CN107236738B - 色氨酸衰减子突变体及其应用以及解除色氨酸衰减子反馈阻遏的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种色氨酸衰减子突变体及其应用以及解除色氨酸衰减子反馈阻遏的方法。本发明提供的色氨酸衰减子突变体，为序列2第n1‑n2位核苷酸所示DNA分子；115≤n1≤122，135≤n2≤186。本发明还保护解除衰减调控的色氨酸操纵子基因，是将色氨酸操纵子基因中的色氨酸衰减子第1至n3位核苷酸去除后得到的DNA分子；114≤n3≤121。本发明还保护一种解除微生物中色氨酸操纵子反馈阻遏的方法，删除微生物的色氨酸操纵子基因中从色氨酸衰减子第1位开始计数的第1至n3位核苷酸。采用本发明提供的方案，可以显著提高色氨酸及其衍生物产量，对于色氨酸及其衍生物的生产领域具有极其重大的应用推广价值。

Description

色氨酸衰减子突变体及其应用以及解除色氨酸衰减子反馈阻 遏的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种色氨酸衰减子突变体、基于该色氨酸衰减子突变体创制的工程菌和工程菌的应用，还涉及及高效解除色氨酸衰减子反馈阻遏的方法。

背景技术

L-色氨酸(L-Tryptophan)是含有吲哚基的芳香族氨基酸，是人和动物的必需氨基酸之一，广泛应用于食品、医药和饲料等行业。在医药行业，色氨酸可作为氨基酸注射液和药品，用于治疗抑郁症、提高睡眠质量、抗高血压及镇痛等。在食品行业，色氨酸作为添加剂可以提高机体对蛋白的利用效率。在饲料行业，色氨酸是安全型饲料添加剂，可以调节动物饲料的氨基酸的平衡，促进家禽家畜生长。L-色氨酸还可以衍生合成羟基色胺、烟酸、辅酶、吲哚乙酸、色素和生物碱等重要的生理活性物质，色氨酸衍生物具有广泛的应用市场。

生物合成氨基酸(如L-色氨酸、L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-组氨酸等)的操纵子存在衰减调节机制。当胞内特定氨基酸浓度较高时，氨基酸操纵子的转录提前终止。相反地，当胞内特定氨基酸缺乏时，RNA聚合酶转录氨基酸操纵子。

生物法生产L-色氨酸或其衍生物的过程中，胞内L-色氨酸逐步积累，通过上述衰减调控机制反馈阻遏色氨酸操纵子的表达，不利于L-色氨酸或其衍生物的生物合成。因此，高效解除色氨酸对色氨酸操纵子的衰减调控，是生物合成L-色氨酸及其衍生物的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种色氨酸衰减子突变体、基于该色氨酸衰减子突变体创制的工程菌和工程菌的应用，还涉及及高效解除色氨酸衰减子反馈阻遏的方法。

本发明首先保护DNA分子甲(色氨酸衰减子突变体)，为如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)或(a5)：

(a1)序列表的序列2第n1-n2位核苷酸所示的DNA分子；n1为115以上122以下的自然数(n1优选为115)，n2为135以上186以下的自然数(n2具体可为135以上156以下的自然数或157以上186以下的自然数，更具体可为135、156或186)；

(a2)将色氨酸衰减子的第1至n3位核苷酸去除后得到的DNA分子，n3为114以上121以下的自然数(n3优选为114)；

(a3)将色氨酸衰减子相关序列的第1至n3位核苷酸去除后得到的DNA分子，n3为114以上121以下的自然数(n3优选为114)；

(a4)在(a1)或(a2)或(a3)的末端连接标签序列得到的DNA分子；

(a5)在(a1)或(a2)或(a3)的末端连接连接序列得到的DNA分子。

色氨酸衰减子突变体为色氨酸衰减子截短体或色氨酸衰减子变体。色氨酸衰减子截短体如序列表的序列2第n1-135位核苷酸所示。色氨酸衰减子变体如序列表的序列2第n1-n4位核苷酸所示，n4为136以上186以下的自然数(n4具体可为136以上156以下的自然数或157以上186以下的自然数，更具体可为156或186)。

本发明还保护所述DNA分子甲在促进下游目的基因表达中的应用。所述应用中，所述DNA分子甲作为调控元件。所述应用中，所述DNA分子甲位于所述目的基因的启动子和所述目的基因的起始密码子之间。所述应用中，所述启动子具体可为序列表的序列1所示的启动子P_thr-trc。所述应用中，所述目的基因具体可为序列表的序列7所示的gfp基因。

本发明还保护DNA分子乙，自上游至下游依次包括：所述DNA分子甲和目的基因。所述目的基因具体可为序列表的序列7所示的gfp基因。

本发明还保护DNA分子丙，自上游至下游依次包括：启动子、所述DNA分子甲、目的基因和终止子。所述启动子具体可为序列表的序列1所示的启动子P_thr-trc。所述目的基因具体可为序列表的序列7所示的gfp基因。所述终止子具体可为CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG。

所述DNA分子甲或所述DNA分子乙或所述DNA分子丙中，不具有色氨酸衰减子的第1至n3位核苷酸，n3为114以上121以下的自然数(n3优选为114)。

所述DNA分子乙自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列2第115至186位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列7所示的gfp基因。

所述DNA分子乙自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列2第122至186位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列7所示的gfp基因。

所述DNA分子丙自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子P_thr-trc，限制性内切酶Hind III的酶切识别序列，序列表的序列2第115至186位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列7所示的gfp基因，终止子序列“CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG”。

所述DNA分子丙自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子P_thr-trc，限制性内切酶Hind III的酶切识别序列，序列表的序列2第122至186位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列7所示的gfp基因，终止子序列“CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG”。

本发明还保护DNA分子丁(解除衰减调控的色氨酸操纵子基因，又称色氨酸操纵子基因突变体)，是将色氨酸操纵子基因中的色氨酸衰减子第1至n3位核苷酸去除后得到的DNA分子；n3为114以上121以下的自然数(n3优选为114)。

所述DNA分子丁具体可为序列表的序列2第115至6687位核苷酸所示的DNA分子。

本发明还保护DNA分子戊，自上游至下游依次包括如下元件：启动子和所述DNA分子丁。所述启动子可为序列表的序列8所示的启动子P_JJ。

所述DNA分子戊自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列8所示的启动子P_JJ、pACYC184质粒中Hind III和BamH I酶切位点之间的小片段、序列表的序列2第115至6687位核苷酸所示的DNA分子。

所述DNA分子戊自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列8所示的启动子P_JJ、pACYC184质粒中Hind III和BamH I酶切位点之间的小片段、序列表的序列2第115至6865位核苷酸所示的DNA分子。

含有所述DNA分子丁或所述DNA分子戊的重组载体也属于本发明的保护范围。

含有所述DNA分子丁或所述DNA分子戊的重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为所述DNA分子丁或所述DNA分子戊插入出发质粒得到的重组质粒。所述出发质粒为低拷贝、中拷贝或高拷贝数质粒，例如pSC101、pACYC184、pBR322或pTrc99a。

所述重组菌是将所述DNA分子丁或所述DNA分子戊导入出发菌得到的。所述出发菌可为埃希氏菌属细菌或棒杆菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌K-12或其衍生菌株，更具体可为大肠杆菌K12MG1655或大肠杆菌AT。所述棒杆菌属细菌具体可为谷氨酸棒杆菌，例如谷氨酸棒杆菌13032等。

大肠杆菌AT是在大肠杆菌K12MG1655中导入编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶(AroG蛋白或AroG*蛋白；AroG蛋白为野生型蛋白，AroG*蛋白为在AroG蛋白基础上进行突变得到的解除反馈抑制的蛋白)的基因和编码转酮酶A(TktA蛋白)的基因得到的重组菌。

AroG*蛋白为如下(b1)或(b2)：

(b1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b2)将序列的氨基酸序列4经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质。

TktA蛋白为如下(c1)或(c2)：

(c1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c2)将序列的氨基酸序列6经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列6衍生的蛋白质。

