KR20180035297A

KR20180035297A - 글루타메이트 측정용 바이오센서 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20180035297A
Application number: KR1020160125177A
Authority: KR
Inventors: 최종일; 전한성; 삼반담 라비쿠마르
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2016-09-29
Filing date: 2016-09-29
Publication date: 2018-04-06
Also published as: KR101898178B1

Abstract

본 발명은 글루타메이트 측정용 바이오센서 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 극지 미생물 플라노코쿠스(Planococcus sp.) 유래 신규 유전자를 이용하여 제조한 바이오센서에 관한 것이다. 본 발명을 통해 개발한 바이오센서는 신규 극지 미생물인 플라노코쿠스에서 유래한 2-인자 신호전달계를 이용하여 숙주세포인 미생물에 도입된 후 글루타메이트의 생산 여부를 효과적으로 확인할 수 있도록 해 주며, 이는 새로운 유전자의 신속한 대량 스크리닝 시에 높은 효율로 활용이 가능하다. 또한, 낮은 농도의 글루타메이트 생산 또한 확인할 수 있으며, 형광 정도에 따라 생산량을 확인하여 생산성 증진을 위한 대사 경로 변경 및 배지 조성 변화 등에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

글루타메이트 측정용 바이오센서 및 그 제조방법{Biosensor for detecting glutamate and preparation method thereof}

본 발명은 글루타메이트 측정용 바이오센서 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 극지 미생물 플라노코쿠스(Planococcus sp.) 유래 신규 유전자를 이용하여 제조한 바이오센서에 관한 것이다.

아미노산은 실생활에서 다양하게 사용되는 물질로, 식품 첨가제, 의약품, 화장품, 사료 보충제 및 농업 화학품 등의 원료가 된다. 이 중 글루타메이트(glutamate)는 맛이 좋고 영양가가 높으며 다양한 의학적 기능을 가지고 있어 가치가 높다. 글루타메이트는 단백질의 분해, 화학적 합성, 효소 합성 또는 발효 과정 등의 방법을 통해 얻을 수 있으며, 최근에는 글루타메이트 대량 생산이 가능한 균주를 발굴하기 위한 연구가 계속되고 있다.

경쟁력 있는 글루타메이트 생산 균주의 예로 유전자 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 또는 재조합 대장균(Escherichia coli) 등이 사용되고 있으나, 생산량 향상을 위한 신규 유전자 확보 및 최적화에 기술적 한계가 있으며, 시행 착오에 따른 시간 소모가 큰 단점이 있다.

이와 같은 시행 착오를 줄이면서 글루타메이트 생산 균주를 효율적으로 선별하기 위해 스크리닝 방법으로 생물학적 센싱 기법을 활용한 바이오센서를 활용하는 방법이 새롭게 주목 받고 있다.

상기 바이오센서는 미생물에 기반한 것으로 외부 환경의 변화를 지속적으로 인지하여 신속하고 정확하게 유전자 발현을 조절하게 된다. 이를 위해 미생물에 기반한 바이오센서는 다양한 신호 기전을 구비하게 되며, 일예로 2-인자 신호전달계(two-component regulatory system)를 들 수 있다. 대장균에서 유래한 2-인자 신호전달계로 EnvZ-OmpR 조합을 들 수 있으며, 특히 세포막을 경계로 하는 외부 환경과 내부 신호 전달 물질의 변화를 감지하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 상기 감지 능력이 우수한 센서 구성 요소를 구성하는 것이 매우 중요한 요소로 부각되게 된다.

대한민국 등록특허공보 0294665호(2001.04.19.).

Hadzhieva T. Trascriptional activation and sensing properties of DegS-DegU: a two-component system involved in the osmotic regulation of Bacillus subtilis, Philipps University Marburg., 2007).

상기와 같은 점에 기인하여, 본 발명에서는 신규 극지 미생물인 플라노코쿠스 sp.(Planococcus sp.) PAMC21323으로부터 2-인자 신호전달계 관련 유전자를 발견하고, 이를 이용하여 글루타메이트 고효율 센싱이 가능한 바이오센서를 제작하고자 하였다.

본 발명은 플라노코쿠스 sp. PAMC21323 유래 degS 유전자 염기서열 및 대장균 유래 envZ 유전자 염기서열 각각의 일부 또는 전부; 및 ompC 프로모터와 연결되어 작동할 수 있는 형광 단백질을 코딩하는 유전자;를 모두 포함하는 글루타메이트 측정용 바이오센서에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는 플라노코쿠스 sp. PAMC21323 유래 degS 유전자 염기서열 및 대장균 유래 envZ 유전자 염기서열 각각의 일부 또는 전부를 포함하는 재조합 벡터 1을 제조하는 단계; ompC 프로모터와 연결되어 작동할 수 있는 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 2를 제조하는 단계; 및 상기 재조합 벡터 1과 재조합 벡터 2를 숙주세포에 형질전환하는 단계;를 포함하는 글루타메이트 측정용 바이오센서 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 글루타메이트 측정용 바이오센서를 이용하여 미생물 외부의 글루타메이트를 검출하는 검출방법에 관한 것이다.

