CN103492553A - 用于生产尸胺的方法和重组微生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含提高尸胺或N-乙酰尸胺生产的失调的形式的DNA分子的重组微生物的用途，以及用于产生所述微生物的重组DNA分子和多肽，所述微生物包含细胞内赖氨酸脱羧酶活性和失调的尸胺输出活性，或包含降低的尸胺输出活性和增强的N-乙酰尸胺形成活性。本发明也涉及使用重组微生物生产尸胺或N-乙酰尸胺的方法。

Description

用于生产尸胺的方法和重组微生物

发明领域

本发明涉及包含提高尸胺或N-乙酰尸胺生产的失调的(deregulated)形式的DNA分子的重组微生物的用途，以及用于产生所述微生物的重组DNA分子和多肽，所述微生物包含细胞内赖氨酸脱羧酶活性和失调的尸胺输出活性，或包含降低的尸胺输出活性和增强的N-乙酰尸胺形成活性。本发明也涉及使用重组微生物生产尸胺或N-乙酰尸胺的方法。

现有技术

JP 2002223770公开了通过将赖氨酸脱羧基因和/或赖氨酸-尸胺逆向转运体基因引入产赖氨酸的微生物，从而生产尸胺的方法。

JP 2004222569公开了通过培养具有L-赖氨酸脱羧酶活性和高丝氨酸营养缺陷型的重组棒杆菌，生产尸胺的方法。

WO 2007113127公开了通过培养具有失调的L-赖氨酸脱羧酶活性的重组棒杆菌，检测尸胺乙酰基转移酶及其提高尸胺生产的缺失，生产尸胺的方法。

US 7,435,584公开了通过培养具有lysE(赖氨酸输出载体)基因高表达的棒杆菌的增强的L-赖氨酸生产的方法。

WO 2008092720公开了通过发酵表达细胞内表达的脱羧酶的高产赖氨酸微生物，生产尸胺的方法，其中这样的微生物可能具有降低的或消除的赖氨酸/尸胺逆向转运体的表达。

发明概述

在一个方面，本发明提供了具有失调的尸胺输出活性的微生物。优选地所述失调的尸胺输出体活性至少部分是由于包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的氨基酸序列的一种或多种尸胺输出体多肽的失调。在本发明的一个实施方案中，微生物具有增强的尸胺输出体活性，而在本发明的另一个实施方案中，微生物具有降低的尸胺输出体活性。优选地，微生物具有增强的赖氨酸脱羧酶活性，甚至更优选地，所述增强的赖氨酸脱羧酶活性是由于包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少80％同一性的氨基酸序列的一种或多种赖氨酸脱羧酶多肽的表达。在本发明的另外的实施方案中，上述微生物还具有选自下述基因的至少一种失调的基因：天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醛脱氢酶(aspartatesemialdehydedehydrogenase)，二氢吡啶二羧酸合酶，二氢吡啶二羧酸还原酶，四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(tetrahydrodipicolinate succinylase)，琥珀酰-氨基-酮基庚二酸转氨酶(succinyl-amino-ketopimelate transaminase)，琥珀酰-二氨基-庚二酸脱琥珀酰酶(succinyl-diamino-pimelate desuccinylase)，二氨基庚二酸表异构酶，二氨基庚二酸脱氢酶，精氨酰-tRNA合成酶，二氨基庚二酸脱羧酶，丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，转酮醇酶，转醛醇酶，6-磷酸葡糖酸内酯酶，果糖1，6-二磷酸酶，高丝氨酸脱氢酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phophoenolpyruvatecarboxykinase)，琥珀酰辅酶A合成酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶，二胺乙酰基转移酶。优选地，上述微生物具有提高的赖氨酸输入活性。在甚至更优选的实施方案中，微生物具有增强的赖氨酸输入活性，这至少部分是由于降低的赖氨酸输出体活性或增强的赖氨酸通透酶活性或增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性或其任意组合。增强的赖氨酸输入活性优选地是由于包含与SEQ ID NO：5具有至少80％同一性的氨基酸序列的至少一种赖氨酸输出体多肽的降低的活性。在本发明的另一个实施方案中，上述微生物具有增强的赖氨酸输入活性，这至少部分是由于增强的赖氨酸通透酶活性或至少部分是由于增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性或二者的组合。

本发明还包含如上所述的微生物，其还具有失调的N-乙酰尸胺形成活性。在本发明的一个实施方案中，所述具有失调的N-乙酰尸胺形成活性的微生物没有，或具有降低的N-乙酰尸胺形成活性。在本发明的另一个实施方案中，所述具有失调的N-乙酰尸胺形成活性的微生物具有增强的N-乙酰尸胺形成活性和降低的尸胺输出体活性。优选地，上述微生物的失调的N-乙酰尸胺形成活性至少部分是由于包含与SEQ ID NO：13具有至少80％同一性的氨基酸序列的N-乙酰尸胺形成多肽的失调。优选地，任一种上述微生物属于真细菌进化枝，甚至更优选地，属于棒杆菌属(Corynebacterium)，最优选地上述微生物属于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)种。

本发明还包含使用任一种上述微生物生产尸胺的方法，和使用任一种上述微生物生产N-乙酰尸胺的方法。本发明还包含任一种上述微生物用于生产尸胺或N-乙酰尸胺的用途。

本发明的其他实施方案是通过发酵任一种上述微生物生产的尸胺的用途和使用通过发酵任一种上述微生物生产的尸胺生产的多胺。

附图简述

图1：在产生戊二胺的谷氨酸棒杆菌DAP-3c中比赖氨酸脱羧酶活性对存在的戊二胺的依赖性。数据代表2次重复实验的平均值。

图2：携带SEQ ID NO：1的尸胺输出体多肽(戊二胺输出体)缺失的谷氨酸棒杆菌_δdapE，和过表达在sod启动子下的编码SEQ ID NO：1的多肽的SEQ ID NO：2的尸胺输出体基因的PsoddapE，及它们的亲本菌株DAP-3c的生长(A)、生物量产量(B)、戊二胺(C)和N-乙酰戊二胺产量的比较。数据代表在以10g L-1葡萄糖为唯一碳源的基本培养基中培养的3次生物学重复的指数生长期的数值。

发明详述

在以下描述中，大量使用了一些术语。此处提供定义以便于理解本发明。

术语尸胺表示1，5-戊二胺(1，5-diaminopentane)(CAS号：462-94-2)。

术语N-乙酰尸胺表示N-乙酰戊二胺(CAS号：102029-76-5)。

本发明的方法以重组微生物为特征，所述微生物优选地包括如本文描述的载体或基因(例如，野生型和/或突变的基因)，和/或以导致尸胺和/或N-乙酰尸胺产生的方式培养。

术语“重组”微生物包括与其来源的天然存在的微生物相比，已被遗传改变、修饰或改造(例如，遗传改造)，从而使其展示改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)的微生物(例如，细菌、酵母细胞、真菌细胞等)。

启动子。引导结构基因转录产生mRNA的DNA序列。一般启动子位于基因的5′区，靠近结构基因的起始密码子。如果启动子是诱导型启动子，那么转录率响应诱导剂而增加。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录率不受诱导剂调节。

增强子。一种启动子元件。增强子可增加特定基因转录为mRNA的效率，这与增强子相对转录起始位点的距离或方向无关。

克隆载体。一种DNA分子，如质粒、粘粒、噬菌粒或噬菌体，其具有在宿主细胞中自主复制的能力且其被用于转化细胞以操纵基因。克隆载体一般包含一个或少数限制性内切酶识别位点(在这些位点可以可检测的方式插入外源DNA序列而不丢失载体的基本生物学功能)，以及适用于鉴定和选择用克隆载体转化的细胞的标记物基因。标记物基因一般包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。

表达载体。包含编码外源蛋白质的克隆的结构基因的DNA分子，其提供外源蛋白质在重组宿主中的表达。一般，将克隆基因的表达置于特定调节序列(如启动子和增强子序列)的控制之下(即，与其有效连接)。启动子序列可为组成型或诱导型的。

重组宿主。重组宿主可为包含克隆载体或表达载体的任意原核或真核细胞。此术语也旨在包括已被遗传改造从而在宿主细胞的染色体或基因组中包含克隆的基因的原核或真核细胞。有关合适的宿主的实例，见Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)[″Sambrook″]。

术语“表达”指基因产物(例如，在本申请中定义和描述的途径或反应的基因的生物合成酶)在一定水平上的表达，在此水平上产生的所编码的此蛋白质的酶活性，或此蛋白质涉及的途径或反应允许代谢流通过表达此基因/途径的生物中的此途径或反应。可通过遗传改变用作起始生物的微生物实现表达。在一些实施方案中，可遗传改变(例如，遗传改造)微生物，从而在相对起始微生物或未被改变的可比微生物的生产的基因产物水平的提高的水平上表达基因产物。遗传改变包括，但不限于，改变或修饰与特定基因的表达相关的调节序列或位点(例如，通过添加强启动子、诱导型启动子或多个启动子，或通过去除调节序列使得表达为组成型)，修饰特定基因的染色体位置，改变特定基因的相邻核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子，增加特定基因的拷贝数，修饰参与特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的蛋白质(例如，调节蛋白，抑制物，增强物，转录激活物等)，或使用本领域的例行操作使特定基因的表达失调的任意其他常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子，例如，以阻断阻抑蛋白的表达)。

在一些实施方案中，可改变微生物的生理或环境，以在相对起始微生物的基因产物表达水平增加或降低的水平上表达基因产物。例如，可用已知或疑似提高特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的活性剂处理微生物，或在所述活性剂的存在下培养微生物，从而增强或提高转录和/或翻译。可选地，可在选择的提高特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的温度下培养微生物，从而增强或提高转录和/或翻译。

术语“失调”指改变或修饰微生物中的至少一个基因，其中所述改变或修饰导致相对没有改变和修饰的尸胺或N-乙酰尸胺生产，在微生物中的尸胺或N-乙酰尸胺生产的效率增加。在一些实施方案中，改变或修饰的基因编码在生物合成途径中的酶或转运蛋白，使得在微生物中的生物合成酶的水平或活性被改变或修饰，或转运特异性或效率被改变或修饰。在一些实施方案中，改变和修饰编码在生物合成途径中的酶的至少一个基因，使得所述酶的水平或活性相对未改变或野生型基因存在时的水平增强或增加。失调也包括改变一个或多个基因的编码区以得到，例如，具有反馈抗酶或具有更高或更低比活的酶。又例如，失调还涵盖编码转录因子(例如激活物、阻抑物)的基因的遗传改变，所述转录因子调节编码酶或转运蛋白的基因的表达。

术语“过表达”指在比起始微生物的遗传改变前存在的水平更高水平上的基因产物的表达，特别是增强基因产物(例如，赖氨酸生物合成酶，或硫酸盐还原途径酶，或半胱氨酸生物合成酶，或在本申请中定义和描述的基因或途径或反应)的表达。在一些实施方案中，可将微生物遗传改变(例如，遗传改造)从而在相对起始微生物的生产的基因产物水平提高的水平上表达基因产物。遗传改变包括，但不限于，改变或修饰与特定基因的表达相关的调节序列或位点(例如，通过添加强启动子、诱导型启动子或多个启动子，或通过去除调节序列使得表达为组成型)，修饰特定基因的染色体位置，改变特定基因的相邻核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子，增加特定基因的拷贝数，修饰参与特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的蛋白质(例如，调节蛋白，抑制物，增强物，转录激活物等)，或使用本领域的例行操作失调特定基因的表达的任意其他常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子，例如，以阻断阻抑蛋白的表达)。过表达基因产物的另一种方式是增强基因产物的稳定性，从而增加其寿命。在Eikmanns等人(Gene.(1991)102，93-8)中可找到在生物(如谷氨酸棒杆菌)中过表达基因的实例。

