CN106520801B - 苏氨酸衰减子的突变体及其应用以及解除苏氨酸操纵子反馈阻遏的方法 - Google Patents

苏氨酸衰减子的突变体及其应用以及解除苏氨酸操纵子反馈阻遏的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解除阻遏的苏氨酸操纵子基因，自上游至下游依次包括元件甲和元件乙；所述元件甲如序列表的序列17第294至n1位核苷酸所示，n1为310以上336以下的自然数；所述元件乙为编码苏氨酸操纵子的基因。本发明还保护一种特异DNA分子，自上游至下游依次包括启动子和解除阻遏的苏氨酸操纵子基因。本发明还保护含有所述特异DNA分子的重组菌以及所述重组菌在生产苏氨酸中的应用。本发明在实践上可用于细菌发酵生产苏氨酸。

Description

苏氨酸衰减子的突变体及其应用以及解除苏氨酸操纵子反馈 阻遏的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及苏氨酸衰减子的突变体及其应用以及解除苏氨酸操纵子反馈阻遏的方法。
背景技术
L-苏氨酸(L-Threonine)的化学名称为α-氨基-β-羟基丁酸，是人体八种必需氨基酸之一。作为生物大分子的基本构成元件，苏氨酸对人和动物的营养及健康具有重要的生理作用，被广泛应用于食品、饲料、以及医药行业，是三大大宗发酵类氨基酸之一。近年来，苏氨酸的市场需求量逐年增长，其中饲料行业对苏氨酸的市场需求量最大。苏氨酸作为安全性饲料添加剂，是继赖氨酸之后的猪生长的第二限制氨基酸，并且是家禽生长的第三限制氨基酸，仅次于赖氨酸和蛋氨酸。
微生物发酵法是目前工业化生产苏氨酸的主要方法。大肠杆菌从天冬氨酸合成苏氨酸共需要五步酶催化反应，其中四步反应由苏氨酸操纵子thrABC编码的酶催化。大肠杆菌苏氨酸操纵子的表达由衰减子(Attenuator)进行翻译水平上的转录调控，胞内苏氨酸和异亮氨酸对大肠杆菌苏氨酸操纵子(thrABC)的协同阻遏作用导致其转录弱化。衰减子包含前导肽基因thrL和后续的终止子结构，位于苏氨酸操纵子的启动子之后和thrA基因之前。
发明内容
本发明的目的是提供一种苏氨酸衰减子的突变体及其在苏氨酸发酵生产中的应用。
本发明首先提供了一种解除阻遏的苏氨酸操纵子基因，自上游至下游依次包括元件甲和元件乙；所述元件甲如序列表的序列17第294至n1位核苷酸所示，n1为310以上336以下的自然数；所述元件乙为编码苏氨酸操纵子的基因。
n1具体可为311或336。
所述“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”中不含有序列表的序列17第1-293位核苷酸。
所述“编码苏氨酸操纵子的基因”为编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体的基因、编码高丝氨酸脱氢酶的基因和编码苏氨酸合成酶的基因。
所述天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体为ThrA蛋白(野生蛋白)或ThrA*蛋白(突变蛋白)。所述高丝氨酸脱氢酶为ThrB蛋白。所述苏氨酸合成酶为ThrC蛋白。编码ThrA蛋白的基因为thrA基因。编码ThrA*蛋白的基因为thrA*基因。编码ThrB蛋白的基因为thrB基因。编码ThrC蛋白的基因为thrC基因。
所述ThrA*蛋白为如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表中序列18所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列18的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体功能的由序列18衍生的蛋白质。
所述thrA*基因为如下(a3)或(a4)或(a5)：
(a3)编码区如序列表中序列17第337-2799位核苷酸所示的DNA分子；
(a4)在严格条件下与(a3)限定的DNA序列杂交且编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体的DNA分子；
(a5)与(a3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体的DNA分子。
与ThrA蛋白相比，ThrA*蛋白只存在一个氨基酸残基的差异，即第253位氨基酸残基由谷氨酸突变为了组氨酸。
所述thrA基因为如下(a6)或(a7)或(a8)：
(a6)编码区如序列表中序列14第337-2799位核苷酸所示的DNA分子；
(a7)在严格条件下与(a6)限定的DNA序列杂交且编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体的DNA分子；
(a8)与(a6)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体的DNA分子。
所述ThrB蛋白为如下(b1)或(b2)：
(b1)由序列表中序列19所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将序列19的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有高丝氨酸脱氢酶功能的由序列19衍生的蛋白质。
所述thrB基因为如下(b3)或(b4)或(b5)：
(b3)编码区如序列表中序列17第2801-3733位核苷酸所示的DNA分子；
(b4)在严格条件下与(b3)限定的DNA序列杂交且编码高丝氨酸脱氢酶的DNA分子；
(b5)与(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码高丝氨酸脱氢酶的DNA分子。
所述ThrC蛋白为如下(c1)或(c2)：
(c1)由序列表中序列20所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c2)将序列20的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有苏氨酸合成酶功能的由序列20衍生的蛋白质。
所述thrC基因为如下(c3)或(c4)或(c5)：
(c3)编码区如序列表中序列17第3734-5020位核苷酸所示的DNA分子；
(c4)在严格条件下与(c3)限定的DNA序列杂交且编码苏氨酸合成酶的DNA分子；
(c5)与(c3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码苏氨酸合成酶的DNA分子。
所述“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)：
(d1)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列17第294至336位核苷酸、序列表的序列17第337-2799位核苷酸、序列表的序列17第2801-3733位核苷酸、序列表的序列17第3734-5020位核苷酸；
(d2)序列表的序列17第294-5020位核苷酸所示的DNA分子；
(d3)序列表的序列17第294-5132位核苷酸所示的DNA分子；
(d4)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列14第294至336位核苷酸、序列表的序列14第337-2799位核苷酸、序列表的序列14第2801-3733位核苷酸、序列表的序列14第3734-5020位核苷酸；
(d5)序列表的序列14第294-5020位核苷酸所示的DNA分子。
本发明还保护一种特异DNA分子，自上游至下游依次包括启动子和以上任一所述的“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”。所述启动子具体可为强启动子，例如L启动子、trc启动子、T5启动子、lac启动子、tac启动子或T7启动子。
所述启动子具体可为启动子PPL。启动子PPL为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)序列表中序列13所示的DNA分子；
(e2)在严格条件下与(e1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
(e3)与(e1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。
所述特异DNA分子具体可为如下(f1)或(f2)：
(f1)自上游至下游依次包括如下元件：启动子和所述“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”；
(f2)自上游至下游依次由如下元件组成：启动子、限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切识别序列和所述解除阻遏的苏氨酸操纵子基因。
本发明还保护含有以上任一所述“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”的重组质粒甲。所述重组质粒甲具体可为在出发质粒的多克隆位点插入所述“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”得到的重组质粒。所述出发质粒为低拷贝、中拷贝或高拷贝数质粒，例如pSC101、pACYC184、pBR322或pTrc99a。所述出发质粒具体可为质粒pACYC184。
本发明还保护含有以上任一所述特异DNA分子的重组质粒乙。所述重组质粒乙具体可为在出发质粒的多克隆位点插入所述特异DNA分子得到的重组质粒。所述出发质粒为低拷贝、中拷贝或高拷贝数质粒，例如pSC101、pACYC184、pBR322或pTrc99a。所述出发质粒具体可为质粒pACYC184。所述出发质粒具体可为质粒pACYC184。所述重组质粒乙更具体可为在质粒pACYC184的Xba I和EcoR V酶切位点之间插入所述特异DNA分子得到的重组质粒。
本发明还保护含有以上任一所述“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”的重组菌甲。所述重组菌甲具体可为将所述重组质粒甲导入出发菌得到的重组菌。
本发明还保护含有以上任一所述特异DNA分子的重组菌乙。所述重组菌乙具体可为将所述重组质粒乙导入出发菌得到的重组菌。
以上任一所述出发菌具体可为大肠杆菌，例如大肠杆菌K-12或其衍生菌株。
以上任一所述出发菌更具体可为以大肠杆菌K12W3110为出发菌株，抑制metA基因、ilvA基因、lysA基因、tdh基因、tdcC基因和sstT基因表达得到的菌株。
所述metA基因为编码高丝氨酸琥珀酰转移酶(MetA蛋白)的基因。所述MetA蛋白为如下(g1)或(g2)：
(g1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(g2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
所述metA基因为如下(g3)或(g4)或(g5)或(g6)：
(g3)编码区如序列表中序列1第752-1681位核苷酸所示的DNA分子；
(g4)序列表中序列1所示的DNA分子；
(g5)在严格条件下与(g3)或(g4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子；
(g6)与(g3)或(g4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子。
所述ilvA基因为编码苏氨酸脱氨酶(IlvA蛋白)的基因。所述IlvA蛋白为如下(h1)或(h2)：
(h1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(h2)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。
所述ilvA基因为如下(h3)或(h4)或(h5)或(h6)：
(h3)编码区如序列表中序列3第638-2182位核苷酸所示的DNA分子；
(h4)序列表中序列3所示的DNA分子；
(h5)在严格条件下与(h3)或(h4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子；
(h6)与(h3)或(h4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子。
所述lysA基因为编码二氨基庚二酸脱羧酶(LysA蛋白)的基因。所述LysA蛋白为如下(i1)或(i2)：
(i1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(i2)将序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列6衍生的蛋白质。
所述lysA基因为如下(i3)或(i4)或(i5)或(i6)：
(i3)编码区如序列表中序列5第639-1901位核苷酸所示的DNA分子；
(i4)序列表中序列5所示的DNA分子；
(i5)在严格条件下与(i3)或(i4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子；
(i6)与(i3)或(i4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子。
所述tdh基因为编码苏氨酸脱水酶(Tdh蛋白)的基因。所述Tdh蛋白为如下(j 1)或(j2)：
(j 1)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(j2)将序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列8衍生的蛋白质。
所述tdh基因为如下(j3)或(j4)或(j5)或(j6)：
(j3)编码区如序列表中序列7第753-1778位核苷酸所示的DNA分子；
(j4)序列表中序列7所示的DNA分子；
(j5)在严格条件下与(j3)或(j4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子；
(j6)与(j3)或(j4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子。
所述tdcC基因为编码苏氨酸吸收转运蛋白(TDCC蛋白)的基因。所述TDCC蛋白为如下(k1)或(k2)：
(k1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(k2)将序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列10衍生的蛋白质。
所述tdcC基因为如下(k3)或(k4)或(k5)或(k6)：
(k3)编码区如序列表中序列9第701-2032位核苷酸所示的DNA分子；
(k4)序列表中序列9所示的DNA分子；
(k5)在严格条件下与(k3)或(k4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子；
(k6)与(k3)或(k4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子。
所述sstT基因为编码苏氨酸吸收转运蛋白(SstT蛋白)的基因。所述SstT蛋白为如下(m1)或(m2)：
(m1)由序列表中序列12所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(m2)将序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列12衍生的蛋白质。
所述sstT基因为如下(m3)或(m4)或(m5)或(m6)：
(m3)编码区如序列表中序列11第701-1945位核苷酸所示的DNA分子；
(m4)序列表中序列11所示的DNA分子；
(m5)在严格条件下与(m3)或(m4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子；
(m6)与(m3)或(m4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子。
以上任一所述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
以上任一所述出发菌更具体可为以大肠杆菌K12W3110为出发菌株，敲除如下六个基因区段得到的菌株：
metA基因的开放阅读框(序列表的序列1第752-1681位核苷酸)；
ilvA基因的开放阅读框(序列表的序列3第638-2182位核苷酸)；
lysA基因的开放阅读框(序列表的序列5第639-1901位核苷酸)；
tdh基因的开放阅读框(序列表的序列7第753-1778位核苷酸)；
tdcC基因的如下区段：序列9中第701-1852位核苷酸；
sstT基因的如下区段：序列11中第697-1759位核苷酸。
敲除metA基因的开放阅读框具体是通过导入干扰片段Ⅰ或干扰质粒Ⅰ实现的。干扰片段Ⅰ自上游至下游依次由序列表的序列1第245-751位核苷酸所示的上游区段和序列表的序列1第1682-2154位核苷酸所示的下游区段组成。干扰质粒Ⅰ为具有干扰片段Ⅰ的重组质粒。干扰质粒Ⅰ具体可为在pKOV质粒的多克隆位点(例如Sal I和Not I酶切位点之间)插入干扰片段Ⅰ得到的重组质粒。
敲除ilvA基因的开放阅读框具体是通过导入干扰片段Ⅱ或干扰质粒Ⅱ实现的。干扰片段Ⅱ自上游至下游依次由序列表的序列3第140-637位核苷酸所示的上游区段和序列表的序列3第2183-2712位核苷酸所示的下游区段组成。干扰质粒Ⅱ为具有干扰片段Ⅱ的重组质粒。干扰质粒Ⅱ具体可为在pKOV质粒的多克隆位点(例如Bam HI和Not I酶切位点之间)插入干扰片段Ⅱ得到的重组质粒。
敲除lysA基因的开放阅读框具体是通过导入干扰片段Ⅲ或干扰质粒Ⅲ实现的。干扰片段Ⅲ自上游至下游依次由序列表的序列5第132-638位核苷酸所示的上游区段和序列表的序列5第1902-2445位核苷酸所示的下游区段组成。干扰质粒Ⅲ为具有干扰片段Ⅲ的重组质粒。干扰质粒Ⅲ具体可为在pKOV质粒的多克隆位点(例如Bam HI和Not I酶切位点之间)插入干扰片段Ⅲ得到的重组质粒。
敲除tdh基因的开放阅读框具体是通过导入干扰片段Ⅳ或干扰质粒Ⅳ实现的。干扰片段Ⅳ自上游至下游依次由序列表的序列7第227-752位核苷酸所示的上游区段和序列表的序列7第1779-2271位核苷酸所示的下游区段组成。干扰质粒Ⅳ为具有干扰片段Ⅳ的重组质粒。干扰质粒Ⅳ具体可为在pKOV质粒的多克隆位点(例如Bam HI和Not I酶切位点之间)插入干扰片段Ⅳ得到的重组质粒。
敲除“tdcC基因的如下区段：序列9中第701-1852位核苷酸”是通过导入干扰片段Ⅴ或干扰质粒Ⅴ实现的。干扰片段Ⅴ自上游至下游依次由序列表的序列9第176-700位核苷酸所示的上游区段和序列表的序列9第1853-2388位核苷酸所示的下游区段组成。干扰质粒Ⅴ为具有干扰片段Ⅴ的重组质粒。干扰质粒Ⅴ具体可为在pKOV质粒的多克隆位点(例如BamHI和Not I酶切位点之间)插入干扰片段Ⅴ得到的重组质粒。
敲除“sstT基因的如下区段：序列11中第697-1759位核苷酸”是通过导入干扰片段Ⅵ或干扰质粒Ⅵ实现的。干扰片段Ⅵ自上游至下游依次由序列表的序列11第14-696位核苷酸所示的上游区段和序列表的序列11第1760-2240位核苷酸所示的下游区段组成。干扰质粒Ⅵ为具有干扰片段Ⅵ的重组质粒。干扰质粒Ⅵ具体可为在pKOV质粒的多克隆位点(例如Bam HI和Not I酶切位点之间)插入干扰片段Ⅵ得到的重组质粒。
本发明还保护所述重组菌甲在生产苏氨酸(例如L-苏氨酸)中的应用。
本发明还保护所述重组菌乙在生产苏氨酸(例如L-苏氨酸)中的应用。
应用所述重组菌生产苏氨酸时，采用葡萄糖作为碳源。
应用所述重组菌生产苏氨酸时，采用发酵培养基培养所述重组菌。
所述发酵培养基可以是丰富培养基，也可以是无机盐培养基。培养基包含碳源、氮源、无机离子、抗生素和其它的营养因子。作为碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳糖等糖类；也可以是甘油、甘露醇等醇类；也可以使用葡萄糖酸、柠檬酸、丁二酸等有机酸类。作为氮源，可以使用氨水、硫酸铵、磷酸铵、氯化铵等无机氮源；也可以使用玉米浆、豆粕水解液、毛发粉、酵母提取物、蛋白胨等有机氮源。无机离子包含铁、钙、镁、锰、钼、钴、铜、钾等离子中的一种或多种。其它营养因子还包括生物素、维生素B1、吡哆醛等维生素。
所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖。
所述发酵培养基具体可为：葡萄糖20.0g/L、硫酸铵15.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、七水硫酸镁2.0g/L、酵母粉2.0g/L、异亮氨酸0.6g/L、蛋氨酸0.6g/L、赖氨酸盐酸盐1.2g/L、碳酸钙15.0g/L、微量元素混合液5mL/L，余量为水。
微量元素混合液：FeSO4·7H2O10g/L、CaCl21.35g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、MnSO4·4H2O0.5g/L、CuSO4·5H2O1g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O0.106g/L、Na2B4O7·10H2O0.23g/L、CoCl2·6H2O0.48g/L、35％HCl 10mL/L，余量为水。
所述培养的条件具体可为：37℃、220rpm震荡培养24h。
所述培养的条件具体可为：将种子液以3％的接种量接种至发酵培养基中，37℃、220rpm震荡培养24h。种子液的制备方法如下：将重组菌接种至液体LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养12h，得到种子液。
所述培养的过程中进行如下过程控制：培养过程中，用氨水调节反应体系的pH值使其维持在6.8-7.0；培养过程中，每隔3-4h取样一次，检测葡萄糖含量，当体系中的葡萄糖含量低于5g/L时，补加葡萄糖并使体系中的葡萄糖浓度达到10g/L。
本发明还保护一种解除苏氨酸操纵子反馈阻遏的方法，包括如下步骤：删除苏氨酸操纵子中的如下DNA区段：序列表的序列17第1-293位核苷酸。所述方法中，还可包括如下步骤：删除苏氨酸操纵子中的如下DNA区段：序列表的序列17第n2-336位核苷酸；n2为311以上336以下的自然数。
本发明通过翻译融合报告基因的方法验证苏氨酸衰减子的改造效果。通过融合thrA基因的5’端序列与两种报告基因lacZ和gfp的完整阅读表达框，然后测定报告蛋白LacZ的酶活和GFP荧光值，计算不同苏氨酸衰减子突变体调控下的基因表达量，验证苏氨酸衰减子突变体的去阻遏作用。
本发明的有益效果在于，获得了一种高效解除反馈阻遏的苏氨酸衰减子突变体，使去阻遏效率显著提高，从而提高了基因表达水平。过表达包含该突变体的苏氨酸操纵子的工程菌可以显著提高苏氨酸产量。本发明中的突变体在实践上可用于细菌发酵生产苏氨酸。