본 발명을 통해 개발한 바이오센서는 신규 극지 미생물인 플라노코쿠스에서 유래한 2-인자 신호전달계를 이용하여 숙주세포인 미생물에 도입된 후 글루타메이트의 생산 여부를 효과적으로 확인할 수 있도록 해 주며, 이는 새로운 유전자의 신속한 대량 스크리닝 시에 높은 효율로 활용이 가능하다. 또한, 낮은 농도의 글루타메이트 생산 또한 확인할 수 있으며, 형광 정도에 따라 생산량을 확인하여 생산성 증진을 위한 대사 경로 변경 및 배지 조성 변화 등에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 (a) 글루타메이트 검출용 재조합 미생물의 기작 및 (b) 재조합 벡터의 개열 지도에 관한 것이다.
도 2는 형질전환된 미생물의 발현 유도 물질(IPTG) 농도에 따른 상대적 형광 농도 그래프에 관한 것이다.
도 3은 형질전환된 미생물의 아미노산별 상대적 형광 그래프에 관한 것이다.
도 4는 형질전환된 미생물의 글루타메이트 농도에 따른 상대적 형광 사진 및 그래프에 관한 것이다.
도 5는 형질전환된 미생물의 발현 유도 시간에 따른 상대적 형광 사진 및 그래프에 관한 것이다.

본 발명은 플라노코쿠스 sp. PAMC21323 유래 degS 유전자 염기서열 및 대장균 유래 envZ 유전자 염기서열 각각의 일부 또는 전부; 및 ompC 프로모터와 연결되어 작동할 수 있는 형광 단백질을 코딩하는 유전자;를 모두 포함하는 글루타메이트 측정용 바이오센서에 관한 것이다. 상기 바이오센서는 제한되지는 않으나 형질전환 미생물을 사용할 수 있는데, 이러한 미생물은 센서 시스템의 역할을 수행할 수 있는 2-인자 신호전달계(2-component regulatory system)가 포함된 플라스미드와 이에 따른 신호를 형광 단백질의 발현으로 나타낼 수 있는 플라스미드가 도입되어 유전적으로 변형되어 있으며 이를 통해 글루타메이트를 감지하고 이를 형광으로 나타내게 된다.

2-인자 신호 전달계는 기본적으로 센서 키나아제(sensor kinase)와 반응 조절체(response regulator)로 구성되며, 상기 센서 키나아제에서 외부 자극을 인식한 후 이에 상응하는 반응 조절체를 인산화하여 활성화시킴으로써 활성화된 반응 조절체가 반응에 관련된 유전자들의 발현을 촉진하게 되고, 해당 단백질의 생산을 통해 반응하게 된다. 상기 플라노코쿠스 유래 degS 유전자를 통해 발현되는 DegS 단백질은 높은 선택도로 글루타메이트 감지가 가능하고, 또한 소수성 도메인을 포함하지 않기 때문에 세포질에 존재할 수 있다(Hadzhieva T., 2007). 상기 플라노코쿠스 유래 degS 유전자는 플라노코쿠스 sp.(Planococcus sp.) PAMC21323의 유전체 서열 분석을 통해 DegS-DegU 2-인자 신호전달계 형태로 확인되었으며, 본 발명의 일 실시예에서는 대장균에서 유래한 envZ 유전자와 재조합하여 DegS-EnvZ 단백질을 발현할 수 있는 degSZ 유전자로 구축되었다. 대장균에서 상기 envZ 유전자는 EnvZ-OmpR 2-인자 신호전달계를 구성하도록 하는데, EnvZ 단백질은 막 관통 단백질로, 원형질 막을 관통하며 외막을 향해 뻗어 있기 때문에 용질의 농도 변화를 감지하고 ATP(adenosine triphosphate)를 분해하여 자가 인산화를 촉진할 수 있다. 상기 인산화를 통해 구조가 변경된 EnvZ 단백질은 OmpR(outer membrane protein R) 전사인자와 결합하여 이에 대한 신호 전달로써 OmpR을 인산화시키며, 연쇄적으로 활성화된 OmpR은 OmpC(outer membrane protein C) 단백질의 발현을 촉진하게 된다.

본 발명에서 제한되지는 않으나 상기 degS 유전자 염기서열의 일부 또는 전부와 envZ 유전자 염기서열 일부 또는 전부가 융합되어 연결될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 DegS 단백질의 감지 영역(sensing domain)과 EnvZ 단백질의 촉매 영역(catalytic domain)을 융합하여 DegSZ 센서 키나아제로 명명된 융합 단백질을 구축하여 사용하였으며, 이를 활용하여 단백질이 미생물 내에 도입되어 글루타메이트를 감지할 수 있도록 해당 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하여 형질전환된 미생물은 글루타메이트를 감지할 수 있게 된다.

본 발명에서 제한되지는 않으나 상기 degS 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, envZ 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 제한되지는 않으나 상기 degS 유전자 염기서열 및 envZ 유전자 염기서열 각각의 일부 또는 전부가 융합된 degSZ 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 4의 서열일 수 있으며 degSZ1 유전자라 명명하고, 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 6의 서열일 수 있으며 degSZ2 유전자라 명명할 수 있다.

본 발명에서 제한되지는 않으나 상기 형광 단백질은 GFP(green fluorescent protein)을 사용할 수 있다.

본 발명에서 제한되지는 않으나 상기 바이오센서는 바람직하게는 재조합 대장균의 형태일 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 것이라면 미생물, 효모, 곰팡이 등 어떠한 숙주세포를 이용하여도 무방하다.

본 발명에서 제한되지는 않으나 상기 degS 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, envZ 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하며, 상기 degS 유전자 염기서열 및 envZ 유전자 염기서열 각각의 일부 또는 전부가 융합된 degSZ 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 4의 서열일 수 있으며 degSZ1 유전자라 명명하고, 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 6의 서열일 수 있으며 degSZ2 유전자라 명명할 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함되는 것은 자명한 것이다.

[균주, 실험재료 및 실험 방법]

- Planococcus sp. PAMC 21323: PAMC(Polar Alpine Microbial Collection, 인천) 극지연구소에서 분양 받아 사용함.

