagggtcatt cagacgctct gcgtcgcatc 480 gacggtgtgg tagatgcgaa acaatacact cggccagtcg aggcaacggt ggctgccgtc 540 aaggcaggag atgatgttga gctcactacg cgctcaatgc acactcgtga ctgctatgta 600 gttgcggagg aaggcgcaga tcttgcccgg atcgagcggg agatcgttga gatgcccaat 660 tacttcgctg attacgatac taccgttact ttcattactg ccgaggaact tgccgcggag 720 cacgcgggta ttccgcatgg aggatcggta attcggcgtg gccataccag cgaaggagtg 780 gccgaaaccg tgtcgtttga gctgcaattg ggctctaacc ccgaatttac gggatcagtc 840 ctggttgcta cggcgcgtgc tgtcgcacgg cttgctgccc ggggcgaaac tggtgcccgg 900 acggtttttg acgttactct tgccgacttg tctccgacta gccccgagga gctccgtgct 960 cactacctg 969 <210> 2 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized ddh from A. Oris <400> 2 Met Ile Arg Val Ala Ile Asn Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg Gly Val 1 5 10 15 Glu Gln Ala Ile Thr Lys Asn Ala Asp Met Glu Val Ala Val Val Phe 20 25 30 Thr Arg Arg Asp Pro Ala Thr Val Thr Thr Gln Gly Ala Pro Val Ala 35 40 45 His Val Asp Asp Met Ala Ala Trp Ala Asp Lys Val Asp Val Cys Leu 50 55 60 Asn Cys Gly Gly Ser Ala Thr Asp Leu Ile Glu Gln Thr Pro Ala Ala 65 70 75 80 Ala Ala Leu Phe Asn Thr Val Asp Ser Phe Asp Thr His Ala Arg Ile 85 90 95 Pro Glu His Phe Ala Ala Val Asp Ala Ala Ala Lys Ala Ser Gly His 100 105 110 Val Ala Leu Ile Ser Ala Gly Trp Asp Pro Gly Leu Phe Ser Met Leu 115 120 125 Arg Val Leu Gly Glu Ala Val Leu Pro Asp Gly Ala Thr Thr Thr Phe 130 135 140 Trp Gly Pro Gly Val Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile 145 150 155 160 Asp Gly Val Val Asp Ala Lys Gln Tyr Thr Arg Pro Val Glu Ala Thr 165 170 175 Val Ala Ala Val Lys Ala Gly Asp Asp Val Glu Leu Thr Thr Arg Ser 180 185 190 Met His Thr Arg Asp Cys Tyr Val Val Ala Glu Glu Gly Ala Asp Leu 195 200 205 Ala Arg 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gcatcgccaa 300 gttatgaatg aagctgcaac cgcagcaggc aatgtagcgt tggtttctac gggctgggac 360 ccaggcatgt tttcgattaa tcgtgtttat gccgctgctg ttttggccga gcaccagcaa 420 cacacgtttt ggggtccagg acttagccag ggccatagcg atgcccttcg ccgcatcccg 480 ggtgttcaaa aggctgttca gtacacgttg ccttctgaag atgcgcttga aaaagcacgg 540 cgcggcgagg ccggagattt gaccggcaag caaacgcata aacgccagtg cttcgttgtg 600 gccgacgcgg ccgaccatga gcgcatcgag aacgatattc ggactatgcc cgattacttc 660 gtaggctatg aggtggaagt caatttcatc gatgaagcaa ccttcgactc tgaacatacg 720 ggtatgcccc acggcggtca cgtgatcacg actggcgaca ctggcggttt taaccacacc 780 gttgagtata ttctcaagct ggaccgtaat cccgacttca ctgcgtcctc tcaaatcgcg 840 ttcggccgtg cagcgcaccg catgaaacaa caaggccaat caggtgcctt taccgttctg 900 gaagttgccc catatttgtt gagcccggaa aacttggacg acttgattgc ccgggatgtg 960 <210> 4 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized ddh from C. glutamicum <400> 4 Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg 1 5 10 15 Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala 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taaaggagtt tcacagggac attctgatgc gatccggcgt 480 atcgcaggcg ttaaagacgc gcgccagtac acgatccccg tggacgccgc gttggagagc 540 gttcgcaatg gagaaaatcc gaccctcacc actcgggaga agcacactcg ggagtgtttc 600 gttgtcgctg aagacggcgc tgaccttaaa gtgatcgaag aaacgatcaa gaccatgcca 660 aactattttg ctgactatga cacgactgtt catttcatct cggaggaaga gctgatgcgg 720 gatcatcaag gaattccgca tggtggcgtc gtacttcgca gcggaaccac gggctttgac 780 tatgagaaca agcacgtaat cgaatacaaa ctcactctgg attcgaaccc cgagttcacc 840 tcctctgttc tcgttgcata tgctcgggcc gcttatcgta tgcaccaaga gggccaatgc 900 ggttgtaaaa ctgtatttga tattgccccg gcataccttc acgttgaatc cggagaggaa 960 ttgcgtaaga aactcttg 978 <210> 8 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized ddh from Coprobacillus sp. <400> 8 Met Ile Lys Ile Gly Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg Gly Val 1 5 10 15 Glu Cys Ala Val His His Ser Gln Asp Met Glu Leu Ala Gly Val Phe 20 25 30 Thr Arg Arg Asn Pro Glu Thr Val Lys Thr His Thr Asp Val Pro Val 35 40 45 Tyr Asp Met Glu Lys Leu Tyr Asp 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gcgtgatgcg cgccaatata ctatccctat cgaggacacc 540 gtggctcgcg tgcgttccgg cgaggcaccc tccctcagca cccgggaacg ccatcttcgt 600 cgttgctacg tggtggccga agagggagcc gaccccggtg agatccgtga gaaaattcgg 660 tcaatgccta attattttgc agattatgat accaaggtct cgtttatttc gcaggaagag 720 atggaacgca gccacaaccg gatgccacat ggtggtttcg ttatgcgtgc gggaaagacc 780 gccgacggaa cgggtcacgt ccttgagttc cgtcttaaat tggactctaa ccccgctttc 840 accgcatccg tgttgttggc ttatgcacgt gcagcatatc ggctgcacca agaaggcgca 900 attggcgcac ggaccgtatt tgatgtaccg ccagcgcatc tgtctcctaa aacgccagag 960 gagattcgtc gttccatgct t 981 <210> 10 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized ddh from M. harundinacea <400> 10 Met Glu Lys Leu Arg Ile Gly Ile Val Gly Tyr Gly Asn Val Gly Arg 1 5 10 15 Ala Val Glu Leu Ser Leu Arg Gln Asn Pro Asp Met Met Ala Ala Val 20 25 30 Val Leu Thr Arg Arg Asp Pro Arg Gly Ile Arg Thr Leu Thr Pro Gly 35 40 45 Leu Met Ala Ser Ser Ile Glu Glu Ala Glu Arg Tyr Ala Ser Glu Val 50 55 60 Asp Val Ala Val Leu Cys 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cgaatgcttc gttgtactcg aagcgggagc agacgcctcg 660 gccgtgcgta agacgattgt tacgatgccc cattattttg atgagtatga caccactgta 720 cactttatcg gcgccgagga attggctcgg gaacacggcg ccatgccgca cggcggattt 780 gtcatccgct caggtaatac ctctcaggaa aacaaacagg taatcgagta tcgtctccaa 840 ctcgactcta accctgaatt taccagctct gtcctcgtcg catatgcacg tgccgtacat 900 cgtatgcaac aggccggtca gtggggctgc aagacggtat ttgatgttgc gccaggcctg 960 ctgtctccgc gctcggcggc cgaactccgc gctcaacttc tt 1002 <210> 14 <211> 334 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized ddh from A. denitrificans <400> 14 Met Gly Leu Asp Asn Asn Ala Arg Thr Ala Ile Arg Ile Gly Ile Val 1 5 10 15 Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg Gly Val Glu Ala Ala Val Ala Arg Asn 20 25 30 Ser Asp Met Ala Val Ala Gly Ile Tyr Thr Arg Arg Asp Pro Ala Gln 35 40 45 Ile Glu Pro Met Gly Ala Gly Val Pro Val His Ala Met Asp Ser Leu 50 55 60 Pro Gly His Lys Gly Ser Ile Asp Val Leu Val Leu Cys Gly Gly Ser 65 70 75 80 Lys Asp Asp Leu Pro Arg Gln Ser Pro Glu Leu Ala Ala His Phe Ser 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300 Ala Gly Gln Trp Gly Cys Lys Thr Val Phe Asp Val Ala Pro Gly Leu 305 310 315 320 Leu Ser Pro Arg Ser Ala Ala Glu Leu Arg Ala Gln Leu Leu 325 330 <210> 15 <211> 957 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized ddh from M. luteus <400> 15 atgaccattc gcgcgggaat tgtaggatat ggaaacctgg gtcgctctgt agaaaaactt 60 gttaaactgc agccggacat ggaacttgtt ggcatttttt cccggcggac tggactcgac 120 acggataccc cagtacttcc tgcggaacgt gcggccgagc acgcgggtga gattgatgtg 180 ctttttctgt gccttggaag cgcgactgat attccagagc aagcggccgg ttacgcacgc 240 cacttcacga ccgttgatac gtatgataac catcaactga tcccacggca tcggtctgaa 300 atggatgctg cggcccggga gggcggccac gtagcgatga tctcaactgg atgggaccca 360 ggactttttt ctgtcaatcg ggtccttgga gccgcccttt ttccgcagcc