CN107287197B - 组氨酸衰减子突变体和解决反馈阻遏的组氨酸操纵子以及它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了组氨酸衰减子突变体和解决反馈阻遏的组氨酸操纵子以及它们的应用。本发明保护的组氨酸衰减子突变体，为序列表的序列2第n1‑n2位核苷酸所示的DNA分子；126≤n1≤143，148≤n2≤286。本发明提供的解除衰减调控的组氨酸操纵子基因，是将组氨酸操纵子基因中的组氨酸衰减子第1至n3位核苷酸去除后得到的DNA分子；125≤n3≤142。本发明还保护一种解除微生物中组氨酸操纵子反馈阻遏的方法，是删除微生物的组氨酸操纵子基因中从组氨酸衰减子第1位开始计数的第1至n3位核苷酸。采用本发明提供的方案，可以显著提高组氨酸及其衍生物产量，对于组氨酸及其衍生物的生产领域具有极其重大的应用推广价值。

Description

组氨酸衰减子突变体和解决反馈阻遏的组氨酸操纵子以及它 们的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及组氨酸衰减子突变体和解决反馈阻遏的组氨酸操纵子以及它们的应用。

背景技术

L-组氨酸是人和动物的第九种必需氨基酸，参与机体生长发育、抗氧化和免疫调节等重要的生理过程，是重要的药用氨基酸，可用于心脏病、贫血、胃肠溃疡治疗的输液制剂。目前，L-组氨酸生产主要采用以猪(牛)血粉为原料的蛋白质水解提取法，然而，蛋白质水解提取法存在原料成本高且利用率低、提取工艺复杂和环境污染大等缺点，使得L-组氨酸的生产成本高，价格昂贵。微生物发酵法生产L-组氨酸尚未得到大规模的工业化应用。L-组氨酸的生物合成具有与核苷酸合成竞争前体物质、复杂的代谢调控机制以及合成过程中高能量需求等特点，导致其工程菌的产酸水平和转化率相对较低。L-组氨酸生产菌株的选育主要采用多轮传统诱变筛选和在诱变菌株的基础上进行基因工程改造的方法。通过诱变筛选获得的菌株会积累大量的负效应突变，导致菌株生长缓慢、环境耐受性降低以及营养需求增高等问题。这些缺陷限制了菌株的工业化应用。因此，从遗传背景清楚的野生型菌株出发，通过代谢工程育种的方法构建L-组氨酸工程菌，可以很大程度上解决上述传统诱变育种存在的问题。

微生物合成氨基酸(如L-组氨酸、L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-色氨酸等)的操纵子基因的转录表达存在衰减调节机制。当胞内特定氨基酸浓度较高时，氨基酸操纵子的转录提前终止。相反地，当胞内特定氨基酸缺乏时，RNA聚合酶转录氨基酸操纵子。

微生物发酵生产L-组氨酸或其衍生物的过程中，胞内L-组氨酸逐步积累，通过上述衰减调控机制反馈阻遏组氨酸操纵子的表达，不利于L-组氨酸或其衍生物的生物合成。因此，为了构建高效生产组氨酸或其衍生物的工程菌，亟需开发组氨酸衰减子改造的方法，以提高组氨酸操纵子表达水平和组氨酸产量。

发明内容

本发明的目的是提供组氨酸衰减子突变体和解决反馈阻遏的组氨酸操纵子以及它们的应用。

本发明首先保护DNA分子甲(组氨酸衰减子突变体)，为如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)或(a5)：

(a1)序列表的序列2第n1-n2位核苷酸所示的DNA分子；n1为126以上143以下的自然数(n1优选为127以上130以下的自然数)，n2为148以上286以下的自然数(n2具体可为148以上196以下的自然数或197以上286以下的自然数，更具体可为148、196或286)；

(a2)将组氨酸衰减子的第1至n3位核苷酸去除后得到的DNA分子，n3为125以上142以下的自然数(n3优选为126以上129以下的自然数)；

(a3)将组氨酸衰减子相关序列的第1至n3位核苷酸去除后得到的DNA分子，n3为125以上142以下的自然数(n3优选为126以上129以下的自然数)；

(a4)在(a1)或(a2)或(a3)的末端连接标签序列得到的DNA分子；

(a5)在(a1)或(a2)或(a3)的末端连接连接序列得到的DNA分子。

组氨酸衰减子突变体为组氨酸衰减子截短体或组氨酸衰减子变体。组氨酸衰减子截短体如序列表的序列2第n1-148位核苷酸所示。组氨酸衰减子变体如序列表的序列2第n1-n4位核苷酸所示，n4为149以上286以下的自然数(n4具体可为149以上196以下的自然数或197以上286以下的自然数，更具体可为196或286)。

本发明还保护所述DNA分子甲在促进下游目的基因表达中的应用。所述应用中，所述DNA分子甲作为调控元件。所述应用中，所述DNA分子甲位于所述目的基因的启动子和所述目的基因的起始密码子之间。所述应用中，所述启动子具体可为序列表的序列1所示的启动子P_BB。所述应用中，所述目的基因具体可为序列表的序列3所示的gfp基因。

本发明还保护DNA分子乙，自上游至下游依次包括：所述DNA分子甲和目的基因。所述目的基因具体可为序列表的序列3所示的gfp基因。

本发明还保护DNA分子丙，自上游至下游依次包括：启动子、所述DNA分子甲、目的基因和终止子。所述启动子具体可为序列表的序列1所示的启动子P_BB。所述目的基因具体可为序列表的序列3所示的gfp基因。所述终止子具体可为“CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG”。

所述DNA分子甲或所述DNA分子乙或所述DNA分子丙中，不具有组氨酸衰减子第1至n3位核苷酸，n3为125以上142以下的自然数(n3优选为126以上129以下的自然数)。

所述DNA分子乙自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列2第130至286位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列3所示的gfp基因。

所述DNA分子丙自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子P_BB，限制性内切酶Hind III的酶切识别序列，序列表的序列2第130至286位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列3所示的gfp基因，终止子序列“CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG”。

本发明还保护DNA分子丁(解除衰减调控的组氨酸操纵子基因，又称组氨酸操纵子基因突变体)，是将组氨酸操纵子基因中的组氨酸衰减子第1至n3位核苷酸去除后得到的DNA分子；n3为125以上142以下的自然数(n3优选为126以上129以下的自然数)。

本发明还保护DNA分子戊，是将组氨酸操纵子基因进行如下两个改造后得到的DNA分子：(1)将组氨酸衰减子第1至n3位核苷酸去除；n3为125以上142以下的自然数(n3优选为126以上129以下的自然数)；(2)将编码ATP磷酸核糖转移酶的基因从编码野生蛋白的基因突变为编码解除了反馈阻遏的突变蛋白的基因。

所述解除了反馈阻遏的突变蛋白具体可为HisG*蛋白。

所述野生蛋白具体可为HisG蛋白。

所述DNA分子戊具体可为序列表的序列2第127至7230位核苷酸所示的DNA分子。

含有所述DNA分子丁或所述DNA分子戊的重组载体也属于本发明的保护范围。

含有所述DNA分子丁或所述DNA分子戊的重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组菌可为将所述DNA分子丁或所述DNA分子戊导入出发菌进行过表达得到的重组菌。所述出发菌为埃希氏菌属细菌或棒杆菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌具体可为大肠杆菌，例如大肠杆菌K-12或其衍生菌株。所述棒杆菌属细菌具体可为谷氨酸棒杆菌，例如谷氨酸棒杆菌13032。

所述重组菌可为对出发菌的组氨酸操纵子进行改造得到的重组菌。所述出发菌为埃希氏菌属细菌或棒杆菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌具体可为大肠杆菌，例如大肠杆菌K-12或其衍生菌株。所述棒杆菌属细菌具体可为谷氨酸棒杆菌，例如谷氨酸棒杆菌13032。所述重组菌具体可为将大肠杆菌K12MG1655进行如下改造得到的重组菌：(1)删除基因组中序列4所示DNA分子中的第586至721位核苷酸；(2)将基因组中序列4所示DNA分子中的第1602位核苷酸由G突变为A。所述改造可通过如下方式实现：将重组质粒pKOV-ΔhisL-hisG*导入大肠杆菌K12MG1655，得到发生同源重组的重组菌。重组质粒pKOV-ΔhisL-hisG*可为含有特异DNA分子的重组质粒；特异DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列4第32至585位核苷酸所示的上游同源臂，序列表的序列4第722至1617位核苷酸所示的下游同源臂。重组质粒pKOV-ΔhisL-hisG*具体可为：在pKOV质粒的Bam HI和Not I酶切位点之间插入了特异DNA分子；特异DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列4第32至585位核苷酸所示的上游同源臂，序列表的序列4第722至1617位核苷酸所示的下游同源臂。

除了改造染色体上原位的组氨酸操纵子基因之外，作为基因过表达的其它方法，如在染色体上整合≥1拷贝的上述解除衰减调控的组氨酸操纵子基因同样在本专利的保护范围之内；此外，通过质粒过表达上述解除衰减调控的组氨酸操纵子基因同样也在本专利的保护范围之内。