- Escherichia coli TOP 10: Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.

- pBAD30C 클로닝 벡터(cloning vector): New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.

- pET28a 클로닝 벡터(cloning vector): Novagen, Darmstadt, Germany

- pUC18 클로닝 벡터(cloning vector): New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.

- SOC 배지(Difco, Franklin Lakes, NJ): H₂O 1L당 Yeast extract 5 g, Tryptone 20 g, NaCl 0.584 g, KCl 0.186 g, MgSO₄2.4 g, glucose 3.6 g

- LB 배지(Difco, Franklin Lakes, NJ): H₂O 1L당 Tryptone 10 g, Yeast extract 5 g, NaCl 10 g

- PCR: Expand High Fidelity System(Applied Biosystems), Veriti 96-well thermal cycler(Roche Molecular Biochemical).

- 플라스미드 추출: Qiagen plasmid mini kit(Qiagen, Venlo, Netherland).

- DNA 전기영동 분석: Mupid kit(Takara, Japan).

- 전기천공법(electroporation): Gene pulser(Bio-rad, Hercules, CA),

Cuvette gap 2 mm, Filed strength 15 kV/cm, Capacitor 50 μF, Resistor 100 Ω.

[실시예 1] pDegSZ 재조합 벡터의 제조

융합 히스티딘 키나아제 DegSZ 제작

상기 단백질의 제조를 위해 대장균(Escherichia coli) TOP 10의 유전체 DNA로부터 표 1의 정방향 프라이머로 envZ_F와 역방향 프라이머로 envZ_R을 각각 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다.

PCR 산물은 낮은 복제 수(low copy number)를 갖는 pBAD30C 플라스미드에 재조합되어 pBAD-EnvZ 벡터를 제조하였다.

플라노코쿠스(Planococcus) sp. PAMC21323 유래 degS 유전자는 전체 1146 bp의 서열 중 대장균의 코돈 편중화에 맞춰 유전자의 크기를 감축하였다. 표 1의 정방향 프라이머로 degS_F와 역방향 프라이머로 degS1_R 및 degS2_R을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하고, 이로부터 540 bp의 degS1과 513 bp의 degS2를 각각 수득하였다.

[표 1]

앞서 구축된 pBAD-EnvZ 와 degS 유전자에 XbaI 및 NdeI 제한효소로 절단하고, T4 DNA ligase(Promega)를 이용하여 pDegSZ1 및 pDegSZ2 2 종류의 벡터를 제조하였다.

[실시예 2] pOGFP 재조합 벡터의 제조

재조합 ompC 프로모터(108 bp)의 제조

대장균(Escherichia coli) TOP 10의 유전체 DNA로부터 표 2의 정방향 프라이머로 하기 ompC_F, 역방향 프라이머로 ompC_R을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다.

[표 2]

GFP 유전자는 pET28a 플라스미드를 이용하여 상기 표 2의 정방향 프라이머로 하기 gfp_F, 역방향 프라이머로 gfp_R을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 수득한 2가지 PCR 산물은 overlap PCR을 이용하여 pUC18 플라스미드에 재조합하였으며, 그 결과 pOGFP 벡터를 제조하였다.

[실시예 3] 글루타메이트 측정용 미생물 바이오센서 제조

형질전환 대장균의 제조 및 배양

상시 실시예 1, 2를 통해 구축한 벡터를 상기 기술한 장비와 조건을 통해 전기천공법을 이용하여 각각 대장균(Escherichia coli) TOP 10 균주에 형질전환하였다.

형질전환된 대장균을 SOC 배지에 접종하여 한 시간 동안 안정화시킨 후, 항생제로 클로람페니콜과 앰피실린이 포함된 루리아-버타니(LB) 배지를 이용하여 선별하였다.

상기 과정을 통해 형질전환된 대장균 콜로니를 50 μg/mL 클로람페니콜이 포함된 루리아-버타니(LB) 배지에 접종한 후, 37 ℃, 250 rpm 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 새롭게 준비한 동일 조건에서 100배 희석한 LB 배지에 옮겨 본배양을 수행하였으며, 600 nm에서 광학밀도(optical density, OD)가 0.5가 될 때까지 배양하였다.

[시험예 1] 미생물 바이오센서를 이용한 형광 확인

이후, 배양액 중 실험군으로 나누어 각각 글루타메이트(glutamate)의 농도가 1 mM가 되도록 하고, GFP 단백질 발현을 유도하기 위해 아라비노스(arabinose)를 실험군별로 각각 0, 0.01, 0.1, 1.0 mM 첨가하였다.

그 결과 단백질 발현 유도 물질로 사용된 아라비노스의 농도에 따라 GFP 단백질의 발현이 증가하여 높은 형광을 나타내는 것을 확인하였다. 특히 pDegSZ1의 경우 pDegSZ2에 비해 형광 발현이 1.3배 강한 것을 확인하였다(도 2).

[시험예 2] 아미노산 종류에 따른 형광

상기 실시예 3에서 배양한 형질전환 대장균을 실험군으로 나누고 GFP 단백질 발현을 유도하기 위해 1.0 mM 아라비노스(arabinose)를 첨가한 후, 각 실험군에 글루타메이트, 아스파테이트, 메티오닌 및 글루타민을 각각 1 mM로 첨가하여 형광 발현을 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 글루타메이트가 첨가된 경우 가장 높은 형광 발현이 되는 것을 알 수 있으며, 메티오닌과 글루타민을 첨가한 경우에는 발현량이 적은 것을 확인하였다. 이로부터, 본 발명의 형질전환 대장균을 이용한 글루타메이트 측정용 바이오센서는 글루타메이트에 대해 높은 특이성을 갖는 것을 알 수 있었다.