ccagcaaaat 420 actttttggg gcaagggcct ctcacaaggt cactcggatg cagtgcggcg ggtgccgggt 480 gtacggcgtg gcgttcagta cactattccg tcagaggaag cgattgcaga ggcccgggct 540 ggtcgcggtg cagagattac tggtgcgtcg gctcatgttc gggagtgtta cgtcgttgca 600 gacgaggcag atcatgctgc tatcactgag gcgatcacca ccatgccgga ttactttgcc 660 ccctatgaga cgaccgtaca ctttatttcg gaggaagaat ttgagcggga tcatcagggt 720 atgccacacg gaggccacgt tgtcacgtct ggtgacttgg gaggctctcg ctctgcggta 780 gaatttgtcc tcgaactcga atctaatcct gactttaccg cagcagccca ggtagcctat 840 ggccgggccg ccgctcgcct taaggcccag ggtgagactg gcgctcgtac ggtacttgag 900 gtcgctccct atcttctgtc accgacgggt ttggatgagc tgattcgccg cgacgtg 957 <210> 16 <211> 319 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized ddh from M. luteus <400> 16 Met Thr Ile Arg Ala Gly Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg Ser 1 5 10 15 Val Glu Lys Leu Val Lys Leu Gln Pro Asp Met Glu Leu Val Gly Ile 20 25 30 Phe Ser Arg Arg Thr Gly Leu Asp Thr Asp Thr Pro Val Leu Pro Ala 35 40 45 Glu Arg Ala Ala Glu His Ala Gly Glu Ile Asp Val Leu Phe Leu Cys 50 55 60 Leu Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Ala Gly Tyr Ala Arg 65 70 75 80 His Phe Thr Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Gln Leu Ile Pro Arg 85 90 95 His Arg Ser Glu Met Asp Ala Ala Ala Arg Glu Gly Gly His Val Ala 100 105 110 Met Ile Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Leu Phe Ser Val Asn Arg Val 115 120 125 Leu Gly Ala Ala Leu Phe Pro Gln Pro Gln Gln Asn Thr Phe Trp Gly 130 135 140 Lys Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Val Arg Arg Val Pro Gly 145 150 155 160 Val Arg Arg Gly Val Gln Tyr Thr Ile Pro Ser Glu Glu Ala Ile Ala 165 170 175 Glu Ala Arg Ala Gly Arg Gly Ala Glu Ile Thr Gly Ala Ser Ala His 180 185 190 Val Arg Glu Cys Tyr Val Val Ala Asp Glu Ala Asp His Ala Ala Ile 195 200 205 Thr Glu Ala Ile Thr Thr Met Pro Asp Tyr Phe Ala Pro Tyr Glu Thr 210 215 220 Thr Val His Phe Ile Ser Glu Glu Glu Phe Glu Arg Asp His Gln Gly 225 230 235 240 Met Pro His Gly Gly His Val Val Thr Ser Gly Asp Leu Gly Gly Ser 245 250 255 Arg Ser Ala Val Glu Phe Val Leu Glu Leu Glu Ser Asn Pro Asp Phe 260 265 270 Thr Ala Ala Ala Gln Val Ala Tyr Gly Arg Ala Ala Ala Arg Leu Lys 275 280 285 Ala Gln Gly Glu Thr Gly Ala Arg Thr Val Leu Glu Val Ala Pro Tyr 290 295 300 Leu Leu Ser Pro Thr Gly Leu Asp Glu Leu Ile Arg Arg Asp Val 305 310 315 <210> 17 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized ddh from B. faecium <400> 17 atgaccgttc atcgtattgg catcgtagga tatggaaacc tcggacgtgg agtagagatc 60 gcgaccagct tgcaggaaga catgcaactc gttggtgtct tcacgcgccg cgacccttca 120 acggtaagca ccgttcatgc tcagacgcca gtacgctcaa tcgacgccct tgaggagatg 180 caagacgaaa ttgatgtgct cgttctttgt ggtggatcac gtaccgacct tcctgaacag 240 acgccccagt tggctgaacg gtttactgtg gttgattcgt ttgacaccca cgcgcggatt 300 cctgagcatt tcgccaaagt tgatgcagcg gcgcgcgctg ctggaaccac cgccctgatt 360 tccactggct gggatccagg cttgttttcg atcaatcgtg tatatggcga agcaatcctt 420 gcgactggaa ctacctacac cttttggggt cggggacttt cccagggcca ctccgatgct 480 gtacggcggg tcgatggcgt agctgctgcc gtacagtaca ctgtaccgag ccaagaagcg 540 attgctcggg tgcgggccgg cgaacagccc acgctgtcga cgcgggaaaa acacacccgg 600 gaatgtttcg tcgttttgga ggatggcgcg gatgctgaga ctgtccgcga ggagatcgta 660 accatgcccc actattttga accttatgac actaccgtaa ccttcctgtc tgcagaggaa 720 ctggcgcgcg atcaccaggg catgccgcac ggcggttttg tgattcggtc aggagagtca 780 agcccaggca ctacccagac tattgaatac cggcttcagg aagactctaa cccggaattt 840 actgcgtcgg tccttgtcgc atatactcgt gctgccgccc ggctcgcagc cgccggcgaa 900 catggtgcta agactccttt cgacgttgcc ccgggccttc tgtccccgaa gtcgcccgaa 960 cagctgcgcg ccgagctcct g 981 <210> 18 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized ddh from B. faecium <400> 18 Met Thr Val His Arg Ile Gly Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg 1 5 10 15 Gly Val Glu Ile Ala Thr Ser Leu Gln Glu Asp Met Gln Leu Val Gly 20 25 30 Val Phe Thr Arg Arg Asp Pro Ser Thr Val Ser Thr Val His Ala Gln 35 40 45 Thr Pro Val Arg Ser Ile Asp Ala Leu Glu Glu Met Gln Asp Glu Ile 50 55 60 Asp Val Leu Val Leu Cys Gly Gly Ser Arg Thr Asp Leu Pro Glu Gln 65 70 75 80 Thr Pro Gln Leu Ala Glu Arg Phe Thr Val Val Asp Ser Phe Asp Thr 85 90 95 His Ala Arg Ile Pro Glu His Phe Ala Lys Val Asp Ala Ala Ala Arg 100 105 110 Ala Ala Gly Thr Thr Ala Leu Ile Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Leu 115 120 125 Phe Ser Ile Asn Arg Val Tyr Gly Glu Ala Ile Leu Ala Thr Gly Thr 130 135 140 Thr Tyr Thr Phe Trp Gly Arg Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala 145 150 155 160 Val Arg Arg Val Asp Gly Val Ala Ala Ala Val Gln Tyr Thr Val Pro 165 170 175 Ser Gln Glu Ala Ile Ala Arg Val Arg Ala Gly Glu Gln Pro Thr Leu 180 185 190 Ser Thr Arg Glu Lys His Thr Arg Glu Cys Phe Val Val Leu Glu Asp 195 200 205 Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Arg Glu Glu Ile Val Thr Met Pro His 210 215 220 Tyr Phe Glu Pro Tyr Asp Thr Thr Val Thr Phe Leu Ser Ala Glu Glu 225 230 235 240 Leu Ala Arg Asp His Gln Gly Met Pro His Gly Gly Phe Val Ile Arg 245 250 255 Ser Gly Glu Ser Ser Pro Gly Thr Thr Gln Thr Ile Glu Tyr Arg Leu 260 265 270 Gln Glu Asp Ser Asn Pro Glu Phe Thr Ala Ser Val Leu Val Ala Tyr 275 280 285 Thr Arg Ala Ala Ala Arg Leu Ala Ala Ala Gly Glu His Gly Ala Lys 290 295 300 Thr Pro Phe Asp Val Ala Pro Gly Leu Leu Ser Pro Lys Ser Pro Glu 305 310 315 320 Gln Leu Arg Ala Glu Leu Leu 325 <210> 19 <211> 975 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized ddh from Carnobacterium sp. <400> 19 atgactaaca agattcggat tggtcttgtg ggttacggta acatcggaaa gggcgtcgaa 60 ttggcgctgg aagagtttcc tgacatggaa ggcattgcgg tcttcactcg tcggaatccc 120 gaagatctcg attcaaagct caaagctatc tctttggacc acattcttga ttaccaggaa 180 gatctggacg ttttgatcct ttgcggcgga agcgccaccg atttgcctgg tcagggtcct 240 gctcttgcaa agcatttctc tacgattgac tcctacgata atcacaatca aattcctgaa 300 tatttcgaaa ctatggacca atctgcaaag gcaggcaaga acatttcaat tatctcggtc 360 ggctgggatc cgggactgtt ctcactgaat cgggccgttt tcgagtccat ccttccggcg 420 ggagagactt acactttttg gggcaaagga ctgtcccagg gccactccga cgccattcgt 480 cggattgatg gcgtcaagtt tggcgttcaa tacaccattc ccgtcgaaac cgcactggag 540 gaagtacggt ctggatcgaa tccgaccctt tccactcggg agaagcacaa acgtgtgtgc 600 tacgttgtag cggaagcggg ctccgaccag aatttgattg aggaaacgat taaaaccatg 660 ccggactact tcgagccgta cgacacgacc gtccatttca tcgacgagaa aacgttcaag 720 gaggagcatc agaaaatgcc acatggtggc ttcgtgatcc gtactgcaac ttcagctacg 780 ggcaacaagc agaaagctga gttccagctc gaattggagt ccaatgcaga attcacttct 840 tcaatcctcg ttgcgtacgc tcgtgccgcc tacaagttta agaaagatgg caagtctggc 900 gctctttcgg tgctggatgt ccctccggca tacctgtctc caaagtcggc agcgcagctc 960 cgcaaggagc tcctg 975 <210> 20 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized ddh from Carnobacterium sp. <400> 20 Met Thr Asn Lys Ile Arg Ile Gly Leu Val Gly Tyr