术语“失调的”包括基因产物(例如，赖氨酸脱羧酶)的表达水平低于或高于操纵微生物前或未经操纵的可比微生物中的表达。在一个实施方案中，微生物可被遗传操纵(例如，遗传改造)为以低于或高于操纵微生物前或未经操纵的可比微生物中的表达水平表达基因产物。遗传操纵可包括，但不限于，改变或修饰与特定基因的表达相关的调节序列或位点(例如，通过去除强启动子、诱导型启动子或多个启动子)，修饰特定基因的染色体位置，改变特定基因的相邻核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子，减少特定基因的拷贝数，修饰参与特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的蛋白质(例如，调节蛋白，抑制物，增强物，转录激活物等)，或本领域例行操作的失调特定基因的表达的任意其他常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子，或敲除或阻断靶蛋白表达的其他方法)。

术语“失调的基因活性”，例如失调的赖氨酸脱羧酶，也表示将基因活性，(例如赖氨酸脱羧酶活性)引入其中以前未观察到相应基因活性(例如赖氨酸脱羧酶活性)的微生物中，例如通过将异源基因(例如单个或多个拷贝的赖氨酸脱羧酶基因)引入微生物，优选地通过遗传改造的方式。

短语“失调的途径或反应”指生物合成途径或反应，其中编码在生物合成途径或反应中的酶的至少一个基因被改变或修饰，使得至少一种生物合成酶的水平或活性被改变或修饰。词组“失调的途径”包括生物合成途径，其中多于一种基因已被改变或修饰，因此改变了相应的基因产物/酶的水平和/或活性。有时，在微生物中“失调”途径(例如，同时失调在给定的生物合成途径中的多于一种基因)的能力来自微生物的特定现象中，其中多于一种酶(例如，2种或3种生物合成酶)由彼此相邻出现在被称为“操纵子”的遗传物质的连续片段上的基因编码。在其他情况下，为了失调途径，必须在一系列相继的改造步骤中失调若干基因。

为了表达根据本发明的失调的基因，必须将编码酶的DNA序列与表达载体中的控制转录表达的调节序列有效连接，然后引入原核或真核宿主细胞中。除了转录调节序列，如启动子和增强子以外，表达载体可包括翻译调节序列和适于选择携带表达载体的细胞的标记物基因。

用于在原核宿主中表达的合适的启动子可为可抑制型、组成型或诱导型。合适的启动子是本领域技术人员熟知的并包括能够识别T4，T3，T5，Sp6和T7聚合酶的启动子，λ噬菌体的P_R和P_L启动子，大肠杆菌的trp，recA，热休克，lacUV5，tac，lpp-lac pr，phoA，gal，trc和lacZ启动子，枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)的α-淀粉酶和σ28-特异性启动子，芽孢杆菌噬菌体的启动子，链霉菌(Streptomyces)启动子，λ噬菌体的int启动子，pBR322的β-内酰胺酶基因的bla启动子，和氯霉素乙酰基转移酶基因的CAT启动子，以及棒杆菌的PGRO，PSOD，PEFTU，PEFTS和这些启动子的组合，如在WO2005059144，WO2007011939，WO2007012078，WO2005059093，WO2008049782，WO2006069711，WO2007020295中描述的。Glick，J.Ind.Microbiol.1：277(1987)；Watson等人，MOLECULARBIOLOGY OF THE GENE，第4版，Benjamin Cummins(1987)；Ausubel等人，见上，和Sambrook等人，见上，综述了原核启动子。

用于表达大肠杆菌赖氨酸脱羧酶的优选启动子是在WO2005059144，WO2007011939，WO2007012078，WO2005059093，WO2008049782，WO2006069711，WO2007020295中描述的谷氨酸棒杆菌的PsodA，PGRO和PEFTU启动子。

在原核宿主中表达蛋白质的方法是本领域技术人员熟知的。见，例如，Williams等人，″Expression of foreign proteins in E.coli using plasmidvectors and purification of specific polyclonal antibodies，″在DNACLONING 2：EXPRESSION SYSTEMS，第2版，Glover等人(编)，第15-58页中(Oxford University Press 1995)。又见，Ward等人，″GeneticManipulation and Expression of Antibodies，″在MONOCLONALANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS，第137-185页中(Wiley-Liss，Inc.1995)；和Georgiou，″Expression of proteins in Bacteria，″在PROTEIN ENGINEERING：PRINCIPLES AND PRACTICE，Cleland等人(编)，第101-127页中(John Wiley&Sons，Inc.1996)。提高和降低基因表达和蛋白质产生的其他方法可在WO2008049782中找到。

可使用多种技术将表达载体引入细菌宿主细胞，包括氯化钙转化、电穿孔，等等。见，例如，Ausubel等人(编)，SHORT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，第3版，第1-1至1-24页(John Wiley&Sons，Inc.1995)。

如本文使用的，基本纯的蛋白质表示期望的纯化的蛋白质基本不含污染的细胞成分，这可通过在聚丙烯酰胺十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)后的单一条带证明。术语″基本纯的″还旨在描述在本领域技术人员使用的一种或多种纯度或同质性特征上同质的分子。例如，基本纯的赖氨酸脱羧酶将显示在标准实验偏差内的如下参数的恒定和可重复的特征：分子量，色谱迁移，氨基酸组成，氨基酸序列，封闭的或未封闭的N-端，HPLC洗脱谱，生物学活性，和其他此类参数。然而，此术语不旨在排除赖氨酸脱羧酶和其他化合物的人工或合成的混合物。此外，此术语不旨在排除从重组宿主分离的赖氨酸脱羧酶融合蛋白。

在第一个方面，本发明提供了微生物，其具有细胞内赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性。

微生物可为任意原核或真核微生物，特别是细菌，古细菌，酵母和真菌。优选的微生物选自棒杆菌属，特别关注谷氨酸棒杆菌，埃希氏菌属，特别关注大肠杆菌，芽孢杆菌属，特别是枯草芽孢杆菌，和链霉菌属。

如上所述，本发明的优选实施方案涉及选自棒杆菌，如棒杆菌属细菌的宿主细胞的用途。特别优选谷氨酸棒杆菌，醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)，嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)，美棒杆菌(Corynebacterium callunae)，产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，热产氨棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)，栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)和Corynebacterium effiziens种。本发明的其他优选实施方案涉及短杆菌，特别是黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)和Brevibacterium divarecatum种的用途。

在本发明的其他优选实施方案中，宿主细胞可选自谷氨酸棒杆菌ATCC13032，醋谷棒杆菌ATCC15806，嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870，热产氨棒杆菌FERMBP-1539，栖糖蜜棒杆菌ATCC17965，Corynebacterium effiziens DSM 44547，Corynebacterium effiziens DSM44549，黄色短杆菌ATCC14067，乳糖发酵短杆菌ATCC13869，Brevibacterium divarecatum ATCC 14020，谷氨酸棒杆菌KFCC10065和谷氨酸棒杆菌ATCC21608，以及来源于其的菌株，通过例如经典诱变和选择或通过定向诱变。

谷氨酸棒杆菌的其他特别优选的菌株可选自ATCC13058，ATCC13059，ATCC13060，ATCC21492，ATCC21513，ATCC21526，ATCC21543，ATCC13287，ATCC21851，ATCC21253，ATCC21514，ATCC21516，ATCC21299，ATCC21300，ATCC39684，ATCC21488，ATCC21649，ATCC21650，ATCC19223，ATCC13869，ATCC21157，ATCC21158，ATCC21159，ATCC21355，ATCC31808，ATCC21674，ATCC21562，ATCC21563，ATCC21564，ATCC21565，ATCC21566，ATCC21567，ATCC21568，ATCC21569，ATCC21570，ATCC21571，ATCC21572，ATCC21573，ATCC21579，ATCC19049，ATCC19050，ATCC19051，ATCC19052，ATCC19053，ATCC19054，ATCC19055，ATCC19056，ATCC19057，ATCC19058，ATCC19059，ATCC19060，ATCC19185，ATCC13286，ATCC21515，ATCC21527，ATCC21544，ATCC21492，NRRL B8183，NRRL W8182，B12NRRLB12416，NRRLB12417，NRRLB12418和NRRLB11476。

缩写KFCC代表韩国联邦菌种保藏中心(Korean Federation ofCulture Collection)，ATCC代表美国模式菌株培养物保藏中心(American-Type Strain Culture Collection)和缩写DSM代表德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)。缩写NRRL代表ARS菌种保藏中心北区研究实验室(ARS cultures collection NorthernRegional Research Laboratory，Peorea，IL，USA)。

在某些实施方案中，本发明的微生物是“Campbell in”或“Campbellout”微生物(或细胞或转化体)。如本文使用的，词组“Campbell in”转化体应表示原始宿主细胞的转化体，其中整个环状双链DNA分子(例如质粒)已通过单个同源重组事件(cross in事件))整合进细胞的染色体，所述同源重组事件有效导致线性化形式的环状DNA分子插入与环状DNA分子的第一DNA序列同源的染色体的第一DNA序列中。词组“Campbelledin”指已整合进“Campbell in”转化体的染色体中的线性化DNA序列。“Campbeu in”转化体包含第一同源DNA序列的副本，其包含并包围同源重组交叉点。

“Campbell out”指来源于“Campbell in”转化体的细胞，其中在“Campbelled in”DNA的线性化的插入的DNA上包含的第二DNA序列与和线性化的插入片段的第二DNA序列同源的染色体来源的第二DNA序列之间发生第二次同源重组事件(cross out事件)，第二次重组事件导致整合的DNA序列的一部分缺失(丢弃(jettisoning))，但重要的是也导致整合的DNA序列的一部分(这可短至单个碱基)保留在染色体中，使得相比原始宿主细胞，“Campbell out”细胞在染色体中含有一个或多个有意的改变(例如，单碱基替换，多碱基替换，插入异源基因或DNA序列，插入同源基因或修饰的同源基因的额外拷贝或多个拷贝，或插入包含多于一种上面列出的这些上述实例的DNA序列)。

“Campbell out”细胞或菌株通常，但不必须，通过针对“Campbelled in”DNA序列的一部分(期望被丢弃的部分)中包含的基因，例如枯草芽孢杆菌sacB基因(当在存在约5％-10％蔗糖时生长的细胞中表达时，其是致死的)的反选择得到。不管使用或不使用反选择，可通过使用任意可筛选的表型，例如，但不限于，菌落形态、菌落颜色、存在或缺乏抗生素抗性，存在或缺乏给定的DNA序列(通过聚合酶链式反应)，存在或缺乏营养缺陷型，存在或缺乏酶，菌落核酸杂交，等等筛选期望的细胞得到或鉴定期望的“Campbell out”细胞，。

导致“Campbell in”或“Campbell out”的同源重组事件可在同源DNA序列内的一定范围的DNA碱基上发生，并且因为同源序列将在此范围的至少部分上彼此相同，通常不可能精确地指定交叉事件发生的位置。换句话说，不可能精确地指定哪些序列来源于插入的DNA，和哪些序列来源于染色体DNA。此外，第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常被部分非同源区隔开，并且此非同源区保持存在于“Campbell out”细胞的染色体中。

