CN110483516B - 可用作Cdc25A/B磷酸酶抑制剂的化合物 - Google Patents

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    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system

Abstract

本发明涉及Cdc25磷酸酶抑制剂技术领域，具体为可用作Cdc25磷酸酶抑制剂的化合物；所述的化合物meleagrin是从菌株
Figure DDA0002153769910000011
Figure DDA0002153769910000012
和Pestalotiopsis microspore的共培养基中制备分离得到的；本发明对从微生物中分离得到的化合物meleagrin测试了对Cdc25A磷酸酶的抑制活性，测试结果表明，化合物meleagrin的抑制率分别为96.6％(当浓度为100μM)，所以化合物meleagrin有发展成Cdc25A/B磷酸酶抑制剂的潜能。

Description

可用作Cdc25A/B磷酸酶抑制剂的化合物
技术领域
本发明涉及Cdc25A/B磷酸酶抑制剂技术领域，具体为可用作Cdc25A/B磷酸酶抑制剂的化合物。
背景技术
在过去的三十几年间有65％的上市药物都基于天然产物结构模板，天然产物结构的多样性超乎人类想象，丰富多变的化学结构几乎能够匹配人类对各类靶标的空间需求。同时，生物的共进化赋予了天然产物很好的生物相容性。从临床用药情况看，天然抗肿瘤药物在抗肿瘤药物中占据了半壁江山。药物筛选的靶点主要有受体、离子通道、酶(激酶为主)、膜转运体和核酸。以上五个靶点占靶点总量的70％以上，目前上市的很多药物都是酶抑制剂，其机制是通过抑制某些酶的某些代谢过程，降低酶促反应物的浓度而发挥药理作用。筛选作用于酶的底物主要是观察药物对酶活性的影响，在该方法中，可以根据具体情况，采用酶的反应底物或者酶的反应产物作为检测对象。
有机体的生长和维系需要细胞复制，细胞周期紧密控制着细胞复制进程。细胞周期运行的主要动力来自细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)，特定的CDK与Cdc25形成的复合物调控这细胞周期的各个阶段。哺乳动物的Cdc25家族有Cdc25A,Cdc25B和Cdc25C三个成员，并且由三个不同的基因编码。Cdc25A控制着细胞周期从S期向M期转变，并且在G2-M的转变中也起着重要作用，Cdc25B和Cdc25C主要控制进入M期。Cdc25A和Cdc25B磷酸酶是细胞周期控制蛋白，这两种酶在一系列癌症中都出现过表达的情况。Cdc25A和Cdc25B在mRNA和蛋白水平上的高表达现象在乳腺癌、胰腺导管腺癌、肝癌、前列腺癌、非霍奇金淋巴癌、食管鳞状细胞癌以及肺癌中都有出现。对于Cdc25C只在少数的研究中才发现在癌症中也存在高表达现象。鉴于在细胞周期中发挥如此重要的作用，Cdc25磷酸酶被认为在致癌基因的转变和人类癌症发生的过程中起着重要的作用。目前临床研究表明，这一家族的蛋白酶在多种癌症组织中均表现出过表达，且往往与较差的癌症早期预测有关，这些均使Cdc25磷酸蛋白酶家族蛋白尤其是Cdc25A和Cdc25B成为抗癌药物设计和发现的另一个具有巨大潜力的癌症治疗药物的分子靶标。所以筛选Cdc25磷酸酶势在必行。
发明内容
本发明的化合物meleagrin，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002153769890000021
本发明的第二个目的是提供一种化合物meleagrin的方法，其特征在于，所述的化合物meleagrin是从菌株
Figure BDA0002153769890000022
bromicola和Pestalotiopsis microspore的共培养基中制备分离得到的。
优选的，所述的制备化合物meleagrin的方法，具体步骤如下：
步骤(1)：将菌株
Figure BDA0002153769890000031
bromicola和Pestalotiopsis microspore分别用PDA培养基进行活化，然后分别用打孔器将其菌落打成5mm的菌饼，将其分别挑入100mL的锥形瓶(含40mL的土豆液体培养基)作为种子培养基，放在摇床上培养(温度为25℃，转速为140rpm)；先将E.bromicola种子培养液接种到1000mL锥形瓶(含100g灭菌大米)，在25度培养箱中培养10天后，再将P.microspore种子培养液接种到大米培养基上进行共培养，30天后收获共培养基。
步骤(2)：将培养好的菌株
Figure BDA0002153769890000032