本发明还保护以上任一所述重组菌在制备组氨酸中的应用。

应用所述重组菌生产组氨酸时，采用发酵培养基培养所述重组菌。

所述发酵培养基可以是丰富培养基，也可以是无机盐培养基。培养基包含碳源、氮源、无机离子、抗生素和其它的营养因子。作为碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳糖等糖类；也可以是甘油、甘露醇等醇类；也可以使用葡萄糖酸、柠檬酸、丁二酸等有机酸类。作为氮源，可以使用氨水、硫酸铵、磷酸铵、氯化铵等无机氮源；也可以使用玉米浆、豆粕水解液、毛发粉、酵母提取物、蛋白胨等有机氮源。无机离子包含铁、钙、镁、锰、钼、钴、铜、钾等离子中的一种或多种。其它营养因子还包括生物素、维生素B1、吡哆醛等维生素。

所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖。

所述发酵培养基具体可为：葡萄糖20.0g/L、硫酸铵15.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、七水硫酸镁2.0g/L、酵母粉2.0g/L、碳酸钙15.0g/L、微量元素混合液5mL/L，余量为水。

微量元素混合液：FeSO₄·7H₂O 10g/L、CaCl₂ 1.35g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L、MnSO₄·4H₂O0.5g/L、CuSO₄·5H₂O 1g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.106g/L、Na₂B₄O₇·10H₂O0.23g/L、CoCl₂·6H₂O0.48g/L、35％HCl 10mL/L，余量为水。

所述培养的条件具体可为：37℃、220rpm震荡培养36h。

所述培养的条件具体可为：将种子液以3％的接种量接种至发酵培养基中，37℃、220rpm震荡培养36h。种子液的制备方法如下：将重组菌接种至液体LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养8h，得到种子液。所述种子液的OD_600nm值具体可为5.0。

所述培养的过程中进行如下过程控制：培养过程中，用氨水调节反应体系的pH值使其维持在6.8-7.0；培养过程中，每隔3-4h取样一次，检测葡萄糖含量，当体系中的葡萄糖含量低于5g/L时，补加葡萄糖并使体系中的葡萄糖浓度达到10g/L。

本发明还保护一种提高微生物生产组氨酸的能力的方法，包括如下步骤：删除微生物的组氨酸操纵子基因中从组氨酸衰减子第1位开始计数的第1至n3位核苷酸；n3为125以上142以下的自然数。所述微生物为具有组氨酸操纵子的微生物。所述微生物具体可为埃希氏菌属微生物。所述埃希氏菌属微生物具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌K-12或其衍生菌株，更具体可为大肠杆菌K12MG1655或其衍生菌株。

本发明还保护一种解除微生物中组氨酸操纵子反馈阻遏的方法，包括如下步骤：删除微生物的组氨酸操纵子基因中从组氨酸衰减子第1位开始计数的第1至n3位核苷酸；n3为125以上142以下的自然数。所述微生物为具有组氨酸操纵子的微生物。所述微生物具体可为埃希氏菌属微生物。所述埃希氏菌属微生物具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌K-12或其衍生菌株，更具体可为大肠杆菌K12MG1655或其衍生菌株。

以上任一所述组氨酸操纵子包括组氨酸衰减子、编码ATP磷酸核糖转移酶(HisG*蛋白或HisG蛋白)的基因、编码组氨醛/醇脱氢酶复合体(HisD蛋白)的基因、编码组氨醇磷酸氨基转移酶(HisC蛋白)的基因、编码咪唑甘油磷酸脱水酶/组氨醇磷酸酶复合体(HisB蛋白)的基因、编码咪唑甘油磷酸合成酶亚基H(HisH蛋白)的基因、编码咪唑甲酰胺异构酶(HisA蛋白)的基因、编码咪唑甘油磷酸合成酶亚基F(HisF蛋白)的基因和编码磷酸核糖酰-AMP环水解酶(HisI蛋白)的基因。

所述HisG*蛋白为如下(b1)或(b2)：

(b1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b2)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有ATP磷酸核糖转移酶功能的由序列5衍生的蛋白质。

所述HisG蛋白为如下(c1)或(c2)：

(c1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c2)将序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有ATP磷酸核糖转移酶功能的由序列6衍生的蛋白质。

所述HisD蛋白为如下(d1)或(d2)：

(d1)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d2)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有组氨醛/醇脱氢酶复合体功能的由序列7衍生的蛋白质。

所述HisC蛋白为如下(e1)或(e2)：

(e1)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(e2)将序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有组氨醇磷酸氨基转移酶功能的由序列8衍生的蛋白质。

所述HisB蛋白为如下(f1)或(f2)：

(f1)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(f2)将序列9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有咪唑甘油磷酸脱水酶/组氨醇磷酸酶复合体功能的由序列9衍生的蛋白质。

所述HisH蛋白为如下(g1)或(g2)：

(g1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(g2)将序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有咪唑甘油磷酸合成酶亚基H功能的由序列10衍生的蛋白质。

所述HisA蛋白为如下(h1)或(h2)：

(h1)由序列表中序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(h2)将序列11的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有咪唑甲酰胺异构酶功能的由序列11衍生的蛋白质。

所述HisF蛋白为如下(i1)或(i2)：

(i1)由序列表中序列12所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(i2)将序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有咪唑甘油磷酸合成酶亚基F功能的由序列12衍生的蛋白质。

所述HisI蛋白为如下(j1)或(j2)：

(j1)由序列表中序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(j2)将序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸核糖酰-AMP环水解酶功能的由序列13衍生的蛋白质。

编码HisG*蛋白的基因具体可如序列表的序列2第197-1096位核苷酸所示。

编码HisG蛋白的基因具体可如序列表的序列4第792-1691位核苷酸所示。

编码HisD蛋白的基因具体可如序列表的序列2第1102-2406位核苷酸所示。

编码HisC蛋白的基因具体可如序列表的序列2第2403-3473位核苷酸所示。

编码HisB蛋白的基因具体可如序列表的序列2第3473-4540位核苷酸所示。

编码HisH蛋白的基因具体可如序列表的序列2第4540-5130位核苷酸所示。

编码HisA蛋白的基因具体可如序列表的序列2第5130-5867位核苷酸所示。

编码HisF蛋白的基因具体可如序列表的序列2第5849-6625位核苷酸所示。

编码HisI蛋白的基因具体可如序列表的序列2第6619-7230位核苷酸所示。

所述组氨酸衰减子具体如序列表的序列2第1至148位核苷酸所示。

所述组氨酸衰减子相关序列具体如序列表的序列2第1至286位核苷酸所示。

所述组氨酸操纵子基因具体如序列表的序列2第1至7230位核苷酸所示。

以上任一所述组氨酸具体可为L-组氨酸。

本发明公开了一种改造组氨酸衰减子的方法，该方法为删除衰减子中编码前导肽的基因ilvL和终止子茎环结构中前段反向互补回文序列，而保留了终止子后段反向互补回文序列。本发明通过去除组氨酸衰减子的特定序列，意外的获得了可以显著提高基因表达水平的组氨酸衰减子突变体。显而易见，根据本发明的试验结果，本领域技术人员可轻易推论得到，去除上述衰减子的终止子茎环结构中前段反向互补回文序列的部分序列，在一定程度上破坏终止子二级互补结构，同样可能得到相似性能的组氨酸衰减子突变体和组氨酸操纵子突变体。因此，这种类似的改造组氨酸衰减子的方法也在本专利的保护范围之中。显而易见，本发明解除大肠杆菌的组氨酸衰减子的方法，同样可应用于其它菌属的组氨酸衰减子。本发明还公开了一种解除衰减调控的组氨酸操纵子基因，具体为去除编码前导肽的基因hisL和终止子茎环结构中前段反向互补回文序列、而保留终止子后段反向互补回文序列的组氨酸操纵子。

应用本发明提供的组氨酸衰减子改造方法，显著提高了工程菌的组氨酸发酵性能。本发明在实践上可用于细菌发酵生产组氨酸。显而易见，本发明还可用于组氨酸代谢途径下游化合物如组胺的生物合成。

采用本发明提供的方案，可以显著提高组氨酸及其衍生物产量，对于组氨酸及其衍生物的生产领域具有极其重大的应用推广价值。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。ATCC：https://www.atcc.org/。

大肠杆菌K12MG1655：ATCC编号为700926。pACYC184质粒：NEB公司，产品目录号E4152S。pGFPuv载体：Clontech Laboratories,Inc.，Catalog No.632312。大肠杆菌EC135：记载于如下文献：Zhang et al,Plos Genetics，2012,8(9):e1002987。pKOV质粒：Addgene公司，产品目录号为25769。

实施例1、衰减子突变体调控gfp基因的表达

一、构建重组质粒pACYC184-P_BB

1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子(启动子P_BB)。

2、以步骤1制备的双链DNA分子为模板，采用WY841和WY842组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