编码AroG*蛋白的基因具体可如序列表的序列3所示。

编码AroG*蛋白的基因的开放阅读框具体可为序列表的序列3第151-1203位核苷酸。

编码TktA蛋白的基因具体可如序列表的序列5所示。

编码TktA蛋白的基因的开放阅读框具体可为序列表的序列5第151-2142位核苷酸。

本发明还保护所述重组菌在制备色氨酸中的应用。

应用所述重组菌生产色氨酸时，采用发酵培养基培养所述重组菌。

所述发酵培养基可以是丰富培养基，也可以是无机盐培养基。培养基包含碳源、氮源、无机离子、抗生素和其它的营养因子。作为碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳糖等糖类；也可以是甘油、甘露醇等醇类；也可以使用葡萄糖酸、柠檬酸、丁二酸等有机酸类。作为氮源，可以使用氨水、硫酸铵、磷酸铵、氯化铵等无机氮源；也可以使用玉米浆、豆粕水解液、毛发粉、酵母提取物、蛋白胨等有机氮源。无机离子包含铁、钙、镁、锰、钼、钴、铜、钾等离子中的一种或多种。其它营养因子还包括生物素、维生素B1、吡哆醛等维生素。

所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖。

所述发酵培养基具体可为：葡萄糖20.0g/L、硫酸铵15.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、七水硫酸镁2.0g/L、酵母粉2.0g/L、碳酸钙15.0g/L、微量元素混合液5mL/L，余量为水。

微量元素混合液：FeSO₄·7H₂O 10g/L、CaCl₂ 1.35g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L、MnSO₄·4H₂O 0.5g/L、CuSO₄·5H₂O 1g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.106g/L、Na₂B₄O₇·10H₂O0.23g/L、CoCl₂·6H₂O 0.48g/L、35％HCl 10mL/L，余量为水。

所述培养的条件具体可为：37℃、220rpm震荡培养36h。

所述培养的条件具体可为：将种子液以3％的接种量接种至发酵培养基中，37℃、220rpm震荡培养36h。种子液的制备方法如下：将重组菌接种至含100mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素的液体LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养8h，得到种子液。所述种子液的OD_600nm值具体可为5.0。

所述培养的过程中进行如下过程控制：培养过程中，用氨水调节反应体系的pH值使其维持在6.8-7.0；培养过程中，每隔3-4h取样一次，检测葡萄糖含量，当体系中的葡萄糖含量低于5g/L时，补加葡萄糖并使体系中的葡萄糖浓度达到10g/L。

本发明还保护一种提高微生物生产色氨酸的能力的方法，包括如下步骤：删除微生物的色氨酸操纵子基因中从色氨酸衰减子第1位开始计数的第1至n3位核苷酸；n3为114以上121以下的自然数(n3优选为114)。所述微生物为具有色氨酸操纵子的微生物。所述微生物具体可为埃希氏菌属微生物。所述埃希氏菌属微生物具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌K-12或其衍生菌株，更具体可为大肠杆菌K12MG1655或大肠杆菌AT。

本发明还保护一种解除微生物中色氨酸操纵子反馈阻遏的方法，包括如下步骤：删除微生物的色氨酸操纵子基因中从色氨酸衰减子第1位开始计数的第1至n3位核苷酸；n3为114以上121以下的自然数(n3优选为114)。所述微生物为具有色氨酸操纵子的微生物。所述微生物具体可为埃希氏菌属微生物。所述埃希氏菌属微生物具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌K-12或其衍生菌株，更具体可为大肠杆菌K12MG1655或大肠杆菌AT。

以上任一所述色氨酸操纵子包括色氨酸衰减子、编码邻氨基苯甲酸合成酶(TrpE蛋白或TrpE*蛋白；TrpE蛋白为野生型蛋白，TrpE*蛋白为在TrpE蛋白基础上进行突变得到的解除反馈抑制的蛋白的基因)、编码磷酸核糖基邻氨基苯甲酸焦磷酸化酶(TrpD蛋白)的基因、编码邻氨基磷酸核糖苯甲酸异构酶(TrpC蛋白)的基因、编码色氨酸合酶β亚基(TrpB蛋白)和编码色氨酸合酶α亚基(TrpA蛋白)的基因。

所述TrpE*蛋白为如下(d1)或(d2)：

(d1)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d2)将序列的氨基酸序列9经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有邻氨基苯甲酸合成酶功能的由序列9衍生的蛋白质。

所述TrpD蛋白为如下(e1)或(e2)：

(e1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(e2)将序列的氨基酸序列10经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸核糖基邻氨基苯甲酸焦磷酸化酶功能的由序列10衍生的蛋白质。

所述TrpC蛋白为如下(f1)或(f2)：

(f1)由序列表中序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(f2)将序列的氨基酸序列11经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有邻氨基磷酸核糖苯甲酸异构酶功能的由序列11衍生的蛋白质。

所述TrpB蛋白为如下(g1)或(g2)：

(g1)由序列表中序列12所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(g2)将序列的氨基酸序列12经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有色氨酸合酶β亚基功能的由序列12衍生的蛋白质。

所述TrpA蛋白为如下(h1)或(h2)：

(h1)由序列表中序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(h2)将序列的氨基酸序列13经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有色氨酸合酶α亚基功能的由序列13衍生的蛋白质。

编码TrpE*蛋白的基因具体可如序列表的序列2第157-1719位核苷酸所示。

编码TrpD蛋白的基因具体可如序列表的序列2第1719-3314位核苷酸所示。

编码TrpC蛋白的基因具体可如序列表的序列2第3315-4676位核苷酸所示。

编码TrpB蛋白的基因具体可如序列表的序列2第4688-5881位核苷酸所示。

编码TrpA蛋白的基因具体可如序列表的序列2第5881-6687位核苷酸所示。

所述色氨酸衰减子具体如序列表的序列2第21至135位核苷酸所示。

所述色氨酸衰减子相关序列具体如序列表的序列2第21至186位核苷酸所示。

所述色氨酸操纵子基因具体如序列表的序列2第21至6687位核苷酸所示。

所述色氨酸操纵子基因具体如序列表的序列2第21至6865位核苷酸所示。

以上任一所述色氨酸具体可为L-色氨酸。

本发明公开了一种色氨酸衰减子的改造方法及其在色氨酸发酵生产中的应用。本发明通过逐步截短色氨酸衰减子功能序列，获得了显著提高基因翻译水平的色衰减子突变体。本发明通过删除衰减子中编码前导肽的基因trpL和终止子茎环结构中前段反向互补回文序列，可以显著提高后续基因的表达水平。显而易见，根据本专利的试验结果，本领域技术人员可轻易推论得到，在本发明保护的色氨酸衰减子突变体上同时保留上述衰减子终止子茎环结构中前段反向互补回文序列的部分序列，但尚未形成稳定的茎环结构，同样可能得到相似性能的色氨酸衰减子突变体和色氨酸操纵子基因突变体。因此，这种类似的改造色氨酸衰减子的方法也在本专利的保护范围之中。

本发明还保护含有具有所述色氨酸衰减子突变体的色氨酸操纵子基因的重组菌以及所述重组菌在生产色氨酸中的应用。应用本发明提供的色氨酸衰减子改造方法，显著提高了工程菌的色氨酸发酵性能。本发明在实践上可用于细菌发酵生产色氨酸。

本发明通过从5’端逐步截短色氨酸衰减子的序列，意外的获得了可以显著提高基因表达水平的色氨酸衰减子突变体。相应的，本发明获得了色氨酸操纵子基因突变体，过表达该色氨酸操纵子基因突变体的工程菌可以显著提高色氨酸及其衍生物产量。显而易见，本发明还可用于色氨酸代谢途径下游化合物的生物合成。如羟基色胺、烟酸、辅酶、吲哚乙酸、色素和生物碱等。显而易见，本发明解除大肠杆菌的色氨酸衰减子的方法，同样可应用于其它菌属的色氨酸衰减子。

采用本发明提供的方案，可以显著提高色氨酸及其衍生物产量，对于色氨酸及其衍生物的生产领域具有极其重大的应用推广价值。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。ATCC：https://www.atcc.org/。

大肠杆菌K12MG1655：ATCC编号为700926。pACYC184质粒：NEB公司，产品目录号E4152S。pGFPuv载体：Clontech Laboratories,Inc.，Catalog No.632312。大肠杆菌EC135：记载于如下文献：Zhang et al,Plos Genetics，2012,8(9):e1002987。质粒pBR322：TaKaRa公司，产品目录号：D3050。

实施例1、衰减子突变体调控gfp基因的表达

一、构建重组质粒pACYC184-P_thr-trc

1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子(启动子P_thr-trc)。

2、以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY1947和WY1948组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

WY1947：CTAGTCTAGAGCTTTTCATTCTGACTGCAAC；

WY1948：CCCAAGCTT ACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACTGTCTGTGCGCTATGCCT。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Xba I和Hind III进行双酶切，回收酶切产物。

4、取pACYC184质粒，用限制性内切酶Xba I和Hind III进行双酶切，回收载体骨架(约4.1kb)。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pACYC184-P_thr-trc。

