CN118389710B - 一种与鸡开产日龄性状相关的tdh基因分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种与鸡开产日龄性状相关的TDH基因分子标记及其应用，属于生物技术领域。本发明的TDH基因分子标记位于鸡参考基因组GRCg6a版本3号染色体第107181657位碱基，位于TDH基因内含子区域，存在T/C多态性；所述SNP位点存在C/C、C/T和T/T三种基因型。本发明利用正反引物对扩增包含上述分子标记位点的片段,并对扩增产物进行Sanger测序，可快速、准确鉴定个体的基因型；该分子标记可以作为鸡育种的遗传标记，选育早开产日龄的优质鸡；可高效准确的检测优质鸡开产日龄性状，并提高鸡群开产日龄的整齐度，对于优质鸡育种具有重要价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种与鸡开产日龄性状相关的TDH基因分子标记及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
黄羽肉鸡是以地方鸡血统为主并以地方鸡特征为育种目标的品种（配套系），具有肉质风味好、体型适中、抗病力强、耐粗饲和适应性强的特点。随着鸡肉需求量的不断增加，消费者对肉质风味的追求越来越高，符合国人消费习惯和偏好的优质型黄羽肉鸡的需求量不断增加。相较于快大型白羽肉鸡，黄羽肉鸡生长速度慢、性成熟晚、饲养周期长，这削弱了黄羽肉鸡的市场竞争力，不利于黄羽肉鸡产业的发展。
开产日龄是鸡性成熟性状之一，与鸡的生产、繁殖、肉品质等性状有较大相关。性成熟早是优质黄羽肉鸡特有的重要经济性状和选种指标。开产标志着母鸡性成熟，性成熟越早的母鸡开产越早，且开产早的个体产蛋初期的生产性能越高。开产日龄影响群体的开产体重和开产蛋重，影响鸡整个产蛋周期的产蛋量。一般来说，开产日龄与开产体重、开产蛋重成正相关，与产蛋量成负相关。开产日龄过大或过小会影响体重和种蛋质量，从而影响育种。适时开产的鸡体重增加相对稳定，体重均匀度高。鸡种鸡饲养过程中为了便于饲养管理，集中获得收益，需要群体的开产日龄保持一致。因此，选择合适开产日龄对于鸡的育种至关重要，可以通过选育开产前的开产日龄大小和整齐度来控制肉种鸡的开产时间一致性。但是开产日龄开产时才能测量，如果在开产时选种将造成极大的饲养成本浪费，亟需建立高效准确的分子检测方法以实现早期选择。
L-苏氨酸脱氢酶（TDH）是L-苏氨酸代谢的关键酶。L-苏氨酸水平与肉鸡的生长、免疫和繁殖息息相关。研究表明，饲料中添加L-苏氨酸能够提高产蛋数。单核苷酸多态性（SNP），是指在基因组上单个核苷酸的变异，在遗传物质传递过程中可以稳定遗传给后代，因此可以作为分子标记进行群体选育和保种。SNP可应用于标记辅助选择（Marker-Assisted Selection，简称MAS），帮助养殖者在性状表现之前精确地选择具有所需形状的个体。实现早期选种，提高选种效率和准确性，降低饲养成本。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种与鸡开产日龄性状相关的TDH基因分子标记及其应用，可快速检测筛选鸡开产日龄。
本发明测量了黄羽肉鸡母鸡的开产日龄，利用全基因组重测序技术进行SNP基因分型，通过全基因组关联分析筛选得到与鸡开产日龄显著相关的TDH基因分子标记，为鸡的开产日龄性状选育提供了新的基因和分子标记资源。
本发明通过以下技术方案解决技术问题：首先提供一种与鸡开产日龄相关的TDH基因分子标记，所述分子标记位于鸡3号染色体第107181657位碱基处，碱基突变为T或C，序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示第230位碱基；分子标记检测所需鸡DNA特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
本发明进一步提供上述特异性引物的应用，包括用于检测鸡开产日龄相关的SNP基因型。具体应用于PCR扩增结合Sanger测序检测鸡开产日龄性状相关SNP基因型的方法，检测方法包括以下步骤，