bromicola和Pestalotiopsis microspore的共培养基用工业乙酸乙酯在室温下浸泡3-5天，浸泡3-4次；优选的，所述培养基(kg)与工业乙酸乙酯(L)的用量比为1:2-1:6；
步骤(3)：去除溶剂，得到粗浸膏；
步骤(4)：将浸膏以水-乙醇作溶剂过大孔树脂柱，正相色谱柱分离，得到化合物meleagrin；优选的，所述大孔树脂柱的规格为外径10.0cm，长60.0cm；所述正相色谱柱的规格为外径2.0cm，长30.0cm，在正相色谱柱分离时，石油醚和丙酮的体积比为10:1-1:1。
本发明的第三个目的是提供化合物meleagrin或其药用盐在制备Cdc25A/B磷酸酶抑制剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种Cdc25A/B磷酸酶抑制剂，其特征在于，包括有效量的作为活性成分的权利要求1所述的化合物meleagrin，或其药用盐，和药学上可接受的载体。
本发明的有益效果在于：本发明对从微生物中分离得到的化合物meleagrin测试了对Cdc25A磷酸酶的抑制活性，测试结果表明，化合物meleagrin的抑制率分别为96.6％(当浓度为100μM)，所以化合物meleagrin有发展成Cdc25A/B磷酸酶抑制剂的潜能。
附图说明
图1为化合物meleagrin的结构式。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1：
1、化合物meleagrin的提取
步骤(1)：将菌株
Figure BDA0002153769890000041
bromicola和Pestalotiopsis microspore分别用PDA培养基进行活化，然后分别用打孔器将其菌落打成5mm的菌饼，将其分别挑入100mL的锥形瓶(含40mL的土豆液体培养基)作为种子培养基，放在摇床上培养(温度为25℃，转速为140rpm)；先将E.bromicola种子培养液接种到1000mL锥形瓶(含100g灭菌大米)，在25度培养箱中培养10天后，再将P.microspore种子培养液接种到大米培养基上进行共培养，30天后收获共培养基。
步骤(2)：将培养好的菌株
Figure BDA0002153769890000051
bromicola和Pestalotiopsis microspore的共培养基用工业乙酸乙酯在室温下浸泡3-5天，浸泡3-4次；优选的，所述培养基(kg)与工业乙酸乙酯(L)的用量比为1:2-1:6；
步骤(3)：去除溶剂，得到粗浸膏；
步骤(4)：将浸膏以水-乙醇作溶剂过大孔树脂柱，正相色谱柱分离，得到化合物meleagrin；优选的，所述大孔树脂柱的规格为外径10.0cm，长60.0cm；所述正相色谱柱的规格为外径2.0cm，长30.0cm，在正相色谱柱分离时，石油醚和丙酮的体积比为10:1-1:1。
2、蛋白的准备和纯化
(1)引物设计
查找NCBI数据库，结合选定的酶切位点设计引物，以cDNA为模板，通过RT-PCR扩出目的基因CDC25A/B并引入限制性内切酶。用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果，并切胶回收，同时对DNA定量；
(2)融合质粒的构建
将携带有谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的p-GEX载体进行双酶切，并用连接酶连接，将连接产物的重组质粒转化至感受态的大肠杆菌体内以相应抗生素进行抗性初筛，从37℃培养过夜的LB平板上挑取单克隆菌落，接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；用质粒提取试剂盒提取质粒并进行双酶切，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，并进一步进行测序鉴定；
(3)CDC25A磷酸酶的制备和纯化
将从LB培养基中收集到的菌落进行裂解，裂解液用流洗液洗柱，将得到的蛋白进行丙烯酰胺凝胶电泳分析；
(4)通过底物荧光素二磷酸(FDP；Sigma)进行磷酸酶活性的测定荧光强度用荧光分光光度计(RF-5301PC,Shimadzu)在530nm下进行测量，激发波长为490nm。通过测量不同底物浓度下的荧光发射强度进行酶活性的稳态动力学分析给出Km＝80μM。化合物抑制活性的测量384孔非底透板中进行。最终选择孵育混合物(50μL)的组成30mM的Tris-HCl(pH 7)，75mM的NaCl，1mM的EDTA，0.4mM的DTT，0.33％的BSA和200nM的Cdc25A/B。加入FDP引发反应之后快速加入待测化合物于37℃孵育1h。以仅加入活性测试缓冲液的孔为对照。反应产物的荧光发射的测量在多孔板读写器中进行。