[시험예 3] 글루타메이트 농도에 따른 형광

상기 실시예 3에서 배양한 형질전환 대장균에 대해 GFP 단백질 발현을 유도하기 위해 1.0 mM 아라비노스(arabinose)를 첨가한 후, 글루타메이트의 농도를 0.25 mM부터 4 mM까지 변화시키면서, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 및 4.0 mM의 농도일 때의 형광 발현을 각각 측정하였다.

그 결과 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 2 mM의 농도까지는 글루타메이트의 농도와 형광 정도가 비례하여 증가하는 경향을 나타냈으나, 이후에는 더 이상의 변화를 나타내지 않는 것을 확인하였다.

[시험예 4] GFP 단백질 발현 후 배양 시간에 따른 형광

상기 실시예 3에서 배양한 형질전환 대장균에 대해 GFP 단백질 발현을 유도하기 위해 1.0 mM 아라비노스(arabinose)를 첨가한 후, 배양 시간의 경과에 따른 형광을 측정하였다.

그 결과 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 발현 유도 시간이 길어짐에 따라 형광 세기 또한 증가하는 것을 확인하였으며, DegSZ1 바이오센서(●)가 DegSZ2(▲) 바이오센서 대비 형광 세기 증가가 약간 높아, 더 민감한 바이오센서임을 확인할 수 있었다.

상기 일 실시예의 결과로부터, 본 발명을 통한 글루타메이트 측정용 바이오센서는 주요 아미노산 중에서 글루타메이트에 특이성을 나타내며, 장 시간 사용할 수 있는 것을 확인함으로써, 글루타메이트 생산 균주 등의 스크리닝 등을 위해 유용하게 사용될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예를 사용하여 본 발명을 설명하였으나, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있는 것은 자명한 것이다.

본 발명은 플라노코쿠스 sp.(Planococcus sp.) PAMC21323에서 얻어진 새로운 degS 유전자와 대장균에서 분리한 envZ 유전자를 재조합하여 2-인자 신호전달계를 구축하여 이를 바이오센서로 이용하는 것에 관한 것으로, 상기 바이오센서는 재조합 미생물로부터 생산되는 글루타메이트를 효과적으로 측정하여 스크리닝을 대량 신속 처리할 수 있는 방법의 개발에 적용할 수 있다. 이를 통해 글루타메이트의 생산 확인과 생산성 증가를 위한 산업 조건 변화 등 넓은 영역에 활용될 수 있다.