Gly Asn Ile Gly 1 5 10 15 Lys Gly Val Glu Leu Ala Leu Glu Glu Phe Pro Asp Met Glu Gly Ile 20 25 30 Ala Val Phe Thr Arg Arg Asn Pro Glu Asp Leu Asp Ser Lys Leu Lys 35 40 45 Ala Ile Ser Leu Asp His Ile Leu Asp Tyr Gln Glu Asp Leu Asp Val 50 55 60 Leu Ile Leu Cys Gly Gly Ser Ala Thr Asp Leu Pro Gly Gln Gly Pro 65 70 75 80 Ala Leu Ala Lys His Phe Ser Thr Ile Asp Ser Tyr Asp Asn His Asn 85 90 95 Gln Ile Pro Glu Tyr Phe Glu Thr Met Asp Gln Ser Ala Lys Ala Gly 100 105 110 Lys Asn Ile Ser Ile Ile Ser Val Gly Trp Asp Pro Gly Leu Phe Ser 115 120 125 Leu Asn Arg Ala Val Phe Glu Ser Ile Leu Pro Ala Gly Glu Thr Tyr 130 135 140 Thr Phe Trp Gly Lys Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Ile Arg 145 150 155 160 Arg Ile Asp Gly Val Lys Phe Gly Val Gln Tyr Thr Ile Pro Val Glu 165 170 175 Thr Ala Leu Glu Glu Val Arg Ser Gly Ser Asn Pro Thr Leu Ser Thr 180 185 190 Arg Glu Lys His Lys Arg Val Cys Tyr Val Val Ala Glu Ala Gly Ser 195 200 205 Asp Gln Asn Leu Ile Glu Glu Thr Ile Lys Thr Met Pro Asp Tyr Phe 210 215 220 Glu Pro Tyr Asp Thr Thr Val His Phe Ile Asp Glu Lys Thr Phe Lys 225 230 235 240 Glu Glu His Gln Lys Met Pro His Gly Gly Phe Val Ile Arg Thr Ala 245 250 255 Thr Ser Ala Thr Gly Asn Lys Gln Lys Ala Glu Phe Gln Leu Glu Leu 260 265 270 Glu Ser Asn Ala Glu Phe Thr Ser Ser Ile Leu Val Ala Tyr Ala Arg 275 280 285 Ala Ala Tyr Lys Phe Lys Lys Asp Gly Lys Ser Gly Ala Leu Ser Val 290 295 300 Leu Asp Val Pro Pro Ala Tyr Leu Ser Pro Lys Ser Ala Ala Gln Leu 305 310 315 320 Arg Lys Glu Leu Leu 325 <210> 21 <211> 1062 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from M. jannaschii <400> 21 atgtccaagg gagaaaaaat gaagatcaag gttggcgtat tgggtgctac cggatcggtt 60 ggccaacgct ttgtgcagct gcttgcagac caccccatgt tcgaattgac tgctctggca 120 gcaagcgaac ggtccgcggg taaaaaatac aaagatgctt gttactggtt tcaagatcgg 180 gacattccag aaaatattaa ggatatggtt gtaattccga cggatccgaa gcacgaagaa 240 ttcgaagacg ttgatattgt ttttagcgcg ctgccctcgg atctggctaa aaaattcgaa 300 cccgaattcg cgaaagaagg aaagctgatc ttcagcaacg catcagccta tcgtatggag 360 gaagatgtgc cgcttgtaat tccagaggta aacgctgatc acctcgaatt gattgaaatt 420 cagcgcgaga agcggggttg ggacggagcc attatcacta acccaaactg ttcaaccatt 480 tgcgccgtaa tcacccttaa gccaattatg gacaaattcg gtcttgaagc ggtgtttatc 540 gctaccatgc aggctgtatc gggcgcagga tacaacggtg tcccgagcat ggctattctg 600 gataacttga ttccctttat taagaatgag gaggagaaga tgcagactga atcgcttaag 660 ttgctgggca cgcttaagga tggaaaagtg gaactcgcta acttcaaaat cagcgcatca 720 tgcaatcgtg tggctgtgat cgacggccac accgaatcga tcttcgtgaa gaccaaggag 780 ggtgcggaac ctgaggaaat taaagaagtg atggacaaat ttgatcctct taaagacctt 840 aaccttccga cgtatgccaa accaatcgta attcgcgaag agatcgatcg cccacagcca 900 cgtcttgacc gcaatgaggg taatggcatg tctattgtcg ttggtcgtat ccgtaaagat 960 ccgatttttg atgttaagta caccgccctg gaacataaca ctatccgtgg cgccgcgggc 1020 gcatcagtgt tgaatgcgga gtatttcgta aagaaataca tc 1062 <210> 22 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from M. jannaschii <400> 22 Met Ser Lys Gly Glu Lys Met Lys Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Gly Ser Val Gly Gln Arg Phe Val Gln Leu Leu Ala Asp His Pro 20 25 30 Met Phe Glu Leu Thr Ala Leu Ala Ala Ser Glu Arg Ser Ala Gly Lys 35 40 45 Lys Tyr Lys Asp Ala Cys Tyr Trp Phe Gln Asp Arg Asp Ile Pro Glu 50 55 60 Asn Ile Lys Asp Met Val Val Ile Pro Thr Asp Pro Lys His Glu Glu 65 70 75 80 Phe Glu Asp Val Asp Ile Val Phe Ser Ala Leu Pro Ser Asp Leu Ala 85 90 95 Lys Lys Phe Glu Pro Glu Phe Ala Lys Glu Gly Lys Leu Ile Phe Ser 100 105 110 Asn Ala Ser Ala Tyr Arg Met Glu Glu Asp Val Pro Leu Val Ile Pro 115 120 125 Glu Val Asn Ala Asp His Leu Glu Leu Ile Glu Ile Gln Arg Glu Lys 130 135 140 Arg Gly Trp Asp Gly Ala Ile Ile Thr Asn Pro Asn Cys Ser Thr Ile 145 150 155 160 Cys Ala Val Ile Thr Leu Lys Pro Ile Met Asp Lys Phe Gly Leu Glu 165 170 175 Ala Val Phe Ile Ala Thr Met Gln Ala Val Ser Gly Ala Gly Tyr Asn 180 185 190 Gly Val Pro Ser Met Ala Ile Leu Asp Asn Leu Ile Pro Phe Ile Lys 195 200 205 Asn Glu Glu Glu Lys Met Gln Thr Glu Ser Leu Lys Leu Leu Gly Thr 210 215 220 Leu Lys Asp Gly Lys Val Glu Leu Ala Asn Phe Lys Ile Ser Ala Ser 225 230 235 240 Cys Asn Arg Val Ala Val Ile Asp Gly His Thr Glu Ser Ile Phe Val 245 250 255 Lys Thr Lys Glu Gly Ala Glu Pro Glu Glu Ile Lys Glu Val Met Asp 260 265 270 Lys Phe Asp Pro Leu Lys Asp Leu Asn Leu Pro Thr Tyr Ala Lys Pro 275 280 285 Ile Val Ile Arg Glu Glu Ile Asp Arg Pro Gln Pro Arg Leu Asp Arg 290 295 300 Asn Glu Gly Asn Gly Met Ser Ile Val Val Gly Arg Ile Arg Lys Asp 305 310 315 320 Pro Ile Phe Asp Val Lys Tyr Thr Ala Leu Glu His Asn Thr Ile Arg 325 330 335 Gly Ala Ala Gly Ala Ser Val Leu Asn Ala Glu Tyr Phe Val Lys Lys 340 345 350 Tyr Ile <210> 23 <211> 1047 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from S. usitatus <400> 23 atgcagacgc ggatcgaggt aggaattctt ggagcgactg gtatggtcgg tcagcacttt 60 atcaaatttt tgcaaggcca cccttggttc gatctcaagt ggctgggtgc ttcagaccgc 120 tccgccggta aacagtacaa agacgcgatg acctggcatc ttgctggagg aaccccagat 180 tcagtcgctg gtctcaccgt cgaagaatgc aaacccggca atgccccccg tctgcttttc 240 agcgctatgg acgctggagt tgcgaccgat attgaacgtg cgtttgcgca ggcgggtcat 300 gtggttgtct cgaatagccg caaccaccgg atggagcaag acgttccttt gatggtgcct 360 gagattaacc cagatcatct gaagctggta ccgggacaac aacgcgcgcg gggatggaaa 420 ggacagattg tcacgaaccc gaattgctct acgatcggtc tggtgatggg tctcggtcca 480 atgaaacagt tcggcattac gaagatcctt gttaccacga tgcaggctat ttcaggcgca 540 ggatacccag gagtagcatc catggatatt atgggtaacg ttgtccccta catcggctct 600 gaagaggaaa agatggagat ggaaactcaa aaaattatgg gtgatttcgc gggcgatcgc 660 atcgtgccgc ttgcagcaaa ggtctcggcc cactgcaatc gggtaggcgt tgttgacggc 720 catacggaaa ctgtgtcagt cgaattctct atgaaaccaa cggaggcaga tttgcgccat 780 gcgatcgaat cctttactgc agtgccccag gaacgcaagc tcccgagcgc accaggacgt 840 ccggttatct atatgaagga agccaaccgg ccccaacctc gtaaggatgc tgaacgggag 900 cgtggcatgg cagcgtttgt tggtcgcctc cgggcatgcc cggtactgga ttataaattt 960 gtggtcctgt cccacaatac gattcgcggc gcagcaggcg cagcagtctt gaatgccgaa 1020 ctcatgcact cagagggaat gttggat 1047 <210> 24 <211> 349 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from S. usitatus <400> 24 Met Gln Thr Arg Ile Glu Val Gly Ile Leu Gly Ala Thr Gly Met Val 1 5 10 15 Gly Gln His Phe Ile Lys Phe Leu Gln Gly His Pro Trp Phe Asp Leu 20 25 30 Lys Trp Leu Gly Ala Ser Asp Arg Ser Ala Gly Lys Gln Tyr Lys Asp 35 40 45 Ala Met Thr Trp His Leu Ala Gly Gly Thr Pro Asp Ser Val Ala Gly 50 55 60 Leu Thr Val Glu Glu Cys Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Phe 65 70 75 80 Ser Ala Met Asp Ala Gly Val Ala Thr Asp Ile Glu Arg Ala Phe Ala 85 90 95 Gln Ala Gly His Val Val Val Ser Asn Ser Arg Asn His Arg Met Glu 100 105 110 Gln Asp Val Pro Leu Met Val 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Ile Arg Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val 325 