第一步、将待测鸡DNA样品，用鸡DNA特异性引物对进行PCR扩增，得到扩增产物，所述待测鸡DNA样品中含有鸡3号染色体第107181657位碱基的SNP分子标记；
第二步、将所述扩增产物进行Sanger测序；
第三步、根据第二步的测序结果判断鸡3号染色体第107181657位碱基的SNP分子标记基因型。
上述方法的所述第一步中鸡DNA特异性引物对的脱氧核糖核苷酸序列由
上游引物：5’-GTGGCTTTTTGGTGCCTATG-3’（SEQ ID NO: 1）
下游引物：5’-GGGCAAGATTTCAGAACAGG-3’（SEQ ID NO: 2）
组成，所述扩增产物长度为534bp，包含鸡3号染色体上第107181657位碱基。
反应体系终浓度以25μl计为：
待测鸡DNA 50 ng
2 x Accurate Taq Master Mix 12.5μl
上游引物 1 μl
下游引物 1 μl
灭菌水 补充至25μl，
所述的PCR扩增的反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30循环；72℃延伸2min；20℃保存。
扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
所述第三步中，判断标准是SNP位点为C/C基因型鸡的开产日龄早于C/T基因型和T/T基因型鸡，C/T基因型鸡的开产日龄早于T/T基因型鸡。
本发明通过TDH基因分子标记检测鸡开产日龄性状的基因型，发现C/C基因型个体的开产日龄早于C/T基因型和T/T基因型个体，C/T基因型个体的开产日龄早于T/T基因型个体。通过以待测鸡的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增，然后将该PCR扩增产物进行Sanger测序和SNP分子标记基因分型，基于该SNP分子标记的基因型可以实现对鸡开产日龄性状进行选择。在育种中，根据育种目标，通过淘汰C/T基因型和T/T基因型个体，保留C/C基因型个体，其有益效果是该分子标记可以作为鸡育种的遗传标记，选育早开产日龄的优质鸡；可以高效快速地鉴定鸡开产日龄性状，并提高鸡群开产日龄的整齐度，为鸡的早期选育提供科学依据，对于优质鸡育种具有重要价值。此外，本发明公开的检测方法简单易操作，在实验室即可开展。
附图说明
图1是开产日龄性状GWAS分析的曼哈顿图。
图2是三种基因型PCR扩增产物的Sanger测序结果。
具体实施方式
适用于黄羽肉鸡的育种。
实施例
本实施例测量了黄羽肉鸡苏禽3号L系母鸡的开产日龄，利用全基因组重测序技术进行SNP基因分型，通过全基因组关联分析筛选得到与开产日龄显著相关的TDH基因分子标记，结果如图1所示。
本实施例通过以下实验对于与鸡开产日龄相关的TDH基因分子标记进行鉴定与应用
1.表型测定和基因型检测
(1)实验材料及开产日龄表型测定
选取黄羽肉鸡苏禽3号L系630只母鸡，作为试验动物，在相同的饲养条件饲养，整个过程采用自由饮食和饮水,性成熟时，记录每只鸡的开产日龄，作为鸡开产日龄的表型数据。
(2)基因组DNA的提取
对待测个体采用翅下静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K消化后，用饱和氯化钠方法提取，TE溶解之后-20℃保存。
(3)PCR扩增
以上述提取的基因组DNA为模板，对包含3号染色体的第107181657位碱基的SNP分子标记片段进行扩增。
上游引物：5’-GTGGCTTTTTGGTGCCTATG-3’（SEQ ID NO: 1）
下游引物：5’-GGGCAAGATTTCAGAACAGG-3’（SEQ ID NO: 2）
反应体系终浓度（25μl）为：
待测DNA 50 ng
2 x Accurate Taq Master Mix 12.5 μl
上游引物 1 μl
下游引物 1 μl
灭菌水 补充至25μl。
PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30循环；72℃延伸2min；20℃保存；取10μl用于琼脂糖检测，扩增得到单一目的条带长度为534bp的扩增产物，且含鸡3号染色体第107181657位碱基的SNP分子标记。扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