为了实用性，在谷氨酸棒杆菌中，一般的第一和第二同源DNA序列为至少约200碱基对的长度，并可多达数千碱基对的长度，然而，可以使操作对更短或更长的序列起作用。第一和第二同源序列的优选长度是约500至2000碱基，并通过将第一和第二同源序列安排成大约相同的长度，优选地具有低于200碱基对的差异，和最优选地使二者中的较短序列为较长序列的碱基对长度的至少70％，帮助从“Campbell in”得到“Campbellout”。

赖氨酸脱羧酶活性指L-赖氨酸脱羧为尸胺，这是由赖氨酸脱羧酶催化的。此酶被归类为E.C.4.1.1.18。例如，从具有赖氨酸脱羧酶活性的大肠杆菌中分离的酶是cadA基因产物(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes，条目b4131，SEQ ID NO：4)和ldcC基因产物(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，条目JW0181，SEQ ID NO：3)。

测量和比较酶促活性的方法是本领域已知的，并在例如“Handbook ofCorynebacetrium glutamicum 2005 Eggeling，Borth编CRC Press BocaRaton USA和其中的参考)或Methods in Enzymology卷17，部分1第3-1098页(1970)，卷17，部分2，第3-961(1971)页，卷41，第3-564(1975)页，卷42第3-537(1975)页，卷63，第3-547(1979)页，卷64，第3-418(1980)页，卷89，第3-656(1982)页，卷90第3-602(1982)页，卷142，第3-732(1987)页，卷143第3-582页(1987)和其中的参考中描述。用于比较谷氨酸棒杆菌菌株的标准菌株是ATCC13032(Handbook of Corynebacetriumglutamicum 2005 Eggeling，Borth编。CRC Press Boca Raton USA)。

大肠杆菌ldcC的氨基酸序列公开在登记号SEQ ID NO：3中，大肠杆菌cadA的氨基酸序列公开在SEQ ID NO：4中。

编码大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因的DNA分子可通过使用具有从SEQID NO：3或4的氨基酸序列逆翻译的核苷酸序列的多核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库得到。

可选地，大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因或本文描述的任意基因可通过使用互相引发(priming)的长寡核苷酸合成DNA分子得到。见，例如，Ausubel等人，(编)，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第8.2.8至8.2.13页(1990)[″Ausubel″]。又见Wosnick等人，Gene 60：115(1987)；和Ausubel等人(编)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，第3版，第8-8至8-9页(John Wiley&Sons，Inc.1995)。使用聚合酶链式反应建立的技术提供了合成至少2千碱基长的DNA分子的能力。Adang等人，Plant Molec.Biol.21：1131(1993)；Bambot等人，PCRMethods and Applications 2：266(1993)；Dillon等人，″Use of thePolymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of SyntheticGenes，″in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第15卷：PCRPROTOCOLS：CURRENT METHODS AND APPLICATIONS，White(编)，第263-268页，(Humana Press，Inc.1993)；Holowachuk等人，PCRMethods Appl.4：299(1995)。

可产生相比亲本酶包含保守氨基酸改变的多肽(例如尸胺输出体多肽)的变体或本文描述的任意基因的变体。即，可得到包含例如SEQ ID NO：1的一个或多个氨基酸取代的变体，其中烷基氨基酸被多肽序列中的烷基氨基酸取代，芳基氨基酸被例如尸胺输出体多肽氨基酸序列中的芳基氨基酸取代，含硫氨基酸被例如尸胺输出体多肽氨基酸序列中的含硫基氨基酸取代，含羟基氨基酸被例如尸胺输出体多肽氨基酸序列中的含羟基氨基酸取代，酸性氨基酸被例如尸胺输出体多肽氨基酸序列中的酸性氨基酸取代，碱性氨基酸被例如尸胺输出体多肽氨基酸序列中的碱性氨基酸取代。

在常见氨基酸中，例如，″保守的氨基酸取代″表示在以下每一组内的取代：(1)甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸，(3)半胱氨酸和甲硫氨酸，(4)丝氨酸和苏氨酸，(5)天冬氨酸和谷氨酸，(6)谷氨酰胺和天冬酰胺，和(7)赖氨酸，精氨酸和组氨酸。

可通过用核苷酸取代在SEQ ID NO：1中列出的核苷酸引入例如尸胺输出体多肽中的保守的氨基酸变化。这样的″保守的氨基酸″变体可通过，例如，寡核苷酸定向的诱变，接头扫描诱变，使用聚合酶链式反应的诱变等等得到。Ausubel等人，见上，第8.0.3-8.5.9页；Ausubel等人(编)，SHORTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3版，第8-10至8-22页(John Wiley&Sons，Inc.1995)。一般又见，McPherson(编)，DIRECTEDMUTAGENESIS：A PRACTICAL APPROACH，IRL Press(1991)。可使用用于细胞外尸胺的HPLC测定来确定尸胺输出体多肽变体输出尸胺的能力。

根据本发明的优选的尸胺输出体多肽是谷氨酸棒杆菌(dapE)的尸胺输出体多肽及其等同基因，所述等同基因与相应的“原始”基因产物具有高达80％，优选地90％和最优选地95％和98％的序列同一性(基于氨基酸序列)，且仍然具有尸胺输出体多肽的生物学活性。可通过本领域已知的方法通过引入核苷酸替换，缺失或插入，或通过克隆其他生物的同源基因容易地构建这些等同基因，所述同源基因可通过本领域熟知的方法，例如数据库检索、文库筛选、互补测定或酶促活性检测鉴定和克隆。优选地，优化克隆的同源基因的核苷酸序列，用于在预期的宿主微生物中的表达，例如通过适应谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌的密码子使用。

可找到与SEQ ID NO：1的序列同源的序列。下面提供实例：来自谷氨酸棒杆菌菌株R TX＝40322的A4QH10_CORGB蛋白SEQ ID NO 25，来自Corynebacterium efficiens的Q8FMK8_COREF蛋白SEQ ID NO 26，来自马氏棒杆菌(Corynebacterium matruchotii)ATCC 33806的ZP_03711358蛋白SEQ ID NO：27，来自无枝菌酸棒杆菌(Corynebacterium amycolatum)SK46的ZP_03392764蛋白SEQ ID NO：28，来自溶血隐秘杆菌(Arcanobacterium haemolyticum)DSM 20595的YP_003696648蛋白SEQ ID NO 29，来自粘金色棒杆菌(Corynebacteriumaurimucosum)ATCC 700975的ZP_06042915蛋白SEQ ID NO 30，来自纹带棒杆菌(Corynebacterium striatum)ATCC 6940的ZP_03936401蛋白SEQ ID NO 31，来自产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)DSM 20306的ZP_06837496蛋白SEQ ID NO 32。

因此，在优选的实施方案中，细胞内或尸胺输出体活性至少部分，优选多于30％或多于50％或多于60％或多于70％或多于75％，80％，85％，90％，95％98％，99％是由于包含与SEQ ID NO：1具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列且具有尸胺输出体活性的一种或多种多肽。

本发明的其他优选实施方案使用谷氨酸棒杆菌的尸胺输出体多肽(SEQ ID NO：1)，其可通过应用计划表达尸胺输出体多肽的微生物(例如大肠杆菌)的密码子使用重译为DNA，或优化密码子使用用于在谷氨酸棒杆菌中表达。

本发明的优选微生物包含细胞内赖氨酸脱羧酶活性，优选包含高的细胞内脱羧酶活性。细胞内赖氨酸脱羧酶活性可通过用一种或多种待由微生物表达的赖氨酸脱羧酶基因转化微生物而产生或增强。另外或可选地，赖氨酸脱羧酶基因可被突变，以增强编码的赖氨酸脱羧酶的表达或酶促活性。

在另一个实施方案中，细胞内赖氨酸脱羧酶活性与细胞外赖氨酸脱羧酶活性组合。可以转化缺乏细胞内或细胞外赖氨酸脱羧酶活性的微生物，以在细胞内或细胞外表达赖氨酸脱羧酶。可通过突变赖氨酸脱羧酶包含用于细胞外表达的信号序列(例如分泌信号或用于分子锚的信号，所述信号在待转化的微生物中有功能)来实现细胞外表达。细胞外表达的实例可在Choi和Lee Appl Microbiol Biotechnol 2004 64：625-635，Current Opinionin Biotechnology 2005，16：538-545，Trends in Biotechnology 2007 16 73-79中找到。

如果细胞内或细胞外赖氨酸脱羧酶活性是由于多于一种的编码具有赖氨酸脱羧酶活性的不同多肽的赖氨酸脱羧酶基因的表达，细胞内或细胞外赖氨酸脱羧酶总活性将是这些不同赖氨酸脱羧酶活性的结果。可通过比较特定微生物中的不同赖氨酸脱羧酶基因的表达水平和比较这些基因表达的赖氨酸脱羧酶的比酶促活性，测量特定赖氨酸脱羧酶基因对总赖氨酸脱羧酶活性的贡献。可根据本领域熟知的方法测量不同基因的表达水平，优选地在蛋白质水平上测量表达水平，例如通过蛋白质印迹或ELISA测定。测量赖氨酸脱羧酶的比酶促活性的方法也是本领域熟知的。在WO2007113127中公开了优选的方法。

如果内源赖氨酸脱羧酶活性是通过至少另一种具有赖氨酸脱羧酶活性的多肽的转基因表达增强的，则这个或这些另外的多肽的贡献可通过比较转化和未转化的微生物的总赖氨酸脱羧酶活性来测量。

在优选的实施方案中，细胞内或细胞外脱羧酶活性或这两种活性至少部分，优选地多于30％或多于50％或多于60％或多于70％或多于75％，80％，85％，90％，95％98％，99％是由于包含与SEQ ID NO：3具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列且具有赖氨酸脱羧酶活性，优选地具有高赖氨酸脱羧酶活性的一种或多种多肽。

在一个实施方案中，细胞内或细胞外脱羧酶活性或这两种活性多于98％或多于99％是由于包含与SEQ ID NO：3具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列且具有赖氨酸脱羧酶活性，优选地具有高赖氨酸脱羧酶活性的一种或多种多肽。

在一个实施方案中，细胞内或细胞外脱羧酶活性或这两种活性多于98％或多于99％是由于包含与SEQ ID NO：4具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列且具有赖氨酸脱羧酶活性，优选具有高的赖氨酸脱羧酶活性的一种或多种多肽。

在一个实施方案中，包含尸胺输出体活性的微生物确实也包含增强的赖氨酸输入能力。

可通过增加从发酵培养基进入微生物的赖氨酸流、或通过减少从微生物到发酵培养基的赖氨酸流的任意措施实现提高的赖氨酸输入能力。

测定赖氨酸输出和输入活性的方法可在Bellmann，A，Vrljic，M，Patek，M，等人MICROBIOLOGY-SGM 147第1765-1774页，2001，和Burkovski，A，Kramer，R.Applied Microbiology and Biotechnology 58第265-274页.2002和其中引用的文献中找到。

例如，可通过减少或消除赖氨酸输出体活性，或增强赖氨酸通透酶活性，或增强赖氨酸/尸胺逆向转运体活性，或其任意组合提高赖氨酸输入能力。

赖氨酸输出体活性可由能够将赖氨酸从培养基转运到细胞的任意多肽导致，例如赖氨酸输出体，同向转运体(symporter)或逆向转运体多肽。

如果微生物具有细胞外赖氨酸脱羧酶活性和高的赖氨酸生产能力，通过采取与描述的用于增强赖氨酸输入能力的措施相反的措施增强赖氨酸输出能力可能是有利的，例如通过增强某些基因的表达，而不是减少某些基因的表达。具有高赖氨酸生产能力和减少或消除的赖氨酸输出体多肽的表达，但缺乏细胞外赖氨酸脱羧酶活性的微生物的实例可在WO 97/23597和WO2005073390(其中公开了通过培养具有增强的氨基酸输出蛋白的表达或活性的微生物的增强的氨基酸生产的方法)和US 7,435,584(其中公开了通过培养具有lysE(赖氨酸输出体载体)基因的高表达的棒杆菌的增强的L-赖氨酸生产的方法)中找到。