WY841：TGCTCTAGACAATTCCGACGTCTAAGAGA；

WY842：CCCAAGCTTGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶XbaI和Hind III进行双酶切，回收酶切产物。

4、取pACYC184质粒，用限制性内切酶XbaI和HindIII进行双酶切，回收载体骨架(约4.1kb)。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pACYC184-P_BB。

二、构建各个重组质粒以及相应的重组菌

1、构建重组菌GFP3230

(1)以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY3230和WY3236组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A1；以pGFPuv载体为模板，采用WY3105和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A2；将PCR扩增产物A1和PCR扩增产物A2混合后作为模板，采用WY3223和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A3。

WY3230：CCCAAGCTT AAACATTCACAGAGACTTTT atgACAC；

WY3236：AGTTCTTCTCCTTTACTCATAGAACCAGAACCAGAACCAATGCCACAGCGCGCCAGCA；

WY3105：GGTTCTGGTTCTGGTTCTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA；

WY1859：ACATGCATGC

TTATTTGTAGAGCTCATCCATGCCA。

(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物A3，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收酶切产物。

(3)取重组质粒pACYC184-P_BB，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。

(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌EC135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pACYC184-P_BB-hisLG-gfp3230。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-P_BB-hisLG-gfp3230进行结构描述如下：在质粒_pACYC184的Xba I和Sph I酶切位点之间插入了特异DNA分子；特异DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子P_BB，限制性内切酶Hind III的酶切识别序列，RBS序列“AAACATTCACAGAGACTTTT”，序列表的序列2第1至286位核苷酸(包含完整的组氨酸衰减子和hisG基因的开放阅读框中编码前30个氨基酸残基的序列)，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列3所示的gfp基因，终止子序列

“CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG”。

含有重组质粒pACYC184-P_BB-hisLG-gfp3230的大肠杆菌EC135命名为重组菌GFP3230。

2、构建重组菌GFP3231

(1)以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY3231和WY3236组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A1；以pGFPuv载体为模板，采用WY3105和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A2；将PCR扩增产物A1和PCR扩增产物A2混合后作为模板，采用WY3231和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A3。

WY3231：CCCAAGCTT ACCTTCCGGGGGCTTTTTTATTGC。

(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物A3，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收酶切产物。

(3)取重组质粒pACYC184-P_BB，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收载体骨架。

(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌EC135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pACYC184-P_BB-hisLG-gfp3231。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-P_BB-hisLG-gfp3231进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和Sph I酶切位点之间插入了特异DNA分子；特异DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子P_BB，限制性内切酶Hind III的酶切识别序列，序列表的序列2第130至286位核苷酸(包括组氨酸衰减子截短体和hisG基因的开放阅读框中编码前30个氨基酸残基的序列)，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列3所示的gfp基因，终止子序列“CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG”。

含有重组质粒pACYC184-P_BB-hisLG-gfp3231的大肠杆菌EC135命名为重组菌GFP3231。

3、构建重组菌GFP3232

(1)以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY3232和WY3236组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A1；以pGFPuv载体为模板，采用WY3105和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A2；将PCR扩增产物A1和PCR扩增产物A2混合后作为模板，采用WY3232和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A3。

WY3232：CCCAAGCTT GTTTAAAGAGGAATAACAAAATGACA。

(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物A3，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收酶切产物。

(3)取重组质粒pACYC184-P_BB，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收载体骨架。

(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌EC135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pACYC184-P_BB-hisLG-gfp3232。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-P_BB-hisLG-gfp3232进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和Sph I酶切位点之间插入了特异DNA分子；特异DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子P_BB，限制性内切酶Hind III的酶切识别序列，序列表的序列2第177至286位核苷酸(包含hisG基因的开放阅读框中编码前30个氨基酸残基的序列，且完全去除了组氨酸衰减子)，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列3所示的gfp基因，终止子序列“CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG”。

含有重组质粒pACYC184-P_BB-hisLG-gfp3232的大肠杆菌EC135命名为重组菌GFP3232。

4、构建GFP对照

将重组质粒pACYC184-P_BB导入大肠杆菌EC135，得到的重组菌命名为GFP对照。

三、GFP荧光强度分析

试验菌株为：重组菌GFP3230、重组菌GFP3231或重组菌GFP3232。

设置GFP对照作为对照菌株。

1、将试验菌株或对照菌株接种至含34mg/L氯霉素的液体LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜。

2、取步骤1得到的菌液，按照1％接种量接种于含34mg/L氯霉素的液体2×YT培养基中，37℃、220rpm振荡培养10小时。

3、取150μL步骤2得到的菌液，加入黑边透底的96孔板中，使用高通量多功能酶标仪(INFINITE 200PRO型，瑞士TECAN)同时检测细胞密度和GFP荧光信号。检测细胞密度的相关参数设置见表1。检测GFP荧光信号的相关参数设置见表2。

表1

	吸光度(Absorbance)
		波长(Wavelength)	600nm
带宽(Bandwidth)	9nm
		闪光次数(Number of Flashes)	25
建立时间(Settle Time)	0ms

表2

	荧光顶读(Fluorescence Top Reading)
		激发波长(Excitation Wavelength)	400nm
发射波长(Emission Wavelength)	510nm
		激发带宽(Excitation Bandwidth)	9nm
发射带宽(Emission Bandwidth)	20nm
		收集(Gain)	100(手动，Manual)
闪光次数(Number of Flashes)	15
		积分时间(Integration Time)	20μs
滞后时间(LagTime)	0μs
		建立时间(Settle Time)	0ms
Z位置(Z-Position)	20000μm(手动，Manual)

各个试验菌株的荧光强度值＝实测荧光值÷细胞密度-对照菌株的实测荧光值÷对照菌株的细胞密度。设置三次重复试验，相应的平均值和标准差结果见表3。

与重组菌GFP3230(完全保留组氨酸衰减子)相比，重组菌GFP3231的荧光强度提高了36.8倍。与重组菌GFP3232(完全去除组氨酸衰减子)相比，重组菌GFP3231的荧光强度提高了43.5倍。结果表明，位于启动子和目的基因之间的组氨酸衰减子截短体可以作为调控元件，促进目的基因的表达。

组氨酸衰减子突变体如序列表的序列2第n1-n2位核苷酸所示，n1为126以上143以下的自然数(n1优选为130)，n2为148以上286以下的自然数(n2具体可为148以上196以下的自然数或197以上286以下的自然数，更具体可为148、196或286)。组氨酸衰减子突变体包括组氨酸衰减子截短体和组氨酸衰减子变体(全称为在组氨酸衰减子截短体下游连接其他核苷酸的变体)。组氨酸衰减子截短体如序列表的序列2第n1-148位核苷酸所示。组氨酸衰减子变体如序列表的序列2第n1-n4位核苷酸所示，n4为149以上286以下的自然数(n4具体可为149以上196以下的自然数或197以上286以下的自然数，更具体可为196或286)。

表3

	荧光强度
		重组菌GFP3230	574.4±35.2
重组菌GFP3231	21727.8±583.2
		重组菌GFP3232	488.5±28.3

实施例2、制备组氨酸

一、工程菌E.coliMG1655hisG*ΔhisL的构建

1、以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY4013和WY4014组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A1。以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY4015和WY4016组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A2。

WY4013：CGCGGATCCCGTCCCATGATTCCTCAGA；

WY4014：AAAGCCCCCGGAAGGTGATGTGAATGTTTATTCAACTGATGTC。

WY4015：GACATCAGTTGAATAAACATTCACATCACCTTCCGGGGGCTTT；

WY4016：ATTGCGGCCGCCCCAGAACAG GGTTTTGCTGCTGACC。

大肠杆菌K12MG1655的基因组中的相关序列见序列表的序列4，第596至743位核苷酸为组氨酸衰减子，第792至1691位核苷酸为编码ATP磷酸核糖转移酶的基因。WY4013和WY4014用于扩增上游同源臂，WY4015和WY4016用于扩增下游同源臂并且在编码ATP磷酸核糖转移酶的基因中引入一个点突变。上游同源臂位于组氨酸衰减子的上游，下游同源臂的起始端对应组氨酸衰减子的第127位核苷酸、终止端位于编码ATP磷酸核糖转移酶的基因内。将大肠杆菌K12MG1655的基因组中引入上述点突变前的相应基因编码的ATP磷酸核糖转移酶命名为HisG蛋白(如序列表的序列6所示)。将引入上述点突变后的相应基因编码的ATP磷酸核糖转移酶命名为HisG*蛋白(如序列表的序列5所示)。与HisG蛋白相比，HisG*蛋白的差异仅在于将HisG蛋白第271位氨基酸残基由谷氨酸突变为了赖氨酸，从而解除了反馈阻遏。

2、将步骤1得到的PCR扩增产物A1和PCR扩增产物A2混合后作为模板，采用WY4013和WY4016组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收酶切产物。