<110> University Industry Liaison Office Of Chonnam National University <120> Biosensor for detecting glutamate and preparation method thereof <130> P16080631154 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 381 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DegS <400> 1 Met Thr Lys Lys Ile Ser Gly Asn Ala Pro Asp Ser Ile Phe Asp Ala 1 5 10 15 Met Val Ala Gly Met Glu Gln Ala Lys Gln Asp Ile Phe Val Ile Ser 20 25 30 Glu Glu Ser Arg Gln Ser Tyr Glu Glu Met Lys Asn Glu Leu Glu Asp 35 40 45 Val Arg Val Glu Ile Ser Ile Ile Val Glu Ala Gly Asp Leu Leu Glu 50 55 60 Glu Lys Thr Arg Ala Ala Arg Arg Arg Leu Ala Glu Val Ser Gln Phe 65 70 75 80 Phe Ser Ser Phe Thr Glu Ser Gln Val Arg Gln Val Tyr Glu Gln Ala 85 90 95 Asn Ala Leu Gln Leu Glu Leu Ser Leu Asn Arg Asn Glu Glu Lys Lys 100 105 110 Cys Arg Gln Lys Arg Asp Lys Leu Gln Arg Arg Leu Gln Val Leu Leu 115 120 125 Gln Thr Ile Glu Arg Thr Glu Arg Phe Val Asn Gln Ile Asn Val Ala 130 135 140 Ser Ser Tyr Leu Thr Ser Asp Tyr Glu Asp Val Asp Glu Ala Ile Asp 145 150 155 160 Lys Asn Lys Ser Phe Gln Asp Tyr Ser Leu Arg Ile Ile Glu Val Gln 165 170 175 Glu Glu Glu Arg Lys Arg Leu Ser Arg Glu Ile His Asp Gly Pro Ala 180 185 190 Gln Met Met Ala Asn Val Leu Leu Arg Ser Asp Leu Ile Glu Arg Thr 195 200 205 Tyr Arg Glu Lys Gly Pro Glu Pro Ala Phe Gln Glu Ile Thr Ser Leu 210 215 220 Lys Asp Met Val Arg Gln Ala Leu Thr Glu Val Arg Arg Ile Ile Tyr 225 230 235 240 Asp Leu Arg Pro Met Thr Leu Asp Asp Leu Gly Leu Val Pro Thr Leu 245 250 255 Arg Lys Tyr Val Asp Thr Ile Glu Glu Tyr Asn Lys Asp Ile Asn Leu 260 265 270 Gln Phe Leu Ser Ser Gly Lys Glu Val Arg Leu Pro Asn Asn Tyr Glu 275 280 285 Thr Thr Ile Phe Arg Leu Val Gln Glu Gly Ile Ser Asn Ala Ile Arg 290 295 300 His Gly Lys Ser Asn Asp Ile Thr Ile Glu Met Lys Trp Leu Lys Asn 305 310 315 320 Gln Val Gln Ile Ile Val Thr Asp Asn Gly Ala Gly Phe Asp Gln Gly 325 330 335 Ile Val Lys Asn Gln Ser Phe Gly Leu Thr Gly Met Arg Glu Arg Ile 340 345 350 Glu Leu Val Glu Gly Lys Leu Ile Ile Asn Ser Ser Pro Gly Asn Gly 355 360 365 Thr Ile Leu Met Phe His Ile Pro Phe Lys Lys Gly Met 370 375 380 <210> 2 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EnvZ <400> 2 Met Arg Arg Leu Arg Phe Ser Pro Arg Ser Ser Phe Ala Arg Thr Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ile Val Thr Leu Leu Phe Ala Ser Leu Val Thr Thr Tyr Leu 20 25 30 Val Val Leu Asn Phe Ala Ile Leu Pro Ser Leu Gln Gln Phe Asn Lys 35 40 45 Val Leu Ala Tyr Glu Val Arg Met Leu Met Thr Asp Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Gln Leu Val Val Pro Pro Ala Phe Arg Arg Glu Ile 65 70 75 80 Tyr Arg Glu Leu Gly Ile Ser Leu Tyr Ser Asn Glu Ala Ala Glu Glu 85 90 95 Ala Gly Leu Arg Trp Ala Gln His Tyr Glu Phe Leu Ser His Gln Met 100 105 110 Ala Gln Gln Leu Gly Gly Pro Thr Glu Val Arg Val Glu Val Asn Lys 115 120 125 Ser Ser Pro Val Val Trp Leu Lys Thr Trp Leu Ser Pro Asn Ile Trp 130 135 140 Val Arg Val Pro Leu Thr Glu Ile His Gln Gly Asp Phe Ser Pro Leu 145 150 155 160 Phe Arg Tyr Thr Leu Ala Ile Met Leu Leu Ala Ile Gly Gly Ala Trp 165 170 175 Leu Phe Ile Arg Ile Gln Asn Arg Pro Leu Val Asp Leu Glu His Ala 180 185 190 Ala Leu Gln Val Gly Lys Gly Ile Ile Pro Pro Pro Leu Arg Glu Tyr 195 200 205 Gly Ala Ser Glu Val Arg Ser Val Thr Arg Ala Phe Asn His Met Ala 210 215 220 Ala Gly Val Lys Gln Leu Ala Asp Asp Arg Thr Leu Leu Met Ala Gly 225 230 235 240 Val Ser His Asp Leu Arg Thr Pro Leu Thr Arg Ile Arg Leu Ala Thr 245 250 255 Glu Met Met Ser Glu Gln Asp Gly Tyr Leu Ala Glu Ser Ile Asn Lys 260 265 270 Asp Ile Glu Glu Cys Asn Ala Ile Ile Glu Gln Phe Ile Asp Tyr Leu 275 280 285 Arg Thr Gly Gln Glu Met Pro Met Glu Met Ala Asp Leu Asn Ala Val 290 295 300 Leu Gly Glu Val Ile Ala Ala Glu Ser Gly Tyr Glu Arg Glu Ile Glu 305 310 315 320 Thr Ala Leu Tyr Pro Gly Ser Ile Glu Val Lys Met His Pro Leu Ser 325 330 335 Ile Lys Arg Ala Val Ala Asn Met Val Val Asn Ala Ala Arg Tyr Gly 340 345 350 Asn Gly Trp Ile Lys Val Ser Ser Gly Thr Glu Pro Asn Arg Ala Trp 355 360 365 Phe Gln Val Glu Asp Asp Gly Pro Gly Ile Ala Pro Glu Gln Arg Lys 370 375 380 His Leu Phe Gln Pro Phe Val Arg Gly Asp Ser Ala Arg Thr Ile Ser 385 390 395 400 Gly Thr Gly Leu Gly Leu Ala Ile Val Gln Arg Ile Val Asp Asn His 405 410 415 Asn Gly Met Leu Glu Leu Gly Thr Ser Glu Arg Gly Gly Leu Ser Ile 420 425 430 Arg Ala Trp Leu Pro Val Pro Val Thr Arg Ala Gln Gly Thr Thr Lys 435 440 445 Glu Gly 450 <210> 3 <211> 407 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DegSZ1 <400> 3 Met Thr Lys Lys Ile Ser Gly Asn Ala Pro Asp Ser Ile Phe Asp Ala 1 5 10 15 Met Val Ala Gly Met Glu Gln Ala Lys Gln Asp Ile Phe Val Ile Ser 20 25 30 Glu Glu Ser Arg Gln Ser Tyr Glu Glu Met Lys Asn Glu Leu Glu Asp 35 40 45 Val Arg Val Glu Ile Ser Ile Ile Val Glu Ala Gly Asp Leu Leu Glu 50 55 60 Glu Lys Thr Arg Ala Ala Arg Arg Arg Leu Ala Glu Val Ser Gln Phe 65 70 75 80 Phe Ser Ser Phe Thr Glu Ser Gln Val