在本发明的一个实施方案中，降低至少一种赖氨酸输出体多肽的活性，其中赖氨酸输出体多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列且具有赖氨酸输出活性，或其中赖氨酸输出体多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列且具有赖氨酸输出活性，或降低其中至少2种赖氨酸输出体多肽的活性，至少一种包含与SEQ ID NO：5具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列且具有赖氨酸输出活性，且至少一种包含与SEQ ID NO：5具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列且具有赖氨酸输出活性。

lysE基因已在文献，Eggeling，L，Sahm，H JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING 92，3201-213，Eggeling，L，Sahm，H ARCHIVES OF MICROBIOLOGY 180，3155-160 2003中描述。又见德国专利申请DE 95-01048222。

YbjE基因产物(SEQ ID NO：6)及其突变体已在例如WO2005073390中描述。

术语“降低的活性”包括基因产物(例如尸胺输出体多肽，或赖氨酸输出体多肽)的表达水平低于操纵微生物前或未经操纵的可比微生物中的表达，优选地将基因产物的表达与在相同条件下生长的特定微生物物种的熟知菌株相比较，例如在棒杆菌的情况下，将基因表达优选地与菌株ATCC13032中的表达水平相比较。在大肠杆菌的情况下，将基因表达优选地与在菌株保藏中心ATCC中保藏的菌株MG1665中的表达水平相比较，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，将表达水平与在菌株保藏中心ATCC中保藏的菌株W303相比较。在一个实施方案中，可遗传操纵(例如，遗传改造)微生物，从而在低于操纵微生物前或未经操纵的可比微生物中的表达的水平表达基因产物。遗传操纵可包括，但不限于，改变或修饰与特定基因的表达相关的调节序列或位点(例如，通过去除强启动子、诱导型启动子或多个启动子)，修饰特定基因的染色体位置，改变特定基因的相邻核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子，减少特定基因的拷贝数，修饰参与特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的蛋白质(例如，调节蛋白，抑制物，增强物，转录激活物等)，或本领域例行操作的降低特定基因的表达的任意其他常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子，或敲除或阻断靶蛋白表达的其他方法)。特别地，可操纵基因使1个或多个核苷酸从宿主生物的染色体中缺失。也可通过引入导致基因产物活性降低的一个或多个基因突变得到基因产物(例如赖氨酸输出体多肽)的降低的活性。此外，也可通过影响调节所述基因产物的表达或活性的调节蛋白降低基因产物的活性，例如通过影响所述基因的转录。实例是转录阻抑物和转录激活物。例如lysE基因的表达受lysG基因产物的负面影响。lysG基因(本文中以SEQ ID NO：7公开)和LysG基因产物(本文中以SEQ ID NO：8公开)的序列也可见如下登记号：P94632，X96471。

在另一个实施方案中，通过增强的赖氨酸通透酶活性或通过增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性或二者的组合增强赖氨酸输入能力。

可通过提高一种或多种内源赖氨酸通透酶基因(例如在SEQ ID NO：9中公开的)的表达，或提高赖氨酸通透酶多肽(例如在SEQ ID NO：10中公开的)的通透酶活性增强给定微生物的赖氨酸通透酶活性，例如通过微生物的随机诱变或通过用一种或多种赖氨酸通透酶基因转化微生物或通过其任意组合进行。

在一个实施方案中，通过重组表达一种或多种赖氨酸通透酶多肽增强微生物的赖氨酸通透酶活性，所述多肽包含与SEQ ID NO：10具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列，并具有赖氨酸通透酶活性，例如具有赖氨酸通透酶活性的同源物或突变体。测定赖氨酸通透酶活性的方法可在Bellmann，A，Vrljic，M，Patek，M，等人MICROBIOLOGY-SGM 147第1765-17742001页，和Burkovski，A，Kramer，R APPLIED MICROBIOLOGY ANDBIOTECHNOLOGY 58 pp.265-2742002，Fujii，T，等人，以及BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY 66，第1981-1984页，2002和其中引用的参考中找到。

可例如通过一种或多种赖氨酸通透酶基因的转化，通过使用具有更高表达活性的失调的启动子提供内源赖氨酸通透酶基因，或通过减少赖氨酸通透酶基因表达或基因产物活性的负调节物实现重组表达。

在另一个实施方案中，通过增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性增强赖氨酸输入能力。赖氨酸/尸胺逆向转运体是在跨越细胞膜的不同方向上同时转运赖氨酸和尸胺的蛋白质。可通过提高一种或多种内源赖氨酸/尸胺逆向转运体基因的表达，通过微生物的随机突变，用一种或多种赖氨酸/尸胺逆向转运体基因转化微生物，或通过优化赖氨酸/尸胺逆向转运体多肽的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性(例如偏好赖氨酸输入和尸胺输出)，或通过其任意组合实现增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性。

在一个实施方案中，通过重组表达一种或多种赖氨酸/尸胺逆向转运体多肽增强微生物的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性，所述多肽包含与SEQ IDNO：11具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列，并具有赖氨酸/尸胺逆向转运体活性，例如具有赖氨酸/尸胺逆向转运体活性的同源物或突变体。

可例如通过一种或多种赖氨酸/尸胺逆向转运体基因的转化，通过使用具有更高表达活性的失调的启动子提供内源赖氨酸/尸胺逆向转运体基因，或通过减少赖氨酸/尸胺逆向转运体基因表达或基因产物活性的负调控物实现重组表达。

已知cadB基因产物(本文以SEQ ID NO：11公开)的输入或输出活性依赖于细胞和发酵培养基中的赖氨酸和尸胺浓度。因此，可通过增加发酵培养基中的赖氨酸浓度，避免发酵培养基的低pH值，或通过插入在发酵培养基中的给定赖氨酸浓度或pH值下促进赖氨酸输入的突变，或通过其组合增强表达功能性cadB基因产物的某些微生物的赖氨酸输入能力(Soksawatmaekhin W.等人；Excretion and uptake of cadaverine by CadBand its physiological functions in Escherichia coli；Molecular Microbiology；2004，；卷51，5；第1401-1412页)。

描述了在发酵培养基中的给定赖氨酸浓度或pH值下促进大肠杆菌cadB基因产物的赖氨酸输入的若干突变(Soksawatmaekhin W.等人；Identification of the Cadaverine Recognition Site on the Cadaverine-LysineAntiporter CadB；The Journal of Biological Chemistry；2006；卷281，39；第29213-29220页)。本领域技术人员将能够鉴定在其他cadB蛋白，例如cadB的同源物或突变体中的类似突变。

因此，在一个实施方案中，赖氨酸/尸胺逆向转运体多肽包含与SEQ IDNO：11具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列，并包含一种或多种以下突变：C12S，W41L，W43L，Y55L，Y57L，Y73L，Y73F，Y73W，Y89L，Y89F，Y89W，Y90L，Y90F，Y90W，Y107L，Y174L，C125S，D185N，E204Q，E204D，Y235L，Y235F，Y235W，W289L，D303N，D303E，Y310L，Y366L，Y368L，D372N，E377Q，E408Q，Y423L，Y423F和Y423W。上述突变根据cadB基因产物的氨基酸序列命名。通过使用序列比较工具，例如通过使用序列比对，本领域技术人员将能够将这些突变转移到其他基因产物上，例如与cadB基因产物同源的基因产物。

优选地，包含与SEQ ID NO：11具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列的赖氨酸/尸胺逆向转运体多肽包含一种或多种以下突变：W41L，W43L，Y57L，Y89L，Y107L，Y174L，D185N，E204Q，Y235L，W289L，D303N，Y366L，Y368L，D372N和E408Q。

更优选地，包含与SEQ ID NO：11具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列的赖氨酸/尸胺逆向转运体多肽包含一种或多种以下突变：W41L，W43L，Y57L，Y107L，Y174L，D185N，Y366L，Y368L和E408Q。

在本发明的另一个实施方案中提供了微生物，其包含细胞内赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性并具有高赖氨酸生产能力。具有高赖氨酸生产能力的微生物能够在例如细胞内或周围培养基中富集赖氨酸，如果赖氨酸不被进一步代谢为例如尸胺的话。

优选地，具有高赖氨酸生产能力的微生物具有选自组(i)的至少一种失调的基因。组(i)是一组在赖氨酸生物合成中起关键作用的基因，并由天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醛脱氢酶，二氢吡啶二羧酸合酶，二氢吡啶二羧酸还原酶，四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶，琥珀酰-氨基-酮基庚二酸转氨酶，琥珀酰-二氨基-庚二酸脱琥珀酰酶，二氨基庚二酸表异构酶，二氨基庚二酸脱氢酶，精氨酰-tRNA合成酶，二氨基庚二酸脱羧酶，丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，转酮醇酶，转醛醇酶，6-磷酸葡糖酸内酯酶，果糖1，6-二磷酸酶，高丝氨酸脱氢酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，琥珀酰辅酶A合成酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶，二胺乙酰基转移酶基因组成。

根据本发明的方法，组(i)的至少一个基因必须是失调的。优选地，在根据本发明的微生物中，组(i)的多于1个基因，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个基因是失调的。

将被失调的组(i)的优选基因是：天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醛脱氢酶，二氢吡啶二羧酸合酶，二氢吡啶二羧酸还原酶，二氨基庚二酸脱氢酶，二氨基庚二酸脱羧酶，丙酮酸羧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，转酮醇酶，转醛醇酶，6-磷酸葡糖酸内酯酶，果糖1，6-二磷酸酶，高丝氨酸脱氢酶，琥珀酰辅酶A合成酶，二胺乙酰基转移酶。

组(i)的基因和基因产物是本领域已知的。EP 1108790公开了在高丝氨酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶基因中的突变，所述突变对重组棒杆菌生产赖氨酸的生产力具有有利影响。WO 00/63388公开了在天冬氨酸激酶基因中的突变，所述突变对重组棒杆菌生产赖氨酸的生产力具有有利影响。关于在上述这些基因中的突变，引入EP 1108790和WO 00/63388作为参考。

在下表中对每个基因/基因产物描述了失调各个基因的可能方法。关于基因的失调，将表的“失调”行中引用的文献和文件一同引入作为参考。在表中提及的方法是失调各个基因的优选实施方案。

表1

失调天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醛脱氢酶，二氢吡啶二羧酸合酶，二氢吡啶二羧酸还原酶，四氢吡啶二羧酸琥珀酰化酶，琥珀酰-氨基-酮基庚二酸转氨酶，琥珀酰-二氨基-庚二酸脱琥珀酰酶，二氨基庚二酸表异构酶，二氨基庚二酸脱氢酶，精氨酰-tRNA合成酶，二氨基庚二酸脱羧酶，丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，转酮醇酶，转醛醇酶，6-磷酸葡糖酸内酯酶，果糖1，6-二磷酸酶基因的优选方法是增加基因活性的“向上”突变，例如通过使用强表达信号的基因扩增和/或增强酶促活性的点突变。

失调高丝氨酸脱氢酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，琥珀酰辅酶A合成酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶，乙酰基转移酶基因的优选方法是减少基因活性的“向下”突变，例如通过使用弱表达信号的基因缺失或破坏和/或破坏或减少酶促活性的点突变。