4、取pKOV质粒，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收载体骨架(约5.6kb)。

5、将步骤3的酶切产物与步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pKOV-ΔhisL-hisG*。根据测序结果，对重组质粒pKOV-ΔhisL-hisG*进行结构描述如下：在pKOV质粒的Bam HI和Not I酶切位点之间插入了特异DNA分子；特异DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列4第32至585位核苷酸所示的上游同源臂，序列表的序列4第722至1617位核苷酸所示的下游同源臂。

6、将重组质粒pKOV-ΔhisL-hisG*导入大肠杆菌K12MG1655，得到发生同源重组的重组菌，将其命名为工程菌E.coliMG1655hisG*ΔhisL。经测序验证，与大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA相比，工程菌E.coliMG1655hisG*ΔhisL存在两个差异：(1)删除了基因组中序列4所示DNA分子中的第586至721位核苷酸(被删除了核苷酸中：前10个为组氨酸衰减子上游的10个核苷酸，剩余的核苷酸为组氨酸衰减子的第1至126位核苷酸)；(2)将基因组中序列4所示DNA分子中的第1602位核苷酸由G突变为了A。工程菌E.coliMG1655hisG*ΔhisL中的组氨酸操纵子如序列表的序列2第127至7230位核苷酸所示。

二、工程菌E.coliMG1655hisG*的构建

1、以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY4013和WY4019组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

WY4019:ATTGCGGCCGCCAGAACCGTTCAGTAAGCAG。

2、取步骤1得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收酶切产物。

3、取pKOV质粒，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收载体骨架(约5.6kb)。

4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pKOV-hisL。

5、将重组质粒pKOV-hisL导入工程菌E.coliMG1655hisG*ΔhisL，得到发生同源重组的重组菌，将其命名为工程菌E.coliMG1655hisG*。

经测序验证，与大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA相比，工程菌E.coliMG1655hisG*存在一个差异：将基因组中序列4所示DNA分子中的第1602位核苷酸由G突变为了A。

三、组氨酸工程菌的摇瓶发酵试验

试验菌株为：工程菌E.coliMG1655hisG*ΔhisL或工程菌E.coliMG1655hisG*。

1、取试验菌株，划线接种于固体LB培养基平板，37℃静置培养12小时。

2、完成步骤1后，挑取平板上的菌苔，接种至液体LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养8h，得到种子液(OD_600nm值＝5.0)。

3、完成步骤2后，将种子液按照3％的接种量接种至发酵培养基中，37℃、220rpm震荡培养。

发酵培养基：葡萄糖20.0g/L、硫酸铵15.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、七水硫酸镁2.0g/L、酵母粉2.0g/L、碳酸钙15.0g/L、微量元素混合液5mL/L，余量为水。

微量元素混合液：FeSO₄·7H₂O 10g/L、CaCl₂ 1.35g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L、MnSO₄·4H₂O0.5g/L、CuSO₄·5H₂O 1g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.106g/L、Na₂B₄O₇·10H₂O0.23g/L、CoCl₂·6H₂O0.48g/L、35％HCl 10mL/L，余量为水。

培养过程中，用氨水调节反应体系的pH值使其维持在6.8-7.0。

培养过程中，每隔3-4h取样一次，使用生物传感分析仪SBA-40D检测葡萄糖含量，当体系中的葡萄糖含量低于5g/L时，补加葡萄糖并使体系中的葡萄糖浓度达到10g/L。

培养36h后取样，12000g离心2分钟，取上清液(即发酵上清)，检测L-组氨酸浓度。

结果见表4(三次重复试验的平均值±标准差)。与工程菌E.coliMG1655hisG*相比，工程菌E.coliMG1655hisG*ΔhisL发酵生产L-组氨酸的产量显著提高。

表4

	发酵上清中的L-组氨酸含量(g/L)
		工程菌E.coliMG1655hisG*	0.22±0.05
工程菌E.coliMG1655hisG*ΔhisL	1.35±0.25

L-组氨酸浓度的检测方法：高效液相法，在参考文献(氨基酸和生物资源，2000，22，59-60)中氨基酸检测方法的基础上进行优化，具体方法如下(2,4-二硝基氟苯(FDBN)柱前衍生高效液相法)：

取10μL上清液于2mL离心管中，加入200μL 0.5M NaHCO₃水溶液和100μL 1％(体积比)FDBN-乙腈溶液，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至室温，然后加入700μL0.04mol/L KH₂PO₄水溶液(pH＝7.2±0.05,用40g/L KOH水溶液调整pH)并摇匀，静置15min，然后过滤并收集滤液。滤液用于上样，进样量为15μL。

色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm,Agilent,USA)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相A为0.04mol/L KH₂PO₄水溶液(pH＝7.2±0.05,用40g/100mL KOH水溶液调整pH)，流动相B为55％(体积比)乙腈水溶液，流动相总流量为1mL/min。

洗脱过程：洗脱起始时刻(0min)流动相A占流动相总流量的体积份数为86％、流动相B占流动相总流量的体积份数为14％；洗脱过程分为4个阶段，每个阶段中流动相A和流动相B占流动相总流量的体积份数均为线性变化；第1阶段(从起始时刻开始共进行2min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为88％、流动相B占流动相总流量的体积份数为12％，第2阶段(从第1阶段结束时刻开始共进行2min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为86％、流动相B占流动相总流量的体积份数为14％，第3阶段(从第2阶段结束时刻开始共进行6min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为70％、流动相B占流动相总流量的体积份数为30％，第4阶段(从第3阶段结束时刻开始共进行10min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为30％、流动相B占流动相总流量的体积份数为70％。

以市售L-组氨酸为标准品制作标准曲线，计算样品的组氨酸浓度。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 组氨酸衰减子突变体和解决反馈阻遏的组氨酸操纵子以及它们的应用

<130> GNCYX171068

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caattccgac gtctaagaga ccattattat cgtgacatta acctataaga acaggcgtgt 60

cacgaggccc tttcgtcttc acctcgagtc cctatcagtg acagagattg acacccctat 120

cagtgataga gatactgagc acatcagcag gacgcactga cc 162

<210> 2

<211> 7230

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgacacgcg ttcaatttaa acaccaccat catcaccatc atcctgacta gtctttcagg 60