本发明通过从5’端逐步截短苏氨酸衰减子功能序列，获得了高效解除苏氨酸操纵子转录阻遏的方法。应用本发明提供的苏氨酸衰减子改造方法，可显著提高苏氨酸操纵子的表达水平，从而提高工程菌的苏氨酸发酵性能。本发明获得高效解除反馈阻遏的核酸序列，构建了高效生产苏氨酸的菌株，为改进苏氨酸发酵生产提供了新方法。
附图说明
图1流式细胞仪分析不同衰减子突变体调控下的GFP表达强度。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
大肠杆菌K12W3110(又称E.coli K12W3110)：日本技术评价研究所生物资源中心(NITE Biological Resource Center,NBRC)。pKOV质粒：Addgene公司，产品目录号为25769。pACYC184质粒：NEB公司，产品目录号E4152S。pAD123质粒：Gene，1999，226(2):297-305。ONPG的全称为：邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷。
实施例所用的各个引物序列如下(5’→3’)：
WY569：GCGTCGACATAGAACCCAACCGCCTGCTCA；
WY570：AACGATCGACTATCACAGAAGAAACCTGATTACCTCACTACATA；
WY571：TATGTAGTGAGGTAATCAGGTTTCTTCTGTGATAGTCGATCGTT；
WY572：ATTGCGGCCGCCCGAAATAAAATCAGGCAACGT；
WY583：CGTTAATGAAATATCGCCAG；
WY584：TCGAAATCGGCCATAAAGAC。
WY577：CGCGGATCCGAAAGTGTACGAAAGCCAGG；
WY578：GCGCTATCAGGCATTTTTCCTATTAACCCCCCAGTTTCGA；
WY579：TCGAAACTGGGGGGTTAATAGGAAAAATGCCTGATAGCGC；
WY580：ATTGCGGCCGCGTGAAGCGGATCTGGCGATT；
WY587：ATGGCTGTATCCGCTCGCTG；
WY588：ACACCATCGATCAGCAAGGGC。
WY573：CGCGGATCCGGCACGATATTTAAGCTGAC；
WY574：CAACCAGCGACTAACCGCAGAACAAACTCCAGATAAGTGC；
WY575：GCACTTATCTGGAGTTTGTTCTGCGGTTAGTCGCTGGTTG；
WY576：ATTGCGGCCGCGCTGGCAACGCGTCATTTAA；
WY585：GTAACACACACACTTCATCT；
WY586：GATCCCGGATGCTGATTTAG。
WY598：CGCGGATCCATACTGCGATGTGATGGGCC；
WY599：AATACCAGCCCTTGTTCGTGCTCACATCCTCAGGCGATAA；
WY600：TTATCGCCTGAGGATGTGAGCACGAACAAGGGCTGGTATT；
WY601：ATTGCGGCCGCCGTTGCCACTTCAATCCCAC；
WY602：GCTATGCCAACAACGATATG；
WY603：GGTTAATACGCCGGTTGAGC。
WY476：CGCGGATCCGGAACGATTGGTCTGGAAAT；
WY477：GGCTTCAATCAGGTCAAGGATATCCTATCCTCAACGAATTA；
WY478：TAATTCGTTGAGGATAGGATATCCTTGACCTGATTGAAGCC；
WY479：ATTGCGGCCGCCGCGACGGATATTATCAATGAC；
WY497：GCGCCAAAATCCAAAGTAGC；
WY498：ATGTGCGCGCTGGGAAACAT。
WY945：CGCGGATCCTATCTTCGCCGTGACCACTGA；
WY946：ACCGAACATATTACAGGCCAGCGATCCTTTCATTGTGTTGTC；
WY947：GACAACACAATGAAAGGATCGCTGGCCTGTAATATGTTCGGT；
WY948：ATTGCGGCCGCCTCGCGAAGTTCCATCATCCT；
WY949：CCTGTAACGAGCGTAACGACT；
WY950：TATCTTCGCCGTGACCACTGA。
WY914：CCCAAGCTTACAGAGTACACAACATCCATG；
WY1630：CCCAAGCTTCATTAGCACCACCATTACCA；
WY1629：CCCAAGCTTCAGGTAACGGTGCGGGCTGA；
WY1628：CCCAAGCTTCGCGTACAGGAAACACAGAA；
WY1627：CCCAAGCTTGTGCGGGCTTTTTTTTTCGA；
WY913：CCCAAGCTTTCGACCAAAGGTAACGAGGT；
WY1746:CATAGAACCAGAACCAGAACCCAATTGCGCCAGCGGGAAC。
WY1752:CAATTG GGTTCTGGTTCTGGTTCTATGACCATGATTACGGATTCACT；
WY1750:CGCGGATCCACGCGAAATACGGGCAGACA。
实施例1、E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT的构建
以大肠杆菌K12W3110为出发菌株，依次敲除metA基因(编码高丝氨酸琥珀酰转移酶的基因)、ilvA基因(编码苏氨酸脱氨酶的基因)、lysA基因(编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因)、tdh基因(编码苏氨酸脱水酶的基因)、tdcC基因(编码苏氨酸吸收转运蛋白的基因)和sstT基因(编码苏氨酸吸收转运蛋白的基因)，获得底盘工程菌，将其命名为E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT。
1、敲除metA基因
(1)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY569和WY570组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅰ-甲(metA基因上游区域)。
(2)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY571和WY572组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅰ-乙(metA基因下游区域)。
(3)将DNA片段Ⅰ-甲和DNA片段Ⅰ-乙混合后作为模板，采用WY569和WY572组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅰ-丙。
(4)取pKOV质粒，用限制性内切酶Sal I和Not I进行双酶切，回收载体骨架(约5.6kb)。
(5)取DNA片段Ⅰ-丙，用限制性内切酶Sal I和Not I进行双酶切，回收酶切产物。
(6)将步骤(4)得到的载体骨架和步骤(5)得到的酶切产物连接，得到重组质粒Ⅰ。根据测序结果，对重组质粒Ⅰ进行结构描述如下：在pKOV质粒的Sal I和Not I酶切位点之间插入了如下特异DNA分子：自上游至下游依次由序列表的序列1第245-751位核苷酸所示的上游区段和序列表的序列1第1682-2154位核苷酸所示的下游区段组成。metA基因如序列表的序列1所示，第752-1681位核苷酸为开放阅读框(编码序列表的序列2所示的metA蛋白)。
(7)将重组质粒Ⅰ导入大肠杆菌K12W3110，得到metA基因敲除的重组菌，命名为E.coliK12W3110△metA。
metA基因敲除的重组菌的鉴定方法：采用WY583和WY584组成的引物对进行PCR扩增，如果得到1375bp扩增产物，初步判断为候选的目标菌；进一步通过测序验证菌株染色体上的metA基因的开放阅读框被敲除。
2、敲除ilvA基因
(1)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY577和WY578组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅱ-甲(ilvA基因上游区域)。
(2)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY579和WY580组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅱ-乙(ilvA基因下游区域)。
(3)将DNA片段Ⅱ-甲和DNA片段Ⅱ-乙混合后作为模板，采用WY577和WY580组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅱ-丙。
(4)取pKOV质粒，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收载体骨架(约5.6kb)。
(5)取DNA片段Ⅱ-丙，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收酶切产物。
(6)将步骤(4)得到的载体骨架和步骤(5)得到的酶切产物连接，得到重组质粒Ⅱ。根据测序结果，对重组质粒Ⅱ进行结构描述如下：在pKOV质粒的Bam HI和Not I酶切位点之间插入了如下特异DNA分子：自上游至下游依次由序列表的序列3第140-637位核苷酸所示的上游区段和序列表的序列3第2183-2712位核苷酸所示的下游区段组成。ilvA基因如序列表的序列3所示，第638-2182位核苷酸为开放阅读框(编码序列表的序列4所示的ilvA蛋白)。
(7)将重组质粒Ⅱ导入E.coli K12W3110△metA，得到ilvA基因敲除的重组菌，命名为E.coli K-12W3110△metA△ilvA。
ilvA基因敲除的重组菌的鉴定方法：采用WY587和WY588组成的引物对进行PCR扩增，如果得到1344bp扩增产物，初步判断为候选的目标菌；进一步通过测序验证菌株染色体上的ilvA基因的开放阅读框被敲除。
3、敲除lysA基因
(1)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY573和WY574组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅲ-甲(lysA基因上游区域)。
(2)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY575和WY576组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅲ-乙(lysA基因下游区域)。
(3)将DNA片段Ⅲ-甲和DNA片段Ⅲ-乙混合后作为模板，采用WY573和WY576组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅲ-丙。
(4)取pKOV质粒，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收载体骨架(约5.6kb)。
(5)取DNA片段Ⅲ-丙，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收酶切产物。
(6)将步骤(4)得到的载体骨架和步骤(5)得到的酶切产物连接，得到重组质粒Ⅲ。根据测序结果，对重组质粒Ⅲ进行结构描述如下：在pKOV质粒的Bam HI和Not I酶切位点之间插入了如下特异DNA分子：自上游至下游依次由序列表的序列5第132-638位核苷酸所示的上游区段和序列表的序列5第1902-2445位核苷酸所示的下游区段组成。lysA基因如序列表的序列5所示，第639-1901位核苷酸为开放阅读框(编码序列表的序列6所示的lysA蛋白)。
(7)将重组质粒Ⅲ导入E.coli K-12W3110△metA△ilvA，得到lysA基因敲除的重组菌，命名为E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA。
lysA基因敲除的重组菌的鉴定方法：采用WY585和WY586组成的引物对进行PCR扩增，如果得到1302bp扩增产物，初步判断为候选的目标菌；进一步通过测序验证菌株染色体上的lysA基因的开放阅读框被敲除。
4、敲除tdh基因
(1)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY598和WY599组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅳ-甲(tdh基因上游区域)。
(2)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY600和WY601组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅳ-乙(tdh基因下游区域)。
(3)将DNA片段Ⅳ-甲和DNA片段Ⅳ-乙混合后作为模板，采用WY598和WY601组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅳ-丙。
(4)取pKOV质粒，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收载体骨架(约5.6kb)。
(5)取DNA片段Ⅳ-丙，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收酶切产物。
(6)将步骤(4)得到的载体骨架和步骤(5)得到的酶切产物连接，得到重组质粒Ⅳ。根据测序结果，对重组质粒Ⅳ进行结构描述如下：在pKOV质粒的Bam HI和Not I酶切位点之间插入了如下特异DNA分子：自上游至下游依次由序列表的序列7第227-752位核苷酸所示的上游区段和序列表的序列7第1779-2271位核苷酸所示的下游区段组成。tdh基因如序列表的序列7所示，第753-1778位核苷酸为开放阅读框(编码序列表的序列8所示的tdh蛋白)。
(7)将重组质粒Ⅳ导入E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA，得到tdh基因敲除的重组菌，命名为E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh。
tdh基因敲除的重组菌的鉴定方法：采用WY602和WY603组成的引物对进行PCR扩增，如果得到1434bp扩增产物，初步判断为候选的目标菌；进一步通过测序验证菌株染色体上的tdh基因的开放阅读框被敲除。
5、敲除tdcC基因
(1)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY476和WY477组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅴ-甲(tdcC基因上游区域)。
(2)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY478和WY479组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅴ-乙(tdcC基因下游区域)。
(3)将DNA片段Ⅴ-甲和DNA片段Ⅴ-乙混合后作为模板，采用WY476和WY479组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅴ-丙)。
(4)取pKOV质粒，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收载体骨架(约5.6kb)。
(5)取DNA片段Ⅴ-丙，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收酶切产物。
(6)将步骤(4)得到的载体骨架和步骤(5)得到的酶切产物连接，得到重组质粒Ⅴ。根据测序结果，对重组质粒Ⅴ进行结构描述如下：在pKOV质粒的Bam HI和Not I酶切位点之间插入了如下特异DNA分子：自上游至下游依次由序列表的序列9第176-700位核苷酸所示的上游区段和序列表的序列9第1853-2388位核苷酸所示的下游区段组成。tdcC基因如序列表的序列9所示，第701-2032位核苷酸为开放阅读框(编码序列表的序列10所示的tdcC蛋白)。
(7)将重组质粒Ⅴ导入E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh，得到tdcC基因敲除的重组菌，命名为E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC。
tdcC基因敲除的重组菌的鉴定方法：采用WY497和WY498组成的引物对进行PCR扩增，如果得到1453bp扩增产物，初步判断为候选的目标菌；进一步通过测序验证菌株染色体上的tdcC基因的如下区段被敲除：序列9中第701-1852位核苷酸。
6、敲除sstT基因
(1)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY945和WY946组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅵ-甲(sstT基因上游区域)。
(2)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY947和WY948组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅵ-乙(sstT基因下游区域)。
(3)将DNA片段Ⅵ-甲和DNA片段Ⅵ-乙混合后作为模板，采用WY945和WY948组成的引物对进行PCR扩增，得到DNA片段Ⅵ-丙。
(4)取pKOV质粒，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收载体骨架(约5.6kb)。
(5)取DNA片段Ⅵ-丙，用限制性内切酶Bam HI和Not I进行双酶切，回收酶切产物。
(6)将步骤(4)得到的载体骨架和步骤(5)得到的酶切产物连接，得到重组质粒Ⅵ。根据测序结果，对重组质粒Ⅵ进行结构描述如下：在pKOV质粒的Bam HI和Not I酶切位点之间插入了如下特异DNA分子：自上游至下游依次由序列表的序列11第14-696位核苷酸所示的上游区段和序列表的序列11第1760-2240位核苷酸所示的下游区段组成。sstT基因如序列表的序列11所示，第701-1945位核苷酸为开放阅读框(编码序列表的序列12所示的sstT蛋白)。
(7)将重组质粒Ⅵ导入E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC，得到sstT基因敲除的重组菌，命名为E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT。
sstT基因敲除的重组菌的鉴定方法：采用WY949和WY950组成的引物对进行PCR扩增，如果得到1569bp扩增产物，初步判断为候选的目标菌；进一步通过测序验证菌株染色体上的sstT基因的如下区段被敲除：序列11中第697-1759位核苷酸。
实施例2、衰减子突变体调控lacZ基因的表达
一、构建重组质粒pACYC184-PPL
1、合成序列表的序列13所示的双链DNA分子(启动子PPL)。
2、以步骤1制备的双链DNA分子为模板，采用WY843和WY842组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
WY843：TGCTCTAGACAATTCCGACGTCTAAGAAA；
WY842：CCCAAGCTTGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT。
3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Xba I和Hind III进行双酶切，回收酶切产物。
4、取pACYC184质粒，用限制性内切酶Xba I和Hind III进行双酶切，回收载体骨架(约4.1kb)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pACYC184-PPL。
二、构建各个重组质粒
1、构建重组质粒A
(1)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY914和WY1746组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A1；以人工合成的序列表的序列15所示的双链DNA分子为模板，采用WY1752和WY1750组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A2；将PCR扩增产物A1和PCR扩增产物A2混合后作为模板，采用WY914和WY1750组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A3。
(2)取PCR扩增产物A3，用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，回收酶切产物。
(3)取重组质粒pACYC184-PPL，用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒A。根据测序结果，对重组质粒A进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和BamH Ⅰ酶切位点之间插入了特异DNA分子A；特异DNA分子A自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13所示的启动子PPL，限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切识别序列，序列表的序列14第172至606位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列15所示的lacZ基因(开放阅读框为序列15中第1-3075位)。重组质粒A命名为pACYC184-PPL-thrLA-lacZ914。
2、构建重组质粒B
(1)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY1630和WY1746组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物B1；以人工合成的序列表的序列15所示的双链DNA分子为模板，采用WY1752和WY1750组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物B2；将PCR扩增产物B1和PCR扩增产物B2混合后作为模板，采用WY1630和WY1750组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物B3。