330 335 Leu Asn Ala Glu Leu Met His Ser Glu Gly Met Leu Asp 340 345 <210> 25 <211> 1032 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from N. innermongolicus <400> 25 atggcagtgc gggtaggtgt attgggcgct acgggagcag tgggtcaacg gcttatccag 60 ctcctcgagc ctcaccctga attcgaaatt gctgctctca ccgcgtcgga gtcttccgct 120 ggtaaaactt atcgtcaggc ggcgaaatgg cgcgtagact ccccaatccc tgacgacgtc 180 gcagagatga ccgtaagcgc aacggatccc gatgaggttc cggatgacgt agatttgctg 240 ttcagcagct tgccgtcaag cgtcggcgaa caggtagagc ccgctttttg cgaagccgga 300 tacgtgatgt cgtccaattc ttctaatgct cgtatggcgg atgacgtccc acttgttatc 360 ccagaggtaa atgctgaaca tattgatctt cttgaggtcc aacgcgatga acgtggatgg 420 gatggcgcga tggtaaaaaa ccctaattgt tcaactatta cctttgtccc aactcttgcg 480 gcccttgagc agtttggcct ggaggaagtc cacgttgcaa cgctgcaagc ggtgtccggt 540 gcaggttatg atggagtctc ctccatggag atcattgaca atgcaattcc ttatattgga 600 tcggaagaag agaaactgga aacggaatct cgtaagctcc tgggagaatt tgacggcgct 660 gaactgtcgc ataactcagt tgaagtcgca gcttcgtgca accgtatccc gaccattgac 720 ggacacttgg agaacgtgtg ggttgagacc gaagacgacc ttacgcccga agatgccgcg 780 gatgcaatgc gcgcgtatcc atcgttggag cttcgttcat ctccggacca gctgattcat 840 gtctttgatg aaccagaccg cccgcaaccg cggatggacc ggactttggg agacggaatg 900 gcaatcgcgg ctggtggttt gcgtgaatcg actttcgacc ttcaatacaa ttgcttggct 960 cataacacca tccggggtgc agcgggagcc tcggttctga acggagagct gttgttggac 1020 caaggttata tt 1032 <210> 26 <211> 344 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from N. innermongolicus <400> 26 Met Ala Val Arg Val Gly Val Leu Gly Ala Thr Gly Ala Val Gly Gln 1 5 10 15 Arg Leu Ile Gln Leu Leu Glu Pro His Pro Glu Phe Glu Ile Ala Ala 20 25 30 Leu Thr Ala Ser Glu Ser Ser Ala Gly Lys Thr Tyr Arg Gln Ala Ala 35 40 45 Lys Trp Arg Val Asp Ser Pro Ile Pro Asp Asp Val Ala Glu Met Thr 50 55 60 Val Ser Ala Thr Asp Pro Asp Glu Val Pro Asp Asp Val Asp Leu Leu 65 70 75 80 Phe Ser Ser Leu Pro Ser Ser Val Gly Glu Gln Val Glu Pro Ala Phe 85 90 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Gly Gly Leu Arg Glu Ser Thr Phe Asp Leu Gln Tyr Asn Cys Leu Ala 305 310 315 320 His Asn Thr Ile Arg Gly Ala Ala Gly Ala Ser Val Leu Asn Gly Glu 325 330 335 Leu Leu Leu Asp Gln Gly Tyr Ile 340 <210> 27 <211> 1047 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from C. aurantiacus <400> 27 atggccacta ttccagtcgc cgttctgggt gccacgggtg ccgtgggtca acggttcatt 60 cagttgcttg agggtcaccc gctttttcag gtagttgccc tgactggcag cgagcgttcc 120 gctggtaaaa aataccacga ggtgtgtcgt tgggttttgg atactcctat gcccgcagcg 180 gttgcaaacc tgacggtact ggatgcagac gcagacctcc ccgcacagct cgtgttctcc 240 gcgctcccgt ctaccgtcgc cggcccgatc gaacaacgtc ttgctgctgc tggtcatatc 300 gtgtgctcca acgcttcgaa ccatcgtatg gagccagatg tgccactcat tattcccgaa 360 gtcaacccgg accatcttgc cttgattccc gttcaacgcc gccgccgtgg ttggtccggt 420 gctattgtta ccaacccaaa ctgcacttcc acgccggcga cgatggtgtt gcgccctttg 480 ctcgatacct ttggagtccg gcgcatgctt ttggtgtcaa tgcaagccct ctctggagcc 540 ggctacccag gtgtgccctc atacgatgta gttgataacg tgatccccta catcggtgga 600 gaagaaccaa aactcgagat tgagccgcag aaaatgctgg gacgtctgga aggagaaacg 660 attgttccag caggcttcac gacttccgca cactgcaatc gggtccctgt gctcgaaggc 720 cacctggttt gtctctcgat cgagcttgaa cggaaagccg accctgccga gatcgcgacg 780 gtgctcagca atttccgtgc actccctcag gaattgcggc tgccgactgc gccagagcag 840 cctatcattg tacgtcacga acccgaccgt cctcaaccgc gccgcgaccg tgatgctgga 900 cggggaatgg ccaccgtagt aggtcgcatt cggccctgca gcctttttga cattaagttg 960 atcgcattgt cacataacac catccggggc gccgccggag cgagcatcct gaacgccgag 1020 cttatgcatg cccaaggttg gctggcg 1047 <210> 28 <211> 349 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from C. aurantiacus <400> 28 Met Ala Thr Ile Pro Val Ala Val Leu Gly Ala Thr Gly Ala Val Gly 1 5 10 15 Gln Arg Phe Ile Gln Leu Leu Glu Gly His Pro Leu Phe Gln Val Val 20 25 30 Ala Leu Thr Gly Ser Glu Arg Ser Ala Gly Lys Lys Tyr His Glu Val 35 40 45 Cys Arg Trp Val Leu Asp Thr Pro Met Pro Ala Ala Val Ala Asn Leu 50 55 60 Thr Val Leu Asp Ala Asp Ala Asp Leu Pro Ala Gln 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ccccggctct cagcgcatgg ttgaaattcg aaccgtacga ggtaatcgct 540 tcaacttatc aggctatctc gggagctggt aagaacttcg acgactggcc ggagatgaag 600 ggaaacatca tcccttttat ttctggcgag gaggaaaaat cagagaagga gcccctcaag 660 atctggggac aacttgacga agctaaggga gagatcgtcc cagccactag ccctgttatt 720 acgagccaat gtattcgggt cccgatcctt tacggacaca ccgcgaccgt ctttgttaaa 780 ttcaagcaga acccaacgaa agaggaactg gtagctgctt tggaatcata tcagggactg 840 cctcaatcct tgaatttgcc gtctacccct aagcaattta ttcagtatct cagcgaagac 900 gaccgtccgc aggttgcgaa ggacgttaac tttgagaatg gtatgggtat ctctattggc 960 cgccttcgta aagattcggt ttacgattgg aagttcgtag gactctcgca caacaccgcg 1020 cgtggcgccg caggaggcgg cgtcctttcg gccgaattgc tgacggctca gggctatatt 1080 accaaaaag 1089 <210> 30 <211> 363 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from L. agilis <400> 30 Met Asp Glu Lys Leu Arg Ala Gly Val Leu Gly Ala Thr Gly Met Val 1 5 10 15 Gly Gln Arg Phe Val Ala Met Leu Glu Asn His Pro Trp Phe Glu Val 20 25 30 Thr Thr Leu Ala Ala Ser Pro Arg Ser 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300 gagcgctacg ccaagacgga gactcccgtt gtatcaaaca actcggccca ccgttggacg 360 ccagacgtac ccatggtagt ccccgagatt aatcccgaac attatgaagt aatcaagtac 420 cagcgggctc gtcttggtac tacgcgtggc ttcatcgccg tgaaaccaaa ctgctccatc 480 caggcatata cgccggcact cgccgcgtgg cgggagttcg aaccgcgtga agtcgtggta 540 tctacttacc aagcgatttc tggtgctggt aagactttcg cggactggcc agaaatggaa 600 ggcaatatca tccctttcat tagcggtgaa gaggagaagt ccgagcggga accactgcgg 660 gtatttggcc acgtcgatga gagcaagggt cagattgtcc cctttgatgg tccactccgt 720 atcacgtcgc agtgtatccg tgtacccgta ttgaatggtc acactgctac tgtttttatc 780 aacttcggca aaaaaccatc taaggatgaa ctcatcgacc gtcttgtgaa ctacacgtcg 840 gaggcgagcc gtcttggtct ccctcacgct cccaaacagt tcatccaata tctgactgag 900 gatgatcgtc cgcaggtacg tttggacgtt gattacgagg gcggtatggg agtttccatc 960 ggtcgcctgc gcgaggacac gctcttcgac ttcaaattcg tgggactcgc tcataacacg 1020 ctgcgtggag ccgcaggtgg agcacttgaa tccgcagaaa tgttgaaagc actcggatat 1080 atttcggcga aa 1092 <210> 32 <211> 364 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from B. pullorum <400> 32 Met Ser Glu Lys Leu Lys Val Gly Ile Ile Gly Ala Thr Gly Met Val 1 5 10 15 Gly Gln Arg Phe Val Thr Leu Leu Asp Asn His Pro Trp Phe Glu Val 20 25 30 Thr Thr Leu Ala Ala Ser Ala His Ser Ala Gly Lys Thr Tyr Glu Gln 35 40 45 Ala Val Gly Gly Arg Trp Lys Met Glu Thr Pro Met Pro Ala Ala Val 50 55 60 Lys Asp Met Ile Val Arg Asp Ala Lys Asp Val Glu Ser Val Ala Ala 65 70 75 80 Asp Val Asp Phe Val Phe Ser Ala Val Asn Met Pro Lys Asp Glu Ile 85 90 95 Arg Ala Leu Glu Glu Arg Tyr Ala Lys Thr Glu Thr Pro Val Val Ser 100 105 110 Asn Asn Ser Ala His Arg Trp Thr Pro Asp Val Pro Met Val Val Pro 115 120 125 Glu Ile Asn Pro Glu His Tyr Glu Val Ile Lys Tyr Gln Arg Ala Arg 130 