cgatgtgtgc tggaagacat tcagatcttc cagtggtgca tgaacgcatg agaaagcccc 120

cggaagatca ccttccgggg gcttttttat tgcgcggttg ataacggttc agacaggttt 180

aaagaggaat aacaaaatga cagacaacac tcgtttacgc atagctatgc agaaatccgg 240

ccgtttaagt gatgactcac gcgaattgct ggcgcgctgt ggcattaaaa ttaatcttca 300

cacccagcgc ctgatcgcga tggcagaaaa catgccgatt gatattctgc gcgtgcgtga 360

cgacgacatt cccggtctgg taatggatgg cgtggtagac cttgggatta tcggcgaaaa 420

cgtgctggaa gaagagctgc ttaaccgccg cgcccagggt gaagatccac gctactttac 480

cctgcgtcgt ctggatttcg gcggctgtcg tctttcgctg gcaacgccgg ttgatgaagc 540

ctgggacggt ccgctctcct taaacggtaa acgtatcgcc acctcttatc ctcacctgct 600

caagcgttat ctcgaccaga aaggcatctc ttttaaatcc tgcttactga acggttctgt 660

tgaagtcgcc ccgcgtgccg gactggcgga tgcgatttgc gatctggttt ccaccggtgc 720

cacgctggaa gctaacggcc tgcgcgaagt cgaagttatc tatcgctcga aagcctgcct 780

gattcaacgc gatggcgaaa tggaagaatc caaacagcaa ctgatcgaca aactgctgac 840

ccgtattcag ggtgtgatcc aggcgcgcga atcaaaatac atcatgatgc acgcaccgac 900

cgaacgtctg gatgaagtca tcgccctgct gccaggtgcc gaacgcccaa ctattctgcc 960

gctggcgggt gaccaacagc gcgtagcgat gcacatggtc agcagcaaaa ccctgttctg 1020

ggaaaccatg gaaaaactga aagcgctggg tgccagttca attctggtcc tgccgattga 1080

gaagatgatg gagtgatcgc catgagcttt aacacaatca ttgactggaa tagctgtact 1140

gcggagcaac aacgccagct gttaatgcgc ccggcgattt ccgcctctga aagcattacc 1200

cgcactgtta acgatattct cgataacgtg aaagcacgcg gcgatgaggc cctgcgggaa 1260

tacagcgcga agtttgataa aaccacggtt accgcgctga aggtgtctgc agaggagatc 1320

gccgccgcca gcgaacgcct gagcgacgag ctaaaacagg cgatggcggt ggcagtaaag 1380

aatattgaaa ccttccacac tgcgcaaaaa ctgccgccgg tagatgtaga aacgcagcca 1440

ggcgtgcgtt gccagcaggt cacgcgtccg gtagcttcag ttgggttgta tattcctggc 1500

ggctccgccc cgctcttctc aacggtatta atgctggcga ctccggcgag tattgcgggc 1560

tgtaaaaaag tggtgctgtg ctcaccgccg ccgattgccg atgagatcct ttatgcggcg 1620

cagctgtgcg gtgtgcagga cgtgtttaac gtcggcggcg cacaggccat tgccgcactg 1680

gcgtttggta cggaatctgt gccaaaagtg gacaaaatct tcgggccggg taacgccttt 1740

gtcaccgaag cgaaacgtca ggtgagccag cgtctggacg gtgcggcgat cgatatgccc 1800

gcaggcccgt cggaagtgct ggtgattgct gacagcggcg ctacgccgga tttcgtggct 1860

tctgatttgc tctctcaggc tgaacacggc ccggactcac aggtgatttt actgacgccc 1920

gctgctgata tggcgcgtcg cgttgccgag gccgtcgaac gccaactggc agaactgccg 1980

cgtgccgaaa ccgcccgcca ggcactgaac gccagccgcc tgatcgtgac taaagattta 2040

gcgcagtgcg tggagatctc caaccagtac ggcccggagc acctgatcat tcagacccgc 2100

aacgcccgtg aactggtcga tagcatcacc agcgccggtt cggtatttct tggtgactgg 2160

tcaccggaat cggcaggtga ttacgcctcc ggcaccaacc acgttctacc gacttacggt 2220

tacaccgcca cctgttccag cctcgggctg gcagatttcc agaagcgcat gaccgtacag 2280

gaactgtcga aagaggggtt ctccgcgctg gcttcaacca tagaaacact ggccgccgcc 2340

gagcgcctga ccgcccacaa aaatgccgtt actttgcgtg ttaacgccct taaggagcaa 2400

gcatgagcac cgtgactatt accgatttag cgcgtgaaaa cgtccgcaac ctgacgccgt 2460

atcagtcggc gcgtcgtctg ggcggtaacg gcgatgtctg gctgaacgcc aacgaatacc 2520

ccactgccgt ggagtttcag cttactcagc aaacgctcaa ccgctacccg gaatgccagc 2580

cgaaagcggt gattgaaaat tacgcgcaat atgcaggcgt aaaaccggag caggtgctgg 2640

tcagccgtgg cgcggacgaa ggtattgaac tgctgattcg cgctttttgc gaaccgggta 2700

aagacgccat cctctactgc ccgccaacgt acggcatgta cagcgtcagc gccgaaacga 2760

ttggcgtcga gtgccgcaca gtgccgacgc tggacaactg gcaactggac ttacagggca 2820

tttccgacaa gctggacggc gtaaaagtgg tttatgtttg cagccccaat aacccgaccg 2880

ggcaactgat caatccgcag gattttcgca ccctgctgga gttaacccgc ggtaaggcga 2940

ttgtggttgc cgatgaagcc tatatcgagt tttgcccgca ggcatcgctg gctggctggc 3000

tggcggaata tccgcacctg gctattttac gcacactgtc gaaagctttt gctctggcgg 3060

ggcttcgttg cggatttacg ctggcaaacg aagaagtcat caacctgctg atgaaagtga 3120

tcgcccccta cccgctctcg acgccggttg ccgacattgc ggcccaggcg ttaagcccac 3180

agggaatcgt cgccatgcgc gaacgggtag cgcaaattat tgcagaacgc gaatacctga 3240

ttgccgcact gaaagagatc ccctgcgtag agcaggtttt cgactctgaa accaactaca 3300

ttctggcgcg ctttaaagcc tccagtgcgg tgtttaaatc tttgtgggat cagggcatta 3360

tcttacgtga tcagaataaa caaccctctt taagcggctg cctgcgaatt accgtcggaa 3420

cccgtgaaga aagccagcgc gtcattgacg ccttacgtgc ggagcaagtt tgatgagtca 3480

gaagtatctt tttatcgatc gcgatggaac cctgattagc gaaccgccga gtgattttca 3540

ggtggaccgt tttgataaac tcgcctttga accgggcgtg atcccggaac tgctgaagct 3600

gcaaaaagcg ggctacaagc tggtgatgat cactaatcag gatggtcttg gaacacaaag 3660

tttcccacag gcggatttcg atggcccgca caacctgatg atgcagatct tcacctcgca 3720

aggcgtacag tttgatgaag tgctgatttg tccgcacctg cccgccgatg agtgcgactg 3780

ccgtaagccg aaagtaaaac tggtggaacg ttatctggct gagcaagcga tggatcgcgc 3840

taacagttat gtgattggcg atcgcgcgac cgacattcaa ctggcggaaa acatgggcat 3900

tactggttta cgctacgacc gcgaaaccct gaactggcca atgattggcg agcaactcac 3960

cagacgtgac cgttacgctc acgtagtgcg taataccaaa gagacgcaga ttgacgttca 4020

ggtgtggctg gatcgtgaag gtggcagcaa gattaacacc ggcgttggct tctttgatca 4080

tatgctggat cagatcgcta cccacggcgg tttccgcatg gaaatcaacg tcaaaggcga 4140

cctctatatc gacgatcacc acaccgtcga agataccggc ctggcgctgg gcgaagcgct 4200

aaaaatcgcc ctcggagaca aacgcggtat ttgccgcttt ggttttgtgc taccgatgga 4260

cgaatgcctt gcccgctgcg cgctggatat ctctggtcgc ccgcacctgg aatataaagc 4320

cgagtttacc taccagcgcg tgggcgatct cagcaccgaa atgatcgagc acttcttccg 4380

ttcgctctca tacaccatgg gcgtgacgct acacctgaaa accaaaggta aaaacgatca 4440

tcaccgtgta gagagtctgt tcaaagcctt tggtcgcacc ctgcgccagg ccatccgcgt 4500

ggaaggcgat accctgccct cgtcgaaagg agtgctgtaa tgaacgtggt gatccttgat 4560

accggctgcg ccaacctgaa ctcggtgaag tctgccattg cgcgtcacgg ttatgaaccc 4620

aaagtcagcc gtgacccgga cgtcgtgttg ctggccgata aactgttttt acccggcgtt 4680

ggcactgcgc aagcggcgat ggatcaggta cgtgagcgcg agctgtttga tctcatcaaa 4740

gcctgtaccc aaccggtgct gggcatctgc ttagggatgc aactgctggg gcggcgcagc 4800

gaagagagca acggcgtcga cttgctgggc atcatcgacg aagacgtgcc gaaaatgacc 4860

gactttggtc tgccactgcc acatatgggc tggaaccgcg tttacccgca ggcaggcaac 4920

cgcctgtttc aggggattga agacggcgcg tacttttact ttgttcacag ctacgcaatg 4980

ccggtcaatc cgtggaccat cgcccagtgt aattacggcg aaccgttcac cgcggcggta 5040

caaaaagata acttctacgg cgtgcagttc cacccggagc gttctggtgc cgctggtgct 5100

aagttgctga aaaacttcct ggagatgtga tgattattcc ggcattagat ttaatcgacg 5160

gcactgtggt gcgtctccat cagggcgatt acggcaaaca gcgcgattac ggtaacgacc 5220

cgctgccgcg attgcaggat tacgccgcgc agggtgccga agtgctgcac ctggtggatc 5280

tgaccggggc aaaagatccg gctaaacgtc aaatcccgct gattaaaacc ctggtcgcgg 5340

gcgttaacgt tccggtgcag gttggcggcg gcgtgcgtag cgaagaagat gtggcggcgt 5400

tactggaagc gggcgttgcg cgcgtagtgg tcggctccac cgcggtgaaa tcacaagata 5460

tggtgaaagg ctggtttgaa cgcttcggtg ccgatgcctt agtgctggcg ctggatgtcc 5520

gtattgacga gcaaggcaac aagcaggtgg cagtcagcgg ctggcaagag aactcgggcg 5580

tttcactgga acaactggtg gaaacctatc tgcccgtcgg cctgaaacat gtgctgtgta 5640

ccgatatctc gcgcgacggc acgctggcag gctctaacgt ctctttatat gaagaagtgt 5700