二、构建各个重组质粒以及相应的重组菌

1、构建重组菌GFP3223

(1)以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY3223和WY3253组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A1；以pGFPuv载体为模板，采用WY3105和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A2；将PCR扩增产物A1和PCR扩增产物A2混合后作为模板，采用WY3223和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A3。

WY3223：CCCAAGCTTACGTAAAAAGGGTATCGACA；

WY3253：AGTTCTTCTCCTTTACTCATAGAACCAGAACCAGAACCCAGTTCGAGAGTCGGTTTTTG；

WY3105：GGTTCTGGTTCTGGTTCTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA；

WY1859：ACATGCATGC

CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTTGTAGAGCTCATCCATGCCA。

(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物A3，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收酶切产物。

(3)取重组质粒pACYC184-P_thr-trc，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。

(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌EC135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pACYC184-P_thr-trc-trpLE-gfp3223。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-P_thr-trc-trpLE-gfp3223进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和Sph I酶切位点之间插入了特异DNA分子；特异DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子P_thr-trc，限制性内切酶Hind III的酶切识别序列，序列表的序列2第1至186位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列7所示的gfp基因，终止子序列“CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG”。

含有重组质粒pACYC184-P_thr-trc-trpLE-gfp3223的大肠杆菌EC135命名为重组菌GFP3223。

2、构建重组菌GFP3224

(1)以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY3224和WY3253组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A1；以pGFPuv载体为模板，采用WY3105和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A2；将PCR扩增产物A1和PCR扩增产物A2混合后作为模板，采用WY3224和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A3。

WY3224：CCCAAGCTTCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACA。

(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物A3，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收酶切产物。

(3)取重组质粒pACYC184-P_thr-trc，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。

(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌EC135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pACYC184-P_thr-trc-trpLE-gfp3224。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-P_thr-trc-trpLE-gfp3224进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和Sph I酶切位点之间插入了特异DNA分子；特异DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子P_thr-trc，限制性内切酶Hind III的酶切识别序列，序列表的序列2第115至186位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列7所示的gfp基因，终止子序列“CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG”。

含有重组质粒pACYC184-P_thr-trc-trpLE-gfp3224的大肠杆菌EC135命名为重组菌GFP3224。

3、构建重组菌GFP3225

(1)以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY3225和WY3253组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A1；以pGFPuv载体为模板，采用WY3105和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A2；将PCR扩增产物A1和PCR扩增产物A2混合后作为模板，采用WY3225和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A3。

WY3225：CCCAAGCTT GCGGGCTTTTTTTTGAACAA。

(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物A3，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收酶切产物。

(3)取重组质粒pACYC184-P_thr-trc，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。

(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌EC135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pACYC184-P_thr-trc-trpLE-gfp3225。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-P_thr-trc-trpLE-gfp3225进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和Sph I酶切位点之间插入了特异DNA分子；特异DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子P_thr-trc，限制性内切酶Hind III的酶切识别序列，序列表的序列2第122至186位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列7所示的gfp基因，终止子序列“CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG”。

含有重组质粒pACYC184-P_thr-trc-trpLE-gfp3225的大肠杆菌EC135命名为重组菌GFP3225。

4、构建重组菌GFP3226

(1)以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY3226和WY3253组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A1；以pGFPuv载体为模板，采用WY3105和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A2；将PCR扩增产物A1和PCR扩增产物A2混合后作为模板，采用WY3226和WY1859组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A3。

WY3226：CCCAAGCTT AACAAAATTAGAGAATAACAATGCAAAC。

(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物A3，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收酶切产物。

(3)取重组质粒pACYC184-P_thr-trc，用限制性内切酶Hind III和Sph I双酶切，回收载体骨架(约4.0kb)。

(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌EC135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pACYC184-P_thr-trc-trpLE-gfp3226。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-P_thr-trc-trpLE-gfp3226进行结构描述如下：在质粒pACYC184的Xba I和Sph I酶切位点之间插入了特异DNA分子；特异DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列1所示的启动子P_thr-trc，限制性内切酶Hind III的酶切识别序列，序列表的序列2第137至186位核苷酸，连接序列“GGTTCTGGTTCTGGTTCT”，序列表的序列7所示的gfp基因，终止子序列“CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG”。

含有重组质粒pACYC184-P_thr-trc-trpLE-gfp3226的大肠杆菌EC135命名为重组菌GFP3226。

5、构建GFP对照

将重组质粒pACYC184-P_thr-trc导入大肠杆菌EC135，得到的重组菌命名为GFP对照。

三、GFP荧光强度分析

试验菌株为：重组菌GFP3223、重组菌GFP3224、重组菌GFP3225或重组菌GFP3226。

设置GFP对照作为对照菌株。

1、将试验菌株或对照菌株接种至含34mg/L氯霉素的液体LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜。

2、取步骤1得到的菌液，按照1％接种量接种于含34mg/L氯霉素的液体LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养12小时。

3、取150μL步骤2得到的菌液，加入黑边透底的96孔板中，使用高通量多功能酶标仪(INFINITE 200 PRO型，瑞士TECAN)同时检测细胞密度和GFP荧光信号。检测细胞密度的相关参数设置见表1。检测GFP荧光信号的相关参数设置见表2。

表1

	吸光度(Absorbance)
		波长(Wavelength)	600nm
带宽(Bandwidth)	9nm
		闪光次数(Number of Flashes)	25
建立时间(Settle Time)	0ms

表2

	荧光顶读(Fluorescence Top Reading)
		激发波长(Excitation Wavelength)	400nm
发射波长(Emission Wavelength)	510nm
		激发带宽(Excitation Bandwidth)	9nm
发射带宽(Emission Bandwidth)	20nm
		收集(Gain)	100(手动，Manual)
闪光次数(Number of Flashes)	15
		积分时间(Integration Time)	20μs
滞后时间(LagTime)	0μs
		建立时间(Settle Time)	0ms
Z位置(Z-Position)	20000μm(手动，Manual)

各个试验菌株的荧光强度值＝实测荧光值÷细胞密度-对照菌株的实测荧光值÷对照菌株的细胞密度。设置三次重复试验，相应的平均值和标准差结果见表3。

与重组菌GFP3223(完全保留色氨酸衰减子)相比，重组菌GFP3224的荧光强度提高了10.7倍。与重组菌GFP3226(完全去除色氨酸衰减子)相比，重组菌GFP3224的荧光强度提高了10.6倍。与重组菌GFP3223相比，重组菌GFP3225的荧光强度提高了3.6倍。与重组菌GFP3226相比，重组菌GFP3225的荧光强度提高了3.6倍。结果表明，位于启动子和目的基因之间的色氨酸衰减子截短体可以作为调控元件，促进目的基因的表达。

色氨酸衰减子突变体如序列表的序列2第n1-n2位核苷酸所示，n1为115以上122以下的自然数(n1优选为115)，n2为135以上186以下的自然数(n2具体可为135以上156以下的自然数或157以上186以下的自然数，更具体可为135、156或186)。色氨酸衰减子突变体包括色氨酸衰减子截短体和色氨酸衰减子变体(全称为在色氨酸衰减子截短体下游连接其他核苷酸的变体)。色氨酸衰减子截短体如序列表的序列2第n1-135位核苷酸所示。色氨酸衰减子变体如序列表的序列2第n1-n4位核苷酸所示，n4为136以上186以下的自然数(n4具体可为136以上156以下的自然数或157以上186以下的自然数，更具体可为156或186)。

表3

	荧光强度
		重组菌GFP3223	2841.4±15.2
重组菌GFP3224	33141.9±283.2
		重组菌GFP3225	13084.2±188.3
重组菌GFP3226	2865.1±76.5

实施例2、制备色氨酸

一、构建重组质粒pBR322-aroG*

1、以大肠杆菌K12MG1655的基因组为模板，采用WY4001和WY4002组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2、以大肠杆菌K12MG1655的基因组为模板，采用WY4003和WY4004组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

3、将步骤1得到的PCR扩增产物和步骤2得到的PCR扩增产物混合后作为模板，采用WY4001和WY4004组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

经测序，步骤3得到的PCR扩增产物的NheI和BamH I酶切识别位点之间的核苷酸如序列表的序列3所示。序列表的序列3中，开放阅读框为第151-1203位核苷酸，编码序列表的序列4所示的AroG*蛋白。与AroG蛋白(野生蛋白)相比，AroG*蛋白只存在一个氨基酸残基的差异，即将AroG蛋白第150位氨基酸残基由脯氨酸突变为了亮氨酸。