Arg Gln Val Tyr Glu Gln Ala 85 90 95 Asn Ala Leu Gln Leu Glu Leu Ser Leu Asn Arg Asn Glu Glu Lys Lys 100 105 110 Cys Arg Gln Lys Arg Asp Lys Leu Gln Arg Arg Leu Gln Val Leu Leu 115 120 125 Gln Thr Ile Glu Arg Thr Glu Arg Phe Val Asn Gln Ile Asn Val Ala 130 135 140 Ser Ser Tyr Leu Thr Ser Asp Tyr Glu Asp Val Asp Glu Ala Ile Asp 145 150 155 160 Lys Asn Lys Ser Phe Gln Asp Tyr Ser Leu Arg Ile Ile Glu Val Gln 165 170 175 Glu Glu His Met Ala Ala Gly Val Lys Gln Leu Ala Asp Asp Arg Thr 180 185 190 Leu Leu Met Ala Gly Val Ser His Asp Leu Arg Thr Pro Leu Thr Arg 195 200 205 Ile Arg Leu Ala Thr Glu Met Met Ser Glu Gln Asp Gly Tyr Leu Ala 210 215 220 Glu Ser Ile Asn Lys Asp Ile Glu Glu Cys Asn Ala Ile Ile Glu Gln 225 230 235 240 Phe Ile Asp Tyr Leu Arg Thr Gly Gln Glu Met Pro Met Glu Met Ala 245 250 255 Asp Leu Asn Ala Val Leu Gly Glu Val Ile Ala Ala Glu Ser Gly Tyr 260 265 270 Glu Arg Glu Ile Glu Thr Ala Leu Tyr Pro Gly Ser Ile Glu Val Lys 275 280 285 Met His Pro Leu Ser Ile Lys Arg Ala Val Ala Asn Met Val Val Asn 290 295 300 Ala Ala Arg Tyr Gly Asn Gly Trp Ile Lys Val Ser Ser Gly Thr Glu 305 310 315 320 Pro Asn Arg Ala Trp Phe Gln Val Glu Asp Asp Gly Pro Gly Ile Ala 325 330 335 Pro Glu Gln Arg Lys His Leu Phe Gln Pro Phe Val Arg Gly Asp Ser 340 345 350 Ala Arg Thr Ile Ser Gly Thr Gly Leu Gly Leu Ala Ile Val Gln Arg 355 360 365 Ile Val Asp Asn His Asn Gly Met Leu Glu Leu Gly Thr Ser Glu Arg 370 375 380 Gly Gly Leu Ser Ile Arg Ala Trp Leu Pro Val Pro Val Thr Arg Ala 385 390 395 400 Gln Ser Thr Thr Lys Glu Gly 405 <210> 4 <211> 1224 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DegSZ1 <400> 4 atgacaaaaa aaatcagtgg aaatgcacct gattctattt ttgatgcgat ggttgcagga 60 atggaacagg caaaacaaga tattttcgtc attagtgaag aaagtcgcca aagttatgaa 120 gagatgaaaa atgaactaga agatgttcgt gtggaaattt caattattgt tgaagcaggt 180 gatcttttag aagaaaaaac gcgtgcagct agaaggcgtt tagcagaagt gtctcagttt 240 ttcagctctt ttacagagag tcaagtgcgt caagtatacg aacaggcaaa cgctcttcaa 300 ttagaattat ccctaaatcg aaacgaagaa aaaaaatgtc gtcaaaaacg ggataagttg 360 caacggcggc ttcaagtgtt acttcaaacg attgaacgaa cagaacgttt tgtcaatcaa 420 ataaatgtcg ctagtagtta tttgacttca gattatgaag atgtcgacga agctatcgac 480 aagaataagt catttcaaga ttatagcctc cgtattatcg aggtgcaaga agaacatatg 540 gcggctggtg ttaagcaact ggcggatgac cgcacgctgc tgatggcggg ggtaagtcac 600 gacttgcgta caccgctgac gcgtattcgc ctggcgaccg agatgatgag cgagcaggat 660 ggctacctgg cagaatcgat caataaagat atcgaggagt gcaatgccat cattgagcag 720 tttatcgact acctgcgcac cggacaggag atgccgatgg aaatggcgga tctcaacgca 780 gtactcggtg aggttattgc tgccgaaagt ggctatgagc gggaaattga aaccgcgctt 840 taccccggca gcattgaagt gaaaatgcac ccgctgtcga tcaaacgcgc ggtggcgaat 900 atggtggtca acgccgcccg ttacggcaat ggctggatca aagtcagcag cgggacggag 960 ccgaatcgcg cctggttcca ggtggaagat gacggtccgg gaattgcgcc ggaacaacgt 1020 aagcaccttt tccagccgtt tgttcgcggc gacagtgcac gcaccattag cggcacggga 1080 ttagggctgg cgattgtgca gcgtatcgtg gataaccata acgggatgct ggagcttggc 1140 accagcgagc ggggcgggct ttccattcgc gcctggctgc ctgtgccggt aacgcgggcg 1200 cagagcacga caaaagaagg gtaa 1224 <210> 5 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DegSZ2 <400> 5 Met Thr Lys Lys Ile Ser Gly Asn Ala Pro Asp Ser Ile Phe Asp Ala 1 5 10 15 Met Val Ala Gly Met Glu Gln Ala Lys Gln Asp Ile Phe Val Ile Ser 20 25 30 Glu Glu Ser Arg Gln Ser Tyr Glu Glu Met Lys Asn Glu Leu Glu Asp 35 40 45 Val Arg Val Glu Ile Ser Ile Ile Val Glu Ala Gly Asp Leu Leu Glu 50 55 60 Glu Lys Thr Arg Ala Ala Arg Arg Arg Leu Ala Glu Val Ser Gln Phe 65 70 75 80 Phe Ser Ser Phe Thr Glu Ser Gln Val Arg Gln Val Tyr Glu Gln Ala 85 90 95 Asn Ala Leu Gln Leu Glu Leu Ser Leu Asn Arg Asn Glu Glu Lys Lys 100 105 110 Cys Arg Gln Lys Arg Asp Lys Leu Gln Arg Arg Leu Gln Val Leu Leu 115 120 125 Gln Thr Ile Glu Arg Thr Glu Arg Phe Val Asn Gln Ile Asn Val Ala 130 135 140 Ser Ser Tyr Leu Thr Ser Asp Tyr Glu Asp Val Asp Glu Ala Ile Asp 145 150 155 160 Lys Asn Lys Ser Phe Gln Asp Tyr Ser Leu Arg Ile Ile His Met Ala 165 170 175 Ala Gly Val Lys Gln Leu Ala Asp Asp Arg Thr Leu Leu Met Ala Gly 180 185 190 Val Ser His Asp Leu Arg Thr Pro Leu Thr Arg Ile Arg Leu Ala Thr 195 200 205 Glu Met Met Ser Glu Gln Asp Gly Tyr Leu Ala Glu Ser Ile Asn Lys 210 215 220 Asp Ile Glu Glu Cys Asn Ala Ile Ile Glu Gln Phe Ile Asp Tyr Leu 225 230 235 240 Arg Thr Gly Gln Glu Met Pro Met Glu Met Ala Asp Leu Asn Ala Val 245 250 255 Leu Gly Glu Val Ile Ala Ala Glu Ser Gly Tyr Glu Arg Glu Ile Glu 260 265 270 Thr Ala Leu Tyr Pro Gly Ser Ile Glu Val Lys Met His Pro Leu Ser 275 280 285 Ile Lys Arg Ala Val Ala Asn Met Val Val Asn Ala Ala Arg Tyr Gly 290 295 300 Asn Gly Trp Ile Lys Val Ser Ser Gly Thr Glu Pro Asn Arg Ala Trp 305 310 315 320 Phe Gln Val Glu Asp Asp Gly Pro Gly Ile Ala Pro Glu Gln Arg Lys 325 330 335 His Leu Phe Gln Pro Phe Val Arg Gly Asp Ser Ala Arg Thr Ile Ser 340 345 350 Gly Thr Gly Leu Gly Leu Ala Ile Val Gln Arg Ile