gcgccagata tccgcaggtg gcatttcagt cctccggcgg tattggcgac attgatgatg 5760

tggcggccct gcgtggcact ggtgtgcgcg gcgtaatagt tggtcgggca ttactggaag 5820

gtaaattcac cgtgaaggag gccatcgcat gctggcaaaa cgcataatcc catgtctcga 5880

cgttcgtgat ggtcaggtgg tgaaaggcgt acagtttcgc aaccatgaaa tcattggcga 5940

tatcgtgccg ctggcaaaac gctacgctga agaaggcgct gacgaactgg tgttctacga 6000

tatcaccgct tccagcgatg gccgtgtggt agataaaagc tgggtatctc gcgtggcgga 6060

agtgatcgac attccgtttt gtgtggcggg tgggattaag tctctggaag atgccgcgaa 6120

aattctttcc tttggcgcgg ataaaatttc catcaactct cctgcgctgg cagacccaac 6180

attaattact cgcctggccg atcgctttgg cgtgcagtgt attgtggtcg gtattgatac 6240

ctggtacgac gccgaaaccg gtaaatatca tgtgaatcaa tataccggcg atgaaagccg 6300

cacccgcgtc actcaatggg aaacgctcga ctgggtacag gaagtgcaaa aacgcggtgc 6360

cggagaaatc gtcctcaata tgatgaatca ggacggcgtg cgtaacggtt acgacctcga 6420

acaactgaaa aaagtgcgtg aagtttgcca cgtcccgctg attgcctccg gtggcgcggg 6480

caccatggaa cacttcctcg aagccttccg cgatgccgac gttgacggcg cgctggcagc 6540

ttccgtattc cacaaacaaa taatcaatat tggtgaatta aaagcgtacc tggcaacaca 6600

gggcgtggag atcaggatat gttaacagaa caacaacgtc gcgaactgga ctgggaaaaa 6660

accgacggac ttatgccggt gattgtgcaa cacgcggtat ccggcgaagt gctaatgctg 6720

ggctatatga acccggaagc cttagacaaa accctcgaaa gcggcaaagt caccttcttc 6780

tcgcgcacta aacagcgact gtggaccaaa ggcgaaacgt cgggcaattt cctcaacgta 6840

gtgagtattg ccccggactg cgacaacgac acgttactgg tgctggcgaa tcccatcggc 6900

ccgacctgcc acaaaggcac cagcagttgc ttcggcgaca ccgctcacca gtggctgttc 6960

ctgtatcaac tggaacaact gctcgccgag cgcaaatctg ccgatccgga aacctcctac 7020

accgccaaac tgtatgccag cggcaccaaa cgcattgcgc agaaagtggg tgaagaaggc 7080

gtggaaaccg cgctggcagc aacggtacat gaccgctttg agctgaccaa cgaggcgtct 7140

gatttgatgt atcacctgct ggtgttgttg caggatcagg ggctggattt aacgacggta 7200

attgagaacc tgcgtaaacg gcatcagtga 7230

<210> 3

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcccgtt atccggatca tatgaaacgg 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatcgtatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct cggacacaaa 420

ctcgagtaca actataactc acacaatgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagcta acttcaaaat tcgccacaac attgaagatg gatccgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtcgacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt 660

cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaataa 717

<210> 4

<211> 1691

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 4

cgcttatctg tttcctgcca gtacagataa tcgtcccatg attcctcaga ccagattagt 60

ttcactcaat gatgtccttt tccgttcctt tgcctgattt caggctatcg attgagtcca 120

tcaatctccg ggcgttagcg ggggagcgca gtagataagc cgtctcttcc agcgagttgt 180

attcttcgag tgacatcaga acacaagcct ctccattctg acgagtaata aggatcgggg 240

catgatcttc aacggctttc atcattgttg ccgacaaatt ctgacgcgct tcgctgtagc 300

taattgtacg catgtcaatc tcctcttttg tacagttcat tgtacaatga tgagcgttaa 360

ttaactattt attaattagt ttgtagatca aggtattgtc agtgagacga aaatccaggc 420

ttcgctattt ttggtgccat cagctaagag gacagtcctc ttagccccct cctttccccg 480

ctcattcatt aaacaaatcc attgccataa aatatataaa aaagcccttg ctttctaacg 540

tgaaagtggt ttaggttaaa agacatcagt tgaataaaca ttcacagaga cttttatgac 600

acgcgttcaa tttaaacacc accatcatca ccatcatcct gactagtctt tcaggcgatg 660

tgtgctggaa gacattcaga tcttccagtg gtgcatgaac gcatgagaaa gcccccggaa 720

gatcaccttc cgggggcttt tttattgcgc ggttgataac ggttcagaca ggtttaaaga 780

ggaataacaa aatgacagac aacactcgtt tacgcatagc tatgcagaaa tccggccgtt 840

taagtgatga ctcacgcgaa ttgctggcgc gctgtggcat taaaattaat cttcacaccc 900

agcgcctgat cgcgatggca gaaaacatgc cgattgatat tctgcgcgtg cgtgacgacg 960

acattcccgg tctggtaatg gatggcgtgg tagaccttgg gattatcggc gaaaacgtgc 1020

tggaagaaga gctgcttaac cgccgcgccc agggtgaaga tccacgctac tttaccctgc 1080

gtcgtctgga tttcggcggc tgtcgtcttt cgctggcaac gccggttgat gaagcctggg 1140

acggtccgct ctccttaaac ggtaaacgta tcgccacctc ttatcctcac ctgctcaagc 1200

gttatctcga ccagaaaggc atctctttta aatcctgctt actgaacggt tctgttgaag 1260

tcgccccgcg tgccggactg gcggatgcga tttgcgatct ggtttccacc ggtgccacgc 1320

tggaagctaa cggcctgcgc gaagtcgaag ttatctatcg ctcgaaagcc tgcctgattc 1380

aacgcgatgg cgaaatggaa gaatccaaac agcaactgat cgacaaactg ctgacccgta 1440

ttcagggtgt gatccaggcg cgcgaatcaa aatacatcat gatgcacgca ccgaccgaac 1500

gtctggatga agtcatcgcc ctgctgccag gtgccgaacg cccaactatt ctgccgctgg 1560

cgggtgacca acagcgcgta gcgatgcaca tggtcagcag cgaaaccctg ttctgggaaa 1620

ccatggaaaa actgaaagcg ctgggtgcca gttcaattct ggtcctgccg attgagaaga 1680

tgatggagtg a 1691

<210> 5

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Thr Asp Asn Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg

1 5 10 15

Leu Ser Asp Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile

20 25 30

Asn Leu His Thr Gln Arg Leu Ile Ala Met Ala Glu Asn Met Pro Ile

35 40 45

Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp

50 55 60

Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu

65 70 75 80

Leu Leu Asn Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu

85 90 95

Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Val

100 105 110

Asp Glu Ala Trp Asp Gly Pro Leu Ser Leu Asn Gly Lys Arg Ile Ala

115 120 125

Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Arg Tyr Leu Asp Gln Lys Gly Ile

130 135 140

Ser Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg

145 150 155 160

Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr

165 170 175

Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys

180 185 190

Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Glu Glu Ser Lys Gln Gln

195 200 205

Leu Ile Asp Lys Leu Leu Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg

210 215 220

Glu Ser Lys Tyr Ile Met Met His Ala Pro Thr Glu Arg Leu Asp Glu

225 230 235 240

Val Ile Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Thr Ile Leu Pro Leu

245 250 255

Ala Gly Asp Gln Gln Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Lys Thr

260 265 270

Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Ser

275 280 285

Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu

290 295

<210> 6

<211> 299

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 6

Met Thr Asp Asn Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg

1 5 10 15

Leu Ser Asp Asp Ser Arg Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile

20 25 30

Asn Leu His Thr Gln Arg Leu Ile Ala Met Ala Glu Asn Met Pro Ile

35 40 45

Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp

50 55 60

Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu

65 70 75 80

Leu Leu Asn Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu

85 90 95

Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Val

100 105 110

Asp Glu Ala Trp Asp Gly Pro Leu Ser Leu Asn Gly Lys Arg Ile Ala

115 120 125

Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Arg Tyr Leu Asp Gln Lys Gly Ile