WY4001：CTAGCTAGCATCTCGTTTTTCGCGACAATCT；

WY4002：CAGGTCAGCGAGATATTGTAGGGTGATCATATCGAGAAAC；

WY4003：GTTTCTCGATATGATCACCCTACAATATCTCGCTGACCTG；

WY4004：CGCGGATCC AGCGAAAGCAGCGGCGGTT。

4、取质粒pBR322，用限制性内切酶Nhe I和BamH I双酶切，回收载体骨架(约4.3kb)。

5、取步骤3得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Nhe I和BamH I双酶切，回收酶切产物。

6、将步骤4的载体骨架和步骤5的酶切产物连接，得到重组质粒pBR322-aroG*。

二、构建重组质粒pBR322-aroG*-tktA

1、以大肠杆菌K12MG1655的基因组为模板，采用WY4005和WY4006组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。经测序，PCR扩增产物的BamHI和Eco 52I酶切识别位点之间的核苷酸如序列表的序列5所示。序列表的序列5中，开放阅读框为第151-2142位核苷酸，编码序列表的序列6所示的TktA蛋白。

WY4005：CGC GGATCC ATCCAGAGATTTCTGAAGCG；

WY4006：AAT CGGCCG TTAATTTCTTATATAACATTGAGTTATAGATATAACAAC。

2、取重组质粒pBR322-aroG*，用限制性内切酶BamH I和Eco 52I双酶切，回收载体骨架(约5.2kb)。

3、取步骤1得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶BamH I和Eco 52I双酶切，回收酶切产物。

4、将步骤2的载体骨架和步骤3的酶切产物连接，得到重组质粒pBR322-aroG*-tktA。根据测序结果，对重组质粒pBR322-aroG*-tktA进行结构描述如下：在质粒pBR322的Nhe I和Eco52I之间插入了自上游至下游依次由如下元件组成的DNA分子：序列表的序列3所示的DMA分子、限制性内切酶BamHI的酶切识别序列、序列表的序列5所示的DMA分子。

三、构建重组质粒pACYC184-P_JJ

1、合成序列表的序列8所示的双链DNA分子(启动子P_JJ)。

2、以步骤1制备的双链DNA分子为模板，采用WY843和WY842组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

WY843：TGCTCTAGACAATTCCGACGTCTAAGAAA；

WY842：CCCAAGCTTGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶XbaI和Hind III进行双酶切，回收酶切产物。

4、取pACYC184质粒，用限制性内切酶XbaI和Hind III进行双酶切，回收载体骨架(约4.1kb)。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pACYC184-P_JJ。

四、构建重组质粒pACYC184-P_JJ-trpL^*E*DCBA

1、以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY4007和WY4010组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A1；以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY4008和WY4010组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A2；以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY4009和WY4010组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A3；以大肠杆菌K12MG1655的基因组DNA为模板，采用WY4011和WY4012组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A4。

WY4007：CGCggatccACGTAAAAAGGGTATCGACA；

WY4008：CGCggatccCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACA；

WY4009：CGCggatcc AACAAAATTAGAGAATAACAATGCAAAC；

WY4010：ATCCTGCATAAAAAACGTGTACGGGCTGGGATTACTC；

WY4011：GAGTAATCCCAGCCCGTACACGTTTTTTATGCAGGAT；

WY4012：ACATGCATGC GTTATGTTGCGGGATTAATTTGT。

通过引物WY4010和WY4011在trpE基因中引入一个点突变，突变后的基因编码序列表的序列9所示的TrpE*蛋白。与TrpE蛋白(野生蛋白)相比，TrpE*蛋白只存在一个氨基酸残基的差异，即将TrpE蛋白第293位氨基酸残基由蛋氨酸突变为了苏氨酸。

2、将PCR扩增产物A1和PCR扩增产物A4混合后作为模板，采用WY4007和WY4012组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物B1；将PCR扩增产物A2和PCR扩增产物A4混合后作为模板，采用WY4008和WY4012组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物B2；将PCR扩增产物A3和PCR扩增产物A4混合后作为模板，采用WY4009和WY4012组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物B3。

3、取重组质粒pACYC184-P_JJ，用限制性内切酶BamH I和Sph I双酶切，回收载体骨架。

4、取步骤2得到的PCR扩增产物B1，用限制性内切酶BamH I和Sph I双酶切，回收酶切产物。

5、将步骤3的载体骨架和步骤4的酶切产物连接，得到重组质粒pACYC184-P_JJ-trpL⁴⁰⁰⁷E*DCBA。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-P_JJ-trpL⁴⁰⁰⁷E*DCBA进行结构描述如下：以pACYC184质粒为出发载体，在XbaI和Hind III酶切位点之间插入了序列表的序列8所示的启动子P_JJ，在BamH I和Sph I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA分子。

6、取步骤2得到的PCR扩增产物B2，用限制性内切酶BamH I和Sph I双酶切，回收酶切产物。

7、将步骤3的载体骨架和步骤6的酶切产物连接，得到重组质粒pACYC184-P_JJ-trpL⁴⁰⁰⁸E*DCBA。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-P_JJ-trpL⁴⁰⁰⁸E*DCBA进行结构描述如下：以pACYC184质粒为出发载体，在XbaI和Hind III酶切位点之间插入了序列表的序列8所示的启动子P_JJ，在BamH I和Sph I酶切位点之间插入了序列表的序列2第115至6865位核苷酸所示的DNA分子。

8、取步骤2得到的PCR扩增产物B3，用限制性内切酶BamH I和Sph I双酶切，回收酶切产物。

9、将步骤3的载体骨架和步骤8的酶切产物连接，得到重组质粒pACYC184-P_JJ-trpL⁴⁰⁰⁹E*DCBA。根据测序结果，对重组质粒pACYC184-P_JJ-trpL⁴⁰⁰⁹E*DCBA进行结构描述如下：以pACYC184质粒为出发载体，在XbaI和Hind III酶切位点之间插入了序列表的序列8所示的启动子P_JJ，在BamH I和Sph I酶切位点之间插入了序列表的序列2第137至6865位核苷酸所示的DNA分子。

五、构建重组菌

将重组质粒pBR322-aroG*-tktA导入大肠杆菌K12MG1655，得到重组菌，将其命名为重组菌AT。

将重组质粒pACYC184-P_JJ-trpL⁴⁰⁰⁷E*DCBA导入重组菌AT中，得到重组菌，将其命名为工程菌Trp4007。

将重组质粒pACYC184-P_JJ-trpL⁴⁰⁰⁸E*DCBA导入重组菌AT中，得到重组菌，将其命名为工程菌Trp4008。

将重组质粒pACYC184-P_JJ-trpL⁴⁰⁰⁹E*DCBA导入重组菌AT中，得到重组菌，将其命名为工程菌Trp4009。

六、色氨酸工程菌的摇瓶发酵试验

试验菌株为：工程菌Trp4007、工程菌Trp4008或工程菌Trp4009。

1、取试验菌株，划线接种于含100mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素的固体LB培养基平板，37℃静置培养12小时。

2、完成步骤2后，挑取平板上的菌苔，接种至含100mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素的液体LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养8h，得到种子液(OD_600nm值＝5.0)。

3、完成步骤3后，将种子液按照3％的接种量接种至发酵培养基中，37℃、220rpm震荡培养。

发酵培养基：葡萄糖20.0g/L、硫酸铵15.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、七水硫酸镁2.0g/L、酵母粉2.0g/L、碳酸钙15.0g/L、微量元素混合液5mL/L，余量为水。

微量元素混合液：FeSO₄·7H₂O 10g/L、CaCl₂ 1.35g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.25g/L、MnSO₄·4H₂O 0.5g/L、CuSO₄·5H₂O 1g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.106g/L、Na₂B₄O₇·10H₂O0.23g/L、CoCl₂·6H₂O 0.48g/L、35％HCl 10mL/L，余量为水。

培养过程中，用氨水调节反应体系的pH值使其维持在6.8-7.0。

培养过程中，每隔3-4h取样一次，使用生物传感分析仪SBA-40D检测葡萄糖含量，当体系中的葡萄糖含量低于5g/L时，补加葡萄糖并使体系中的葡萄糖浓度达到10g/L。

培养36h后取样，12000g离心2分钟，取上清液(即为发酵上清)，检测L-色氨酸浓度。

结果见表4(三次重复试验的平均值±标准差)。工程菌Trp4008生产L-色氨酸的能力最高，发酵上清中的L-色氨酸浓度为1.20±0.15g/L。

表4

	发酵上清中的L-色氨酸含量(g/L)
		工程菌Trp4007	0.43±0.08
工程菌Trp4008	1.20±0.15
		工程菌Trp4009	0.51±0.10