(2)取PCR扩增产物B3，用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，回收酶切产物。
(3)取重组质粒pACYC184-PPL，用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒B。根据测序结果，对重组质粒B进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和BamH Ⅰ酶切位点之间插入了特异DNA分子B；特异DNA分子B自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13所示的启动子PPL，限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切识别序列，序列表的序列14第198至606位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列15所示的lacZ基因。重组质粒B命名为pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1630。
3、构建重组质粒C
(1)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY1629和WY1746组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物C1；以人工合成的序列表的序列15所示的双链DNA分子为模板，采用WY1752和WY1750组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物C2；将PCR扩增产物C1和PCR扩增产物C2混合后作为模板，采用WY1629和WY1750组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物C3。
(2)取PCR扩增产物C3，用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，回收酶切产物。
(3)取重组质粒pACYC184-PPL，用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒C。根据测序结果，对重组质粒C进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和BamH Ⅰ酶切位点之间插入了特异DNA分子C；特异DNA分子C自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13所示的启动子PPL，限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切识别序列，序列表的序列14第236至606位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列15所示的lacZ基因。重组质粒C命名为pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1629。
4、构建重组质粒D
(1)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY1628和WY1746组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物D1；以人工合成的序列表的序列15所示的双链DNA分子为模板，采用WY1752和WY1750组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物D2；将PCR扩增产物D1和PCR扩增产物D2混合后作为模板，采用WY1628和WY1750组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物D3。
(2)取PCR扩增产物D3，用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，回收酶切产物。
(3)取重组质粒pACYC184-PPL，用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒D。根据测序结果，对重组质粒D进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和BamH Ⅰ酶切位点之间插入了特异DNA分子D；特异DNA分子D自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13所示的启动子PPL，限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切识别序列，序列表的序列14第256至606位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列15所示的lacZ基因。重组质粒D命名为pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1628。
5、构建重组质粒E
(1)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY1627和WY1746组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物E1；以人工合成的序列表的序列15所示的双链DNA分子为模板，采用WY1752和WY1750组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物E2；将PCR扩增产物E1和PCR扩增产物E2混合后作为模板，采用WY1627和WY1750组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物E3。
(2)取PCR扩增产物E3，用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，回收酶切产物。
(3)取重组质粒pACYC184-PPL，用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒E。根据测序结果，对重组质粒E进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和BamH Ⅰ酶切位点之间插入了特异DNA分子E；特异DNA分子E自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13所示的启动子PPL，限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切识别序列，序列表的序列14第294至606位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列15所示的lacZ基因。重组质粒E命名为pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1627。
6、构建重组质粒F
(1)以大肠杆菌K12W3110的基因组DNA为模板，采用WY913和WY1746组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物F1；以人工合成的序列表的序列15所示的双链DNA分子为模板，采用WY1752和WY1750组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物F2；将PCR扩增产物F1和PCR扩增产物F2混合后作为模板，采用WY913和WY1750组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物F3。
(2)取PCR扩增产物F3，用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，回收酶切产物。
(3)取重组质粒pACYC184-PPL，用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒F。根据测序结果，对重组质粒F进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和BamH Ⅰ酶切位点之间插入了特异DNA分子F；特异DNA分子F自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13所示的启动子PPL，限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切识别序列，序列表的序列14第310至606位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列15所示的lacZ基因。重组质粒F命名为pACYC184-PPL-thrLA-lacZ913。
三、构建重组菌
将pACYC184-PPL-thrLA-lacZ914导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为LAC914。
将pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1630导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为LAC1630。
将pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1629导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为LAC1629。
将pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1628导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为LAC1628。
将pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1627导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为LAC1627。
将pACYC184-PPL-thrLA-lacZ913导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为LAC913。
将pACYC184质粒导入E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为LAC对照。
四、β-半乳糖苷酶活性测定
试验菌株为：LAC914、LAC1630、LAC1629、LAC1628、LAC1627或LAC913。
1、将试验菌株接种至含34mg/L氯霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养12h,得到种子液。
2、取步骤1得到的种子液，按照2％的接种量接种至含34mg/L氯霉素的液体2YT培养基，37℃、220rpm培养6h。
3、完成步骤2后，从培养体系取样1.5ml，测定OD600nm的光密度值，1ml作为待测样本检测β-半乳糖苷酶活性。
检测β-半乳糖苷酶活性的方法：
(1)将1ml待测样本10000×g离心5min，收集菌体沉淀，用pH7.2的PBS缓冲液洗涤两遍，然后用Z-buffer定容至1ml并充分悬浮菌体，置于冰上备用。Z-buffer：40mM NaH2PO4、60mM Na2HPO4、10mM KCl、1mM MgSO4、50mMβ-mercaptoethanol，pH 7.0。
(2)完成步骤(1)后，取样0.05mL，加入0.2mL 4mg/ml的ONPG水溶液和0.8mL Z-buffer并混匀，37℃静置反应并记录反应起始时间，体系呈淡黄色时加入1mL 1M Na2CO3水溶液终止反应并记录反应终止时间，用紫外分光光度计测定OD420nm值。
LAC对照进行上述步骤，作为紫外分光光度计测定OD420nm值的空白对照。
β-半乳糖苷酶酶活Miller Unit＝1000×OD420nm/(OD600nm×t×V)；
t，反应时间(反应终止时间与反应起始时间的差值，min)；V，加样体积，0.05mL。
β-半乳糖苷酶活的定义为每个细胞每分钟分解1μmolONPG所需要的酶量。
每个菌株测量三次，取平均值和标准差。
结果见表1。不同试验菌株进行上述步骤，相应的β-半乳糖苷酶酶活具有显著差异，LAC1627的酶活水平显著高于其他各个菌株。
表1
试验菌株 酶活(Miller Unit)
LAC914 47.72±3.33
LAC1630 26.17±2.71
LAC1629 31.20±1.17
LAC1628 16.11±1.67
LAC1627 132.09±4.61
LAC913 22.59±4.23
实施例3、衰减子突变体调控gfp基因的表达
一、构建重组质粒
构建如下六个重组质粒：pACYC184-PPL-thrLA-gfp914、pACYC184-PPL-thrLA-gfp1630、pACYC184-PPL-thrLA-gfp1629、pACYC184-PPL-thrLA-gfp1628、pACYC184-PPL-thrLA-gfp1627和pACYC184-PPL-thrLA-gfp913。
pACYC184-PPL-thrLA-gfp914与pACYC184-PPL-thrLA-lacZ914的区别仅在于：用特异DNA分子X取代了序列表的序列15所示的lacZ基因。
pACYC184-PPL-thrLA-gfp1630与pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1630的区别仅在于：用特异DNA分子X取代了序列表的序列15所示的lacZ基因。
pACYC184-PPL-thrLA-gfp1629与pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1629的区别仅在于：用特异DNA分子X取代了序列表的序列15所示的lacZ基因。
pACYC184-PPL-thrLA-gfp1628与pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1628的区别仅在于：用特异DNA分子X取代了序列表的序列15所示的lacZ基因。
pACYC184-PPL-thrLA-gfp1627与pACYC184-PPL-thrLA-lacZ1627的区别仅在于：用特异DNA分子X取代了序列表的序列15所示的lacZ基因。
pACYC184-PPL-thrLA-gfp913与pACYC184-PPL-thrLA-lacZ913的区别仅在于：用特异DNA分子X取代了序列表的序列15所示的lacZ基因。
特异DNA分子X为：以pAD123质粒为模板，采用WY1751和WY1748组成的引物对进行PCR扩增得到的PCR扩增产物的正数第22位核苷酸至倒数第10位核苷酸(其中具有序列表的序列16所示的gfp基因)。
WY1751:TTG GGTTCTGGTTCTGGTTCT ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACT；
WY1748:CGCGGATCCCTTGCATGCCTGCAGGAGAT。
二、构建重组菌
将pACYC184-PPL-thrLA-gfp914导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为GFP914。
将pACYC184-PPL-thrLA-gfp1630导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为GFP1630。
将pACYC184-PPL-thrLA-gfp1629导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为GFP1629。
将pACYC184-PPL-thrLA-gfp1628导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为GFP1628。
将pACYC184-PPL-thrLA-gfp1627导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为GFP1627。
将pACYC184-PPL-thrLA-gfp913导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为GFP913。
将pACYC184质粒导入E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为GFP对照。
三、流式细胞仪分析GFP在细胞群体中的表达
试验菌株为：GFP914、GFP1630、GFP1629、GFP1628、GFP1627、GFP913或GFP对照(空白对照)。
1、将试验菌株接种至含34mg/L氯霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养2h,离心收集菌体。
2、取步骤1得到的菌体，用pH7.2的PBS缓冲液悬浮，得到OD600nm值为0.5的菌悬液。
3、取步骤2得到的菌悬液，用流式细胞分析仪(FACSCalibur型，美国BD公司)计数50000个细胞，使用FlowJ软件分析实验结果。
各个试验菌株相应的结果见图1和表2(50000个细胞的平均值)。图1中，菌群荧光分布曲线从右至左分别为GFP1627、GFP913、GFP914、GFP1630、GFP1629、GFP1628和GFP对照。GFP1627的荧光水平比其它菌株提高了30至1280倍。
表2
平均荧光强度
GFP914 50.55
GFP1630 39.15
GFP1629 28.45
GFP1628 1.40
GFP1627 1798.40
GFP913 57.95
实施例4、制备苏氨酸
一、制备thrA突变基因
1、以大肠杆菌K12W3110的基因组为模板，采用WY914和WY926组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、以大肠杆菌K12W3110的基因组为模板，采用WY925和WY832组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、将步骤1得到的PCR扩增产物和步骤2得到的PCR扩增产物混合后作为模板，采用WY914和WY832组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
经测序，步骤3得到的PCR扩增产物的Hind Ⅲ和EcoR V酶切识别位点之间的核苷酸如序列表的序列17第172至5132所示。序列表的序列17中，第337-2799位核苷酸编码ThrA*蛋白，第2801-3733位核苷酸编码ThrB蛋白，第3734-5020位核苷酸编码ThrC蛋白。ThrA*蛋白(突变蛋白)如序列表的序列18所示，与ThrA蛋白(野生蛋白)相比，突变蛋白只存在一个氨基酸残基的差异，即第253位氨基酸残基由谷氨酸突变为了组氨酸。ThrB蛋白如序列表的序列19所示。ThrC蛋白如序列表的序列20所示。
WY914：CCCAAGCTTACAGAGTACACAACATCCATG；
WY925：GAAGTCGATGTCCTACCAGGCGATGGAGCTTTCCTAC；
WY926：GTAGGAAAGCTCCATCGCCTGGTAGGACATCGACTTC；
WY832：CCCGATATCGCATTTATTGAGAATTTCTCC。
二、构建具有thrA突变基因的重组质粒
1、取重组质粒pACYC184-PPL，用限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR V双酶切，回收载体骨架(约4.2kb)。
2、取步骤一的3得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR V双酶切，回收酶切产物。
3、将步骤1的载体骨架和步骤2的酶切产物连接，得到重组质粒pACYC184-PPL-thrLA*BC914。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-PPL-thrLA*BC914进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和EcoR V酶切位点之间插入了特异DNA分子Ⅰ；特异DNA分子Ⅰ自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13所示的启动子PPL，限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切识别序列，序列表的序列17第172-5132位核苷酸所示的DNA分子。
4、制备重组质粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1630。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1630进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和EcoR V酶切位点之间插入了特异DNA分子Ⅱ；特异DNA分子Ⅱ自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13所示的启动子PPL，限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切识别序列，序列表的序列17第198-5132位核苷酸所示的DNA分子。
5、制备重组质粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1629。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1629进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和EcoR V酶切位点之间插入了特异DNA分子Ⅲ；特异DNA分子Ⅲ自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13所示的启动子PPL，限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切识别序列，序列表的序列17第236-5132位核苷酸所示的DNA分子。