如果天冬氨酸激酶作为基因(i)组的成员被失调，那么除了天冬氨酸激酶以外的至少第二个基因(i)成员必须也被失调。

已经观察到，在根据本发明的方法的微生物中产生的尸胺的大部分随后可被乙酰化(WO 2007/113127)。为了阻止归因于N-乙酰尸胺形成多肽的乙酰化反应，所述多肽被定义为能够产生N-乙酰尸胺的酶促活性多肽。为了增加尸胺产量，本发明的优选实施方案是失调生产的微生物的二胺乙酰基转移酶，特别是降低其活性，例如通过缺失或破坏基因。

N-乙酰尸胺形成多肽的一个实例是谷氨酸棒杆菌的乙酰辅酶A依赖的二胺乙酰基转移酶(NP_600742蛋白)，例如在SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13中公开的。

在本发明的一个实施方案中，通过降低至少一种N-乙酰尸胺形成多肽的活性降低N-乙酰尸胺形成活性，所述多肽包含与SEQ ID NO：13具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％同一性的氨基酸序列并具有N-乙酰尸胺形成活性。N-乙酰尸胺形成活性可如WO2007/113127中描述的检测。

已经观察到，在根据本发明的方法的微生物中产生的尸胺的大部分可通过氨丙基尸胺形成多肽转化为氨丙基尸胺。为了阻止此反应和为了增加尸胺产量，本发明的优选实施方案是失调进行生产的微生物的氨丙基尸胺形成多肽，特别是降低其活性，例如通过缺失或破坏基因。

氨丙基尸胺形成多肽的一个实例是大肠杆菌的亚精胺合酶，如在Soksawatmaekhin W.等人；Molecular Microbiology；(2004)Vol.51，5；第1401-1412页中描述，SEQ ID NO：14。

因此，在本发明的一个实施方案中，通过降低至少一种氨丙基尸胺形成多肽的活性降低氨丙基尸胺形成活性，所述多肽包含与SEQ ID NO：14具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％同一性的氨基酸序列。

已经观察到，可通过使生产尸胺的微生物的高丝氨酸脱氢酶多肽活性失调来提高微生物的赖氨酸生产能力，如在JP2004222569中描述的，优选地通过缺失或破坏编码高丝氨酸脱氢酶多肽的基因减少其活性。

高丝氨酸脱氢酶多肽的一个实例是谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸脱氢酶，本文以SEQ ID NO：15公开，或大肠杆菌的高丝氨酸脱氢酶，本文以SEQID NO：16和SEQ ID NO：17公开。

因此，在本发明的一个实施方案中，通过降低高丝氨酸脱氢酶多肽的活性降低高丝氨酸脱氢酶活性，所述多肽包含与SEQ ID NO：15，16或17具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％同一性的氨基酸序列。

测定高丝氨酸脱氢酶活性的方法可在M.B.Jenkins，V.W.Woodward，Biochimica et Biophysica Acta，1970，212，21-32中找到。

在本发明的另一个实施方案中，微生物具有不同于通过脱羧的减少的降解赖氨酸的能力，例如通过具有降低的赖氨酸羟化酶活性。

赖氨酸羟化酶多肽是具有赖氨酸羟化酶活性的多肽，又称赖氨酸N6-羟化酶[EC：1.14.13.59]。具有赖氨酸羟化酶活性的检测可在Meneely KM，和Lamb AL BIOCHEMISTRY 46第11930-11937页2007和IJ，HsuehLC，Baldwin JE，等人EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY 268第6625-6636页中找到。

一个实例是大肠杆菌CFT073的赖氨酸羟化酶iucD(SEQ ID NO：18)。

在本发明的另一个实施方案中，通过减少降低一种多肽的活性降低赖氨酸降解活性，所述多肽包含与SEQ ID NO：18的赖氨酸羟化酶具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％同一性的氨基酸序列，并具有赖氨酸羟化酶活性。

在本发明的另一个实施方案中，微生物具有失调的亚精胺形成或摄取活性，或腐胺形成或摄取活性，或其组合。

亚精胺形成活性是由能够合成亚精胺的多肽造成的。亚精胺形成多肽的一个实例是SEQ ID NO：14的亚精胺合酶。

腐胺形成活性是由能够合成腐胺的多肽造成的。腐胺形成多肽的一个实例是大肠杆菌的腐胺合酶speE(例如在SEQ ID NO：19中公开)，或大肠杆菌的鸟氨酸脱羧酶，speF(例如在SEQ ID NO：20中公开)。

具有亚精胺或腐胺摄取活性的多肽是能够转运亚精胺或腐胺或这二者进入细胞的多肽。亚精胺和或腐胺摄取多肽的一个实例是大肠杆菌的potE(例如在SEQ ID NO：21中公开)，其功能为腐胺/鸟氨酸逆向转运体。

在本发明的一个实施方案中，微生物具有降低的亚精胺形成或摄取活性，或腐胺形成或摄取活性，其中

a)通过降低亚精胺形成多肽的活性失调亚精胺形成活性，所述多肽包含与SEQ ID NO：14具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％同一性的氨基酸序列，或

b)通过降低腐胺形成多肽的活性失调腐胺形成活性，所述多肽包含与SEQ ID NO：19具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％同一性的氨基酸序列，或

c)通过降低鸟氨酸脱羧酶多肽的活性失调腐胺形成活性，所述多肽包含与SEQ ID NO：20具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％同一性的氨基酸序列，或

d)通过降低亚精胺、或腐胺、或亚精胺和腐胺摄取多肽的活性失调亚精胺、或腐胺、或亚精胺和腐胺摄取活性，所述多肽包含与SEQ ID NO：21具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％同一性的氨基酸序列，或

e)其中通过降低a)，b)，c)或d)的组合的活性，降低亚精胺形成或摄取活性，或腐胺形成或摄取活性，或其组合。

本发明的一个重要方面包括培养或培育本文描述的重组微生物，从而生产期望的化合物尸胺。

因此本发明的一个实施方案是尸胺生产系统，其包含微生物，所述微生物包含细胞内赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性，和适于培养此微生物的发酵培养基，优选地，发酵培养基包含赖氨酸。

尸胺生产系统是用于生产尸胺的技术系统，例如包含尸胺生产微生物的培养基，或包含赖氨酸的溶液或培养基和生产赖氨酸脱羧酶的微生物。通常尸胺生产系统包含支持尸胺生产的技术系统，例如发酵罐。

术语“培养”包括维持和/或生长本发明的活微生物(例如，维持和/或生长培养物或菌株)。在一个实施方案中，在液体培养基中培养本发明的微生物。在另一个实施方案中，在固体培养基或半固体培养基上培养本发明的微生物。在一个优选的实施方案中，在包含对维持和/或生长微生物必需或有益的营养物的培养基(例如，无菌的、液体培养基)中培养本发明的微生物。

可使用的碳源包括糖和碳水化合物，如例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪，如例如豆油，向日葵油，花生油和椰子油，脂肪酸，如例如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇，如例如甘油和乙醇，和有机酸，如例如醋酸。在一个优选的实施方案中，使用葡萄糖，果糖或蔗糖作为碳源。这些物质可单独使用或作为混合物使用。

在另一个优选的实施方案中，在包含木糖，阿拉伯糖，纤维二糖或其混合物的液体、固体或半固体培养基之中或其上培养本文描述的微生物，这样的培养基可包含或可不包含如上述碳源的其他碳源。

培养本发明微生物的培养基可仅包含有限数量的不同碳源，例如1，2，3，4，5或更多种碳源，或可包含非常复杂的碳源混合物，木质纤维素底物或农业残留物的水解物，例如来自(但不限于)如玉米，小麦，黑麦，大麦，稻，木薯来源的淀粉的水解物，或稻草、木材、纸或其他植物来源的材料的水解物。

碳源的优选组合是包含高含量葡萄糖和木糖，果糖和木糖，蔗糖和木糖，或蔗糖和葡萄糖，或蔗糖和果糖，或蔗糖，葡萄糖和果糖和蔗糖，葡萄糖，果糖和木糖，或葡萄糖，果糖和木糖，或葡萄糖，果糖，木糖和阿拉伯糖，或蔗糖，木糖和阿拉伯糖，或葡萄糖，木糖和阿拉伯糖，和上述糖的其他组合的培养基。

在培养基包含木糖的情况下，使用表达或过表达木糖代谢基因的本发明的微生物是有利的。

木糖代谢基因是例如大肠杆菌xylABFGHR基因座的基因，包含木糖转运系统的基因(xylE，xylT和xylFGH基因)，用于木糖利用的基因(xylA和xylB基因)和用于木糖转录激活物的基因(xylR基因)。

过表达xylABFGHR基因座的基因的微生物在EP1577396和EP1577369中描述。在例如(Kawaguchi，等人Engineering of a xylosemetabolic pathway in Corynebacterium gutamicum，Applied andEnvironmental Microbiology，2006，Vol.72，5，第3418-3428页)中已描述了这样的棒杆菌，其单独过表达大肠杆菌的xylA基因、或与xylB一起过表达，编码木糖异构酶并且xylB基因编码木酮糖激酶。

在优选的实施方案中，本发明的微生物表达或过表达至少xylA或xylB基因，甚至更优选地表达或过表达xylA和xylB基因。

在培养基包含阿拉伯糖的情况下，使用表达或过表达阿拉伯糖代谢基因的本发明的微生物是有利的。阿拉伯糖代谢基因是例如araBAD操纵子的基因，例如大肠杆菌的araA，araB，araD和araE基因，分别编码L-阿拉伯糖异构酶(araA)，L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸-4-表异构酶(araD)，或谷氨酸棒杆菌的araBDA操纵子的基因，其包含araA，araB和araD基因的同源物和编码L-阿拉伯糖异构酶的araE，编码转录调节物的araR基因和编码假定的醛糖1-表异构酶的galM基因。优选地，本发明的微生物表达或过表达至少araA，araB和araD基因，更优选地表达或过表达至少araA，araB，araD和araE基因。Kawaguchi等人Identificationand Functional Analysis of the Gene Cluster for L-Arabinose Utilization inCorynebacterium glutamicum，Applied and Environmental Microbiology，2009，75，Vol.11，第3419-3429页)。

阿拉伯糖代谢基因的大肠杆菌同源物也可用于异源微生物如谷氨酸棒杆菌中(Kawaguchi等人Engineering of an L-arabinose metabolicpathway in Corynebacterium glutamicum，Applied Microbiology andBiotechnology，2008，77，Vol，5，第1053-1062页)。

在培养基包含纤维二糖的情况下，使用表达或过表达纤维二糖代谢基因的本发明的微生物是有利的。纤维二糖代谢基因是例如谷氨酸棒杆菌的bglA基因，其编码磷酸烯醇式丙酮酸：糖类磷酸转移酶系统(PTS)β-葡糖苷特异性酶IIBCA组分和磷酸-β-葡萄糖苷酶。来自棒杆菌R菌株的这些基因和相应蛋白质的实例可以登记号AF508972找到。

在培养基包含木糖，阿拉伯糖，纤维二糖或其他碳源的组合的情况下，使用表达或过表达木糖代谢，阿拉伯糖代谢或纤维二糖代谢基因的本发明的微生物是有利的。例如，在培养基具有高含量的木糖和阿拉伯糖的情况下，使用表达或过表达木糖和阿拉伯糖代谢基因，例如表达xylA和xylB基因和araA，araB，araD基因，优选地xylA和xylB araA，araB，araD和araE基因的微生物是有利的。

在培养基具有高含量的木糖和纤维二糖的情况下，使用表达或过表达木糖和纤维二糖代谢基因，例如表达xylA和xylB和bglA基因的微生物是有利的(Sasaki等人Simultaneous utilization of D-cellobiose，D-glucose，and D-xylose by recombinant Corynebacterium glutamicum underoxygen-deprived conditions，Applied Microbiology and Biotechnology，2008，Vol.81，4，第691-699页)。