Val Asp Asn His 355 360 365 Asn Gly Met Leu Glu Leu Gly Thr Ser Glu Arg Gly Gly Leu Ser Ile 370 375 380 Arg Ala Trp Leu Pro Val Pro Val Thr Arg Ala Gln Ser Thr Thr Lys 385 390 395 400 Glu Gly <210> 6 <211> 1209 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DegSZ2 <400> 6 atgacaaaaa aaatcagtgg aaatgcacct gattctattt ttgatgcgat ggttgcagga 60 atggaacagg caaaacaaga tattttcgtc attagtgaag aaagtcgcca aagttatgaa 120 gagatgaaaa atgaactaga agatgttcgt gtggaaattt caattattgt tgaagcaggt 180 gatcttttag aagaaaaaac gcgtgcagct agaaggcgtt tagcagaagt gtctcagttt 240 ttcagctctt ttacagagag tcaagtgcgt caagtatacg aacaggcaaa cgctcttcaa 300 ttagaattat ccctaaatcg aaacgaagaa aaaaaatgtc gtcaaaaacg ggataagttg 360 caacggcggc ttcaagtgtt acttcaaacg attgaacgaa cagaacgttt tgtcaatcaa 420 ataaatgtcg ctagtagtta tttgacttca gattatgaag atgtcgacga agctatcgac 480 aagaataagt catttcaaga ttatagcctc cgtattatcc atatggcggc tggtgttaag 540 caactggcgg atgaccgcac gctgctgatg gcgggggtaa gtcacgactt gcgtacaccg 600 ctgacgcgta ttcgcctggc gaccgagatg atgagcgagc aggatggcta cctggcagaa 660 tcgatcaata aagatatcga ggagtgcaat gccatcattg agcagtttat cgactacctg 720 cgcaccggac aggagatgcc gatggaaatg gcggatctca acgcagtact cggtgaggtt 780 attgctgccg aaagtggcta tgagcgggaa attgaaaccg cgctttaccc cggcagcatt 840 gaagtgaaaa tgcacccgct gtcgatcaaa cgcgcggtgg cgaatatggt ggtcaacgcc 900 gcccgttacg gcaatggctg gatcaaagtc agcagcggga cggagccgaa tcgcgcctgg 960 ttccaggtgg aagatgacgg tccgggaatt gcgccggaac aacgtaagca cctgttccag 1020 ccgtttgtcc gcggcgatag tgcgcgcacc attagcggca cgggattagg gctggcaatt 1080 gtgcagcgta tcgtggataa ccataacggg atgctggagc ttggcaccag cgagcggggc 1140 gggctttcca ttcgcgcctg gctgcctgtg ccggtaacgc gggcgcagag cacgacaaaa 1200 gaagggtaa 1209 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> degS_F <400> 7 taagcatcta gaatgacaaa aaaaatcagt gga 33 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> degS1_R <400> 8 tgcttacata tgttcttctt gcacctcgat 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> degS2_R <400> 9 tgcttacata tggataatac ggaggctata 30 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> envZ_F <400> 10 tctagaatga ggcgattgcg cttctcg 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> envZ_R <400> 11 aagcttttac ccttcttttg tcgtgcc 27 <210> 12 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ompC_F <400> 12 gaattctccc ttgcatttac attttgaaac atctatagcg atctcttgag ttggaa 56 <210> 13 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ompC_R <400> 13 tctagtaagt ccattctccc caaaaatgca gaataatcca actcaagag 49 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gfp_F <400> 14 acttactaga gaaagaggag aaatactaga tgcagtctaa agga 44 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gfp_R <400> 15 ggatccttat taatggtgat ggtgatggtg 30 <210> 16 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DegS part of DegSZ used for protein fusion with EnvZ protein <400> 16 Met Thr Lys Lys Ile Ser Gly Asn Ala Pro Asp Ser Ile Phe Asp Ala 1 5 10 15 Met Val Ala Gly Met Glu Gln Ala Lys Gln Asp Ile Phe Val Ile Ser 20 25 30 Glu Glu Ser Arg Gln Ser Tyr Glu Glu Met Lys Asn Glu Leu Glu Asp 35 40 45 Val Arg Val Glu Ile Ser Ile Ile Val Glu Ala Gly Asp Leu Leu Glu 50 55 60 Glu Lys Thr Arg Ala Ala Arg Arg Arg Leu Ala Glu Val Ser Gln Phe 65 70 75 80 Phe Ser Ser Phe Thr Glu Ser Gln Val Arg Gln Val Tyr Glu Gln Ala 85 90 95 Asn Ala Leu Gln Leu Glu Leu Ser Leu Asn Arg Asn Glu Glu Lys Lys 100 105 110 Cys Arg Gln Lys Arg Asp Lys Leu Gln Arg Arg Leu Gln Val Leu Leu 115 120 125 Gln Thr Ile Glu Arg Thr Glu Arg Phe Val Asn Gln Ile Asn Val Ala 130 135 140 Ser Ser Tyr Leu Thr Ser Asp Tyr Glu Asp Val Asp Glu Ala Ile Asp 145 150 155 160 Lys Asn Lys Ser Phe Gln Asp 165 <210> 17 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EnvZ part of DegSZ used for protein fusion with DegS protein <400> 17 Met Ala Ala Gly Val Lys Gln Leu Ala Asp Asp Arg Thr Leu Leu Met 1 5 10 15 Ala Gly Val Ser His Asp Leu Arg Thr Pro Leu Thr Arg Ile Arg Leu 20 25 30 Ala Thr Glu Met Met Ser Glu Gln Asp Gly Tyr Leu Ala Glu Ser Ile 35 40 45 Asn Lys Asp Ile Glu Glu Cys Asn Ala Ile Ile Glu Gln Phe Ile Asp 50 55 60 Tyr Leu Arg Thr Gly Gln Glu Met Pro Met Glu Met Ala Asp Leu Asn 65 70 75 80 Ala Val Leu Gly Glu Val Ile Ala Ala Glu Ser Gly Tyr Glu Arg Glu 85 90 95 Ile Glu Thr Ala Leu Tyr Pro Gly Ser Ile Glu Val Lys Met His Pro 100 105 110 Leu Ser Ile Lys Arg Ala Val Ala Asn Met Val Val Asn Ala Ala Arg 115 120 125 Tyr Gly Asn Gly Trp Ile Lys Val Ser Ser Gly Thr Glu Pro Asn Arg 130 135 140 Ala Trp Phe Gln Val Glu Asp Asp Gly Pro Gly Ile Ala Pro Glu Gln 145 150 155 160 Arg Lys His Leu Phe Gln Pro Phe Val Arg Gly Asp Ser Ala Arg Thr 165 170 175 Ile Ser Gly Thr Gly Leu Gly Leu Ala Ile Val Gln Arg Ile Val Asp 180 185 190 Asn His Asn Gly Met Leu Glu Leu Gly Thr Ser Glu Arg Gly Gly Leu 195 200 205 Ser Ile Arg Ala Trp Leu Pro Val Pro Val Thr Arg Ala Gln Gly Thr 210 215 220 Thr Lys Glu Gly 225