6、制备重组质粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1628。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1628进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和EcoR V酶切位点之间插入了特异DNA分子Ⅳ；特异DNA分子Ⅳ自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13所示的启动子PPL，限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切识别序列，序列表的序列17第256-5132位核苷酸所示的DNA分子。
7、制备重组质粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1627。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-PPL-thrLA*BC1627进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和EcoR V酶切位点之间插入了特异DNA分子Ⅴ；特异DNA分子Ⅴ自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13所示的启动子PPL，限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切识别序列，序列表的序列17第294-5132位核苷酸所示的DNA分子。
8、制备重组质粒pACYC184-PPL-thrLA*BC913。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-PPL-thrLA*BC913进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和EcoR V酶切位点之间插入了特异DNA分子Ⅵ；特异DNA分子Ⅵ自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13所示的启动子PPL，限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切识别序列，序列表的序列17第310-5132位核苷酸所示的DNA分子。
三、构建重组菌
将pACYC184-PPL-thrLA*BC914导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为TA914。
将pACYC184-PPL-thrLA*BC1630导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为TA1630。
将pACYC184-PPL-thrLA*BC1629导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为TA1629。
将pACYC184-PPL-thrLA*BC1628导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为TA1628。
将pACYC184-PPL-thrLA*BC1627导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为TA1627。
将pACYC184-PPL-thrLA*BC913导入E.coli K-12
W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为TA913。
将pACYC184质粒导入E.coli K-12W3110△metA△ilvA△lysA△tdh△tdcC△sstT，得到重组菌，将其命名为TA对照。
四、苏氨酸工程菌的摇瓶发酵试验
试验菌株为：TA914、TA1630、TA1629、TA1628、TA1627、TA913或TA对照。
1、取试验菌株，划线接种于含34mg/L氯霉素的固体LB培养基平板，37℃静置培养12小时。
2、完成步骤1后，挑取平板上的菌苔，接种至LB培养基斜面中，37℃静置培养10-12h。
3、完成步骤2后，挑取平板上的菌苔，接种至液体LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养12h，得到种子液。
4、完成步骤3后，将种子液按照3％的接种量接种至发酵培养基中，37℃、220rpm震荡培养。
发酵培养基：葡萄糖20.0g/L、硫酸铵15.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、七水硫酸镁2.0g/L、酵母粉2.0g/L、异亮氨酸0.6g/L、蛋氨酸0.6g/L、赖氨酸盐酸盐1.2g/L、碳酸钙15.0g/L、微量元素混合液5mL/L，余量为水。
微量元素混合液：FeSO4·7H2O10g/L、CaCl21.35g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、MnSO4·4H2O0.5g/L、CuSO4·5H2O1g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O0.106g/L、Na2B4O7·10H2O0.23g/L、CoCl2·6H2O0.48g/L、35％HCl 10mL/L，余量为水。
培养过程中，用氨水调节反应体系的pH值使其维持在6.8-7.0。
培养过程中，每隔3-4h取样一次，使用生物传感分析仪SBA-40D检测葡萄糖含量，当体系中的葡萄糖含量低于5g/L时，补加葡萄糖并使体系中的葡萄糖浓度达到10g/L。
培养24h后取样，12000g离心2分钟，取上清液，检测苏氨酸浓度。
结果见表3(三次重复试验的平均值±标准差)。TA1627生产苏氨酸的能力最高，发酵上清中的苏氨酸浓度高达9.52±1.35。
表3
发酵上清中的苏氨酸浓度(g/L)
TA913 5.46±0.53
TA914 6.11±0.41
TA1627 9.52±1.35
TA1628 0.57±0.11
TA1629 2.22±0.03
TA1630 3.15±0.35
TA对照 0.21±0.07
苏氨酸浓度的检测方法：高效液相法，在参考文献(氨基酸和生物资源，2000，22，59-60)中氨基酸检测方法的基础上进行优化，具体方法如下(2,4-二硝基氟苯(FDBN)柱前衍生高效液相法)：
取10μL上清液于2mL离心管中，加入200μL 0.5M NaHCO3水溶液和100μL 1％(体积比)FDBN-乙腈溶液，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至室温，然后加入700μL0.04mol/L KH2PO4水溶液(pH＝7.2±0.05,用40g/L KOH水溶液调整pH)并摇匀，静置15min，然后过滤并收集滤液。滤液用于上样，进样量为15μL。
色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm,Agilent,USA)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相A为0.04mol/L KH2PO4水溶液(pH＝7.2±0.05,用40g/100mL KOH水溶液调整pH)，流动相B为55％(体积比)乙腈水溶液，流动相总流量为1mL/min。
洗脱过程：洗脱起始时刻(0min)流动相A占流动相总流量的体积份数为86％、流动相B占流动相总流量的体积份数为14％；洗脱过程分为4个阶段，每个阶段中流动相A和流动相D占流动相总流量的体积份数均为线性变化；第1阶段(从起始时刻开始共进行2min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为88％、流动相B占流动相总流量的体积份数为12％，第2阶段(从第1阶段结束时刻开始共进行2min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为86％、流动相B占流动相总流量的体积份数为14％，第3阶段(从第2阶段结束时刻开始共进行6min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为70％、流动相B占流动相总流量的体积份数为30％，第4阶段(从第3阶段结束时刻开始共进行10min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为30％、流动相B占流动相总流量的体积份数为70％。
以市售L-苏氨酸为标准品(购自sigma,货号8917)制作标准曲线，计算样品的苏氨酸浓度。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<160> 20
<210> 1
<211> 2305
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 1
cgttaatgaa atatcgccag ttccacatcc atgcgcaatc agcggtactc agtgatagtg 60
cggtcatggc aatgcttaag cagaaataat cgtgtcacca ttggtgggta ctaaacctga 120
agttcagccc accgggatga gaaaaaatcg cctacgcccc cacatacgcc agattcagca 180
acggatacgg tttccccaaa tcgtccacct cagagcgtcc cgtaacctta aaacccacct 240
tcttatagaa cccaaccgcc tgctcatttt gctcattaac gttggttgtc agttccggtg 300
ccatcgagag cgcatgctcc accagcaccc gacctacgcc gcagccgcgc acatcaggat 360
cgataaacag cgcatccata tgctgcccac ttagcaacat aaatccaacc ggctgatccc 420
gctcattaac cgcgacccac aacggcgctt ccggcaggaa ggaacgaact aggtcctcca 480
gctcggtccg atactctgct gatagaaaat cgtgagtggc atcgacagaa cgacaccaaa 540
tcgcaacgag ttcctcccct tcctcatgcc gtgagcggcg aatactaata accattttct 600
ctccttttag tcattcttat attctaacgt agtcttttcc ttgaaacttt ctcaccttca 660
acatgcaggc tcgacattgg caaattttct ggttatcttc agctatctgg atgtctaaac 720
gtataagcgt atgtagtgag gtaatcaggt tatgccgatt cgtgtgccgg acgagctacc 780
cgccgtcaat ttcttgcgtg aagaaaacgt ctttgtgatg acaacttctc gtgcgtctgg 840
tcaggaaatt cgtccactta aggttctgat ccttaacctg atgccgaaga agattgaaac 900
tgaaaatcag tttctgcgcc tgctttcaaa ctcacctttg caggtcgata ttcagctgtt 960
gcgcatcgat tcccgtgaat cgcgcaacac gcccgcagag catctgaaca acttctactg 1020
taactttgaa gatattcagg atcagaactt tgacggtttg attgtaactg gtgcgccgct 1080
gggcctggtg gagtttaatg atgtcgctta ctggccgcag atcaaacagg tgctggagtg 1140
gtcgaaagat cacgtcacct cgacgctgtt tgtctgctgg gcggtacagg ccgcgctcaa 1200
tatcctctac ggcattccta agcaaactcg caccgaaaaa ctctctggcg tttacgagca 1260
tcatattctc catcctcatg cgcttctgac gcgtggcttt gatgattcat tcctggcacc 1320
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tctggcagag acggaagaag gggatgcata tctgtttgcc agtaaagata agcgcattgc 1440
ctttgtgacg ggccatcccg aatatgatgc gcaaacgctg gcgcaggaat ttttccgcga 1500
tgtggaagcc ggactagacc cggatgtacc gtataactat ttcccgcaca atgatccgca 1560
aaatacaccg cgagcgagct ggcgtagtca cggtaattta ctgtttacca actggctcaa 1620
ctattacgtc taccagatca cgccatacga tctacggcac atgaatccaa cgctggatta 1680
atcttctgtg atagtcgatc gttaagcgat tcagcacctt acctcaggca ccttcgggtg 1740
ccttttttat ttccgaaacg tacctcagca ggtgaataaa ttttattcat attgttatca 1800
acaagttatc aagtattttt aattaaaatg gaaattgttt ttgattttgc attttaaatg 1860
agtagtctta gttgtgctga acgaaaagag cacaacgatc cttcgttcac agtggggaag 1920
ttttcggatc catgacgagg agctgcacga tgactgaaca ggcaacaaca accgatgaac 1980
tggctttcac aaggccgtat ggcgagcagg agaagcaaat tcttactgcc gaagcggtag 2040
aatttctgac tgagctggtg acgcatttta cgccacaacg caataaactt ctggcagcgc 2100
gcattcagca gcagcaagat attgataacg gaacgttgcc tgattttatt tcggaaacag 2160
cttccattcg cgatgctgat tggaaaattc gcgggattcc tgcggactta gaagaccgcc 2220
gcgtagagat aactggcccg gtagagcgca agatggtgat caacgcgctc aacgccaatg 2280
tgaaagtctt tatggccgat ttcga 2305
<210> 2
<211> 309
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 2
Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg
1 5 10 15
Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu
20 25 30
Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile
35 40 45
Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln
50 55 60
Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr
65 70 75 80
Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln
85 90 95
Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu
100 105 110
Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu
115 120 125
Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala
130 135 140
Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg
145 150 155 160
Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His
165 170 175
Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser
180 185 190
Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu
195 200 205
Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser
210 215 220
Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala
225 230 235 240
Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp
245 250 255
Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr
260 265 270
Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp
275 280 285
Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met
290 295 300
Asn Pro Thr Leu Asp
305
<210> 3
<211> 2889
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 3
atggctgtat ccgctcgctg gaacacgcct acagcaaaga cggcggcctg gcggtgctct 60
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gcgcggtgcg cgataaatcg aaactggggg gttaataatg gctgactcgc aacccctgtc 660
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<210> 4
<211> 514
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 4
Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr
1 5 10 15
Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr
20 25 30
Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile
35 40 45
Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg
50 55 60
Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His
65 70 75 80
Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe
85 90 95
Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala
100 105 110
Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val
115 120 125
Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu
130 135 140
Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro
145 150 155 160
Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln
165 170 175
Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu
180 185 190
Ala Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys
195 200 205
Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu
210 215 220
Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu
225 230 235 240
Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln
245 250 255
Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala
260 265 270
Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Glu Pro Ser
275 280 285
Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr Ile Ala Leu His Asn
290 295 300
Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn
305 310 315 320
Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln
325 330 335
Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe
340 345 350
Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Thr Glu Phe Asn
355 360 365
Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg
370 375 380
Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn
385 390 395 400
Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys
405 410 415