130 135 140

Ser Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg

145 150 155 160

Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr

165 170 175

Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys

180 185 190

Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Glu Glu Ser Lys Gln Gln

195 200 205

Leu Ile Asp Lys Leu Leu Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg

210 215 220

Glu Ser Lys Tyr Ile Met Met His Ala Pro Thr Glu Arg Leu Asp Glu

225 230 235 240

Val Ile Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Thr Ile Leu Pro Leu

245 250 255

Ala Gly Asp Gln Gln Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Glu Thr

260 265 270

Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Ser

275 280 285

Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu

290 295

<210> 7

<211> 434

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 7

Met Ser Phe Asn Thr Ile Ile Asp Trp Asn Ser Cys Thr Ala Glu Gln

1 5 10 15

Gln Arg Gln Leu Leu Met Arg Pro Ala Ile Ser Ala Ser Glu Ser Ile

20 25 30

Thr Arg Thr Val Asn Asp Ile Leu Asp Asn Val Lys Ala Arg Gly Asp

35 40 45

Glu Ala Leu Arg Glu Tyr Ser Ala Lys Phe Asp Lys Thr Thr Val Thr

50 55 60

Ala Leu Lys Val Ser Ala Glu Glu Ile Ala Ala Ala Ser Glu Arg Leu

65 70 75 80

Ser Asp Glu Leu Lys Gln Ala Met Ala Val Ala Val Lys Asn Ile Glu

85 90 95

Thr Phe His Thr Ala Gln Lys Leu Pro Pro Val Asp Val Glu Thr Gln

100 105 110

Pro Gly Val Arg Cys Gln Gln Val Thr Arg Pro Val Ala Ser Val Gly

115 120 125

Leu Tyr Ile Pro Gly Gly Ser Ala Pro Leu Phe Ser Thr Val Leu Met

130 135 140

Leu Ala Thr Pro Ala Ser Ile Ala Gly Cys Lys Lys Val Val Leu Cys

145 150 155 160

Ser Pro Pro Pro Ile Ala Asp Glu Ile Leu Tyr Ala Ala Gln Leu Cys

165 170 175

Gly Val Gln Asp Val Phe Asn Val Gly Gly Ala Gln Ala Ile Ala Ala

180 185 190

Leu Ala Phe Gly Thr Glu Ser Val Pro Lys Val Asp Lys Ile Phe Gly

195 200 205

Pro Gly Asn Ala Phe Val Thr Glu Ala Lys Arg Gln Val Ser Gln Arg

210 215 220

Leu Asp Gly Ala Ala Ile Asp Met Pro Ala Gly Pro Ser Glu Val Leu

225 230 235 240

Val Ile Ala Asp Ser Gly Ala Thr Pro Asp Phe Val Ala Ser Asp Leu

245 250 255

Leu Ser Gln Ala Glu His Gly Pro Asp Ser Gln Val Ile Leu Leu Thr

260 265 270

Pro Ala Ala Asp Met Ala Arg Arg Val Ala Glu Ala Val Glu Arg Gln

275 280 285

Leu Ala Glu Leu Pro Arg Ala Glu Thr Ala Arg Gln Ala Leu Asn Ala

290 295 300

Ser Arg Leu Ile Val Thr Lys Asp Leu Ala Gln Cys Val Glu Ile Ser

305 310 315 320

Asn Gln Tyr Gly Pro Glu His Leu Ile Ile Gln Thr Arg Asn Ala Arg

325 330 335

Glu Leu Val Asp Ser Ile Thr Ser Ala Gly Ser Val Phe Leu Gly Asp

340 345 350

Trp Ser Pro Glu Ser Ala Gly Asp Tyr Ala Ser Gly Thr Asn His Val

355 360 365

Leu Pro Thr Tyr Gly Tyr Thr Ala Thr Cys Ser Ser Leu Gly Leu Ala

370 375 380

Asp Phe Gln Lys Arg Met Thr Val Gln Glu Leu Ser Lys Glu Gly Phe

385 390 395 400

Ser Ala Leu Ala Ser Thr Ile Glu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Arg Leu

405 410 415

Thr Ala His Lys Asn Ala Val Thr Leu Arg Val Asn Ala Leu Lys Glu

420 425 430

Gln Ala

<210> 8

<211> 356

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 8

Met Ser Thr Val Thr Ile Thr Asp Leu Ala Arg Glu Asn Val Arg Asn

1 5 10 15

Leu Thr Pro Tyr Gln Ser Ala Arg Arg Leu Gly Gly Asn Gly Asp Val

20 25 30

Trp Leu Asn Ala Asn Glu Tyr Pro Thr Ala Val Glu Phe Gln Leu Thr

35 40 45

Gln Gln Thr Leu Asn Arg Tyr Pro Glu Cys Gln Pro Lys Ala Val Ile

50 55 60

Glu Asn Tyr Ala Gln Tyr Ala Gly Val Lys Pro Glu Gln Val Leu Val

65 70 75 80

Ser Arg Gly Ala Asp Glu Gly Ile Glu Leu Leu Ile Arg Ala Phe Cys

85 90 95

Glu Pro Gly Lys Asp Ala Ile Leu Tyr Cys Pro Pro Thr Tyr Gly Met

100 105 110

Tyr Ser Val Ser Ala Glu Thr Ile Gly Val Glu Cys Arg Thr Val Pro

115 120 125

Thr Leu Asp Asn Trp Gln Leu Asp Leu Gln Gly Ile Ser Asp Lys Leu

130 135 140

Asp Gly Val Lys Val Val Tyr Val Cys Ser Pro Asn Asn Pro Thr Gly

145 150 155 160

Gln Leu Ile Asn Pro Gln Asp Phe Arg Thr Leu Leu Glu Leu Thr Arg

165 170 175

Gly Lys Ala Ile Val Val Ala Asp Glu Ala Tyr Ile Glu Phe Cys Pro

180 185 190

Gln Ala Ser Leu Ala Gly Trp Leu Ala Glu Tyr Pro His Leu Ala Ile

195 200 205

Leu Arg Thr Leu Ser Lys Ala Phe Ala Leu Ala Gly Leu Arg Cys Gly

210 215 220

Phe Thr Leu Ala Asn Glu Glu Val Ile Asn Leu Leu Met Lys Val Ile

225 230 235 240

Ala Pro Tyr Pro Leu Ser Thr Pro Val Ala Asp Ile Ala Ala Gln Ala

245 250 255

Leu Ser Pro Gln Gly Ile Val Ala Met Arg Glu Arg Val Ala Gln Ile

260 265 270

Ile Ala Glu Arg Glu Tyr Leu Ile Ala Ala Leu Lys Glu Ile Pro Cys

275 280 285

Val Glu Gln Val Phe Asp Ser Glu Thr Asn Tyr Ile Leu Ala Arg Phe

290 295 300

Lys Ala Ser Ser Ala Val Phe Lys Ser Leu Trp Asp Gln Gly Ile Ile

305 310 315 320

Leu Arg Asp Gln Asn Lys Gln Pro Ser Leu Ser Gly Cys Leu Arg Ile

325 330 335

Thr Val Gly Thr Arg Glu Glu Ser Gln Arg Val Ile Asp Ala Leu Arg

340 345 350

Ala Glu Gln Val

355

<210> 9

<211> 355

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 9

Met Ser Gln Lys Tyr Leu Phe Ile Asp Arg Asp Gly Thr Leu Ile Ser

1 5 10 15

Glu Pro Pro Ser Asp Phe Gln Val Asp Arg Phe Asp Lys Leu Ala Phe

20 25 30

Glu Pro Gly Val Ile Pro Glu Leu Leu Lys Leu Gln Lys Ala Gly Tyr

35 40 45

Lys Leu Val Met Ile Thr Asn Gln Asp Gly Leu Gly Thr Gln Ser Phe

50 55 60

Pro Gln Ala Asp Phe Asp Gly Pro His Asn Leu Met Met Gln Ile Phe

65 70 75 80

Thr Ser Gln Gly Val Gln Phe Asp Glu Val Leu Ile Cys Pro His Leu

85 90 95

Pro Ala Asp Glu Cys Asp Cys Arg Lys Pro Lys Val Lys Leu Val Glu

100 105 110

Arg Tyr Leu Ala Glu Gln Ala Met Asp Arg Ala Asn Ser Tyr Val Ile

115 120 125

Gly Asp Arg Ala Thr Asp Ile Gln Leu Ala Glu Asn Met Gly Ile Thr

130 135 140

Gly Leu Arg Tyr Asp Arg Glu Thr Leu Asn Trp Pro Met Ile Gly Glu

145 150 155 160

Gln Leu Thr Arg Arg Asp Arg Tyr Ala His Val Val Arg Asn Thr Lys

165 170 175

Glu Thr Gln Ile Asp Val Gln Val Trp Leu Asp Arg Glu Gly Gly Ser

180 185 190

Lys Ile Asn Thr Gly Val Gly Phe Phe Asp His Met Leu Asp Gln Ile

195 200 205

Ala Thr His Gly Gly Phe Arg Met Glu Ile Asn Val Lys Gly Asp Leu

210 215 220

Tyr Ile Asp Asp His His Thr Val Glu Asp Thr Gly Leu Ala Leu Gly

225 230 235 240

Glu Ala Leu Lys Ile Ala Leu Gly Asp Lys Arg Gly Ile Cys Arg Phe

245 250 255

Gly Phe Val Leu Pro Met Asp Glu Cys Leu Ala Arg Cys Ala Leu Asp

260 265 270

Ile Ser Gly Arg Pro His Leu Glu Tyr Lys Ala Glu Phe Thr Tyr Gln

275 280 285

Arg Val Gly Asp Leu Ser Thr Glu Met Ile Glu His Phe Phe Arg Ser

290 295 300

Leu Ser Tyr Thr Met Gly Val Thr Leu His Leu Lys Thr Lys Gly Lys

305 310 315 320

Asn Asp His His Arg Val Glu Ser Leu Phe Lys Ala Phe Gly Arg Thr

325 330 335

Leu Arg Gln Ala Ile Arg Val Glu Gly Asp Thr Leu Pro Ser Ser Lys

340 345 350

Gly Val Leu

355

<210> 10

<211> 196

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 10

Met Asn Val Val Ile Leu Asp Thr Gly Cys Ala Asn Leu Asn Ser Val

1 5 10 15

Lys Ser Ala Ile Ala Arg His Gly Tyr Glu Pro Lys Val Ser Arg Asp

20 25 30

Pro Asp Val Val Leu Leu Ala Asp Lys Leu Phe Leu Pro Gly Val Gly

35 40 45

Thr Ala Gln Ala Ala Met Asp Gln Val Arg Glu Arg Glu Leu Phe Asp

50 55 60

Leu Ile Lys Ala Cys Thr Gln Pro Val Leu Gly Ile Cys Leu Gly Met

65 70 75 80

Gln Leu Leu Gly Arg Arg Ser Glu Glu Ser Asn Gly Val Asp Leu Leu

85 90 95

Gly Ile Ile Asp Glu Asp Val Pro Lys Met Thr Asp Phe Gly Leu Pro

100 105 110

Leu Pro His Met Gly Trp Asn Arg Val Tyr Pro Gln Ala Gly Asn Arg

115 120 125

Leu Phe Gln Gly Ile Glu Asp Gly Ala Tyr Phe Tyr Phe Val His Ser

130 135 140

Tyr Ala Met Pro Val Asn Pro Trp Thr Ile Ala Gln Cys Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Glu Pro Phe Thr Ala Ala Val Gln Lys Asp Asn Phe Tyr Gly Val Gln