可使用的氮源包括含氮有机化合物，如蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，麦芽提取物，玉米浆，大豆粉和尿素或无机化合物，如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独使用或作为混合物使用。可使用的磷源是磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。培养基必须还包含金属盐，如例如硫酸镁或硫酸铁，这是生长所必需的。最后，除了上述物质以外，也可使用必要的促生长物质，如氨基酸和维生素。还可将合适的前体加入培养基。上述供养物质可以单个批次加入培养基，或在培养期间适当地加入。

优选地，在受控的pH下培养本发明的微生物。术语“受控的pH”包括导致期望的精细化学品(例如尸胺)的产生的任意pH。在一个实施方案中，在约7的pH下培养微生物。在另一个实施方案中，在6.0和8.5之间的pH下培养微生物。可通过本领域技术人员已知的许多方法中任意一种维持期望的pH。例如，使用碱性化合物如氢氧化钠，氢氧化钾，氨，或氨水，或酸性化合物，如磷酸或硫酸，以适当地控制培养物的pH。

也优选地，在受控的曝气(aeration)下培养本发明的微生物。术语“受控的曝气”包括导致期望的精细化学品(例如尸胺)的产生的足够的曝气(例如，氧气)。在一个实施方案中，通过调节培养物中的氧气水平，例如，通过调节培养基中溶解的氧气量控制曝气。优选地，通过搅拌培养物控制培养物的曝气。可通过螺旋桨或类似的机械搅拌设备，通过旋转或振荡生长容器(例如，发酵罐)或通过多种抽吸设备提供搅拌。还可通过使无菌空气或氧气通过培养基(例如，通过发酵混合物)控制曝气。也优选地，在没有过分发泡的条件下培养本发明的微生物(例如，通过加入消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯(fatty acid polyglycol ester))。

此外，可在受控的温度下培养本发明的微生物。术语“受控的温度”包括导致期望的精细化学品(例如尸胺)的产生的任意温度。在一个实施方案中，受控的温度包括在15℃和95℃之间的温度。在另一个实施方案中，受控的温度包括在15℃和70℃之间的温度。优选的温度是在20℃和55℃之间，更优选地在30℃和45℃之间或在30℃和50℃之间。

可在液体培养基中培养(例如，维持和/或生长)微生物，优选地通过常规培养方法如静置培养，试管培养，振荡培养(例如，旋转振荡培养，摇瓶培养等)，曝气旋动培养，或发酵，连续或间歇培养。在一个优选的实施方案中，在摇瓶中培养微生物。在更优选的实施方案中，在发酵罐(例如，发酵方法)中培养微生物。本发明的发酵方法包括但不限于，分批、补料分批和连续的发酵法。词组“分批方法”或“分批发酵”指一种封闭系统，其中培养基组成、营养物、补充添加剂等在发酵开始时设定，在发酵期间不改变，然而，可尝试控制如pH和氧气浓度这些因素，以避免培养基过分酸化和/或微生物死亡。词组“补料分批方法”或“补料分批”发酵指一种分批发酵，除了随发酵进行加入一种或多种基质或补充物(例如，以增量加入或连续加入)。词组“连续方法”或“连续发酵”指一种系统，其中将定量的发酵培养基连续加入发酵罐并同时移除等量的用过的或“条件”培养基，优选地用于回收期望的尸胺。已开发了多种这样的方法，并且是本领域熟知的。

本发明的方法还可包括回收尸胺的步骤。术语“回收”尸胺包括从培养基中提取，收获，分离或纯化化合物。可根据本领域已知的任意常规分离或纯化方法进行化合物的回收，包括但不限于，用常规树脂处理(例如，阴离子或阳离子交换树脂，非离子吸附树脂等)，用常规吸附剂处理(例如，活性炭，硅酸，硅胶，纤维素，氧化铝等)，pH改变，溶剂提取(例如，使用常规溶剂如醇，乙酸乙酯，己烷等)，蒸馏，透析，过滤，浓缩，结晶，再结晶，pH调节，冻干等等。例如可通过首先去除微生物从培养基中回收尸胺。然后使去除生物量的液体培养基通过或经过阳离子交换树脂以去除不想要的阳离子，然后通过或经过阴离子交换树脂以去除不想要的无机阴离子和具有比尸胺强的酸性的有机酸。另外，可用腐蚀剂处理液体培养基并用有机溶剂如烷醇通过相分离提取尸胺。可通过蒸馏从提取相中回收尸胺，以获得足够用于不同应用的纯度。可能的应用包括通过与二羧基有机酸缩聚生产聚酰胺。

因此，在另一个方面，本发明提供了生产聚酰胺(例如尼龙(nylon)^TM)的方法，所述方法包括上述用于生产尸胺的步骤。尸胺以已知方式与二、三或多羧酸反应以得到聚酰胺。优选地，尸胺与包含4-10个碳的二羧酸如琥珀酸，戊二酸，己二酸，庚二酸，辛二酸，壬二酸，癸二酸等反应。二羧酸优选地是游离酸。

本发明的微生物用于通过发酵这些微生物生产尸胺，其中在培养物中培养微生物，优选地在如上所述的培养条件下培养微生物。

因此，本发明包括用于生产尸胺的方法，所述方法包括发酵微生物，所述微生物包含细胞内赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性。优选地，所述方法包括从培养基中回收尸胺。

在一个实施方案中，微生物包含增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性，例如微生物过表达与SEQ ID NO：11具有至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性并具有赖氨酸/尸胺逆向转运体活性的多肽，例如具有赖氨酸/尸胺逆向转运体活性的同源物或突变体，并且所述方法包括在包含赖氨酸的培养基中发酵微生物。优选地，所述培养基包含多于0,1mM，或多于0,5mM，或多于1mM，或多于3mM，或多于5mM，或多于7mM，或多于8mM，或多于9mM，或多于10mM的赖氨酸。更优选地，所述培养基包含多于15mM的赖氨酸。甚至更优选地，所述培养基包含多于20mM的赖氨酸。最优选地，所述培养基包含多于30mM的赖氨酸。

在另一个实施方案中，微生物包含细胞外赖氨酸脱羧酶活性，或包含细胞外赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性。

本发明的另一个实施方案是生产尸胺的方法，其中在培养基中的尸胺浓度(mol/l)比N-乙酰尸胺或氨丙基尸胺或这二者的浓度(mol/l)高至少1.2倍，或高多于1.3倍，或高多于1.4倍，或高多于1.5倍，或高多于1.6倍，或高多于1.7倍，或高多于1.8倍，或高多于1.9倍或高多于2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍。本发明的另一个实施方案是在所述方法中生产的培养基。

可通过加工包含尸胺(DAP)的发酵液体培养基，即在生产尸胺的方法结束或已被终止后的其状态的培养基，回收或纯化由上述方法生产的尸胺。

如在下文培养基中描述的从发酵液体培养基中回收或纯化尸胺的方法仅是为了示例目的。本领域技术人员将知道也可成功应用的下述方法的备选方法或变化形式。

为了回收生产的尸胺，使发酵液变浓或浓缩是有利的。可通过已知方法使发酵液变浓或浓缩，例如，借助旋转蒸发仪，薄膜蒸发仪，降膜蒸发仪，通过反渗透或通过纳米过滤(nanofiltration)。如必要，可去除由于浓缩程序沉淀的盐，例如通过过滤或离心。然后可以本发明的方式加工浓缩的发酵液以得到尸胺。对于依照本发明的加工，这样的浓缩程序是可行的，但不是绝对必要的。

根据本发明，借助有机提取剂从发酵液中提取尸胺。更具体地，使用与水的混溶的尽可能极性的并在碱性pH中稳定的有机溶剂，如特别是极性、双极性质子有机溶剂。合适的溶剂特别是具有3-8个碳原子的环状或开链的，任选分支的烷醇，特别是正和异丙醇，正、仲和异丁醇，或环己醇，以及正戊醇，正己醇，正庚醇，正辛醇，2-辛醇及其单或多分支的同分异构体形式。本文特别提及正丁醇。

在优选的实施方案中，在升高的温度分批进行提取和/或随后的相分离，这受水和提取剂或可能形成的共沸物的沸点限制。使用提取剂正丁醇可在例如，约25-90℃或，优选地，在40-70℃进行提取和相分离。为了提取，搅拌两个相直到建立了分配平衡，例如经过10秒至2小时，优选地5至15分钟的时间。然后静置澄清相直到其完全分离；这优选地需要10秒至5小时，例如15至120或30至90分钟，特别地在正丁醇的情况下，也在从约25-90℃或40-70℃范围的温度下。

在另外优选的实施方案中，在多阶段过程(例如在混合澄清器组合)中连续地从发酵液中提取尸胺，或在提取柱中连续地从发酵液中提取尸胺。

作为优化过程的一部分，技术人员可设定可根据本发明使用的提取柱的结构，用于在每种情况下的待分离的相。合适的提取柱原则上是无电源输入的提取柱或有电源输入的提取柱，例如脉冲柱(pulsed column)或具有旋转的内部构件的柱。作为常规工作的一部分，技术人员也可选择合适的方式类型和内部构件的材料，如筛盘和柱盘，以优化相分离。小分子的液-液提取的基本理论是熟知的(参见例如H.-J.Rehm和G.Reed，编，(1993)，Biotechology，卷3Bioprocessing，第21章，VCH，Weinheim)。例如，在Lo等人，编，(1983)Handbook of Solvent Extraction，JohnWiley&Sons，New York中描述了工业适用的提取柱的结构。明确参考上面的教科书的公开。

在相分离后，以本身已知的方式从含有尸胺的提取相中分离和纯化尸胺。回收尸胺的可能措施特别是(但不限于)，蒸馏，使用合适的有机或无机酸作为盐沉淀，或这些合适措施的组合。

可连续地或分批进行蒸馏。可使用单个蒸馏柱或彼此偶联的多个蒸馏柱。配置蒸馏柱装置和建立操作参数是技术人员的职责。可以本身已知的方式设计在每种情况下使用的蒸馏柱(见例如Sattler，ThermischeTrennverfahren[Thermal separation methods]，第2版1995，Weinheim，p.135ff；Perry’s Chemical Engineers Handbook，第7版1997，New York，章节13)。因此，使用的蒸馏柱可包含有效分离的内部构件，如分离盘，例如有孔盘，泡罩盘或浮阀盘(valve tray)，安排的填充物，例如金属薄片或织物填充物，或随机的填充物床。在使用的柱中需要的板数和回流比基本由纯度要求和待分离的液体的相对沸腾位置决定，技术人员能够通过已知方法确定具体设计和操作数据。

可通过加入合适的有机或无机酸，例如硫酸，盐酸，磷酸，醋酸，甲酸，碳酸，草酸等实现作为盐沉淀。在另一个优选的实施方案中，使用有机二羧酸，形成可直接或在纯化(例如，通过再结晶)后使用的盐，在随后的缩聚中得到聚酰胺。更具体地，这样的二羧酸是C₄-C₁₂二羧酸。

在提取程序中产生的有机尸胺相也可通过层析加工。对于层析，将尸胺相应用于合适的树脂，例如强或弱酸性离子交换器(如Lewatit 1468 S，Dowex Marathon C，Amberlyst 119 Wet等等)，而期望的产物或污染物部分或全部保留在层析树脂上。如必要，使用相同的或其他层析树脂，可重复这些层析步骤。技术人员熟知合适的层析树脂的选择及其最有效的应用。可通过过滤或超滤浓缩纯化产物，并在合适的温度下储存。