Leu His Val Arg Tyr Met Val Gly Gly Arg Pro Ser His Pro Leu Gln
420 425 430
Glu Arg Leu Tyr Ser Phe Glu Phe Pro Glu Ser Pro Gly Ala Leu Leu
435 440 445
Arg Phe Leu Asn Thr Leu Gly Thr Tyr Trp Asn Ile Ser Leu Phe His
450 455 460
Tyr Arg Ser His Gly Thr Asp Tyr Gly Arg Val Leu Ala Ala Phe Glu
465 470 475 480
Leu Gly Asp His Glu Pro Asp Phe Glu Thr Arg Leu Asn Glu Leu Gly
485 490 495
Tyr Asp Cys His Asp Glu Thr Asn Asn Pro Ala Phe Arg Phe Phe Leu
500 505 510
Ala Gly
<210> 5
<211> 2565
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 5
gtaacacaca cacttcatct aaagagagta attcggtacg ttctgttccc gcaggcgtat 60
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gaaaaatttc aatatgacgt aagttaacgg cggccattag cgctctctcg caatccggta 540
atccatatca tttttgcata gactcgacat aaatcgatat tttttattct ttttatgatg 600
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tagcgtgaca ccagcacatc atcaaagcca attaacgaaa tctcacccgg tacatcaata 2160
ccattatcat tgagaacgcc catcgcaccc gccgccattg aatcgttata acaggctacc 2220
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ccaatgcggg tatgaccttg ctgaattaaa tgacgcgttg ccagccaggc accgtaacga 2460
tcgtccagag caatacaacg gttttcaaag ccaggcagga tacggttgat cagcaccata 2520
ccgggcattt gtttcattaa tgaggctaaa tcagcatccg ggatc 2565
<210> 6
<211> 420
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 6
Met Pro His Ser Leu Phe Ser Thr Asp Thr Asp Leu Thr Ala Glu Asn
1 5 10 15
Leu Leu Arg Leu Pro Ala Glu Phe Gly Cys Pro Val Trp Val Tyr Asp
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Ala Gln Ile Ile Arg Arg Gln Ile Ala Ala Leu Lys Gln Phe Asp Val
35 40 45
Val Arg Phe Ala Gln Lys Ala Cys Ser Asn Ile His Ile Leu Arg Leu
50 55 60
Met Arg Glu Gln Gly Val Lys Val Asp Ser Val Ser Leu Gly Glu Ile
65 70 75 80
Glu Arg Ala Leu Ala Ala Gly Tyr Asn Pro Gln Thr His Pro Asp Asp
85 90 95
Ile Val Phe Thr Ala Asp Val Ile Asp Gln Ala Thr Leu Glu Arg Val
100 105 110
Ser Glu Leu Gln Ile Pro Val Asn Ala Gly Ser Val Asp Met Leu Asp
115 120 125
Gln Leu Gly Gln Val Ser Pro Gly His Arg Val Trp Leu Arg Val Asn
130 135 140
Pro Gly Phe Gly His Gly His Ser Gln Lys Thr Asn Thr Gly Gly Glu
145 150 155 160
Asn Ser Lys His Gly Ile Trp Tyr Thr Asp Leu Pro Ala Ala Leu Asp
165 170 175
Val Ile Gln Arg His His Leu Gln Leu Val Gly Ile His Met His Ile
180 185 190
Gly Ser Gly Val Asp Tyr Ala His Leu Glu Gln Val Cys Gly Ala Met
195 200 205
Val Arg Gln Val Ile Glu Phe Gly Gln Asp Leu Gln Ala Ile Ser Ala
210 215 220
Gly Gly Gly Leu Ser Val Pro Tyr Gln Gln Gly Glu Glu Ala Val Asp
225 230 235 240
Thr Glu His Tyr Tyr Gly Leu Trp Asn Ala Ala Arg Glu Gln Ile Ala
245 250 255
Arg His Leu Gly His Pro Val Lys Leu Glu Ile Glu Pro Gly Arg Phe
260 265 270
Leu Val Ala Gln Ser Gly Val Leu Ile Thr Gln Val Arg Ser Val Lys
275 280 285
Gln Met Gly Ser Arg His Phe Val Leu Val Asp Ala Gly Phe Asn Asp
290 295 300
Leu Met Arg Pro Ala Met Tyr Gly Ser Tyr His His Ile Ser Ala Leu
305 310 315 320
Ala Ala Asp Gly Arg Ser Leu Glu His Ala Pro Thr Val Glu Thr Val
325 330 335
Val Ala Gly Pro Leu Cys Glu Ser Gly Asp Val Phe Thr Gln Gln Glu
340 345 350
Gly Gly Asn Val Glu Thr Arg Ala Leu Pro Glu Val Lys Ala Gly Asp
355 360 365
Tyr Leu Val Leu His Asp Thr Gly Ala Tyr Gly Ala Ser Met Ser Ser
370 375 380
Asn Tyr Asn Ser Arg Pro Leu Leu Pro Glu Val Leu Phe Asp Asn Gly
385 390 395 400
Gln Ala Arg Leu Ile Arg Arg Arg Gln Thr Ile Glu Glu Leu Leu Ala
405 410 415
Leu Glu Leu Leu
420
<210> 7
<211> 2460
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 7
gctatgccaa caacgatatg caggagctgg aagcacgtct gaaagaagcg cgtgaagccg 60
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ctgcggcgca tacccctgag caaattacgc gtgcagtaga agcatttacg cgtattggta 720
aacaactggg cgttatcgcc tgaggatgtg agatgaaagc gttatccaaa ctgaaagcgg 780
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ttaaaatccg taaaacagcc atctgcggga ctgacgttca catctataac tgggatgagt 900
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cccgtgcggt taacgtcgcc aaagaaaatc tcaatgacgt gatggcggag ttaggcatga 1440
ccgaaggttt tgatgtcggt ctggaaatgt ccggtgcgcc gccagcgttt cgtaccatgc 1500
ttgacaccat gaatcacggc ggccgtattg cgatgctggg tattccgccg tctgatatgt 1560
ctatcgactg gaccaaagtg atctttaaag gcttgttcat taaaggtatt tacggtcgtg 1620
agatgtttga aacctggtac aagatggcgg cgctgattca gtctggcctc gatctttcgc 1680
cgatcattac ccatcgtttc tctatcgatg atttccagaa gggctttgac gctatgcgtt 1740
cgggccagtc cgggaaagtt attctgagct gggattaaca cgaacaaggg ctggtattcc 1800
agccctttta tctgaggata atctgttaaa tatgtaaaat cctgtcagtg taataaagag 1860
ttcgtaattg tgctgatctc ttatatagct gctctcatta tctctctacc ctgaagtgac 1920
tctctcacct gtaaaaataa tatctcacag gcttaatagt ttcttaatac aaagcctgta 1980
aaacgtcagg ataacttcag aggtcgtcgg taatttatga tgaacagcac caataaactt 2040
agtgttatta ttccgttata taatgcgggc gatgatttcc gcacttgtat ggaatcttta 2100
attacgcaaa cctggactgc tctggaaatc attattatta acgatggttc aacggataat 2160
tctgttgaaa tagcaaagta ttacgcagaa aactatccgc acgttcgttt gttgcatcag 2220
gcgaatgctg gcgcatcggt ggcgcgtaat cgtgggattg aagtggcaac gggcaaatat 2280
gtcgcttttg tcgatgctga cgatgaagtc tatcccacca tgtacgaaac gctgatgacc 2340
atggcgttag aggacgacct cgacgtggcg cagtgcaacg ctgactggtg ttttcgtgaa 2400
acgggagaaa cctggcaatc catccccacc gatcgccttc gctcaaccgg cgtattaacc 2460
<210> 8
<211> 341
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 8
Met Lys Ala Leu Ser Lys Leu Lys Ala Glu Glu Gly Ile Trp Met Thr
1 5 10 15
Asp Val Pro Val Pro Glu Leu Gly His Asn Asp Leu Leu Ile Lys Ile
20 25 30
Arg Lys Thr Ala Ile Cys Gly Thr Asp Val His Ile Tyr Asn Trp Asp
35 40 45
Glu Trp Ser Gln Lys Thr Ile Pro Val Pro Met Val Val Gly His Glu
50 55 60
Tyr Val Gly Glu Val Val Gly Ile Gly Gln Glu Val Lys Gly Phe Lys
65 70 75 80
Ile Gly Asp Arg Val Ser Gly Glu Gly His Ile Thr Cys Gly His Cys
85 90 95
Arg Asn Cys Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Cys Arg Asn Thr Ile Gly
100 105 110
Val Gly Val Asn Arg Pro Gly Cys Phe Ala Glu Tyr Leu Val Ile Pro
115 120 125
Ala Phe Asn Ala Phe Lys Ile Pro Asp Asn Ile Ser Asp Asp Leu Ala
130 135 140
Ala Ile Phe Asp Pro Phe Gly Asn Ala Val His Thr Ala Leu Ser Phe
145 150 155 160
Asp Leu Val Gly Glu Asp Val Leu Val Ser Gly Ala Gly Pro Ile Gly
165 170 175
Ile Met Ala Ala Ala Val Ala Lys His Val Gly Ala Arg Asn Val Val
180 185 190
Ile Thr Asp Val Asn Glu Tyr Arg Leu Glu Leu Ala Arg Lys Met Gly
195 200 205
Ile Thr Arg Ala Val Asn Val Ala Lys Glu Asn Leu Asn Asp Val Met
210 215 220
Ala Glu Leu Gly Met Thr Glu Gly Phe Asp Val Gly Leu Glu Met Ser
225 230 235 240
Gly Ala Pro Pro Ala Phe Arg Thr Met Leu Asp Thr Met Asn His Gly
245 250 255
Gly Arg Ile Ala Met Leu Gly Ile Pro Pro Ser Asp Met Ser Ile Asp
260 265 270
Trp Thr Lys Val Ile Phe Lys Gly Leu Phe Ile Lys Gly Ile Tyr Gly
275 280 285
Arg Glu Met Phe Glu Thr Trp Tyr Lys Met Ala Ala Leu Ile Gln Ser
290 295 300
Gly Leu Asp Leu Ser Pro Ile Ile Thr His Arg Phe Ser Ile Asp Asp
305 310 315 320
Phe Gln Lys Gly Phe Asp Ala Met Arg Ser Gly Gln Ser Gly Lys Val
325 330 335
Ile Leu Ser Trp Asp
340
<210> 9
<211> 2732
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 9
gatgccaaaa ggtgcgccaa aatccaaagt agcggcaacg tgcgactact ccgcagaagt 60
cgttctgcat ggtgataact tcaacgacac tatcgctaaa gtgagcgaaa ttgtcgaaat 120
ggaaggccgt atttttatcc caccttacga tgatccgaaa gtgattgctg gccagggaac 180
gattggtctg gaaattatgg aagatctcta tgatgtcgat aacgtgattg tgccaattgg 240
tggtggcggt ttaattgctg gtattgcggt ggcaattaaa tctattaacc cgaccattcg 300
tgttattggc gtacagtctg aaaacgttca cggcatggcg gcttctttcc actccggaga 360
aataaccacg caccgaacta ccggcaccct ggcggatggt tgtgatgtct cccgcccggg 420
taatttaact tacgaaatcg ttcgtgaatt agtcgatgac atcgtgctgg tcagcgaaga 480
cgaaatcaga aacagtatga ttgccttaat tcagcgcaat aaagtcgtca ccgaaggcgc 540
aggcgctctg gcatgtgctg cattattaag cggtaaatta gaccaatata ttcaaaacag 600
aaaaaccgtc agtattattt ccggcggcaa tatcgatctt tctcgcgtct ctcaaatcac 660
cggtttcgtt gacgcttaat taattcgttg aggataggat atgagtactt cagatagcat 720
tgtatccagc cagacaaaac aatcgtcctg gcgtaaatca gataccacat ggacgttagg 780
cttgtttggt acggcaatcg gcgccggggt gctgttcttc cctatccgcg caggttttgg 840
cggactgatc ccgattcttc tgatgttggt attggcatac cccatcgcgt tttattgcca 900
ccgggcgctg gcgcgtctgt gtctttctgg ctctaaccct tccggcaaca ttacggaaac 960
ggtggaagag cattttggta aaactggcgg cgtggttatc acgttcctgt acttcttcgc 1020
gatttgccca ctgctgtgga tttatggcgt tactattacc aataccttta tgacgttctg 1080
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cgtctcttcc ttcgtggttt ctaagcgtga agagtatgag aaagacttcg gtcgcgactt 1440
caccgaacgt aaatgttccc aaatcatttc tcgtgccagc atgctgatgg ttgcagtggt 1500
gatgttcttt gcctttagct gcctgtttac tctgtctccg gccaacatgg cggaagccaa 1560
agcgcagaat attccagtgc tttcttatct ggctaaccac tttgcgtcca tgaccggtac 1620
caaaacaacg ttcgcgatta cactggaata tgcggcttcc atcatcgcac tcgtggctat 1680
cttcaaatct ttcttcggtc actatctggg aacgctggaa ggtctgaatg gcctggtcct 1740
gaagtttggt tataaaggcg acaaaactaa agtgtcgctg ggtaaactga acactatcag 1800
catgatcttc atcatgggct ccacctgggt tgttgcctac gccaacccga acatccttga 1860
cctgattgaa gccatgggcg caccgattat cgcatccctg ctgtgcctgt tgccgatgta 1920
tgccatccgt aaagcgccgt ctctggcgaa ataccgtggt cgtctggata acgtgtttgt 1980
taccgtgatt ggtctgctga ccatcctgaa catcgtatac aaactgtttt aatccgtaac 2040
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cttcgattaa gttttccgtg ctcgatgcca gcgactgtga agtattaatg tcaggtattg 2160
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ccgagtccgc cattattacc gatgaagtca ttgataatat ccgtcgcgtt tctccactgg 2400
cacccctgca taattacgcc aatttaagtg gtattgaatc ggcgcagcaa ttatttccgg 2460
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acggtcagag tgttgatacc tcaatgggaa tg 2732
<210> 10
<211> 443
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 10
Met Ser Thr Ser Asp Ser Ile Val Ser Ser Gln Thr Lys Gln Ser Ser
1 5 10 15
Trp Arg Lys Ser Asp Thr Thr Trp Thr Leu Gly Leu Phe Gly Thr Ala
20 25 30
Ile Gly Ala Gly Val Leu Phe Phe Pro Ile Arg Ala Gly Phe Gly Gly
35 40 45
Leu Ile Pro Ile Leu Leu Met Leu Val Leu Ala Tyr Pro Ile Ala Phe
50 55 60
Tyr Cys His Arg Ala Leu Ala Arg Leu Cys Leu Ser Gly Ser Asn Pro
65 70 75 80
Ser Gly Asn Ile Thr Glu Thr Val Glu Glu His Phe Gly Lys Thr Gly
85 90 95
Gly Val Val Ile Thr Phe Leu Tyr Phe Phe Ala Ile Cys Pro Leu Leu
100 105 110
Trp Ile Tyr Gly Val Thr Ile Thr Asn Thr Phe Met Thr Phe Trp Glu
115 120 125