135 140 Leu Gly Thr Thr Arg Gly Phe Ile Ala Val Lys Pro Asn Cys Ser Ile 145 150 155 160 Gln Ala Tyr Thr Pro Ala Leu Ala Ala Trp Arg Glu Phe Glu Pro Arg 165 170 175 Glu Val Val Val Ser Thr Tyr Gln Ala Ile Ser Gly Ala Gly Lys Thr 180 185 190 Phe Ala Asp Trp Pro Glu Met Glu Gly Asn Ile 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attacggctc tcggagcatc cgaacgttcc 120 gcgggaaaat cctacgctga agcagttaat tggattgaag ccgttgagtt gcctgacgca 180 attgcctcta tgacggtcac tgattgctct cccgcaagca tgaaaggcgt tgatttcgtg 240 ttttctggtt tggacgcgtc tgtagcgacc gaacttgagg gcgatctcgc tcgggctggt 300 attcccgtga tctcaaatgc taagaactat cgcactcacc cgcatgtccc ccttctggta 360 ccagaggtga acgcgaccca caccgagatg attaaggcac aagattttga tccttccggc 420 cgtggcttta tcgtaacgaa tccaaattgt gtcgcggttc ctctcgtgat ggcgctcaag 480 cctctcatgg acgcgtacgg tatccaggca gtcgccctca cgactatgca atcggtgtct 540 ggtgctggtt accccggagt cgcctctttg gacatcctgg gaaatgtgat cccatttatt 600 tccggcgagg agccgaaaat cgccgcggag cctatgaaat tgttgggccg gctgggagga 660 gaccaaaccg tcaccgaggc ccgtttccct attgacgcta ccgcaactcg tgtgcctacc 720 atcgagggac atcttttgag cgtgaagatt aagttcgaac aaaagccagc gtctgctgac 780 gaaattaagg ctgtgctccg taactggaag cacgaggttt caggtttgga tcttccgtct 840 tctccgcgta ctgcgctcaa agtttacgat gacgatcggt ttccacaacc acgcaaaaac 900 gcttacaacg agaacggaat gcaagtcggc gtgggtcgtg tgcgtatgct cgagtttttt 960 gacgcgggtc ttgttgcatt gggccataat acgtgtcggg gtgcggctgg cgtagctatc 1020 ttgaacgctg agctgctggt aaaacagggt ttcatccaa 1059 <210> 34 <211> 353 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from B. bacterium <400> 34 Met Lys Gln Phe Asn Val Gly Ile Leu Gly Ala Thr Gly Ala Val Gly 1 5 10 15 Gln Lys Phe Ile Asn Leu Leu Gln Gly His Pro Trp Phe Thr Ile Thr 20 25 30 Ala Leu Gly Ala Ser Glu Arg Ser Ala Gly Lys Ser Tyr Ala Glu Ala 35 40 45 Val Asn Trp Ile Glu Ala Val Glu Leu Pro Asp Ala Ile Ala Ser Met 50 55 60 Thr Val Thr Asp Cys Ser Pro Ala Ser Met Lys Gly Val Asp Phe Val 65 70 75 80 Phe Ser Gly Leu Asp Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Glu Gly Asp Leu 85 90 95 Ala Arg Ala Gly Ile Pro Val Ile Ser Asn Ala Lys Asn Tyr Arg Thr 100 105 110 His Pro His Val Pro Leu Leu Val Pro Glu Val Asn Ala Thr His Thr 115 120 125 Glu Met Ile Lys Ala Gln Asp Phe Asp Pro Ser Gly Arg Gly Phe Ile 130 135 140 Val Thr Asn Pro Asn Cys Val Ala Val Pro Leu Val Met Ala Leu Lys 145 150 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codon optimized asd from M. hansupus <400> 35 atggctcgtt tgcgtgctgc gttgatcggc gcgacgggac tcgccggtca acagttcatt 60 gcggccctca aagaccaccc ttttattgaa ttgactggac tggcagcgtc gccacggtcg 120 gcgggcaaaa cgtacgctga agccctcaag actgcatcag gtatgactgc atggttcgta 180 ccagaacccc tgccagccgg cattgctggt atgaaagttg ttgcgggaga cgccctcgag 240 gcgaaagatt atgaccttgt tttctctgct gtagaagcgg acgtagcccg cgagcttgag 300 ccaaaactgg cgaaagacat tccagtattt tcggctgcta gcgcgttccg ctacgaagat 360 gacgtaccac tgcttatccc ccccgttaac gccgcacacg cgcctctgat tcgtgaacag 420 cagcgtcgtc gtggttggaa aggttatgtt gttccaatcc caaattgcac gaccaccggc 480 cttgcggtta cgctcgcgcc tcttgtcgag cggtttggag tcaaggctgt cttgatgacc 540 tcacttcaag caatgagcgg agcgggacgg tctcctggcg tgatcggcat ggacattctt 600 gataacgtga ttccgtatat ccccaaagag gaacataaag tagaagtgga gactaagaaa 660 attcttggtg ctcttcgtcc tggtggcgaa ggccttacgc cccacgatat ccgcgtctca 720 tgcacctgca ctcgggtcgc ggtcatggaa ggccatactg aatcagtttt tgtttctctg 780 gaaaaaaaag ctactgttgc agaggttacc caagcgttgc gtgaatggca gggcgcggaa 840 cttgcacgga aattgccgtc cgccgcaccg cgttggattg aagtgcttga tgaccccttc 900 cgcccacaac cgcgtcttga ccgggacacg cacggtggaa tggctaccac ggtgggtcgg 960 attcgtgagg acggtgtttt ggagaacgga tttaagtacg ttttggtttc tcacaacact 1020 aaaatgggag ctgctcgcgg cgcgattttg gtagcagaac tgcttcgggc tcaaggcttg 1080 cttgga 1086 <210> 36 <211> 362 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from M. hansupus <400> 36 Met Ala Arg Leu Arg Ala Ala Leu Ile Gly Ala Thr Gly Leu Ala Gly 1 5 10 15 Gln Gln Phe Ile Ala Ala Leu Lys Asp His Pro Phe Ile Glu Leu Thr 20 25 30 Gly Leu Ala Ala Ser Pro Arg Ser Ala Gly Lys Thr Tyr Ala Glu Ala 35 40 45 Leu Lys Thr Ala Ser Gly Met Thr Ala Trp Phe Val Pro Glu Pro Leu 50 55 60 Pro Ala Gly Ile Ala Gly Met Lys Val Val Ala Gly Asp Ala Leu Glu 65 70 75 80 Ala Lys Asp Tyr Asp Leu Val Phe Ser Ala Val Glu Ala Asp Val Ala 85 90 95 Arg Glu Leu Glu Pro Lys Leu Ala Lys Asp Ile Pro Val Phe Ser Ala 100 105 110 Ala Ser Ala Phe Arg Tyr Glu Asp Asp Val Pro Leu 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gaggaaaaaa gcgaacaaga gccgcttcgc 660 atttggggta ctgtagagga tggccaaatt gttaaagcct ccgcacccca tattacgacg 720 caatgcatcc gggtaccagt gactgacggt cacctggcca ctgttttcgt tagcttcgag 780 aataaaccct caaaggaaga cattctcgaa tcctggaaaa attacaaggg tcggccgcaa 840 gagcttgaac ttccgtcagc acccaaacaa ttcatcactt acttcgaaga ggaaaatcgg 900 ccacagacca acctcgaccg cgacatcgaa aatggaatgg gcatttccgc tggccgcctc 960 cgggaggata gcctttatga ctttaaattc gttggactct cacataacac tctgcgcgga 1020 gctgctggtg gtgcggtact gatcgcagag ttgctcaagg cagagggcta cattactaag 1080 cgc 1083 <210> 38 <211> 361 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from P. sabinae <400> 38 Met Thr Glu Lys Leu Arg Ala Gly Ile Val Gly Gly Thr Gly Met Val 1 5 10 15 Gly Gln Arg Phe Ile Ala Leu Leu Glu Asn His Pro Trp Phe Gln Val 20 25 30 Thr Ala Ile Ala Ala Ser Ala Asn Ser Ala Gly Lys Thr Tyr Glu Glu 35 40 45 Ser Val Lys Gly Arg Trp Lys Leu Ser Thr Pro Met Pro Glu Ser Val 50 55 60 Lys His Ile Pro Val Gln Asp Ala Ser Arg Val Glu Glu Val 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aggtcttgta aagcttcatg tctcctcgta tcaagcggta 480 tccggtagcg gtctcgcagg cgtcgaaacc ctcgcaaaac aggtcgctgc tgttggtgac 540 cataacgtcg agttcgtcca cgacggtcag gccgccgacg caggagatgt tggcccatac 600 gtcagcccca tcgcttataa tgttttgccc ttcgcaggta acctggttga cgacggaacc 660 tttgagaccg acgaggagca aaaactgcgc aatgaaagcc gtaagatcct cggactgccg 720 gacttgaaag tttccggtac gtgtgtacgt gttcccgtgt ttactggaca taccttgact 780 atccatgctg agttcgataa agcaattacc gtggaccaag ctcaggagat cctcggagca 840 gcgtcgggag taaagttggt agacgtaccg actcctctgg cggctgcggg tattgatgag 900 tcgcttgtag gacgcattcg ccaagactcg acggtggatg acaaccgcgg actcgttctc 960 gtggtatctg gcgacaatct tcggaagggc gcggctttga ataccatcca gatcgccgag 1020 cttctggtaa ag 1032 <210> 40 <211> 344 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized asd from C. glutamicum <400> 40 Met Thr Thr Ile Ala Val Val Gly Ala Thr Gly Gln Val Gly Gln Val 1 5 10 15 Met Arg Thr Leu Leu Glu Glu Arg Asn Phe Pro Ala Asp Thr Val Arg 20 25 30 Phe Phe Ala Ser Pro Arg Ser Ala Gly Arg 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aaagggcggt tcggattttg accctaaagg caagagcgat 420 ctcgaaatca tgcggttttg tcagtctttt atgaccgaac tgcatcgtca catcggcgaa 480 tatcgcgatg tcccggcggg tgatatcggc gtgggtggtc gtgagatcgg atacctcttt 540 ggtcattatc gtcggatggc gaatcagcac