可通过现有技术鉴定分离的化合物和纯度。这包括高效液相色谱(HPLC)，气相色谱(GC)，光谱学方法，染色方法，薄层色谱，NIRS，酶测定或微生物测定。这些分析方法总结在：Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60：133-140；Malakhova等人(1996)Biotekhnologiya11 27-32；和Schmidt等人(1998)Bioprocess Engineer.19：67-70.Ullmann′sEncyclopedia of Industrial Chemistry(1996)A27卷，VCH：Weinheim，第89-90页，第521-540页，第540-547页，第559-566页，第575-581页和第581-587页；Michal，G(1999)Biochemical Pathways：An Atlas ofBiochemistry and Molecular Biology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等人(1987)Applications of HPLC in Biochemistry in：LaboratoryTechniques in Biochemistry和Molecular Biology，17卷。

因为通过上述方法生产和回收或纯化的尸胺可通过已知技术用于生产聚酰胺，这些聚酰胺代表了本发明的另一个实施方案。

在以下非限制性实施例和参考附图的基础上，现在将更详细地描述本发明。

实施例

菌株和质粒。通过密码子优化表达赖氨酸脱羧酶从谷氨酸棒杆菌11424合理地得到戊二胺生产菌谷氨酸棒杆菌DAP-3c(Kind，S.，Jeong，W.K.，

H.和Wittmann，C.(Kind等人，2010a)″Systems-widemetabolic pathway engineering in Corynebacterium glutamicum forbio-based production of diaminopentane.″Metab Eng.；和Kind，S.，Jeong，W.K.，

H.，Zelder，O.和Wittmann，C.(Kind等人2010b).″Identification and elimination of the competing N-acetyldiaminopentanepathway for improved production of diaminopentane by Corynebacteriumglutamicum.″Appl Environ Microbiol 76(15)，5175-80.)。在本研究中使用这两种菌株。对于菌株构建，如以前描述的(Kind等人，2010a)应用大肠杆菌菌株DH5α和NM522(Invitrogen，Karlsruhe，德国)和质粒pTc和pClikint sacB。

培养基。在复合培养基中培养第一预培养物(Kind等人，2010a)。应用基本培养基用于第二预培养物和随后的主要培养物(Becker，J.，Klopprogge，C.和Wittmann，C.(2008)(Becker等人，2008).″Metabolicresponses to pyruvate kinase deletion in lysine producing Corynebacteriumglutamicum.″Microb Cell Fact 7，8.)。

培养

在旋转振动器(振动直径5cm，Multitron，Infors AG，Bottmingen，瑞士)上在30℃和230rpm进行所有培养。对于第一预培养，使用单个菌落作为接种物。孵育约8小时后，通过离心(8800×g，2分钟，4℃)收获细胞，用无菌5％NaCl溶液洗两次，然后用作第二次预培养(50mL，在500mL带挡板的烧瓶中)的接种物。在于上述相同的条件下收获指数生长期的细胞，并用作主要培养的接种物，一式三份进行主要培养(50mL，在500mL带挡板的烧瓶中)。在培养期间维持pH恒定在7.0±0.2。

化学品。胰蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物和琼脂从Difco Laboratories(Detroit，USA)得到。所有其他化学品为分析级，从Aldrich(Steinheim，德国)，Merck(Darmstadt，德国)或Fluka(Buchs，瑞士)得到。

谷氨酸棒杆菌的遗传改造。如以前描述的进行质粒DNA的构建、纯化和分析，和大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的转化(Kind等人，2010a)。如最近描述的进行基因的靶向缺失和天然谷氨酸棒杆菌启动子的更换(Bolten，C.J.，Schr，H.，Dickschat，J.和Wittmann，C.(2010)(Bolten等人，2010).″Towards methionine overproduction in Corynebacterium glutamicum-methanethiol and dimethyldisulfide as reduced sulfur sources.″JMicrobiol Biotechnol 20(8)，1196-203.；Dickschat，J.S.，Wickel，S.，Bolten，C.J.，Nawrath，T.，Schulz，S.和Wittmann，C.(2010)(Dickschat等人.2010).″Pyrazine Biosynthesis in Corynebacterium glutamicum.″European Journal of Organic Chemistry 2010(14)，2687-2695.al.)。简单地说，通过将编码区替换为缩短的基因片段缺失基因。用于基于基因组的表达扩增，将对应的天然启动子替换为sod基因的强启动子(NCgl2826)(Becker，J.，Klopprogge，C.，Herold，A.，Zelder，O.，Bolten，C.J.和Wittmann，C.(2007)(Becker等人，2007).″Metabolic flux engineering ofL-lysine production in Corynebacterium glutamicum-over expression andmodification of G6P dehydrogenase.″J Biotechnol.)。为此目的，使用不能在谷氨酸棒杆菌中复制的整合型质粒pClik int sacB(Becker，J.，Klopprogge，C.，Zelder，O.，Heinzle，E.和Wittmann，C.(2005)(Becker等人，2005).″Amplified Expression of Fructose 1，6-bisphosphatase inCorynebacterium glutamicum increases in vivo flux through the pentosephosphate pathway and lysine production on different carbon sources.″Appl Environ Microbiol 71(12)，8587-8596.；使用在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒pClik 5a MCS和tuf基因启动子(NCgl0480)的组合用于基于质粒的基因的过表达(Kind等人，2010a))。通过PCR确认遗传修饰。在表2中列出了用于构建和确认遗传变化的引物。

表2：野生型基因和衍生的突变体基因、对应的修饰和引物的位点特异性序列，所述引物用于构建(1-4/6)和通过PCR确认(1，4/6)谷氨酸棒杆菌突变体菌株中的等位基因替换。

底物和产物的分析。通过葡萄糖分析仪(2300 STAT Plus，YellowSprings Instrument，Ohio)定量在1∶10稀释的培养上清中的葡萄糖浓度。通过HPLC(LaChrom Elite，VWR Hitachi，West Chester，PA，USA)，应用Aminex HPX-87H柱(300×7.8mm；Bio-Rad，Hercules，CA，USA)作为固定相和12.5mM H2SO4作为流动相在0.5mL min-1和40℃定量在1∶10稀释的培养上清中的海藻糖和有机酸。分别使用在220nm处的紫外光(有机酸)和折射率(海藻糖)进行检测。如以前描述的以在660nm处的光密度和以细胞干量进行细胞浓度的测定(Kiefer，P.，Heinzle，E.，Zelder，O.和Wittmann，C.(2004)(Kiefer等人，2004).″Comparative metabolic fluxanalysis of lysine-producing Corynebacterium glutamicum cultured onglucose或fructose.″Appl Environ Microbiol 70(1)，229-39.)。通过HPLC进行在培养上清(1∶10稀释的)和细胞提取物中的氨基酸定量(

J.O.，Fritz，M.，Heinzle，E.和Wittmann，C.(2005).(

等人，2005)″Invivo quantification of intracellular amino acids and intermediates of themethionine pathway in Corynebacterium glutamicum.″)。通过修改的洗脱梯度使相同的方法适于定量包括1，5-戊二胺和N-乙酰-1，5-戊二胺的生物多胺(Kind等人，2010a)。

细胞内代谢物分析。通过快速过滤和在沸水中提取进行细胞内代谢物取样(Wittmann，C.，Kromer，J.O.，Kiefer，P.，Binz，T.和Heinzle，E.(2004)(Wittmann等人，2004).″Impact of the cold shock phenomenon onquantification of intracellular metabolites in bacteria.″Anal Biochem327(1)，135-9.；Bolten等人，2007)。这包括用15ml 5％NaCl溶液洗涤滤器上的细胞的步骤，5％NaCl溶液与培养基的离子强度一致，以避免代谢物渗漏(Bolten等人，2007)。

RNA提取和基因表达分析。如以前描述的从指数生长的细胞中进行总RNA提取(Kind等人，2010b)。用于比较基因表达分析，使用在线软件Agilent eArray从谷氨酸棒杆菌基因组NC_006958设计定制的DNA微阵列。如Kind等人(2010b)描述的进行用于目的基因的寡核苷酸探针的设计、荧光标记、杂交、扫描和数据处理。在这些实验中使用的定制DNA微阵列包含14363个探针，和3057个开放阅读框每个具有多达5个复制。

赖氨酸脱羧酶活性。在粗细胞提取物中测定赖氨酸脱羧酶活性。如以前描述的进行细胞提取物的制备、蛋白质浓度的测定和赖氨酸脱羧酶活性的测量(Kind等人，2010a)。用于酶动力学的实验，对反应混合物加入戊二胺，至终浓度分别为10，15，20，30和35mmol L^-1。

在谷氨酸棒杆菌中表达的赖氨酸脱羧酶的动力学性能。第一个重要研究发现产物输出作为生产的潜在瓶颈的一般相关性。研究集中在赖氨酸脱羧酶的动力学性能，特别是在被其终产物，戊二胺的抑制方面。为此，在谷氨酸棒杆菌DAP 3-c的指数生长期间得到粗细胞提取物并测定在此戊二胺生产菌中表达的赖氨酸脱羧酶活性。赖氨酸脱羧酶的比体外活性为97.0±3.5mmol g^-1h^-1。这比在培养基中聚集的戊二胺和N-乙酰戊二胺中测定的比体内产物流量1.07±0.02mmol g^-1h^-1高近百倍。很明显，只募集了赖氨酸脱羧酶的可用催化能力的小部分用于产物形成。

为了分析此涉及的酶的终产物抑制的程度，额外地在戊二胺的不同浓度上测定了其比活。很明显，比赖氨酸脱羧酶活性随着戊二胺浓度的增加大大降低(图1)。然后通过定量在生产菌中相应的细胞内戊二胺水平评估此抑制的相关性。使用合适的快速过滤法并完全去除周围培养基后，从3个生物重复样品中测定的戊二胺的胞内池大小是20.3±1.6mM。在这些条件下，体外LdcC活性降低了约40％(图1)。这表明，生物合成途径的末端步骤在体内被升高的细胞内产物水平显著抑制，并揭示了产物输出作为有价值的代谢改造靶的相关性。涉及一种或多种目前未知的输出蛋白的主动运输过程似乎是由于戊二胺在细胞质中性pH下的化学性质，即其高正电荷。鉴定戊二胺输出的潜在候选物。为了鉴定潜在的编码基因，进行了基因组范围的转录谱测定。为此，比较了戊二胺生产菌株谷氨酸棒杆菌DAP-3c和其产生赖氨酸但不产生戊二胺的亲本菌株谷氨酸棒杆菌11424之间的全基因表达谱。为了分析，从在指数生长期间，即光密度为3时收获的细胞中提取RNA。分别地，从4个生物重复样品得到参考的RNA，和从7个生物重复样品得到DAP-3c的RNA。在标记和与基因组范围微阵列竞争性杂交前合并参考RNA。

在分析和统计学处理的3000个基因中，约35个基因显示了在戊二胺生产菌中的统计学显著的上调(表2)。这些基因属于不同的功能类别，最有趣的是，包括不同的转运蛋白。在上调的转运蛋白中，4种可归因于铁和糖转运并因此与目的功能无关。

然而，属于5个操纵子的7个基因代表迄今为止未表征的转运系统。它们展示了用于戊二胺输出的潜在候选物。相关的转运蛋白包括ABC转运蛋白(cg2181和cg2184)和通透酶(cg2893)及其调节物(cg2894)。此外，转运调节物AsnC家族调节蛋白(cg2942)，LysE型易位蛋白的调节物(cg2941)上调。在所有候选物中，在通透酶中可见最高的表达增加(表3)。此基因属于易化体(facilitator)超家族并被选作待测试的用于戊二胺输出的第一候选物。应当提及，赖氨酸输出体lysE的表达降低了约3.8倍。除了上述基因，5个基因编码迄今为止功能未知的蛋白质。