发酵上清中L-色氨酸浓度的检测方法：高效液相法，在参考文献(氨基酸和生物资源，2000，22，59-60)中氨基酸检测方法的基础上进行优化，具体方法如下(2,4-二硝基氟苯(FDBN)柱前衍生高效液相法)：

取10μL上清液于2mL离心管中，加入200μL 0.5M NaHCO₃水溶液和100μL 1％(体积比)FDBN-乙腈溶液，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至室温，然后加入700μL0.04mol/L KH₂PO₄水溶液(pH＝7.2±0.05,用40g/L KOH水溶液调整pH)并摇匀，静置15min，然后过滤并收集滤液。滤液用于上样，进样量为15μL。

色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm,Agilent,USA)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相A为0.04mol/L KH₂PO₄水溶液(pH＝7.2±0.05,用40g/100mL KOH水溶液调整pH)，流动相B为55％(体积比)乙腈水溶液，流动相总流量为1mL/min。

洗脱过程：洗脱起始时刻(0min)流动相A占流动相总流量的体积份数为86％、流动相B占流动相总流量的体积份数为14％；洗脱过程分为4个阶段，每个阶段中流动相A和流动相B占流动相总流量的体积份数均为线性变化；第1阶段(从起始时刻开始共进行2min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为88％、流动相B占流动相总流量的体积份数为12％，第2阶段(从第1阶段结束时刻开始共进行2min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为86％、流动相B占流动相总流量的体积份数为14％，第3阶段(从第2阶段结束时刻开始共进行6min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为70％、流动相B占流动相总流量的体积份数为30％，第4阶段(从第3阶段结束时刻开始共进行10min)结束时流动相A占流动相总流量的体积份数为30％、流动相B占流动相总流量的体积份数为70％。

以市售L-色氨酸为标准品制作标准曲线，计算样品的色氨酸浓度。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 色氨酸衰减子突变体及其应用以及解除色氨酸衰减子反馈阻遏的方法

<130> GNCYX171072

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcttttcatt ctgactgcaa cgggcaatat gtctctgtgt ggattaaaaa aagagtgtct 60