Claims

플라노코쿠스 sp. PAMC21323 유래 degS 유전자 염기서열 및 대장균 유래 envZ 유전자 염기서열 각각의 일부 또는 전부; 및
ompC 프로모터와 연결되어 작동할 수 있는 형광 단백질을 코딩하는 유전자;
를 모두 포함하는 글루타메이트 측정용 바이오센서.
제 1항에 있어서, 상기 degS 유전자 염기서열의 일부 또는 전부와 envZ 유전자 염기서열 일부 또는 전부가 융합되어 연결된 것을 특징으로 하는 글루타메이트 측정용 바이오센서.
제 1항에 있어서,
상기 degS 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, envZ 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 글루타메이트 측정용 바이오센서.
제 2항에 있어서,
상기 degS 유전자 염기서열 및 envZ 유전자 염기서열 각각의 일부 또는 전부가 융합된 degSZ 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 글루타메이트 측정용 바이오센서.
제 1항에 있어서,
상기 형광 단백질은 GFP(green fluorescent protein)인 것을 특징으로 하는 글루타메이트 측정용 바이오센서.
제 1항에 있어서,
상기 바이오센서는 재조합 대장균인 것을 특징으로 하는 글루타메이트 측정용 바이오센서.
플라노코쿠스 sp. PAMC21323 유래 degS 유전자 염기서열 및 대장균 유래 envZ 유전자 염기서열 각각의 일부 또는 전부를 포함하는 재조합 벡터 1을 제조하는 단계;
ompC 프로모터와 연결되어 작동할 수 있는 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 2를 제조하는 단계; 및
상기 재조합 벡터 1과 재조합 벡터 2를 숙주세포에 형질전환하는 단계;
를 포함하는 글루타메이트 측정용 바이오센서 제조방법.
제 7항에 있어서,
상기 degS 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, envZ 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하며, 상기 degS 유전자 염기서열 및 envZ 유전자 염기서열 각각의 일부 또는 전부가 융합된 degSZ 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 글루타메이트 측정용 바이오센서 제조방법.
제 7항에 있어서,
상기 형광 단백질은 GFP(green fluorescent protein)인 것을 특징으로 하는 글루타메이트 측정용 바이오센서 제조방법.
제 1항 내지 제6항으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 한 항의 글루타메이트 측정용 바이오센서를 이용하여 미생물 외부의 글루타메이트를 검출하는 검출방법.