Asn Gln Leu Gly Phe Ala Pro Leu Asn Arg Gly Phe Val Ala Leu Phe
130 135 140
Leu Leu Leu Leu Met Ala Phe Val Ile Trp Phe Gly Lys Asp Leu Met
145 150 155 160
Val Lys Val Met Ser Tyr Leu Val Trp Pro Phe Ile Ala Ser Leu Val
165 170 175
Leu Ile Ser Leu Ser Leu Ile Pro Tyr Trp Asn Ser Ala Val Ile Asp
180 185 190
Gln Val Asp Leu Gly Ser Leu Ser Leu Thr Gly His Asp Gly Ile Leu
195 200 205
Ile Thr Val Trp Leu Gly Ile Ser Ile Met Val Phe Ser Phe Asn Phe
210 215 220
Ser Pro Ile Val Ser Ser Phe Val Val Ser Lys Arg Glu Glu Tyr Glu
225 230 235 240
Lys Asp Phe Gly Arg Asp Phe Thr Glu Arg Lys Cys Ser Gln Ile Ile
245 250 255
Ser Arg Ala Ser Met Leu Met Val Ala Val Val Met Phe Phe Ala Phe
260 265 270
Ser Cys Leu Phe Thr Leu Ser Pro Ala Asn Met Ala Glu Ala Lys Ala
275 280 285
Gln Asn Ile Pro Val Leu Ser Tyr Leu Ala Asn His Phe Ala Ser Met
290 295 300
Thr Gly Thr Lys Thr Thr Phe Ala Ile Thr Leu Glu Tyr Ala Ala Ser
305 310 315 320
Ile Ile Ala Leu Val Ala Ile Phe Lys Ser Phe Phe Gly His Tyr Leu
325 330 335
Gly Thr Leu Glu Gly Leu Asn Gly Leu Val Leu Lys Phe Gly Tyr Lys
340 345 350
Gly Asp Lys Thr Lys Val Ser Leu Gly Lys Leu Asn Thr Ile Ser Met
355 360 365
Ile Phe Ile Met Gly Ser Thr Trp Val Val Ala Tyr Ala Asn Pro Asn
370 375 380
Ile Leu Asp Leu Ile Glu Ala Met Gly Ala Pro Ile Ile Ala Ser Leu
385 390 395 400
Leu Cys Leu Leu Pro Met Tyr Ala Ile Arg Lys Ala Pro Ser Leu Ala
405 410 415
Lys Tyr Arg Gly Arg Leu Asp Asn Val Phe Val Thr Val Ile Gly Leu
420 425 430
Leu Thr Ile Leu Asn Ile Val Tyr Lys Leu Phe
435 440
<210> 11
<211> 2645
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 11
atagcattcc ggctatcttc gccgtgacca ctgacccgtt cattgtgctg acctcaaacc 60
tgtttgcgat cctcggcctg cgtgcgatgt atttcctgct ggcgggcgta gcagagcgtt 120
tctcgatgct caaatatggc ctggcggtga ttctggtgtt tatcggtatc aagatgctga 180
ttgtcgactt ctaccatatt ccaatcgccg tctcgctggg cgtggtgttt ggcattctgg 240
tgatgacgtt tattatcaac gcctgggtga attatcggca tgataagcag cggggtggat 300
aatttttaat ctgcctaagc cgtgtaccct gtcattaaca tgagcaccgt tttctccctc 360
tcccttccag ggagagggtc ggggtgaggg taatttttcg caccgatgct ggcctgttcc 420
cctcacccta accctctccc caaacggggc gaggggactg accgagtcct tttttgatgt 480
tgtcatcagt ctggaagccg cacgttggct ttatttttat gtcaaagaaa tgtaaccatt 540
aagtttcaaa atatgacctc tctttaaaat ccagcatttt tcgcttcccg aagctgtaac 600
tttccttata ctcgaccttg caaacacttt gttacatcct gaaagatgcg tcgacagaac 660
gcaccaggga tgtgcgacaa cacaatgaaa ggatcgaaaa atgactacgc aacgttcacc 720
ggggctattc cggcgtctgg ctcatggcag cctggtaaaa caaatcctgg tcggccttgt 780
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tactttgttc gtcggcgcac tgaaagccgt tgcccccatc ctggtgttga tgctggtgat 900
ggcatctatt gctaaccacc agcacgggca gaaaaccaat atccgcccta ttttgttcct 960
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ttctaccctg catttatcca gtagcgcggg tgatatttcg ccgccgtcag gcattgtcga 1080
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cggtttctcc acactgtggg gctacgcgca actgctggtc gtgctggttg gctgtatgtt 1380
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cccgctggtg ctgctgtgcc tgcgcgaaag cggtgtgtat gccttcttca cccgcagctc 1500
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ctattccgtt tctattccgc tgggagccac catcaatatg gcgggcgcag caatcactat 1620
taccgtgttg acgctggctg cggttaatac gctgggtatt ccggtcgatc tgcccacggc 1680
gctgctgttg agcgtggtgg cttctctgtg tgcctgtggc gcatccggcg tggcgggggg 1740
gtctctgctg ctgatcccac tggcctgtaa tatgttcggt atttcgaacg atatcgccat 1800
gcaggtggtt gccgtcggct ttatcatcgg cgtattgcag gactcttgcg aaaccgcgct 1860
gaactcttca actgacgtgc tgttcactgc ggcagcttgc caggcagaag acgatcgtct 1920
ggcaaatagc gccctgcgta attaattgtt taaccccttt cgtctacggc ggaaggggtt 1980
ttctcaactt taaacggatc aattcccctt ttctgcatcc gccagaaacg aatgatattc 2040
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ggatgatgga acttcgcgag gccaattccg ccagtcagca caataaaaat cgccattacc 2280
cataagctgc gcgtgcgtaa ggtaatcaat gtacgaatgg cattaaggat ggcactggca 2340
ccagcgggat aggtgcccag aagaaaaaaa tgtacgccaa taacggcgct atagaccgaa 2400
agctgctttt tgaagcgacg ttcgtcacga ttgaaaaatg ttgtgatacc aatcagaaag 2460
gcgatgacac ccacgccctg ggccagccaa tacgcggtca tgataaatcc ttagcaggta 2520
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actttatagc gttacgccgc ttttgaagat cgccagttcg cggaagtcgt tacgctcgtt 2640
acagg 2645
<210> 12
<211> 414
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 12
Met Thr Thr Gln Arg Ser Pro Gly Leu Phe Arg Arg Leu Ala His Gly
1 5 10 15
Ser Leu Val Lys Gln Ile Leu Val Gly Leu Val Leu Gly Ile Leu Leu
20 25 30
Ala Trp Ile Ser Lys Pro Ala Ala Glu Ala Val Gly Leu Leu Gly Thr
35 40 45
Leu Phe Val Gly Ala Leu Lys Ala Val Ala Pro Ile Leu Val Leu Met
50 55 60
Leu Val Met Ala Ser Ile Ala Asn His Gln His Gly Gln Lys Thr Asn
65 70 75 80
Ile Arg Pro Ile Leu Phe Leu Tyr Leu Leu Gly Thr Phe Ser Ala Ala
85 90 95
Leu Ala Ala Val Val Phe Ser Phe Ala Phe Pro Ser Thr Leu His Leu
100 105 110
Ser Ser Ser Ala Gly Asp Ile Ser Pro Pro Ser Gly Ile Val Glu Val
115 120 125
Met Arg Gly Leu Val Met Ser Met Val Ser Asn Pro Ile Asp Ala Leu
130 135 140
Leu Lys Gly Asn Tyr Ile Gly Ile Leu Val Trp Ala Ile Gly Leu Gly
145 150 155 160
Phe Ala Leu Arg His Gly Asn Glu Thr Thr Lys Asn Leu Val Asn Asp
165 170 175
Met Ser Asn Ala Val Thr Phe Met Val Lys Leu Val Ile Arg Phe Ala
180 185 190
Pro Ile Gly Ile Phe Gly Leu Val Ser Ser Thr Leu Ala Thr Thr Gly
195 200 205
Phe Ser Thr Leu Trp Gly Tyr Ala Gln Leu Leu Val Val Leu Val Gly
210 215 220
Cys Met Leu Leu Val Ala Leu Val Val Asn Pro Leu Leu Val Trp Trp
225 230 235 240
Lys Ile Arg Arg Asn Pro Phe Pro Leu Val Leu Leu Cys Leu Arg Glu
245 250 255
Ser Gly Val Tyr Ala Phe Phe Thr Arg Ser Ser Ala Ala Asn Ile Pro
260 265 270
Val Asn Met Ala Leu Cys Glu Lys Leu Asn Leu Asp Arg Asp Thr Tyr
275 280 285
Ser Val Ser Ile Pro Leu Gly Ala Thr Ile Asn Met Ala Gly Ala Ala
290 295 300
Ile Thr Ile Thr Val Leu Thr Leu Ala Ala Val Asn Thr Leu Gly Ile
305 310 315 320
Pro Val Asp Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Ser Val Val Ala Ser Leu
325 330 335
Cys Ala Cys Gly Ala Ser Gly Val Ala Gly Gly Ser Leu Leu Leu Ile
340 345 350
Pro Leu Ala Cys Asn Met Phe Gly Ile Ser Asn Asp Ile Ala Met Gln
355 360 365
Val Val Ala Val Gly Phe Ile Ile Gly Val Leu Gln Asp Ser Cys Glu
370 375 380
Thr Ala Leu Asn Ser Ser Thr Asp Val Leu Phe Thr Ala Ala Ala Cys
385 390 395 400
Gln Ala Glu Asp Asp Arg Leu Ala Asn Ser Ala Leu Arg Asn
405 410
<210> 13
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
caattccgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat 60
cacgaggccc tttcgtcttc acctcgagtc cctatcagtg atagagattg acatccctat 120
cagtgataga gatactgagc acatcagcag gacgcactga cc 162
<210> 14
<211> 5020
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
agcttttcat tctgactgca acgggcaata tgtctctgtg tggattaaaa aaagagtgtc 60
tgatagcagc ttctgaactg gttacctgcc gtgagtaaat taaaatttta ttgacttagg 120
tcactaaata ctttaaccaa tataggcata gcgcacagac agataaaaat tacagagtac 180
acaacatcca tgaaacgcat tagcaccacc attaccacca ccatcaccat taccacaggt 240
aacggtgcgg gctgacgcgt acaggaaaca cagaaaaaag cccgcacctg acagtgcggg 300
cttttttttt cgaccaaagg taacgaggta acaaccatgc gagtgttgaa gttcggcggt 360
acatcagtgg caaatgcaga acgttttctg cgtgttgccg atattctgga aagcaatgcc 420
aggcaggggc aggtggccac cgtcctctct gcccccgcca aaatcaccaa ccacctggtg 480
gcgatgattg aaaaaaccat tagcggccag gatgctttac ccaatatcag cgatgccgaa 540
cgtatttttg ccgaactttt gacgggactc gccgccgccc agccggggtt cccgctggcg 600
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gatccggtcg aaaaactgct ggcagtgggg cattacctcg aatctaccgt cgatattgct 840
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ttgatgaagt tctccggcat tctttctggt tcgctttctt atatcttcgg caagttagac 2280
gaaggcatga gtttctccga ggcgaccacg ctggcgcggg aaatgggtta taccgaaccg 2340
gacccgcgag atgatctttc tggtatggat gtggcgcgta aactattgat tctcgctcgt 2400
gaaacgggac gtgaactgga gctggcggat attgaaattg aacctgtgct gcccgcagag 2460
tttaacgccg agggtgatgt tgccgctttt atggcgaatc tgtcacaact cgacgatctc 2520
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ccgttggtac tgcgcggata tggtgcgggc aatgacgtta cagctgccgg tgtctttgct 2760
gatctgctac gtaccctctc atggaagtta ggagtctgac atggttaaag tttatgcccc 2820
ggcttccagt gccaatatga gcgtcgggtt tgatgtgctc ggggcggcgg tgacacctgt 2880
tgatggtgca ttgctcggag atgtagtcac ggttgaggcg gcagagacat tcagtctcaa 2940
caacctcgga cgctttgccg ataagctgcc gtcagaacca cgggaaaata tcgtttatca 3000
gtgctgggag cgtttttgcc aggaactggg taagcaaatt ccagtggcga tgaccctgga 3060
aaagaatatg ccgatcggtt cgggcttagg ctccagtgcc tgttcggtgg tcgcggcgct 3120
gatggcgatg aatgaacact gcggcaagcc gcttaatgac actcgtttgc tggctttgat 3180
gggcgagctg gaaggccgta tctccggcag cattcattac gacaacgtgg caccgtgttt 3240
tctcggtggt atgcagttga tgatcgaaga aaacgacatc atcagccagc aagtgccagg 3300
gtttgatgag tggctgtggg tgctggcgta tccggggatt aaagtctcga cggcagaagc 3360
cagggctatt ttaccggcgc agtatcgccg ccaggattgc attgcgcacg ggcgacatct 3420
ggcaggcttc attcacgcct gctattcccg tcagcctgag cttgccgcga agctgatgaa 3480
agatgttatc gctgaaccct accgtgaacg gttactgcca ggcttccggc aggcgcggca 3540
ggcggtcgcg gaaatcggcg cggtagcgag cggtatctcc ggctccggcc cgaccttgtt 3600
cgctctgtgt gacaagccgg aaaccgccca gcgcgttgcc gactggttgg gtaagaacta 3660
cctgcaaaat caggaaggtt ttgttcatat ttgccggctg gatacggcgg gcgcacgagt 3720
actggaaaac taaatgaaac tctacaatct gaaagatcac aacgagcagg tcagctttgc 3780
gcaagccgta acccaggggt tgggcaaaaa tcaggggctg ttttttccgc acgacctgcc 3840
ggaattcagc ctgactgaaa ttgatgagat gctgaagctg gattttgtca cccgcagtgc 3900
gaagatcctc tcggcgttta ttggtgatga aatcccacag gaaatcctgg aagagcgcgt 3960
gcgcgcggcg tttgccttcc cggctccggt cgccaatgtt gaaagcgatg tcggttgtct 4020
ggaattgttc cacgggccaa cgctggcatt taaagatttc ggcggtcgct ttatggcaca 4080
aatgctgacc catattgcgg gtgataagcc agtgaccatt ctgaccgcga cctccggtga 4140
taccggagcg gcagtggctc atgctttcta cggtttaccg aatgtgaaag tggttatcct 4200
ctatccacga ggcaaaatca gtccactgca agaaaaactg ttctgtacat tgggcggcaa 4260
tatcgaaact gttgccatcg acggcgattt cgatgcctgt caggcgctgg tgaagcaggc 4320
gtttgatgat gaagaactga aagtggcgct agggttaaac tcggctaact cgattaacat 4380
cagccgtttg ctggcgcaga tttgctacta ctttgaagct gttgcgcagc tgccgcagga 4440
gacgcgcaac cagctggttg tctcggtgcc aagcggaaac ttcggcgatt tgacggcggg 4500
tctgctggcg aagtcactcg gtctgccggt gaaacgtttt attgctgcga ccaacgtgaa 4560