gatagcagct tctgaactgg ttacctgccg tgagtaaatt aaaattttat tgacttaggt 120

cactaaatac tttaaccaat ataggcatag cgcacagaca gttgacaatt aatcatccgg 180

ctcgtataat gt 192

<210> 2

<211> 6865

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 2

acgtaaaaag ggtatcgaca atgaaagcaa ttttcgtact gaaaggttgg tggcgcactt 60

cctgaaacgg gcagtgtatt caccatgcgt aaagcaatca gatacccagc ccgcctaatg 120

agcgggcttt tttttgaaca aaattagaga ataacaatgc aaacacaaaa accgactctc 180

gaactgctaa cctgcgaagg cgcttatcgc gacaatccca ccgcgctttt tcaccagttg 240

tgtggggatc gtccggcaac gctgctgctg gaatccgcag atatcgacag caaagatgat 300

ttaaaaagcc tgctgctggt agacagtgcg ctgcgcatta cagctttagg tgacactgtc 360

acaatccagg cactttccgg caacggcgaa gccctcctgg cactactgga taacgccctg 420

cctgcgggtg tggaaagtga acaatcacca aactgccgtg tgctgcgctt cccccctgtc 480

agtccactgc tggatgaaga cgcccgctta tgctcccttt cggtttttga cgctttccgt 540

ttattgcaga atctgttgaa tgtaccgaag gaagaacgag aagccatgtt cttcggcggc 600

ctgttctctt atgaccttgt ggcgggattt gaagatttac cgcaactgtc agcggaaaat 660

aactgccctg atttctgttt ttatctcgct gaaacgctga tggtgattga ccatcagaaa 720

aaaagcaccc gtattcaggc cagcctgttt gctccgaatg aagaagaaaa acaacgtctc 780

actgctcgcc tgaacgaact acgtcagcaa ctgaccgaag ccgcgccgcc gctgccagtg 840

gtttccgtgc cgcatatgcg ttgtgaatgt aatcagagcg atgaagagtt cggtggcgta 900

gtgcgtttgt tgcaaaaagc gattcgcgct ggagaaattt tccaggtggt gccatctcgc 960

cgtttctctc tgccctgccc gtcaccgctg gcggcctatt acgtgctgaa aaagagtaat 1020

cccagcccgt acacgttttt tatgcaggat aatgatttca ccctatttgg cgcgtcgccg 1080

gaaagctcgc tcaagtatga tgccaccagc cgccagattg agatctaccc gattgccgga 1140

acacgcccac gcggtcgtcg cgccgatggt tcactggaca gagatctcga cagccgtatt 1200

gaactggaaa tgcgtaccga tcataaagag ctgtctgaac atctgatgct ggttgatctc 1260

gcccgtaatg atctggcacg catttgcacc cccggcagcc gctacgtcgc cgatctcacc 1320

aaagttgacc gttattccta tgtgatgcac ctcgtctctc gcgtagtcgg cgaactgcgt 1380

cacgatcttg acgccctgca cgcttatcgc gcctgtatga atatggggac gttaagcggt 1440

gcgccgaaag tacgcgctat gcagttaatt gccgaggcgg aaggtcgtcg ccgcggcagc 1500

tacggcggcg cggtaggtta tttcaccgcg catggcgatc tcgacacctg cattgtgatc 1560

cgctcggcgc tggtggaaaa cggtatcgcc accgtgcaag cgggtgctgg tgtagtcctt 1620

gattctgttc cgcagtcgga agccgacgaa acccgtaaca aagcccgcgc tgtactgcgc 1680

gctattgcca ccgcgcatca tgcacaggag actttctgat ggctgacatt ctgctgctcg 1740

ataatatcga ctcttttacg tacaacctgg cagatcagtt gcgcagcaat gggcataacg 1800

tggtgattta ccgcaaccat attccggcgc aaaccttaat tgaacgcctg gcgaccatga 1860

gcaatccggt gctgatgctt tctcctggcc ccggtgtgcc gagcgaagcc ggttgtatgc 1920

cggaactcct cacccgcttg cgtggcaagc tgcccattat tggcatttgc ctcggacatc 1980

aggcgattgt cgaagcttac gggggctatg tcggtcaggc gggcgaaatt ctccacggta 2040

aagcctccag cattgaacat gacggtcagg cgatgtttgc cggattaaca aacccgctgc 2100

cggtggcgcg ttatcactcg ctggttggca gtaacattcc ggccggttta accatcaacg 2160

cccattttaa tggcatggtg atggcagtac gtcacgatgc ggatcgcgtt tgtggattcc 2220

agttccatcc ggaatccatt ctcaccaccc agggcgctcg cctgctggaa caaacgctgg 2280

cctgggcgca gcagaaacta gagccagcca acacgctgca accgattctg gaaaaactgt 2340

atcaggcgca gacgcttagc caacaagaaa gccaccagct gttttcagcg gtggtgcgtg 2400

gcgagctgaa gccggaacaa ctggcggcgg cgctggtgag catgaaaatt cgcggtgagc 2460

acccgaacga gatcgccggg gcagcaaccg cgctactgga aaacgcagcg ccgttcccgc 2520

gcccggatta tctgtttgct gatatcgtcg gtactggcgg tgacggcagc aacagtatca 2580

atatttctac cgccagtgcg tttgtcgccg cggcctgtgg gctgaaagtg gcgaaacacg 2640

gcaaccgtag cgtctccagt aaatctggtt cgtccgatct gctggcggcg ttcggtatta 2700

atcttgatat gaacgccgat aaatcgcgcc aggcgctgga tgagttaggt gtatgtttcc 2760

tctttgcgcc gaagtatcac accggattcc gccacgcgat gccggttcgc cagcaactga 2820

aaacccgcac cctgttcaat gtgctggggc cattgattaa cccggcgcat ccgccgctgg 2880

cgttaattgg tgtttatagt ccggaactgg tgctgccgat tgccgaaacc ttgcgcgtgc 2940

tggggtatca acgcgcggcg gtggtgcaca gcggcgggat ggatgaagtt tcattacacg 3000

cgccgacaat cgttgccgaa ctgcatgacg gcgaaattaa aagctatcag ctcaccgcag 3060

aagactttgg cctgacaccc taccaccagg agcaactggc aggcggaaca ccggaagaaa 3120

accgtgacat tttaacacgt ttgttacaag gtaaaggcga cgccgcccat gaagcagccg 3180

tcgctgcgaa cgtcgccatg ttaatgcgcc tgcatggcca tgaagatctg caagccaatg 3240

cgcaaaccgt tcttgaggta ctgcgcagtg gttccgctta cgacagagtc accgcactgg 3300

cggcacgagg gtaaatgatg caaaccgttt tagcgaaaat cgtcgcagac aaggcgattt 3360

gggtagaagc ccgcaaacag cagcaaccgc tggccagttt tcagaatgag gttcagccga 3420

gcacgcgaca tttttatgat gcgctacagg gtgcgcgcac ggcgtttatt ctggagtgca 3480

agaaagcgtc gccgtcaaaa ggcgtgatcc gtgatgattt cgatccagca cgcattgccg 3540

ccatttataa acattacgct tcggcaattt cggtgctgac tgatgagaaa tattttcagg 3600

ggagctttaa tttcctcccc atcgtcagcc aaatcgcccc gcagccgatt ttatgtaaag 3660

acttcattat cgacccttac cagatctatc tggcgcgcta ttaccaggcc gatgcctgct 3720

tattaatgct ttcagtactg gatgacgacc aatatcgcca gcttgccgcc gtcgctcaca 3780

gtctggagat gggggtgctg accgaagtca gtaatgaaga ggaacaggag cgcgccattg 3840

cattgggagc aaaggtcgtt ggcatcaaca accgcgatct gcgtgatttg tcgattgatc 3900

tcaaccgtac ccgcgagctt gcgccgaaac tggggcacaa cgtgacggta atcagcgaat 3960

ccggcatcaa tacttacgct caggtgcgcg agttaagcca cttcgctaac ggttttctga 4020

ttggttcggc gttgatggcc catgacgatt tgcacgccgc cgtgcgccgg gtgttgctgg 4080

gtgagaataa agtatgtggc ctgacgcgtg ggcaagatgc taaagcagct tatgacgcgg 4140

gcgcgattta cggtgggttg atttttgttg cgacatcacc gcgttgcgtc aacgttgaac 4200

aggcgcagga agtgatggct gcggcaccgt tgcagtatgt tggcgtgttc cgcaatcacg 4260

atattgccga tgtggtggac aaagctaagg tgttatcgct ggcggcagtg caactgcatg 4320

gtaatgaaga acagctgtat atcgatacgc tgcgtgaagc tctgccagca catgttgcca 4380

tctggaaagc attaagcgtc ggtgaaaccc tgcccgcccg cgagtttcag cacgttgata 4440

aatatgtttt agacaacggc cagggtggaa gcgggcaacg ttttgactgg tcactattaa 4500

atggtcaatc gcttggcaac gttctgctgg cggggggctt aggcgcagat aactgcgtgg 4560

aagcggcaca aaccggctgc gccggacttg attttaattc tgctgtagag tcgcaaccgg 4620

gcatcaaaga cgcacgtctt ttggcctcgg ttttccagac gctgcgcgca tattaaggaa 4680

aggaacaatg acaacattac ttaaccccta ttttggtgag tttggcggca tgtacgtgcc 4740

acaaatcctg atgcctgctc tgcgccagct ggaagaagct tttgtcagtg cgcaaaaaga 4800

tcctgaattt caggctcagt tcaacgacct gctgaaaaac tatgccgggc gtccaaccgc 4860

gctgaccaaa tgccagaaca ttacagccgg gacgaacacc acgctgtatc tcaagcgtga 4920

agatttgctg cacggcggcg cgcataaaac taaccaggtg ctggggcagg cgttgctggc 4980

gaagcggatg ggtaaaaccg aaatcatcgc cgaaaccggt gccggtcagc atggcgtggc 5040

gtcggccctt gccagcgccc tgctcggcct gaaatgccgt atttatatgg gtgccaaaga 5100

cgttgaacgc cagtcgccta acgtttttcg tatgcgctta atgggtgcgg aagtgatccc 5160

ggtgcatagc ggttccgcga cgctgaaaga tgcctgtaac gaggcgctgc gcgactggtc 5220

cggtagttac gaaaccgcgc actatatgct gggcaccgca gctggcccgc atccttatcc 5280

gaccattgtg cgtgagtttc agcggatgat tggcgaagaa accaaagcgc agattctgga 5340

aagagaaggt cgcctgccgg atgccgttat cgcctgtgtt ggcggcggtt cgaatgccat 5400

cggcatgttt gctgatttca tcaatgaaac caacgtcggc ctgattggtg tggagccagg 5460

tggtcacggt atcgaaactg gcgagcacgg cgcaccgcta aaacatggtc gcgtgggtat 5520

ctatttcggt atgaaagcgc cgatgatgca aaccgaagac gggcagattg aagaatctta 5580

ctccatctcc gccggactgg atttcccgtc tgtcggccca caacacgcgt atcttaacag 5640

cactggacgc gctgattacg tgtctattac cgatgatgaa gcccttgaag ccttcaaaac 5700

gctgtgcctg cacgaaggga tcatcccggc gctggaatcc tcccacgccc tggcccatgc 5760

gttgaaaatg atgcgcgaaa acccggataa agagcagcta ctggtggtta acctttccgg 5820

tcgcggcgat aaagacatct tcaccgttca cgatattttg aaagcacgag gggaaatctg 5880

atggaacgct acgaatctct gtttgcccag ttgaaggagc gcaaagaagg cgcattcgtt 5940

cctttcgtca cgctcggtga tccgggcatt gagcagtcat tgaaaattat cgatacgcta 6000

attgaagccg gtgctgacgc gctggagtta ggtatcccct tctccgaccc actggcggat 6060

ggcccgacga ttcaaaacgc cactctgcgc gcctttgcgg caggtgtgac tccggcacaa 6120

tgttttgaaa tgctggcact gattcgccag aaacacccga ccattcccat tggcctgttg 6180

atgtatgcca atctggtgtt taacaaaggc attgatgagt tttatgccca gtgcgaaaaa 6240

gtcggcgtcg attcggtgct ggttgccgat gtgccagttg aagagtccgc gcccttccgc 6300

caggccgcgt tgcgtcataa tgtcgcacct atcttcatct gcccgccaaa tgccgatgac 6360

gacctgctgc gccagatagc ctcttacggt cgtggttaca cctatttgct gtcacgagca 6420

ggcgtgaccg gcgcagaaaa ccgcgccgcg ttacccctca atcatctggt tgcgaagctg 6480

aaagagtaca acgctgcacc tccattgcag ggatttggta tttccgcccc ggatcaggta 6540

aaagcagcga ttgatgcagg agctgcgggc gcgatttctg gttcggccat tgttaaaatc 6600

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ccgatgaaag cggcgacgcg cagttaatcc cacagccgcc agttccgctg gcggcatttt 6720

aactttcttt aatgaagccg gaaaaatcct aaattcattt aatatttatc tttttaccgt 6780

ttcgcttacc ccggtcgaac gtcaacttac gtcatttttc cgcccaacag taatataatc 6840

aaacaaatta atcccgcaac ataac 6865

<210> 3

<211> 1403

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 3

atctcgtttt tcgcgacaat ctggcgtttt tcttgctaat tccaggatta atccgttcat 60

agtgtaaaac cccgtttaca cattctgacg gaagatatag attggaagta ttgcattcac 120

taagataagt atggcaacac tggaacagac atgaattatc agaacgacga tttacgcatc 180

aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa 240

aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat 300

gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa 360

gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta 420

atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc acggtgggct ggaaagggct gattaacgat 480

ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg 540

cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccta 600

caatatctcg ctgacctgat gagctggggc gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag 660

gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac 720

ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg 780

tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat 840

atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa 900

gaagggctga acaaagcagg cctgccagca caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac 960

tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc 1020

ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag 1080

agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc 1140

tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg 1200

taaggtttaa ttgtcggatg cgccgtcaga gtggcgtatc cgatgaatca ccacaggcct 1260

gataagtcgc gcagcgtcgc atcaggcaat gtgctccatt gttagcaaca aaaaagccga 1320

ctcacttgca gtcggctttc tcattttaaa cgaatgacgt ttacttcgct ttaccctggt 1380

ttgcaaccgc cgctgctttc gct 1403

<210> 4

<211> 350

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 4

Met Asn Tyr Gln Asn Asp Asp Leu Arg Ile Lys Glu Ile Lys Glu Leu

1 5 10 15

Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Glu Lys Phe Pro Ala Thr Glu Asn Ala