（4）Sanger测序和基因分型
分别将各个样本的PCR产物进行Sanger测序，测序峰图如图2所示。
2.相关性分析
选取630只开产日龄表型记录清晰的黄羽肉鸡苏禽3号L系母鸡个体进行相关性分析。采用R 4.2统计绘图软件的ANOVA检验函数进行统计检验，选择两两之间平均值比较模式对供试验鸡群的基因型和开产日龄性状进行统计检验，P<0.05表明差异显著，P<0.01表明差异极显著。结果如表1所示，在检测个体中，C/C基因型有7个，C/T基因型有109个，T/T基因型有462个，三种基因型鸡的开产日龄差异显著（P<0.05）。C/C基因型个体的开产日龄平均值为154.57天，早于C/T基因型个体5天（P<0.05）, 早于T/T基因型个体8天（P<0.05）。C/T基因型个体的开产日龄的平均值为159.65天，早于TT基因型个体3天（P<0.05）。结果表明鸡TDH基因分子标记与鸡开产日龄性状显著相关，可根据实际育种目标，选育C/C基因型个体以选育早开产日龄的优质型肉种鸡，提高整体的开产日龄均匀度，提高选育效率。
表1. TDH基因分子标记与开产日龄的关联分析
| 基因型 | 个数/只 | 开产日龄/天 | 标准差 | CV |
| C/C | 7 | 154.57a | 7.91 | 5.12% |
| C/T | 109 | 159.65b | 8.86 | 5.55% |
| T/T | 462 | 162.35c | 7.62 | 4.69% |
注：同列数据肩标相同字母表示差异不显著，肩标不同字母表示差异显著（P<0.05）。
除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (5)
1.一种与鸡开产日龄性状相关的TDH基因分子标记的应用，其特征在于：用于黄羽肉鸡苏禽3号母鸡开产日龄性状的分子检测，所述分子标记的SNP位点位于鸡3号染色体第107181657位碱基处，碱基为T或C，基因型为C/C、C/T和T/T；分子标记检测所需鸡DNA特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1所述与鸡开产日龄性状相关的TDH基因分子标记的应用，其特征在于：检测方法包括以下步骤，
第一步、将待测鸡DNA样品，用鸡DNA特异性引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；
第二步、将所述扩增产物进行Sanger测序；
第三步、根据第二步的测序结果判断目标位点的TDH基因分子标记基因型。
3.根据权利要求2所述与鸡开产日龄性状相关的TDH基因分子标记的应用，其特征在于：所述第一步中鸡DNA特异性引物对的脱氧核糖核苷酸序列由上游引物SEQ ID NO: 1和下游引物SEQ ID NO: 2组成，所述扩增产物长度为534bp，包含鸡3号染色体上第107181657位碱基的SNP分子标记。
4.根据权利要求3所述与鸡开产日龄性状相关的TDH基因分子标记的应用，其特征在于：所述第一步中，反应体系终浓度以25μl计为：
待测鸡DNA 50 ng
2 x Accurate Taq Master Mix 12.5μl
上游引物F 1 μl
下游引物R 1 μl
灭菌水 补足至25μl，
所述的PCR扩增的反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30循环；72℃延伸2min；20℃保存；分子标记扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4所示。
5.根据权利要求2所述与鸡开产日龄性状相关的TDH基因分子标记的应用，其特征在于：所述第三步中，判断标准是SNP位点为C/C基因型鸡的开产日龄早于C/T基因型鸡和T/T基因型鸡，C/T基因型鸡的开产日龄早于T/T基因型鸡。
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