cgataccgtg ccacgtttcc tgcacgacgg tcagtggtca cccaaagcga ctcaggcgac 4620
gttatccaac gcgatggacg tgagtcagcc gaacaactgg ccgcgtgtgg aagagttgtt 4680
ccgccgcaaa atctggcaac tgaaagagct gggttatgca gccgtggatg atgaaaccac 4740
gcaacagaca atgcgtgagt taaaagaact gggctacact tcggagccgc acgctgccgt 4800
agcttatcgt gcgctgcgtg atcagttgaa tccaggcgaa tatggcttgt tcctcggcac 4860
cgcgcatccg gcgaaattta aagagagcgt ggaagcgatt ctcggtgaaa cgttggatct 4920
gccaaaagag ctggcagaac gtgctgattt acccttgctt tcacataatc tgcccgccga 4980
ttttgctgcg ttgcgtaaat tgatgatgaa tcatcagtaa 5020
<210> 15
<211> 3113
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atgaccatga ttacggattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 60
ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 120
gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 180
tttgcctggt ttccggcacc agaagcggtg ccggaaagct ggctggagtg cgatcttcct 240
gaggccgata ctgtcgtcgt cccctcaaac tggcagatgc acggttacga tgcgcccatc 300
tacaccaacg tgacctatcc cattacggtc aatccgccgt ttgttcccac ggagaatccg 360
acgggttgtt actcgctcac atttaatgtt gatgaaagct ggctacagga aggccagacg 420
cgaattattt ttgatggcgt taactcggcg tttcatctgt ggtgcaacgg gcgctgggtc 480
ggttacggcc aggacagtcg tttgccgtct gaatttgacc tgagcgcatt tttacgcgcc 540
ggagaaaacc gcctcgcggt gatggtgctg cgctggagtg acggcagtta tctggaagat 600
caggatatgt ggcggatgag cggcattttc cgtgacgtct cgttgctgca taaaccgact 660
acacaaatca gcgatttcca tgttgccact cgctttaatg atgatttcag ccgcgctgta 720
ctggaggctg aagttcagat gtgcggcgag ttgcgtgact acctacgggt aacagtttct 780
ttatggcagg gtgaaacgca ggtcgccagc ggcaccgcgc ctttcggcgg tgaaattatc 840
gatgagcgtg gtggttatgc cgatcgcgtc acactacgtc tgaacgtcga aaacccgaaa 900
ctgtggagcg ccgaaatccc gaatctctat cgtgcggtgg ttgaactgca caccgccgac 960
ggcacgctga ttgaagcaga agcctgcgat gtcggtttcc gcgaggtgcg gattgaaaat 1020
ggtctgctgc tgctgaacgg caagccgttg ctgattcgag gcgttaaccg tcacgagcat 1080
catcctctgc atggtcaggt catggatgag cagacgatgg tgcaggatat cctgctgatg 1140
aagcagaaca actttaacgc cgtgcgctgt tcgcattatc cgaaccatcc gctgtggtac 1200
acgctgtgcg accgctacgg cctgtatgtg gtggatgaag ccaatattga aacccacggc 1260
atggtgccaa tgaatcgtct gaccgatgat ccgcgctggc taccggcgat gagcgaacgc 1320
gtaacgcgaa tggtgcagcg cgatcgtaat cacccgagtg tgatcatctg gtcgctgggg 1380
aatgaatcag gccacggcgc taatcacgac gcgctgtatc gctggatcaa atctgtcgat 1440
ccttcccgcc cggtgcagta tgaaggcggc ggagccgaca ccacggccac cgatattatt 1500
tgcccgatgt acgcgcgcgt ggatgaagac cagcccttcc cggctgtgcc gaaatggtcc 1560
atcaaaaaat ggctttcgct acctggagag acgcgcccgc tgatcctttg cgaatacgcc 1620
cacgcgatgg gtaacagtct tggcggtttc gctaaatact ggcaggcgtt tcgtcagtat 1680
ccccgtttac agggcggctt cgtctgggac tgggtggatc agtcgctgat taaatatgat 1740
gaaaacggca acccgtggtc ggcttacggc ggtgattttg gcgatacgcc gaacgatcgc 1800
cagttctgta tgaacggtct ggtctttgcc gaccgcacgc cgcatccagc gctgacggaa 1860
gcaaaacacc agcagcagtt tttccagttc cgtttatccg ggcaaaccat cgaagtgacc 1920
agcgaatacc tgttccgtca tagcgataac gagctcctgc actggatggt ggcgctggat 1980
ggtaagccgc tggcaagcgg tgaagtgcct ctggatgtcg ctccacaagg taaacagttg 2040
attgaactgc ctgaactacc gcagccggag agcgccgggc aactctggct cacagtacgc 2100
gtagtgcaac cgaacgcgac cgcatggtca gaagccgggc acatcagcgc ctggcagcag 2160
tggcgtctgg cggaaaacct cagtgtgacg ctccccgccg cgtcccacgc catcccgcat 2220
ctgaccacca gcgaaatgga tttttgcatc gagctgggta ataagcgttg gcaatttaac 2280
cgccagtcag gctttctttc acagatgtgg attggcgata aaaaacaact gctgacgccg 2340
ctgcgcgatc agttcacccg tgcaccgctg gataacgaca ttggcgtaag tgaagcgacc 2400
cgcattgacc ctaacgcctg ggtcgaacgc tggaaggcgg cgggccatta ccaggccgaa 2460
gcagcgttgt tgcagtgcac ggcagataca cttgctgatg cggtgctgat tacgaccgct 2520
cacgcgtggc agcatcaggg gaaaacctta tttatcagcc ggaaaaccta ccggattgat 2580
ggtagtggtc aaatggcgat taccgttgat gttgaagtgg cgagcgatac accgcatccg 2640
gcgcggattg gcctgaactg ccagctggcg caggtagcag agcgggtaaa ctggctcgga 2700
ttagggccgc aagaaaacta tcccgaccgc cttactgccg cctgttttga ccgctgggat 2760
ctgccattgt cagacatgta taccccgtac gtcttcccga gcgaaaacgg tctgcgctgc 2820
gggacgcgcg aattgaatta tggcccacac cagtggcgcg gcgacttcca gttcaacatc 2880
agccgctaca gtcaacagca actgatggaa accagccatc gccatctgct gcacgcggaa 2940
gaaggcacat ggctgaatat cgacggtttc catatgggga ttggtggcga cgactcctgg 3000
agcccgtcag tatcggcgga attccagctg agcgccggtc gctaccatta ccagttggtc 3060
tggtgtcaaa aataataata accgggcagg ccatgtctgc ccgtatttcg cgt 3113
<210> 16
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60
gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120
aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180
gtcactactt tcgggtatgg tgttcaatgc tttgcgagat acccagatca tatgaaacag 240
catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300
aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360
aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420
ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480
atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600
ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660
cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717
<210> 17
<211> 5132
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agcttttcat tctgactgca acgggcaata tgtctctgtg tggattaaaa aaagagtgtc 60
tgatagcagc ttctgaactg gttacctgcc gtgagtaaat taaaatttta ttgacttagg 120
tcactaaata ctttaaccaa tataggcata gcgcacagac agataaaaat tacagagtac 180
acaacatcca tgaaacgcat tagcaccacc attaccacca ccatcaccat taccacaggt 240
aacggtgcgg gctgacgcgt acaggaaaca cagaaaaaag cccgcacctg acagtgcggg 300
cttttttttt cgaccaaagg taacgaggta acaaccatgc gagtgttgaa gttcggcggt 360
acatcagtgg caaatgcaga acgttttctg cgtgttgccg atattctgga aagcaatgcc 420
aggcaggggc aggtggccac cgtcctctct gcccccgcca aaatcaccaa ccacctggtg 480
gcgatgattg aaaaaaccat tagcggccag gatgctttac ccaatatcag cgatgccgaa 540
cgtatttttg ccgaactttt gacgggactc gccgccgccc agccggggtt cccgctggcg 600
caattgaaaa ctttcgtcga tcaggaattt gcccaaataa aacatgtcct gcatggcatt 660
agtttgttgg ggcagtgccc ggatagcatc aacgctgcgc tgatttgccg tggcgagaaa 720
atgtcgatcg ccattatggc cggcgtatta gaagcgcgcg gtcacaacgt tactgttatc 780
gatccggtcg aaaaactgct ggcagtgggg cattacctcg aatctaccgt cgatattgct 840
gagtccaccc gccgtattgc ggcaagccgc attccggctg atcacatggt gctgatggca 900
ggtttcaccg ccggtaatga aaaaggcgaa ctggtggtgc ttggacgcaa cggttccgac 960
tactctgctg cggtgctggc tgcctgttta cgcgccgatt gttgcgagat ttggacggac 1020
gttgacgggg tctatacctg cgacccgcgt caggtgcccg atgcgaggtt gttgaagtcg 1080
atgtcctacc agcatgcgat ggagctttcc tacttcggcg ctaaagttct tcacccccgc 1140
accattaccc ccatcgccca gttccagatc ccttgcctga ttaaaaatac cggaaatcct 1200
caagcaccag gtacgctcat tggtgccagc cgtgatgaag acgaattacc ggtcaagggc 1260
atttccaatc tgaataacat ggcaatgttc agcgtttctg gtccggggat gaaagggatg 1320
gtcggcatgg cggcgcgcgt ctttgcagcg atgtcacgcg cccgtatttc cgtggtgctg 1380
attacgcaat catcttccga atacagcatc agtttctgcg ttccacaaag cgactgtgtg 1440
cgagctgaac gggcaatgca ggaagagttc tacctggaac tgaaagaagg cttactggag 1500
ccgctggcag tgacggaacg gctggccatt atctcggtgg taggtgatgg tatgcgcacc 1560
ttgcgtggga tctcggcgaa attctttgcc gcactggccc gcgccaatat caacattgtc 1620
gccattgctc agggatcttc tgaacgctca atctctgtcg tggtaaataa cgatgatgcg 1680
accactggcg tgcgcgttac tcatcagatg ctgttcaata ccgatcaggt tatcgaagtg 1740
tttgtgattg gcgtcggtgg cgttggcggt gcgctgctgg agcaactgaa gcgtcagcaa 1800
agctggctga agaataaaca tatcgactta cgtgtctgcg gtgttgccaa ctcgaaggct 1860
ctgctcacca atgtacatgg ccttaatctg gaaaactggc aggaagaact ggcgcaagcc 1920
aaagagccgt ttaatctcgg gcgcttaatt cgcctcgtga aagaatatca tctgctgaac 1980
ccggtcattg ttgactgcac ttccagccag gcagtggcgg atcaatatgc cgacttcctg 2040
cgcgaaggtt tccacgttgt cacgccgaac aaaaaggcca acacctcgtc gatggattac 2100
taccatcagt tgcgttatgc ggcggaaaaa tcgcggcgta aattcctcta tgacaccaac 2160
gttggggctg gattaccggt tattgagaac ctgcaaaatc tgctcaatgc aggtgatgaa 2220
ttgatgaagt tctccggcat tctttctggt tcgctttctt atatcttcgg caagttagac 2280
gaaggcatga gtttctccga ggcgaccacg ctggcgcggg aaatgggtta taccgaaccg 2340
gacccgcgag atgatctttc tggtatggat gtggcgcgta aactattgat tctcgctcgt 2400
gaaacgggac gtgaactgga gctggcggat attgaaattg aacctgtgct gcccgcagag 2460
tttaacgccg agggtgatgt tgccgctttt atggcgaatc tgtcacaact cgacgatctc 2520
tttgccgcgc gcgtggcgaa ggcccgtgat gaaggaaaag ttttgcgcta tgttggcaat 2580
attgatgaag atggcgtctg ccgcgtgaag attgccgaag tggatggtaa tgatccgctg 2640
ttcaaagtga aaaatggcga aaacgccctg gccttctata gccactatta tcagccgctg 2700
ccgttggtac tgcgcggata tggtgcgggc aatgacgtta cagctgccgg tgtctttgct 2760
gatctgctac gtaccctctc atggaagtta ggagtctgac atggttaaag tttatgcccc 2820
ggcttccagt gccaatatga gcgtcgggtt tgatgtgctc ggggcggcgg tgacacctgt 2880
tgatggtgca ttgctcggag atgtagtcac ggttgaggcg gcagagacat tcagtctcaa 2940
caacctcgga cgctttgccg ataagctgcc gtcagaacca cgggaaaata tcgtttatca 3000
gtgctgggag cgtttttgcc aggaactggg taagcaaatt ccagtggcga tgaccctgga 3060
aaagaatatg ccgatcggtt cgggcttagg ctccagtgcc tgttcggtgg tcgcggcgct 3120
gatggcgatg aatgaacact gcggcaagcc gcttaatgac actcgtttgc tggctttgat 3180
gggcgagctg gaaggccgta tctccggcag cattcattac gacaacgtgg caccgtgttt 3240
tctcggtggt atgcagttga tgatcgaaga aaacgacatc atcagccagc aagtgccagg 3300
gtttgatgag tggctgtggg tgctggcgta tccggggatt aaagtctcga cggcagaagc 3360
cagggctatt ttaccggcgc agtatcgccg ccaggattgc attgcgcacg ggcgacatct 3420
ggcaggcttc attcacgcct gctattcccg tcagcctgag cttgccgcga agctgatgaa 3480
agatgttatc gctgaaccct accgtgaacg gttactgcca ggcttccggc aggcgcggca 3540
ggcggtcgcg gaaatcggcg cggtagcgag cggtatctcc ggctccggcc cgaccttgtt 3600
cgctctgtgt gacaagccgg aaaccgccca gcgcgttgcc gactggttgg gtaagaacta 3660
cctgcaaaat caggaaggtt ttgttcatat ttgccggctg gatacggcgg gcgcacgagt 3720
actggaaaac taaatgaaac tctacaatct gaaagatcac aacgagcagg tcagctttgc 3780
gcaagccgta acccaggggt tgggcaaaaa tcaggggctg ttttttccgc acgacctgcc 3840
ggaattcagc ctgactgaaa ttgatgagat gctgaagctg gattttgtca cccgcagtgc 3900
gaagatcctc tcggcgttta ttggtgatga aatcccacag gaaatcctgg aagagcgcgt 3960
gcgcgcggcg tttgccttcc cggctccggt cgccaatgtt gaaagcgatg tcggttgtct 4020
ggaattgttc cacgggccaa cgctggcatt taaagatttc ggcggtcgct ttatggcaca 4080
aatgctgacc catattgcgg gtgataagcc agtgaccatt ctgaccgcga cctccggtga 4140
taccggagcg gcagtggctc atgctttcta cggtttaccg aatgtgaaag tggttatcct 4200
ctatccacga ggcaaaatca gtccactgca agaaaaactg ttctgtacat tgggcggcaa 4260
tatcgaaact gttgccatcg acggcgattt cgatgcctgt caggcgctgg tgaagcaggc 4320