20 25 30

Ala Asn Thr Val Ala His Ala Arg Lys Ala Ile His Lys Ile Leu Lys

35 40 45

Gly Asn Asp Asp Arg Leu Leu Val Val Ile Gly Pro Cys Ser Ile His

50 55 60

Asp Pro Val Ala Ala Lys Glu Tyr Ala Thr Arg Leu Leu Ala Leu Arg

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Asp Glu Leu Glu Ile Val Met Arg Val Tyr Phe Glu

85 90 95

Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro His

100 105 110

Met Asp Asn Ser Phe Gln Ile Asn Asp Gly Leu Arg Ile Ala Arg Lys

115 120 125

Leu Leu Leu Asp Ile Asn Asp Ser Gly Leu Pro Ala Ala Gly Glu Phe

130 135 140

Leu Asp Met Ile Thr Leu Gln Tyr Leu Ala Asp Leu Met Ser Trp Gly

145 150 155 160

Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Val His Arg Glu Leu Ala

165 170 175

Ser Gly Leu Ser Cys Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr

180 185 190

Ile Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Asn Ala Ala Gly Ala Pro His Cys

195 200 205

Phe Leu Ser Val Thr Lys Trp Gly His Ser Ala Ile Val Asn Thr Ser

210 215 220

Gly Asn Gly Asp Cys His Ile Ile Leu Arg Gly Gly Lys Glu Pro Asn

225 230 235 240

Tyr Ser Ala Lys His Val Ala Glu Val Lys Glu Gly Leu Asn Lys Ala

245 250 255

Gly Leu Pro Ala Gln Val Met Ile Asp Phe Ser His Ala Asn Ser Ser

260 265 270

Lys Gln Phe Lys Lys Gln Met Asp Val Cys Ala Asp Val Cys Gln Gln

275 280 285

Ile Ala Gly Gly Glu Lys Ala Ile Ile Gly Val Met Val Glu Ser His

290 295 300

Leu Val Glu Gly Asn Gln Ser Leu Glu Ser Gly Glu Pro Leu Ala Tyr

305 310 315 320

Gly Lys Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Asp Thr Asp Ala

325 330 335

Leu Leu Arg Gln Leu Ala Asn Ala Val Lys Ala Arg Arg Gly

340 345 350

<210> 5

<211> 2342

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 5

atccagagat ttctgaagcg gcaaaaggat gttccatgta catgacgcgc ggcttgcggt 60

aaattgttgg caaattttcc ggcgtagccc aaaacgcgct gtcgtcaagt cgttaagggc 120

gtgcccttca tcatccgatc tggagtcaaa atgtcctcac gtaaagagct tgccaatgct 180

attcgtgcgc tgagcatgga cgcagtacag aaagccaaat ccggtcaccc gggtgcccct 240

atgggtatgg ctgacattgc cgaagtcctg tggcgtgatt tcctgaaaca caacccgcag 300

aatccgtcct gggctgaccg tgaccgcttc gtgctgtcca acggccacgg ctccatgctg 360

atctacagcc tgctgcacct caccggttac gatctgccga tggaagaact gaaaaacttc 420

cgtcagctgc actctaaaac tccgggtcac ccggaagtgg gttacaccgc tggtgtggaa 480

accaccaccg gtccgctggg tcagggtatt gccaacgcag tcggtatggc gattgcagaa 540

aaaacgctgg cggcgcagtt taaccgtccg ggccacgaca ttgtcgacca ctacacctac 600

gccttcatgg gcgacggctg catgatggaa ggcatctccc acgaagtttg ctctctggcg 660

ggtacgctga agctgggtaa actgattgca ttctacgatg acaacggtat ttctatcgat 720

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cacgttattc gcgacatcga cggtcatgac gcggcatcta tcaaacgcgc agtagaagaa 840

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tatgctcagt gggatgcgaa agaagcaggc caggcgaaag aatccgcatg gaacgagaaa 1080

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aatccggcga aaatcgccag ccgtaaagcg tctcagaatg ctatcgaagc gttcggtccg 1260

ctgttgccgg aattcctcgg cggttctgct gacctggcgc cgtctaacct gaccctgtgg 1320

tctggttcta aagcaatcaa cgaagatgct gcgggtaact acatccacta cggtgttcgc 1380

gagttcggta tgaccgcgat tgctaacggt atctccctgc acggtggctt cctgccgtac 1440

acctccacct tcctgatgtt cgtggaatac gcacgtaacg ccgtacgtat ggctgcgctg 1500

atgaaacagc gtcaggtgat ggtttacacc cacgactcca tcggtctggg cgaagacggc 1560

ccgactcacc agccggttga gcaggtcgct tctctgcgcg taaccccgaa catgtctaca 1620

tggcgtccgt gtgaccaggt tgaatccgcg gtcgcgtgga aatacggtgt tgagcgtcag 1680

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gaactgattt tcatcgctac cggttcagaa gttgaactgg ctgttgctgc ctacgaaaaa 1860

ctgactgccg aaggcgtgaa agcgcgcgtg gtgtccatgc cgtctaccga cgcatttgac 1920

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actgttgata acgttgttgc gaaagcaaaa gaactgctgt aattagcatt tcgggtaaaa 2160

aggtcgcttc ggcgaccttt tttattacct tgatatgtcc gtttgcggac aagcaataga 2220

taaggcgtgt tgtagatcac aaatatttat atgcaataaa tatcaattat gtaatatgca 2280

tcacgatatg cgtattgaca tttgttgtta tatctataac tcaatgttat ataagaaatt 2340

aa 2342

<210> 6

<211> 663

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 6

Met Ser Ser Arg Lys Glu Leu Ala Asn Ala Ile Arg Ala Leu Ser Met

1 5 10 15

Asp Ala Val Gln Lys Ala Lys Ser Gly His Pro Gly Ala Pro Met Gly

20 25 30

Met Ala Asp Ile Ala Glu Val Leu Trp Arg Asp Phe Leu Lys His Asn

35 40 45

Pro Gln Asn Pro Ser Trp Ala Asp Arg Asp Arg Phe Val Leu Ser Asn

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Gly His Gly Ser Met Leu Ile Tyr Ser Leu Leu His Leu Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Leu Pro Met Glu Glu Leu Lys Asn Phe Arg Gln Leu His Ser Lys

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Thr Pro Gly His Pro Glu Val Gly Tyr Thr Ala Gly Val Glu Thr Thr

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Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ile Ala Asn Ala Val Gly Met Ala Ile

115 120 125

Ala Glu Lys Thr Leu Ala Ala Gln Phe Asn Arg Pro Gly His Asp Ile

130 135 140

Val Asp His Tyr Thr Tyr Ala Phe Met Gly Asp Gly Cys Met Met Glu

145 150 155 160

Gly Ile Ser His Glu Val Cys Ser Leu Ala Gly Thr Leu Lys Leu Gly

165 170 175

Lys Leu Ile Ala Phe Tyr Asp Asp Asn Gly Ile Ser Ile Asp Gly His

180 185 190

Val Glu Gly Trp Phe Thr Asp Asp Thr Ala Met Arg Phe Glu Ala Tyr

195 200 205

Gly Trp His Val Ile Arg Asp Ile Asp Gly His Asp Ala Ala Ser Ile

210 215 220

Lys Arg Ala Val Glu Glu Ala Arg Ala Val Thr Asp Lys Pro Ser Leu

225 230 235 240

Leu Met Cys Lys Thr Ile Ile Gly Phe Gly Ser Pro Asn Lys Ala Gly

245 250 255

Thr His Asp Ser His Gly Ala Pro Leu Gly Asp Ala Glu Ile Ala Leu

260 265 270

Thr Arg Glu Gln Leu Gly Trp Lys Tyr Ala Pro Phe Glu Ile Pro Ser

275 280 285

Glu Ile Tyr Ala Gln Trp Asp Ala Lys Glu Ala Gly Gln Ala Lys Glu

290 295 300

Ser Ala Trp Asn Glu Lys Phe Ala Ala Tyr Ala Lys Ala Tyr Pro Gln

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Glu Ala Ala Glu Phe Thr Arg Arg Met Lys Gly Glu Met Pro Ser Asp

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Phe Asp Ala Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Lys Leu Gln Ala Asn Pro

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Ala Lys Ile Ala Ser Arg Lys Ala Ser Gln Asn Ala Ile Glu Ala Phe

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Ser Asn Leu Thr Leu Trp Ser Gly Ser Lys Ala Ile Asn Glu Asp Ala

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Ala Gly Asn Tyr Ile His Tyr Gly Val Arg Glu Phe Gly Met Thr Ala

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Ile Ala Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Phe Leu Pro Tyr Thr Ser

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Thr Phe Leu Met Phe Val Glu Tyr Ala Arg Asn Ala Val Arg Met Ala