3、体外Cdc25A/B酶方法和抑制活性分析
FDP可以被酪氨酸磷酸酶进行磷酸化，从而被用作Cdc25酶反应的反应底物。磷酸酶实验的反应底物在490nm被激发，530nm进行发射。可以通过测量荧光强度测量酶活性，通过比较实验组和对照组的荧光强度可以计算抑制效率。实验组加入抑制剂，对照组不加抑制剂。
该实验包括对照组1，对照组2和实验组。对照组1的反应系统包含50mM FDP，1mMCdc25酶，然后添加FDP缓冲液至终体积为50μL。对照组2的反应体系包含50mM FDP和已知浓度的化合物meleagrin，然后添加FDP缓冲液至终体积为50μL。实验组包含50mM FDP，1mMCdc25酶，特定浓度的化合物meleagrin，然后补加FDP缓冲液至终体积为50μL。待加完所有试剂，在37℃孵1h。反应完成后，于530nm下测定反应体系的荧光强度。实验组的荧光强度与对照组荧光强度的比值即为化合物对Cdc25酶的抑制率。
实验结果：通过大肠杆菌进行Cdc25酶的表达，通过琼脂糖株对两种酶进行纯化。重组Cdc25A和Cdc25B酶的活性以及Km值通过荧光底物(FDP)进行分析。分析结果显示两种酶都表现出稳定的催化活性，Km＝80μM。将化合物meleagrin用DMSO配制成初浓度为10mM的溶液，随后用PBS进行稀释，保证反应体系中药物的终浓度为100μM。然后用非底透的白色384孔板进行活性筛选，530nm下进行测量。设置五个重复，筛选抑制率的结果为96.6％。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.化合物meleagrin的制备方法，所述化合物meleagrin的结构式如式(I)所示：
Figure FDA0002520715260000011
所述化合物meleagrin是从菌株
Figure FDA0002520715260000012
bromicola和Pestalotiopsis microspore的共培养基中制备分离得到的，所述化合物meleagrin的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)：将菌株
Figure FDA0002520715260000013
bromicola和Pestalotiopsis microspore分别用PDA培养基进行活化，然后分别用打孔器将其菌落打成5mm的菌饼，将其分别挑入100mL的锥形瓶，所述100mL的锥形瓶内含40mL的土豆液体培养基，然后将其作为种子培养基，放在摇床上培养，所述摇床的温度为25℃，所述摇床的转速为140rpm；先将E.bromicola种子培养液接种到1000mL锥形瓶，所述1000mL锥形瓶内含100g灭菌大米，在25度培养箱中培养10天后，再将P.microspore种子培养液接种到大米培养基上进行共培养，30天后收获共培养基；
步骤(2)：将培养好的菌株
Figure FDA0002520715260000014
bromicola和Pestalotiopsis microspore的共培养基用工业乙酸乙酯在室温下浸泡3-5天，浸泡3-4次；
步骤(3)：去除溶剂，得到粗浸膏；
步骤(4)：将浸膏以水-乙醇作溶剂过大孔树脂柱，正相色谱柱分离，得到化合物meleagrin。
2.根据权利要求1所述的一种化合物meleagrin的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述培养基与工业乙酸乙酯的用量比为1:2-1:6。
3.根据权利要求1所述的一种化合物meleagrin的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述大孔树脂柱的规格为外径10.0cm，长60.0cm。
4.根据权利要求1所述的一种化合物meleagrin的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述正相色谱柱的规格为外径2.0cm，长30.0cm。
5.根据权利要求1所述的一种化合物meleagrin的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，在正相色谱柱分离时，石油醚和丙酮的体积比为10:1-1:1。
6.根据权利要求1所述的化合物meleagrin或其药用盐在制备Cdc25A/B磷酸酶抑制剂中的应用。
7.一种Cdc25A/B磷酸酶抑制剂，其特征在于，包括有效量的作为活性成分的权利要求1所述的化合物meleagrin，或其药用盐，和药学上可接受的载体。
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