gaatcgggag tccttaccgg caaaggtctg 600 acttggggcg gcagcctggt tcggaccgaa gccacgggat acggttgtgt ctatttcgta 660 tcggagatga tcaaagcaaa aggcgagtca atctcgggac agaagattat cgtatccgga 720 tcgggaaatg ttgctaccta tgccattgag aaagctcaag agctgggcgc gacggtgatc 780 ggcttctcgg attcctcagg ctgggtgcat actccgaatg gtgtggacgt ggctaaactt 840 cgcgaaatca aggaagtacg tcgcgcacgc gtaagcgttt atgccgatga agtggaggga 900 gcaacctacc ataccgatgg atccatctgg gatcttaagt gtgacatcgc acttccttgc 960 gctacgcaaa atgaactgaa cggagagaat gcgaaaacgc tggccgataa tggttgccgc 1020 ttcgtcgcgg agggcgctaa catgccgagc accccggagg ccgtcgaagt ttttcgggag 1080 cgcgacatcc ggttcggccc cggcaaagcg gctaatgctg gcggagtggc aacgtcagcg 1140 ttggagatgc agcagaacgc atcccgggac tcatggagct tcgaatacac cgacgaacgc 1200 ctccaggtca ttatgaagaa catttttaag acgtgtgcgg aaaccgcagc cgagtatggc 1260 cacgagaacg attacgtcgt cggagcaaac attgcaggat ttaagaaagt tgctgatgcg 1320 atgctcgccc aaggtgtgat c 1341 <210> 42 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized gdh from C. glutamicum <400> 42 Met Thr Val Asp Glu Gln Val Ser Asn Tyr Tyr Asp Met Leu Leu Lys 1 5 10 15 Arg Asn Ala Gly Glu Pro Glu Phe His Gln Ala Val Ala Glu Val Leu 20 25 30 Glu Ser Leu Lys Ile Val Leu Glu Lys Asp Pro His Tyr Ala Asp Tyr 35 40 45 Gly Leu Ile Gln Arg Leu Cys Glu Pro Glu Arg Gln Leu Ile Phe Arg 50 55 60 Val Pro Trp Val Asp Asp Gln Gly Gln Val His Val Asn Arg Gly Phe 65 70 75 80 Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala Leu Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg 85 90 95 Phe His Pro Ser Val Asn Leu Gly Ile Val Lys Phe Leu Gly Phe Glu 100 105 110 Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Gly Leu Pro Ile Gly Gly Gly Lys 115 120 125 Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Leu Glu Ile Met 130 135 140 Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu His Arg His Ile Gly Glu 145 150 155 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tctgccaggc gttcatgact gagttgtatc ggcatattgg tcccgatatc 480 gacgtgcctg ctggtgactt gggcgttggt gcgcgtgaaa ttggttacat gtacggacaa 540 taccggaaga tcgtcggcgg attctacaat ggcgtcctga ccggtaaagc ccggtcattc 600 ggtggaagct tggtccggcc cgaagcaact ggttacggat cggtgtatta tgtggaggct 660 gtgatgaaac atgaaaatga cacgcttgta ggtaaaactg ttgcactggc aggttttggt 720 aacgttgcat ggggtgcagc taagaagctc gcggagttgg gtgcgaaagc agtaactttg 780 tctggcccgg atggctatat ctacgacccc gagggtatca ctaccgagga aaagatcaat 840 tacatgcttg aaatgcgggc gtctggacgt aacaaggtac aggattacgc agacaagttt 900 ggagtgcaat tctttccggg tgaaaagcct tggggccaaa aagttgacat tattatgcct 960 tgtgcaactc agaatgatgt tgacctggaa caggctaaaa agatcgtggc gaacaacgtg 1020 aagtactaca tcgaagtagc caacatgcct actactaatg aagcattgcg gtttcttatg 1080 cagcaaccta acatggtagt cgcccccagc aaggctgtga acgcaggtgg agtactggta 1140 tcgggtttcg agatgtcaca aaattccgaa cgtctgtcat ggaccgccga agaagtcgat 1200 agcaaactgc atcaggtgat gactgacatt catgacggtt cagccgccgc agctgaacgc 1260 tacggacttg gttacaatct tgtcgcaggt gctaatatcg taggttttca gaagatcgcc 1320 gatgccatga tggctcaagg aatcgcttgg 1350 <210> 44 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized gdh from C. symbiosum <400> 44 Met Ser Lys Tyr Val Asp Arg Val Ile Ala Glu Val Glu Lys Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Glu Pro Glu Phe Val Gln Thr Val Glu Glu Val Leu Ser Ser 20 25 30 Leu Gly Pro Val Val Asp Ala His Pro Glu Tyr Glu Glu Val Ala Leu 35 40 45 Leu Glu Arg Met Val Ile Pro Glu Arg Val Ile Glu Phe Arg Val Pro 50 55 60 Trp Glu Asp Asp Asn Gly Lys Val His Val Asn Thr Gly Tyr Arg Val 65 70 75 80 Gln Phe Asn Gly Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe Ala 85 90 95 Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Met Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ala 100 105 110 Phe Lys Asp Ser Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Ala Lys Gly Gly 115 120 125 Ser Asp Phe Asp Pro Asn Gly Lys Ser Asp Arg Glu Val Met Arg Phe 130 135 140 Cys Gln Ala Phe Met Thr Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Pro Asp Ile 145 150 155 160 Asp Val Pro Ala Gly Asp Leu Gly Val Gly Ala Arg 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gccacgtggg ccggtgtagt tgttgaggga gaacgtatcg 9360 ccaggtgaaa cgactgcgcc gtcgaccatt tgcgcggtga ggcggatgtt tgttccggag 9420 gcagcagaga agccgccggt ggtgaactcg cccatgacct cattgaaggt agcgttttgg 9480 gcgtcggtgg cggtgaatgt tgctggggtg tcctcataga cagcgtcgat ggtgcggggg 9540 ccatcgccgg tgaggttgtt gggcagatcg gccagggttt cttcccagtt gattccgtgt 9600 ccggtgactt ctggggtgac tacgcgggag cctgaggaga aactgatttg agcgttggtg 9660 ggctcgatct ctgtttcttt gaggccttcg gccagcattg ctgtggctgc ttctgcattg 9720 atgtcgacgc ggatggtgcc gttttcttct gggaaactca ccacttcacc catgcgctcg 9780 acggggatgg tgccttcaat tccgtcatcg cctcggacga cgaaggggct agatacggct 9840 ttagctccgg cgccttctgc aagttcatcg atggtgtctt ggctgatcgc agcgggaaca 9900 acgtatggct cggcttctac gccctctggg ttgagccagt tttctgtgac tgcttgttcc 9960 aaaacggtgc gg 9972 <210> 52 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence <400> 52 tgccgtttct cgcgttgtgt gtggtactac gtggggacct aagcgtgtat tatggaaacg 60 tctgtatcgg ataagtagcg aggagtgttc gttaaaa 97 <210> 53 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence <400> 53 tagagtttta aaggagtagt tttaca 26 <210> 54 <211> 173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence <400> 54 taggcatttt tagtacgtgc aataaccact ctggtttttc cagggtggtt ttttgatgcc 60 ctttttggag tcttcaactg cttagctttg acctgcacaa atagttgcaa attgtcccac 120 atacacataa agtagcttgc gtatttaaaa ttatgaacct aaggggttta gca 173 <210> 55 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence <400> 55 taggcttttc gacgtctcct ccggcgaaac ccaaaaaagg aaccctcaca gttcgtgagg 60 gttcctttta ctattgtcta 80 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence <400> 56 tgtaaaacta ctcctttaaa actcta 26 <210> 57 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter Sequence <400> 57 ttttaacgaa cactcctcgc tacttatccg atacagacgt ttccataata cacgcttagg 60 tccccacgta gtaccacaca caacgcgaga aacggca 97 <210> 58 <211> 334 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 58 Met 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Phe Gly Asp Asp Pro Thr 1 5 10 15 Val Asn Arg Leu Gln Ala Arg Ala Ala Glu Val Leu Gly Phe Glu Ala 20 25 30 Ala Leu Ile Phe Pro Ser Gly Thr Gln Ser Asn Leu Ala Ala Leu Met 35 40 45 Thr His Cys Gln Arg Gly Asp Glu Met Ile Val Gly Gln Glu Ala His 50 55 60 Thr Tyr Val His Glu Ala Gly Gly Thr Ser Val Leu Gly Ala Ile His 65 70 75 80 Pro His Val Val Pro Asn Leu Pro Asp Gly Thr Leu Asp Leu Ser Asp 85 90 95 Val Glu Ala Ala Ile Lys Pro Asp Asp Pro His Tyr Pro Arg Thr Arg 100 105 110 Leu Leu Ala Leu Glu Asn Thr Ile Gly Gly Arg Ala Val Pro Arg Ala 115 120 125 Tyr Leu Glu Arg Ala Val Gly Leu Ala Arg Arg Arg Arg Leu Ala Thr 130 135 140 His Leu Asp Gly Ala Arg Ile Phe Asn Ala Ala Val Ala Leu Asn Thr 145 150 155 