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Ser Leu Arg Val Thr Pro Asn Met Ser Thr Trp Arg Pro Cys Asp Gln

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Val Glu Ser Ala Val Ala Trp Lys Tyr Gly Val Glu Arg Gln Asp Gly

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Pro Thr Ala Leu Ile Leu Ser Arg Gln Asn Leu Ala Gln Gln Glu Arg

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Asp Cys Ala Gly Gln Pro Glu Leu Ile Phe Ile Ala Thr Gly Ser Glu

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Val Glu Leu Ala Val Ala Ala Tyr Glu Lys Leu Thr Ala Glu Gly Val

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Lys Ala Arg Val Val Ser Met Pro Ser Thr Asp Ala Phe Asp Lys Gln

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Asp Ala Ala Tyr Arg Glu Ser Val Leu Pro Lys Ala Val Thr Ala Arg

595 600 605

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

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atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

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catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatcgtatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct cggacacaaa 420

ctcgagtaca actataactc acacaatgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagcta acttcaaaat tcgccacaac attgaagatg gatccgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtcgacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt 660

cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaataa 717

<210> 8

<211> 162

<212> DNA

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caattccgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat 60

cacgaggccc tttcgtcttc acctcgagtc cctatcagtg atagagattg acctccctat 120

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<212> PRT

<213> 大肠杆菌

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Pro Ala Thr Leu Leu Leu Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ser Lys Asp Asp

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Leu Lys Ser Leu Leu Leu Val Asp Ser Ala Leu Arg Ile Thr Ala Leu

50 55 60

Gly Asp Thr Val Thr Ile Gln Ala Leu Ser Gly Asn Gly Glu Ala Leu

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Leu Ala Leu Leu Asp Asn Ala Leu Pro Ala Gly Val Glu Ser Glu Gln

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Ser Pro Asn Cys Arg Val Leu Arg Phe Pro Pro Val Ser Pro Leu Leu

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Asp Glu Asp Ala Arg Leu Cys Ser Leu Ser Val Phe Asp Ala Phe Arg

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Leu Leu Gln Asn Leu Leu Asn Val Pro Lys Glu Glu Arg Glu Ala Met

130 135 140

Phe Phe Gly Gly Leu Phe Ser Tyr Asp Leu Val Ala Gly Phe Glu Asp

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Leu Pro Gln Leu Ser Ala Glu Asn Asn Cys Pro Asp Phe Cys Phe Tyr

165 170 175

Leu Ala Glu Thr Leu Met Val Ile Asp His Gln Lys Lys Ser Thr Arg

180 185 190

Ile Gln Ala Ser Leu Phe Ala Pro Asn Glu Glu Glu Lys Gln Arg Leu

195 200 205

Thr Ala Arg Leu Asn Glu Leu Arg Gln Gln Leu Thr Glu Ala Ala Pro

210 215 220

Pro Leu Pro Val Val Ser Val Pro His Met Arg Cys Glu Cys Asn Gln

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Ser Asp Glu Glu Phe Gly Gly Val Val Arg Leu Leu Gln Lys Ala Ile

245 250 255

Arg Ala Gly Glu Ile Phe Gln Val Val Pro Ser Arg Arg Phe Ser Leu

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Pro Cys Pro Ser Pro Leu Ala Ala Tyr Tyr Val Leu Lys Lys Ser Asn

275 280 285

Pro Ser Pro Tyr Thr Phe Phe Met Gln Asp Asn Asp Phe Thr Leu Phe

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Gly Ala Ser Pro Glu Ser Ser Leu Lys Tyr Asp Ala Thr Ser Arg Gln

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Ile Glu Ile Tyr Pro Ile Ala Gly Thr Arg Pro Arg Gly Arg Arg Ala

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Asp Gly Ser Leu Asp Arg Asp Leu Asp Ser Arg Ile Glu Leu Glu Met

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Ala Arg Asn Asp Leu Ala Arg Ile Cys Thr Pro Gly Ser Arg Tyr Val

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Ala Asp Leu Thr Lys Val Asp Arg Tyr Ser Tyr Val Met His Leu Val

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Ser Arg Val Val Gly Glu Leu Arg His Asp Leu Asp Ala Leu His Ala

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Gln Ala Gly Ala Gly Val Val Leu Asp Ser Val Pro Gln Ser Glu Ala

485 490 495

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500 505 510

Ala His His Ala Gln Glu Thr Phe

515 520

<210> 10

<211> 531

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 10

Met Ala Asp Ile Leu Leu Leu Asp Asn Ile Asp Ser Phe Thr Tyr Asn

1 5 10 15

Leu Ala Asp Gln Leu Arg Ser Asn Gly His Asn Val Val Ile Tyr Arg

20 25 30

Asn His Ile Pro Ala Gln Thr Leu Ile Glu Arg Leu Ala Thr Met Ser

35 40 45

Asn Pro Val Leu Met Leu Ser Pro Gly Pro Gly Val Pro Ser Glu Ala

50 55 60

Gly Cys Met Pro Glu Leu Leu Thr Arg Leu Arg Gly Lys Leu Pro Ile

65 70 75 80

Ile Gly Ile Cys Leu Gly His Gln Ala Ile Val Glu Ala Tyr Gly Gly

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Tyr Val Gly Gln Ala Gly Glu Ile Leu His Gly Lys Ala Ser Ser Ile

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Glu His Asp Gly Gln Ala Met Phe Ala Gly Leu Thr Asn Pro Leu Pro

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Thr Ile Asn Ala His Phe Asn Gly Met Val Met Ala Val Arg His Asp

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Ala Asp Arg Val Cys Gly Phe Gln Phe His Pro Glu Ser Ile Leu Thr

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Leu Leu Ala Ala Phe Gly Ile Asn Leu Asp Met Asn Ala Asp Lys Ser

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485 490 495

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515 520 525

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530

<210> 11

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<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 11

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1 5 10 15

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275 280 285

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

His Val Ala Ile Trp Lys Ala Leu Ser Val Gly Glu Thr Leu Pro Ala

355 360 365

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370 375 380

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Gly Asn Val Leu Leu Ala Gly Gly Leu Gly Ala Asp Asn Cys Val Glu

405 410 415

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<210> 12

<211> 397

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 12

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130 135 140

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385 390 395

<210> 13

<211> 268

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 13

Met Glu Arg Tyr Glu Ser Leu Phe Ala Gln Leu Lys Glu Arg Lys Glu

1 5 10 15

Gly Ala Phe Val Pro Phe Val Thr Leu Gly Asp Pro Gly Ile Glu Gln

20 25 30

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Leu Asn His Leu Val Ala Lys Leu Lys Glu Tyr Asn Ala Ala Pro Pro

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Ile Glu Gln His Ile Asn Glu Pro Glu Lys Met Leu Ala Ala Leu Lys

245 250 255

Val Phe Val Gln Pro Met Lys Ala Ala Thr Arg Ser

260 265

Claims (10)

1.DNA分子甲，为如下（a1）、（a2）或（a3）：

（a1）序列表的序列2第115-186位核苷酸所示的DNA分子；

（a2）在（a1）的末端连接标签序列得到的DNA分子；

（a3）在（a1）的末端连接连接序列得到的DNA分子。

2.权利要求1所述DNA分子甲在促进下游目的基因表达中的应用。

3.DNA分子乙，自上游至下游依次包括：权利要求1所述DNA分子甲和目的基因。

4.DNA分子丙，自上游至下游依次包括：启动子、权利要求1所述DNA分子甲、目的基因和终止子。

5.DNA分子丁，是将色氨酸操纵子基因中的色氨酸衰减子第1至114位核苷酸去除后得到的DNA分子；所述色氨酸操纵子基因如序列表的序列2第21至6687位核苷酸所示。

6.DNA分子戊，自上游至下游依次包括如下元件：启动子和权利要求5所述DNA分子丁。

7.含有权利要求5或6所述DNA分子的重组载体或重组菌。

8.权利要求7所述重组菌在制备色氨酸中的应用。

9.一种提高微生物生产色氨酸的能力的方法，包括如下步骤：删除微生物的色氨酸操纵子基因中从色氨酸衰减子第1位开始计数的第1至114位核苷酸；所述色氨酸操纵子基因如序列表的序列2第21至6687位核苷酸所示。

10.一种解除微生物中色氨酸操纵子反馈阻遏的方法，包括如下步骤：删除微生物的色氨酸操纵子基因中从色氨酸衰减子第1位开始计数的第1至114位核苷酸；所述色氨酸操纵子基因如序列表的序列2第21至6687位核苷酸所示。