gtttgatgat gaagaactga aagtggcgct agggttaaac tcggctaact cgattaacat 4380
cagccgtttg ctggcgcaga tttgctacta ctttgaagct gttgcgcagc tgccgcagga 4440
gacgcgcaac cagctggttg tctcggtgcc aagcggaaac ttcggcgatt tgacggcggg 4500
tctgctggcg aagtcactcg gtctgccggt gaaacgtttt attgctgcga ccaacgtgaa 4560
cgataccgtg ccacgtttcc tgcacgacgg tcagtggtca cccaaagcga ctcaggcgac 4620
gttatccaac gcgatggacg tgagtcagcc gaacaactgg ccgcgtgtgg aagagttgtt 4680
ccgccgcaaa atctggcaac tgaaagagct gggttatgca gccgtggatg atgaaaccac 4740
gcaacagaca atgcgtgagt taaaagaact gggctacact tcggagccgc acgctgccgt 4800
agcttatcgt gcgctgcgtg atcagttgaa tccaggcgaa tatggcttgt tcctcggcac 4860
cgcgcatccg gcgaaattta aagagagcgt ggaagcgatt ctcggtgaaa cgttggatct 4920
gccaaaagag ctggcagaac gtgctgattt acccttgctt tcacataatc tgcccgccga 4980
ttttgctgcg ttgcgtaaat tgatgatgaa tcatcagtaa aatctattca ttatctcaat 5040
caggccgggt ttgcttttat gcagcccggc ttttttatga agaaattatg gagaaaaatg 5100
acagggaaaa aggagaaatt ctcaataaat gc 5132
<210> 18
<211> 820
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg
1 5 10 15
Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln
20 25 30
Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val
35 40 45
Ala Met Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile
50 55 60
Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala
65 70 75 80
Ala Gln Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln
85 90 95
Glu Phe Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly
100 105 110
Gln Cys Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys
115 120 125
Met Ser Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn
130 135 140
Val Thr Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala
165 170 175
Ser Arg Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala
180 185 190
Gly Asn Glu Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp
195 200 205
Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu
210 215 220
Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Gln Val
225 230 235 240
Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln His Ala Met Glu
245 250 255
Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro
260 265 270
Ile Ala Gln Phe Gln Ile Pro Cys Leu Ile Lys Asn Thr Gly Asn Pro
275 280 285
Gln Ala Pro Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Arg Asp Glu Asp Glu Leu
290 295 300
Pro Val Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val
305 310 315 320
Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe
325 330 335
Ala Ala Met Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser
340 345 350
Ser Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val
355 360 365
Arg Ala Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu
370 375 380
Gly Leu Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser
385 390 395 400
Val Val Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Lys Phe
405 410 415
Phe Ala Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln
420 425 430
Gly Ser Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Asn Asn Asp Asp Ala
435 440 445
Thr Thr Gly Val Arg Val Thr His Gln Met Leu Phe Asn Thr Asp Gln
450 455 460
Val Ile Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu
465 470 475 480
Leu Glu Gln Leu Lys Arg Gln Gln Ser Trp Leu Lys Asn Lys His Ile
485 490 495
Asp Leu Arg Val Cys Gly Val Ala Asn Ser Lys Ala Leu Leu Thr Asn
500 505 510
Val His Gly Leu Asn Leu Glu Asn Trp Gln Glu Glu Leu Ala Gln Ala
515 520 525
Lys Glu Pro Phe Asn Leu Gly Arg Leu Ile Arg Leu Val Lys Glu Tyr
530 535 540
His Leu Leu Asn Pro Val Ile Val Asp Cys Thr Ser Ser Gln Ala Val
545 550 555 560
Ala Asp Gln Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Glu Gly Phe His Val Val Thr
565 570 575
Pro Asn Lys Lys Ala Asn Thr Ser Ser Met Asp Tyr Tyr His Gln Leu
580 585 590
Arg Tyr Ala Ala Glu Lys Ser Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn
595 600 605
Val Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Glu Asn Leu Gln Asn Leu Leu Asn
610 615 620
Ala Gly Asp Glu Leu Met Lys Phe Ser Gly Ile Leu Ser Gly Ser Leu
625 630 635 640
Ser Tyr Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Met Ser Phe Ser Glu Ala
645 650 655
Thr Thr Leu Ala Arg Glu Met Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp
660 665 670
Asp Leu Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg
675 680 685
Glu Thr Gly Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Ile Glu Ile Glu Pro Val
690 695 700
Leu Pro Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala
705 710 715 720
Asn Leu Ser Gln Leu Asp Asp Leu Phe Ala Ala Arg Val Ala Lys Ala
725 730 735
Arg Asp Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp
740 745 750
Gly Val Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu
755 760 765
Phe Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr
770 775 780
Tyr Gln Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp
785 790 795 800
Val Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp
805 810 815
Lys Leu Gly Val
820
<210> 19
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Met Val Lys Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Ala Asn Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Phe Asp Val Leu Gly Ala Ala Val Thr Pro Val Asp Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Gly Asp Val Val Thr Val Glu Ala Ala Glu Thr Phe Ser Leu Asn Asn
35 40 45
Leu Gly Arg Phe Ala Asp Lys Leu Pro Ser Glu Pro Arg Glu Asn Ile
50 55 60
Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Phe Cys Gln Glu Leu Gly Lys Gln Ile
65 70 75 80
Pro Val Ala Met Thr Leu Glu Lys Asn Met Pro Ile Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Gly Ser Ser Ala Cys Ser Val Val Ala Ala Leu Met Ala Met Asn Glu
100 105 110
His Cys Gly Lys Pro Leu Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ala Leu Met Gly
115 120 125
Glu Leu Glu Gly Arg Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Asp Asn Val Ala
130 135 140
Pro Cys Phe Leu Gly Gly Met Gln Leu Met Ile Glu Glu Asn Asp Ile
145 150 155 160
Ile Ser Gln Gln Val Pro Gly Phe Asp Glu Trp Leu Trp Val Leu Ala
165 170 175
Tyr Pro Gly Ile Lys Val Ser Thr Ala Glu Ala Arg Ala Ile Leu Pro
180 185 190
Ala Gln Tyr Arg Arg Gln Asp Cys Ile Ala His Gly Arg His Leu Ala
195 200 205
Gly Phe Ile His Ala Cys Tyr Ser Arg Gln Pro Glu Leu Ala Ala Lys
210 215 220
Leu Met Lys Asp Val Ile Ala Glu Pro Tyr Arg Glu Arg Leu Leu Pro
225 230 235 240
Gly Phe Arg Gln Ala Arg Gln Ala Val Ala Glu Ile Gly Ala Val Ala
245 250 255
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Pro Thr Leu Phe Ala Leu Cys Asp Lys
260 265 270
Pro Glu Thr Ala Gln Arg Val Ala Asp Trp Leu Gly Lys Asn Tyr Leu
275 280 285
Gln Asn Gln Glu Gly Phe Val His Ile Cys Arg Leu Asp Thr Ala Gly
290 295 300
Ala Arg Val Leu Glu Asn
305 310
<210> 20
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Met Lys Leu Tyr Asn Leu Lys Asp His Asn Glu Gln Val Ser Phe Ala
1 5 10 15
Gln Ala Val Thr Gln Gly Leu Gly Lys Asn Gln Gly Leu Phe Phe Pro
20 25 30
His Asp Leu Pro Glu Phe Ser Leu Thr Glu Ile Asp Glu Met Leu Lys
35 40 45
Leu Asp Phe Val Thr Arg Ser Ala Lys Ile Leu Ser Ala Phe Ile Gly
50 55 60
Asp Glu Ile Pro Gln Glu Ile Leu Glu Glu Arg Val Arg Ala Ala Phe
65 70 75 80
Ala Phe Pro Ala Pro Val Ala Asn Val Glu Ser Asp Val Gly Cys Leu
85 90 95
Glu Leu Phe His Gly Pro Thr Leu Ala Phe Lys Asp Phe Gly Gly Arg
100 105 110
Phe Met Ala Gln Met Leu Thr His Ile Ala Gly Asp Lys Pro Val Thr
115 120 125
Ile Leu Thr Ala Thr Ser Gly Asp Thr Gly Ala Ala Val Ala His Ala
130 135 140
Phe Tyr Gly Leu Pro Asn Val Lys Val Val Ile Leu Tyr Pro Arg Gly
145 150 155 160
Lys Ile Ser Pro Leu Gln Glu Lys Leu Phe Cys Thr Leu Gly Gly Asn
165 170 175
Ile Glu Thr Val Ala Ile Asp Gly Asp Phe Asp Ala Cys Gln Ala Leu
180 185 190
Val Lys Gln Ala Phe Asp Asp Glu Glu Leu Lys Val Ala Leu Gly Leu
195 200 205
Asn Ser Ala Asn Ser Ile Asn Ile Ser Arg Leu Leu Ala Gln Ile Cys
210 215 220
Tyr Tyr Phe Glu Ala Val Ala Gln Leu Pro Gln Glu Thr Arg Asn Gln
225 230 235 240
Leu Val Val Ser Val Pro Ser Gly Asn Phe Gly Asp Leu Thr Ala Gly
245 250 255
Leu Leu Ala Lys Ser Leu Gly Leu Pro Val Lys Arg Phe Ile Ala Ala
260 265 270
Thr Asn Val Asn Asp Thr Val Pro Arg Phe Leu His Asp Gly Gln Trp
275 280 285
Ser Pro Lys Ala Thr Gln Ala Thr Leu Ser Asn Ala Met Asp Val Ser
290 295 300
Gln Pro Asn Asn Trp Pro Arg Val Glu Glu Leu Phe Arg Arg Lys Ile
305 310 315 320
Trp Gln Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Ala Ala Val Asp Asp Glu Thr Thr
325 330 335
Gln Gln Thr Met Arg Glu Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Ser Glu Pro
340 345 350
His Ala Ala Val Ala Tyr Arg Ala Leu Arg Asp Gln Leu Asn Pro Gly
355 360 365
Glu Tyr Gly Leu Phe Leu Gly Thr Ala His Pro Ala Lys Phe Lys Glu
370 375 380
Ser Val Glu Ala Ile Leu Gly Glu Thr Leu Asp Leu Pro Lys Glu Leu
385 390 395 400
Ala Glu Arg Ala Asp Leu Pro Leu Leu Ser His Asn Leu Pro Ala Asp
405 410 415
Phe Ala Ala Leu Arg Lys Leu Met Met Asn His Gln
420 425

Claims (9)

1.一种解除阻遏的苏氨酸操纵子基因，自上游至下游依次包括元件甲和元件乙；所述元件甲如序列表的序列17第294至n1位核苷酸所示，n1为310以上336以下的自然数；所述元件乙为编码苏氨酸操纵子的基因；所述解除阻遏的苏氨酸操纵子基因中不含有序列表的序列17第1-293位核苷酸。
2.如权利要求1所述的解除阻遏的苏氨酸操纵子基因，其特征在于：所述“编码苏氨酸操纵子的基因”为编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体的基因、编码高丝氨酸脱氢酶的基因和编码苏氨酸合成酶的基因。
3.如权利要求1所述的解除阻遏的苏氨酸操纵子基因，其特征在于：
所述解除阻遏的苏氨酸操纵子基因为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)：
(d1)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列17第294至336位核苷酸、序列表的序列17第337-2799位核苷酸、序列表的序列17第2801-3733位核苷酸、序列表的序列17第3734-5020位核苷酸；
(d2)序列表的序列17第294-5020位核苷酸所示的DNA分子；
(d3)序列表的序列17第294-5132位核苷酸所示的DNA分子；
(d4)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列14第294至336位核苷酸、序列表的序列14第337-2799位核苷酸、序列表的序列14第2801-3733位核苷酸、序列表的序列14第3734-5020位核苷酸；
(d5)序列表的序列14第294-5020位核苷酸所示的DNA分子。
4.一种特异DNA分子，自上游至下游依次包括启动子和权利要求1至3中任一所述的“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”。
5.含有权利要求1至3中任一所述“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”的重组质粒甲或含有权利要求4所述特异DNA分子的重组质粒乙。
6.含有权利要求1至3中任一所述的“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”的重组菌甲或含有权利要求4所述特异DNA分子的的重组菌乙。
7.权利要求6所述重组菌甲或权利要求6所述重组菌乙在生产苏氨酸中的应用。
8.一种解除苏氨酸操纵子反馈阻遏的方法，包括如下步骤：删除苏氨酸操纵子中的如下DNA区段：序列表的序列17第1-293位核苷酸。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括如下步骤：删除苏氨酸操纵子中的如下DNA区段：序列表的序列17第n2-336位核苷酸；n2为311以上336以下的自然数。
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