165 170 175

Phe His Pro Glu Arg Ser Gly Ala Ala Gly Ala Lys Leu Leu Lys Asn

180 185 190

Phe Leu Glu Met

195

<210> 11

<211> 245

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 11

Met Ile Ile Pro Ala Leu Asp Leu Ile Asp Gly Thr Val Val Arg Leu

1 5 10 15

His Gln Gly Asp Tyr Gly Lys Gln Arg Asp Tyr Gly Asn Asp Pro Leu

20 25 30

Pro Arg Leu Gln Asp Tyr Ala Ala Gln Gly Ala Glu Val Leu His Leu

35 40 45

Val Asp Leu Thr Gly Ala Lys Asp Pro Ala Lys Arg Gln Ile Pro Leu

50 55 60

Ile Lys Thr Leu Val Ala Gly Val Asn Val Pro Val Gln Val Gly Gly

65 70 75 80

Gly Val Arg Ser Glu Glu Asp Val Ala Ala Leu Leu Glu Ala Gly Val

85 90 95

Ala Arg Val Val Val Gly Ser Thr Ala Val Lys Ser Gln Asp Met Val

100 105 110

Lys Gly Trp Phe Glu Arg Phe Gly Ala Asp Ala Leu Val Leu Ala Leu

115 120 125

Asp Val Arg Ile Asp Glu Gln Gly Asn Lys Gln Val Ala Val Ser Gly

130 135 140

Trp Gln Glu Asn Ser Gly Val Ser Leu Glu Gln Leu Val Glu Thr Tyr

145 150 155 160

Leu Pro Val Gly Leu Lys His Val Leu Cys Thr Asp Ile Ser Arg Asp

165 170 175

Gly Thr Leu Ala Gly Ser Asn Val Ser Leu Tyr Glu Glu Val Cys Ala

180 185 190

Arg Tyr Pro Gln Val Ala Phe Gln Ser Ser Gly Gly Ile Gly Asp Ile

195 200 205

Asp Asp Val Ala Ala Leu Arg Gly Thr Gly Val Arg Gly Val Ile Val

210 215 220

Gly Arg Ala Leu Leu Glu Gly Lys Phe Thr Val Lys Glu Ala Ile Ala

225 230 235 240

Cys Trp Gln Asn Ala

245

<210> 12

<211> 258

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 12

Met Leu Ala Lys Arg Ile Ile Pro Cys Leu Asp Val Arg Asp Gly Gln

1 5 10 15

Val Val Lys Gly Val Gln Phe Arg Asn His Glu Ile Ile Gly Asp Ile

20 25 30

Val Pro Leu Ala Lys Arg Tyr Ala Glu Glu Gly Ala Asp Glu Leu Val

35 40 45

Phe Tyr Asp Ile Thr Ala Ser Ser Asp Gly Arg Val Val Asp Lys Ser

50 55 60

Trp Val Ser Arg Val Ala Glu Val Ile Asp Ile Pro Phe Cys Val Ala

65 70 75 80

Gly Gly Ile Lys Ser Leu Glu Asp Ala Ala Lys Ile Leu Ser Phe Gly

85 90 95

Ala Asp Lys Ile Ser Ile Asn Ser Pro Ala Leu Ala Asp Pro Thr Leu

100 105 110

Ile Thr Arg Leu Ala Asp Arg Phe Gly Val Gln Cys Ile Val Val Gly

115 120 125

Ile Asp Thr Trp Tyr Asp Ala Glu Thr Gly Lys Tyr His Val Asn Gln

130 135 140

Tyr Thr Gly Asp Glu Ser Arg Thr Arg Val Thr Gln Trp Glu Thr Leu

145 150 155 160

Asp Trp Val Gln Glu Val Gln Lys Arg Gly Ala Gly Glu Ile Val Leu

165 170 175

Asn Met Met Asn Gln Asp Gly Val Arg Asn Gly Tyr Asp Leu Glu Gln

180 185 190

Leu Lys Lys Val Arg Glu Val Cys His Val Pro Leu Ile Ala Ser Gly

195 200 205

Gly Ala Gly Thr Met Glu His Phe Leu Glu Ala Phe Arg Asp Ala Asp

210 215 220

Val Asp Gly Ala Leu Ala Ala Ser Val Phe His Lys Gln Ile Ile Asn

225 230 235 240

Ile Gly Glu Leu Lys Ala Tyr Leu Ala Thr Gln Gly Val Glu Ile Arg

245 250 255

Ile Cys

<210> 13

<211> 203

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 13

Met Leu Thr Glu Gln Gln Arg Arg Glu Leu Asp Trp Glu Lys Thr Asp

1 5 10 15

Gly Leu Met Pro Val Ile Val Gln His Ala Val Ser Gly Glu Val Leu

20 25 30

Met Leu Gly Tyr Met Asn Pro Glu Ala Leu Asp Lys Thr Leu Glu Ser

35 40 45

Gly Lys Val Thr Phe Phe Ser Arg Thr Lys Gln Arg Leu Trp Thr Lys

50 55 60

Gly Glu Thr Ser Gly Asn Phe Leu Asn Val Val Ser Ile Ala Pro Asp

65 70 75 80

Cys Asp Asn Asp Thr Leu Leu Val Leu Ala Asn Pro Ile Gly Pro Thr

85 90 95

Cys His Lys Gly Thr Ser Ser Cys Phe Gly Asp Thr Ala His Gln Trp

100 105 110

Leu Phe Leu Tyr Gln Leu Glu Gln Leu Leu Ala Glu Arg Lys Ser Ala

115 120 125

Asp Pro Glu Thr Ser Tyr Thr Ala Lys Leu Tyr Ala Ser Gly Thr Lys

130 135 140

Arg Ile Ala Gln Lys Val Gly Glu Glu Gly Val Glu Thr Ala Leu Ala

145 150 155 160

Ala Thr Val His Asp Arg Phe Glu Leu Thr Asn Glu Ala Ser Asp Leu

165 170 175

Met Tyr His Leu Leu Val Leu Leu Gln Asp Gln Gly Leu Asp Leu Thr

180 185 190

Thr Val Ile Glu Asn Leu Arg Lys Arg His Gln

195 200

Claims (10)

1.DNA分子甲，为如下（a1）、（a4）或（a5）：

（a1）序列表的序列2第130-286位核苷酸所示的DNA分子；

（a4）在（a1）的末端连接标签序列得到的DNA分子；

（a5）在（a1）的末端连接连接序列得到的DNA分子。

2.权利要求1所述DNA分子甲在促进下游目的基因表达中的应用。

3.DNA分子乙，自上游至下游依次包括：权利要求1所述DNA分子甲和目的基因。

4.DNA分子丙，自上游至下游依次包括：启动子、权利要求1所述DNA分子甲、目的基因和终止子。

5.DNA分子丁，是将组氨酸操纵子基因中的组氨酸衰减子第1至129位核苷酸去除后得到的DNA分子；所述组氨酸操纵子基因如序列表的序列2第1至7230位核苷酸所示。

6.DNA分子戊，是将组氨酸操纵子基因进行如下两个改造后得到的DNA分子：（1）将组氨酸衰减子第1至129位核苷酸去除；（2）将编码ATP 磷酸核糖转移酶的基因从编码野生蛋白的基因突变为编码解除了反馈阻遏的突变蛋白的基因；所述组氨酸操纵子基因如序列表的序列2第1至7230位核苷酸所示。

7.含有权利要求5或6所述DNA分子的重组载体或重组菌。

8.权利要求7所述重组菌在制备组氨酸中的应用。

9.一种提高微生物生产组氨酸的能力的方法，包括如下步骤：删除微生物的组氨酸操纵子基因中从组氨酸衰减子第1位开始计数的第1至129位核苷酸；所述组氨酸操纵子基因如序列表的序列2第1至7230位核苷酸所示。

10.一种解除微生物中组氨酸操纵子反馈阻遏的方法，包括如下步骤：删除微生物的组氨酸操纵子基因中从组氨酸衰减子第1位开始计数的第1至129位核苷酸；所述组氨酸操纵子基因如序列表的序列2第1至7230位核苷酸所示。