160 Asp Val Arg Asn Leu Cys Ala Gly Phe Asp Ser Val Ser Val Cys Leu 165 170 175 Ser Lys Gly Leu Gly Ala Pro Val Gly Thr Leu Leu Leu Gly Ser Ala 180 185 190 Asp Phe Ile Ala Arg Ala Thr Arg Val Arg Lys Ile Leu Gly Gly Gly 195 200 205 Met Arg Gln Val Gly Val Leu Ala Ala Ala Gly Leu Tyr Ala Leu 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species from environmental sample <400> 228 Met Ser Ala Pro Val Asp Leu Arg Ser Asp Thr Val Thr Arg Pro Ser 1 5 10 15 Pro Gly Met Arg Lys Ala Met Leu Glu Ala Glu Leu Gly Asp Asp Val 20 25 30 Phe Gly Asp Asp Pro Thr Val Asn Arg Leu Gln Ala Arg Ala Ala Glu 35 40 45 Ile Phe Gly Phe Glu Ala Ala Leu Leu Phe Pro Ser Gly Thr Gln Ser 50 55 60 Asn Leu Ala Ala Leu Met Ser His Cys Gln Arg Gly Asp Glu Val Ile 65 70 75 80 Leu Gly Met Glu Ala His Ser Tyr Arg Tyr Glu Ala Gly Gly Leu Ser 85 90 95 Val Leu Gly Ser Ile Gln Pro Gln Ala Ile Pro Asn Arg Pro Asp Gly 100 105 110 Thr Leu Asp Leu Ala Glu Val Glu Ala Ala Ile Lys Pro Asp Asp Pro 115 120 125 His Phe Ala Arg Ser Arg Leu Leu Ala Leu Glu Asn Thr Ile Thr Gly 130 135 140 Arg Val Leu Lys Arg Glu Tyr Leu Gly Lys Ala Val Glu Leu Ala Arg 145 150 155 160 Arg Lys Asn Leu Ser Ile His Leu Asp Gly Ala Arg Val Phe Asn Ala 165 170 175 Ala Thr Ala Leu Thr Met Lys Val Lys Glu Leu Cys Ala Gly Phe Asp 180 185 190 Ser Val Ser Ser Cys Leu Ser Lys Gly Leu Gly Ala Pro 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cgaaaatccc gaccttgccc gggcgtgtga agacgccggc 300 ataaccttca tcggtccgcc tgccaaagtg ctggagcttg ccgggaacaa ggtccacgcc 360 atcgaggcag ccaaggccgc aggcgtgcca accctcacct caacgccacc gtcggccaac 420 atcgaggagc tgatggcaag tgccgaaagc atcggctttc cggcgttcgt taaggcggtt 480 gccggtggcg gtggccgcgg catgcggcgg atcgcggacc gcgatcagct cagagaatcg 540 ctatctgccg cgatgcgcga ggccgaaggc gcgttcggcg acccgacggc atacatcgag 600 caggcggtag gccggccgcg gcacatcgag gtgcaggtac tcgctgacag tcagggcgac 660 accatccatc tgttcgagcg cgactgttcg gtgcagcgac ggcaccaaaa gatcattgag 720 attgcaccgg ctccgcacat ctcgactgag ttgcgcgagg cgttgtgtcg tgatgcggtg 780 cggttcgctg aatcgatcga ttactcctgc gccggcactg tcgagtttct ggttgagacc 840 gagggtgagc gggccggtca gcacgtcttc atcgagatga atcctcgaat ccaggtggag 900 cacaccatta ctgaggagat caccgatgtt gatcttgtgc aggcccagat gcggattgct 960 gcaggggaaa gccttactga tcttggtctg tcacaggaag cgattcggat caacggggcc 1020 gcgctgcaat gccgaatcac caccgaggat cctgcgaacg atttccggcc cgatacgggc 1080 accattaccg cctatcgttc cgcgggcggt 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gagcagatgc ggccagcgat cgaggcggta 1980 cgagagaccg gcagcaccat cgccgaggta gccctgtgct acaccggcga cctcaactca 2040 ccggccgagg acctgtacac cctggactac tacctgcgac tggccgagaa gatggtcaag 2100 gccggtgctc acatcatcgg gatcaaggac atggctgggc tgctccggcc gcctgcggct 2160 cggaagttgg tcaccgcact acggcagaac ttcgacctcc cggtgcatct gcacacccac 2220 gacaccgccg gtggtcagct ggcgacactg ctcgccgcca tcgaggttgg agtcgatgca 2280 gtcgatgtgg ccagcgcccc gatggccgga accaccagtc aggtgcccgc ttcagcactg 2340 gtcgcggcct gcgcgaatac tgagcggccc accaaccttg acctgcgaga cgtgatggag 2400 cttgagccgt actgggaggc ggttcggaag gtgtatgcgc cgttcgagtc aggactgccg 2460 agcccaaccg gccgggtcta tgaccacgag atccccggtg gccagctctc caatctccgg 2520 cagcaggcaa ttgctctggg actgggggag aagtttgagc aaattgaggc tatgtatacc 2580 gccgcgagcc gcatcttggg taggccgccc aaggtcacac cgtcctcgaa agtcgttggt 2640 gatcttgctt tacacctagt tgcggttgga gccgatccgg acgacttcgc ccagaaccct 2700 cacaagtacg acatcccgga ttcagtgatc ggtttcctca acggtgagct aggtgatccg 2760 cccggcggct ggccggagcc gttccgcacc 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Ala Val Phe 20 25 30 Ala Tyr Glu Asp Arg Asn Ala Val His Arg Ile Lys Ala Asp Glu Ala 35 40 45 Tyr Leu Ile Gly Glu Arg Gly His Pro Val Arg Ala Tyr Leu Asp Ile 50 55 60 Asn Glu Ile Met Arg Ala Ala Lys Gln Ser Glu Ala Asp Ala Ile Tyr 65 70 75 80 Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Pro Asp Leu Ala Arg Ala Cys 85 90 95 Glu Asp Ala Gly Ile Thr Phe Ile Gly Pro Pro Ala Lys Val Leu Glu 100 105 110 Leu Ala Gly Asn Lys Val His Ala Ile Glu Ala Ala Lys Ala Ala Gly 115 120 125 Val Pro Thr Leu Thr Ser Thr Pro Pro Ser Ala Asn Ile Glu Glu Leu 130 135 140 Met Ala Ser Ala Glu Ser Ile Gly Phe Pro Ala Phe Val Lys Ala Val 145 150 155 160 Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg Arg Ile Ala Asp Arg Asp Gln 165 170 175 Leu Arg Glu Ser Leu Ser Ala Ala Met Arg Glu Ala Glu Gly Ala Phe 180 185 190 Gly Asp Pro Thr Ala Tyr Ile Glu Gln Ala Val Gly Arg Pro Arg His 195 200 205 Ile Glu Val Gln Val Leu Ala Asp Ser Gln Gly Asp Thr Ile His Leu 210 215 220 Phe Glu Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His Gln Lys Ile Ile Glu 225 230 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Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial ribosome binding site <400> 306 agctggtgga atat 14 <210> 307 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial ribosome binding site <400> 307 aggaggttgt 10 <210> 308 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial ribosome binding site <400> 308 tgacacctat tg 12

Claims (76)

  1. NADPH를 사용하여 생산된 화합물을 생산하는 미생물 세포의 능력을 향상시키는 방법으로서, 세포의 이용 가능한 NADPH를 변경하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    이용 가능한 NADPH는 세포에서 변형된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH)를 발현시킴으로써 변경되며, 변형된 GAPDH는 이의 조효소 특이성이 확장되도록 변형되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    세포의 이용 가능한 NADPH는 미생물 세포에서 효소 글루타메이트 탈수소 효소(gdh), 아스파르테이트 세미알데하이드 탈수소 효소(asd), 다이하이드로피콜리네이트 환원 효소(dapB) 및 메소-다이아미노피멜레이트 탈수소 효소(ddh)의 하나 이상의 변이체 효소를 발현시킴으로써 변경되며, 변이체 효소는 조효소 NADH 및 NADPH에 대해 이중 특이성을 나타내는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 상응하는 자연 발생 GAPDH에 비해 조효소 NADP에 대해 증가된 특이성을 갖는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 세포는 박테리아 세포인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    박테리아 세포는 코리네박테리움 종, 에스케리키아 종, 바실러스 종 또는 게오바실루스 종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 박테리아로부터인 방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    박테리아는 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 대장균인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 세포는 효모 세포인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    효모 세포는 사카로마이세스 종으로부터의 세포인 방법.
  10. 제 4 항에 있어서,
    자연 발생 GAPDH는 gapA인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    gapA는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 갖는 방법.
  12. 제 2 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  13. 제 2 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 36 및 37에 해당하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치의 트레오닌은 리신으로 치환되는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 58의 아미노산 36에 해당하는 위치의 류신은 트레오닌으로 치환되고, SEQ ID NO: 58의 아미노산 37에 해당하는 위치의 트레오닌은 리신에 의해 치환되는 방법.
  18. 제 2 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 아미노산 192에 해당하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 방법.
  19. 제 2 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 58의 아미노산 172에 해당하는 위치의 프롤린은 세린으로 치환되는 방법.
  20. 제 2 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 58의 아미노산 224에 해당하는 위치의 류신은 세린으로 치환되는 방법.
  21. 제 2 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 58의 아미노산 110에 해당하는 위치의 히스티딘은 아스파르트산으로 치환되는 방법.
  22. 제 135 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 58의 아미노산 140에 해당하는 위치의 티로신은 글리신으로 치환되는 방법.
  23. 제 13 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 69, 71, 73, 303, 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물은 표 2로부터 선택되는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    화합물은 L-리신 또는 L-트레오닌인 방법.
  26. 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 확장된 조효소 특이성을 갖는 변형된 GAPDH를 포함하는 미생물 세포로서, 미생물 세포는 변형된 GAPDH가 결여된 상대 미생물 세포에 비해 NADPH를 사용하여 생산된 화합물의 생산을 개선시키는 미생물 세포.
  27. 제 26 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 자연적으로 존재하는 GAPDH에 비해 NADP에 대한 증가된 특이성을 갖는 미생물 세포.
  28. 제 27 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 미생물 세포.
  29. 제 27 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 미생물 세포.
  30. 제 27 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 58의 위치 36, 37 또는 둘 다의 아미노산에 대한 치환을 포함하는 미생물 세포.
  31. 제 27 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 SEQ ID NO: 69, 71, 73, 303, 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 미생물 세포.
  32. 제 26 항에 있어서,
    화합물은 표 2로부터 선택되는 미생물 세포.
  33. 제 32 항에 있어서,
    화합물은 L-리신 또는 L-트레오닌인 미생물 세포.
  34. 제 26 항에 있어서,
    미생물 세포는 박테리아로부터인 미생물 세포.
  35. 제 34 항에 있어서,
    박테리아는 코리네박테리움 종, 에스케리키아 종, 바실러스 종 또는 게오바실루스 종인 미생물 세포.
  36. 제 35 항에 있어서,
    박테리아는 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 대장균인 미생물 세포.
  37. 제 33 항에 있어서,
    미생물 세포는 효모 세포인 미생물 세포.
  38. GAPDH를 변형시켜 변형된 GAPDH가 조효소 NADP 및 NAD에 대해 이중 특이성을 갖게 하는 단계를 포함하여 GAPDH의 조효소 특이성을 확장시키는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 NAD에 비해 조효소 NADP에 대한 증가된 특이성을 갖는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    변형된 GAPDH는 NAD보다 NADP를 더 효과적으로 사용하는 방법.
  41. 제 3 항에 있어서,
    상기 방법은 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 변이체 효소는 SEQ ID NO: 42 또는 44의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  42. 제 3 항에 있어서,
    상기 방법은 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 변이체 효소는 SEQ ID NO: 30 또는 40의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  43. 제 3 항에 있어서,
    상기 방법은 dapB의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 변이체 효소는 SEQ ID NO: 46 또는 48의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  44. 제 3 항에 있어서,
    상기 방법은 ddh를 발현시키는 단계를 포함하고, ddh 효소는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  45. 제 3 항에 있어서,
    상기 방법은 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 변이체 효소는 SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 및 182로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  46. 제 3 항에 있어서,
    상기 방법은 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, 변이체 효소는 SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  47. 제 3 항에 있어서,
    모든 4개 효소의 변이체는 미생물 세포에서 동시에 발현되는 방법.
  48. 하나 이상의 효소 gdh, asd, dapB 및 ddh의 변이체를 포함하는 미생물 세포로서, 여기서 변이체는 조효소 NADH 및 NADPH에 대한 이중 특이성을 나타내는 미생물 세포.
  49. 제 45 항에 있어서,
    gdh의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 144, 150, 162, 166, 170, 174, 178로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  50. 제 46 항에 있어서,
    asd의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 108 및 118로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  51. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 세포에서 트레오닌 알돌라제의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 더 포함하는 방법으로서, 트레오닌 알돌라제의 변이체 효소는 대장균 트레오닌 알돌라제(ltaE)와 상이한 기질 선호도 또는 효소 동역학을 나타내는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서,
    변이체 트레오닌 알돌라제는 글리신 생산보다 트레오닌 생산에 유리한 방법.
  53. 제 51 항에 있어서,
    변이체 트레오닌 알돌라제는 SEQ ID NO: 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 및 232로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서,
    변이체 트레오닌 알돌라제는 SEQ ID NO: 196, 206, 220, 224 및 232로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  55. 제 51 항에 있어서,
    화합물은 L-트레오닌인 방법.
  56. 제 7 항에 있어서,
    박테리아는 대장균이고 상기 방법은 대장균 세포에서 pyc를 발현시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  57. 제 56 항에 있어서,
    상기 방법은 pyc의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하고, pyc의 변이체 효소는 SEQ ID NO: 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 및 289로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  58. 각각 하나 이상의 합성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 thrA 유전자, thrB 유전자 및 thrC 유전자를 포함하는 다중-카피 복제 플라스미드를 포함하는 미생물 세포.
  59. 제 58 항에 있어서,
    미생물 세포는 tdh 결실(Δtdh) 세포인 미생물 세포.
  60. 제 58 항에 있어서,
    다중-카피 복제 플라스미드는 SEQ ID NO: 77의 thrABC 오페론 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 미생물 세포.
  61. 다음 단계 중 둘 이상을 포함하여 미생물 세포에 의해 화합물의 생산 효율을 개선시키는 방법: (1) 내인성 해당 효소 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 조효소 특이성을 확장시킴으로써 NADPH를 생산하는 해당 경로를 조작하여 효소가 NADP 및 NAD에 대한 이중 특이성을 갖게 하는 단계; (2) NADH로부터 NADPH를 생성하는 박테리아에서 수소전달 효소를 발현시키는 단계; (3) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소의 상동체를 발현시킴으로써 리신 합성을 위한 DAP-경로를 재프로그래밍하는 단계; (4) 보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh 및 asd 효소의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 위한 thrABC-경로를 재프로그래밍하는 단계; (5) 트레오닌의 글리신으로의 분해를 감소시키거나 역전시키는 내인성 L-트레오닌 알돌라제(ltA)의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 재프로그래밍하는 단계; 및 (6) 이종 피루베이트 카복실라제(pyc) 또는 이의 상동체를 발현시켜 옥살로아세테이트의 합성을 증가시키거나 내인성 pyc의 발현을 증가시키는 단계.
  62. 제 61 항에 있어서,
    화합물은 표 2로부터 선택되는 방법.
  63. 제 62 항에 있어서,
    화합물은 L-트레오닌인 방법.
  64. 제 61 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서,
    내인성 해당 효소 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 조효소 특이성을 확장시킴으로써 NADPH를 생산하는 해당 경로를 조작하여 효소가 NADP 및 NAD에 대한 이중 특이성을 갖게 하는 단계는 SEQ ID NO: 294, 296, 233, 234, 235, 236, 298, 및 300으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 gapA의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
  65. 제 61 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서,
    보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh, asd, dapB 및 ddh 효소의 상동체를 발현시킴으로써 리신 합성을 위한 DAP-경로를 재프로그래밍하는 단계는 다음 단계 중 하나 이상을 포함하는 방법:
    i) SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 및 182로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계;
    ii) SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계;
    iii) SEQ ID NO: 46 및 48로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 dapB의 변이체 효소를 발현시키는 단계; 및
    iv) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 ddh의 변이체 효소를 발현시키는 단계.
  66. 제 61 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서,
    보조 인자로서 NADPH보다 NADH를 더 효과적으로 사용하는 내인성 gdh 및 asd 효소의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 위한 thrABC-경로를 재프로그래밍하는 단계는 다음 단계 중 하나 이상을 포함하는 방법:
    i) SEQ ID NO: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 및 182로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 gdh의 변이체 효소를 발현시키는 단계; 및
    ii) SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 asd의 변이체 효소를 발현시키는 단계.
  67. 제 61 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서,
    트레오닌의 글리신으로의 분해를 감소시키거나 역전시키는 내인성 L-트레오닌 알돌라제(ltA)의 상동체를 발현시킴으로써 트레오닌 합성을 재프로그래밍하는 단계는 SEQ ID NO: 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 및 232로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 ltA의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
  68. 제 61 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 피루베이트 카복실라제(pyc) 또는 이의 상동체를 발현시켜 옥살로아세테이트의 합성을 증가시키거나 내인성 pyc의 발현을 증가시키는 단계는 SEQ ID NO: 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 및 289로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 pyc의 변이체 효소를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
  69. 절단된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA) 유전자를 암호화하는 인공 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 290, 291, 292, 및 293으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 인공 폴리뉴클레오타이드.
  70. 제 69 항에 있어서,
    폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 290, 291, 292 및 293으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인공 폴리뉴클레오타이드.
  71. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제 69 항 또는 제 70 항의 인공 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  72. 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소(gapA)의 재조합 단백질 단편으로서, 여기서 재조합 단백질 단편은 SEQ ID NO: 233, 234, 235, 236, 및 298로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 재조합 단백질 단편.
  73. 제 72 항에 있어서,
    재조합 단백질 단편은 SEQ ID NO: 233, 234, 235, 236, 및 298로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질 단편.
  74. 제 72 항 또는 제 73 항에 있어서,
    재조합 단백질 단편은 gapA 활성이 결여되는 재조합 단백질 단편.
  75. 제 74 항에 있어서,
    재조합 단백질 단편은 미생물 세포가 gapA 활성을 갖는 다른 단백질을 포함할 때 미생물 세포에 의해 표 2로부터 선택된 화합물의 생산성을 증가시키는 재조합 단백질 단편.
  76. 제 26 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 세포는 변이체 트레오닌 알돌라제, pyc 단백질 또는 둘 다를 더 포함하는 미생물 세포.
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