表3：生产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌11424和生产戊二胺的谷氨酸棒杆菌DAP-3c的比较性转录组分析。从每种菌株的至少4个生物重复样品中得到的数据以11424菌株对比DAP-3c菌株的表达比例表示，并包含显著上调的基因。认为是显著不同的表达比例的截断取为1.7。与转运功能相关的基因以黑体突出显示。

推定的戊二胺输出体cg2893的靶向缺失。首先删除作为潜在候选物的编码主要易化体超家族通透酶cg2893的基因。为此，构建了重组质粒，其允许用缺乏编码区的659bp的缩短片段无标记替换靶基因。通过位点特异性PCR使用引物cg2893-1和cg2893-4(表1)确认来自第二次重组的克隆的期望的缺失。通过与野生型得到的1329bp的片段长度明显不同的670bp的缩短的PCR产物鉴定了阳性克隆。比较了缺乏通透酶的缺失突变体和亲本菌株。研究包括在葡萄糖的基本培养基中培养，接着是随后分析液体培养基中的产物谱。缺乏通透酶的菌株显示了实质上降低的戊二胺分泌(图2，表4)。戊二胺产量从200mmol(mol^-1葡萄糖)降低至32mmol(mol^-1葡萄糖)，对应于84％的减少。很明显，通透酶cg2893表现了在谷氨酸棒杆菌中戊二胺的主要输出体。基于其功能作用，将其注释为戊二胺输出体dapE。有趣地是，dapE缺失对N-乙酰戊二胺输出的作用截然不同。在指定的谷氨酸棒杆菌dapE中，仍然显著输出了产物的乙酰化变体(图2，表3)。这表明鉴定的输出蛋白对戊二胺相当特异，而不是对N-乙酰戊二胺。和亲本菌株中一样，赖氨酸分泌可以忽略。应当注意，戊二胺输出没有完全被通透酶的缺失关闭。这显示此酶是主要的，但不是独有的输出系统。

表4：生产戊二胺的谷氨酸棒杆菌DAP-3c，δdapE和δdapE δlysE在以葡萄糖作为单一碳源的基本培养基中的生长和生产特征。

赖氨酸输出体对于戊二胺输出的功能作用。缺乏主要戊二胺输出体的谷氨酸棒杆菌_δdapE仍然显示了分泌戊二胺至培养基中。这提示存在另一种戊二胺输出蛋白。由于戊二胺和其前体赖氨酸的结构相似性，另外检查了作为可能的候选物的赖氨酸输出体LysE。在谷氨酸棒杆菌_δdapE中缺失了编码基因lysE。然而，双缺失突变体谷氨酸棒杆菌_δdapE _δlysE在基本培养基中的生长和生产特征与其亲本菌株相比没有显示显著差异(表4)。这提示LysE不参与戊二胺的输出。

通过扩增dapE代谢改造戊二胺生产。新的输出体dapE成为有希望的提高戊二胺生产的代谢改造靶。将其在最佳的生产菌株谷氨酸棒杆菌DAP-3c中扩增。这是通过基于基因组的过表达实现的。为此，将天然的dapE启动子替换为超氧化物歧化酶(sod)的强启动子。使用引物P_sod2893-1至P_sod2893-6构建质粒，所述质粒允许在dapE的起始密码子前直接无标记整合sod启动子。通过PCR，基于和野生型相比延长200bp的PCR片段确认在基因上游序列和起始密码子之间携带sod启动子的阳性克隆。将得到的突变体命名为谷氨酸棒杆菌P_soddapE。

图2显示了改造后输出的影响。总的来说，dapE的扩增导致显著增加的产物分泌。相比DAP-3c，在P_soddapE中戊二胺产量增加了20％达到240mmol(mol葡萄糖)^-1(表3)。比生产速率(qDAP)甚至增加了40％，达到1.1mmol g^-1h^-1。作为有益的副作用，N-乙酰戊二胺的形成降低了超过75％，提示优化的输出降低了不理想的产物乙酰化。此外，输出体突变体显示了较高的活力，这通过较高的比生长速率(0.30相比0.25h^-1)和高比葡萄糖摄取速率(4.5相比4.2mmol g^-1h^-1)反映(图2，表4)。生物量产量在两种菌株中相当类似。其他副产物的产率也类似。海藻糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸和α-酮戊二酸都以相当低的量存在，但未受影响。总的来说，具有提高的dapE表达的经改造的突变体显示了关键生产性能的显著改进。应当提及，另外检测的在tuf启动子控制下的基于质粒的dapE过表达导致实质上延迟的细胞生长(μ＝0.18h^-1)和略微降低的戊二胺产量(Y_Dap/S＝192mmol(mol葡萄糖)^-1)。

dapE的基因序列和多肽序列公开如下

dapE基因序列

atgacttcagaaaccttacaggcgcaagcgcctacgaaaacccaacgtt-

gggctttcctcgccgttatcagcggtggtctctttctgatcggtgtagacaactcgattctc-

tacaccgcactccctctgctgcgtgaacagctcgcagccaccgaaacccaagcgttgtg-

gatcatcaacgcatatcccctgctcatggcgggccttcttttgggtaccggcacttt-

gggtgacaaaatcggccaccgccggatgttcctcatgggcttgagcattttcg-

gaatcgcttcacttggtgctgcgtttgctccaactgcgtgggctcttgttgctgcga-

gagctttccttggcatcggtgcggcaacgatgatgcctgcaaccttggctctgatccg-

cattacgtttgaggatgagcgtgagcgcaacactgcaattggtatttggggttccgtgg-

caattcttggcgctgcggcaggcccgatcattggtggtgcgctgtt-

ggaattcttctggtggggttcggttttcctcattaacgttccggtggctgttatcgcgtt-

gatcgctacgctttttgtggcgccggccaatatcgcgaatccgtctaagcattgggat-

ttcttgtcgtcgttctatgcgctgctcacacttgctgggttgatcatcac-

gatcaaggaatctgtgaatactgcacgccatatgcctcttcttttgggtgcagtcatcatgtt-

gatcattggtgcggtgttgtttagcagtcgtcagaagaagatcgaggagccacttcta-

gatctgtcgttgttccgtaatcgccttttcttaggcggtgtggttgctgcggg-

catggcgatgtttactgtgtccggtttggaaatgactacctcgcagcgtttccagtt-

gtctgtgggtttcactccacttgaggctggtttgctcatgatcccagctgcattggg-

tagcttcccgatgtctattatcggtggtgcaaacctgcatcgttggggcttcaaac-

cgctgatcagtggtggttttgctgccactgccgttggcatcgccctgtgtattt-

ggggcgcgactcatactgatggtttgccgtttttcatcgcgggtc-

tattcttcatgggcgcgggtgctggttcggtaatgtctgtgtcttccactgcgat-

tatcggttccgcgccggtgcgtaaggctggcatggcgtcgtcgatcgaa-

gaggtctcttatgagttcggcacgctgttgtctgtcgcgattttgggtagctt-

gttcccattcttctactcgctgcatgccccggcagaggttgcgga-

taacttctcggcgggtgttcaccacgcgattgatggcgatgcggcgcgtgcatcttt-

ggacaccgcatacattaacgtgttgatcattgccctagtatgcgcag-

tagcggctgctctgatcagcagttaccttttccgcggaaatccgaagggagccaataatgcgcactag

dapE蛋白序列

MTSETLQAQAPTKTQRWAFLAVISGGLFLIGVDNSILYTALPLLREQLAATETQAL-

WIINAYPLLMAGLLLGTGTLGDKIGHRRMFLMGLSIFGIASLGAAFAPTAWALVAARAFLGI-

GAATMMPATLALIRITFEDERERNTAIGIWGSVAILGAAAGPIIGGALLE-

FFWWGSVFLINVPVAVIALIATLFVAPANIANPSKHWDFLSSFYALLTLAG-

LIITIKESVNTARHMPLLLGAVIMLIIGAVLFSSRQKKIEEPLLDLSLFRN-

RLFLGGVVAAGMAMFTVSGLEMTTSQRFQLSVGFTPLEAGLLMIPAALGSFPMSI-

IGGANLHRWGFKPLISGGFAATAVGIALCIWGATHTDGLPFFIAGLFF-

MGAGAGSVMSVSSTAIIGSAPVRKAGMASSIEEVSYEFGTLLSVAILGSLFPFFYSLHAPAE-

VADNFSAGVHHAIDGDAARASLDTAYINVLIIALVCAVAAALISSYLFRGNPKGANNAH

Claims (20)

1.包含失调的尸胺输出体活性的微生物。

2.如权利要求1要求保护的微生物，其中失调的尸胺输出体活性至少部分是由于一种或多种尸胺输出体多肽的失调，所述多肽包含与SEQ IDNO：1具有至少80％同一性的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2要求保护的微生物，其中尸胺输出体活性增强。

4.如权利要求1至3中任一项要求保护的微生物，其中赖氨酸脱羧酶活性增强。

5.如权利要求3或4中任一项要求保护的微生物，其中赖氨酸脱羧酶活性是由于一种或多种赖氨酸脱羧酶多肽的表达，所述多肽包含与SEQ IDNO：3或4具有至少80％同一性的氨基酸序列。

6.如权利要求3或4中任一项要求保护的微生物，所述微生物具有至少一种失调的基因，所述基因选自由天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰-氨基-酮基庚二酸转氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脱琥珀酰酶、二氨基庚二酸表异构酶、二氨基庚二酸脱氢酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脱羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、转酮醇酶、转醛醇酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、果糖1，6-二磷酸酶、高丝氨酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、琥珀酰辅酶A合成酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、二胺乙酰基转移酶的基因组成的组。

7.如权利要求1至6中任一项要求保护的微生物，所述微生物具有增强的赖氨酸输入活性。

8.如权利要求7要求保护的微生物，其中增强的赖氨酸输入活性是由于降低的赖氨酸输出体活性或增强的赖氨酸通透酶活性或增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性或其任意组合。

9.如权利要求7或8要求保护的微生物，其中增强的赖氨酸输入活性是由于至少一种赖氨酸输出体多肽的降低的活性，所述多肽包含与SEQ IDNO：5具有至少80％同一性的氨基酸序列。

10.如权利要求7至9中任一项要求保护的微生物，其中增强的赖氨酸输入活性是由于增强的赖氨酸通透酶活性或由于增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性或二者的组合。

11.如权利要求1至10中任一项要求保护的微生物，其中微生物具有失调的N-乙酰尸胺形成活性。

12.如权利要求11要求保护的微生物，其中微生物没有或具有降低的N-乙酰尸胺形成活性。

13.如权利要求11要求保护的微生物，其中微生物具有增强的N-乙酰尸胺形成活性和降低的尸胺输出体活性。

14.如权利要求11至13中任一项要求保护的微生物，其中通过失调N-乙酰尸胺形成多肽的活性失调N-乙酰尸胺形成活性，所述N-乙酰尸胺形成多肽包含与SEQ ID NO：13具有至少80％同一性的氨基酸序列。

15.如权利要求1至14中任一项要求保护的微生物，其中微生物属于真细菌进化枝。

16.如权利要求1至15中任一项要求保护的微生物，其中微生物是谷氨酸棒杆菌。

17.生产尸胺的方法，所述方法包括发酵如权利要求1至12或15或16中任选一项要求保护的微生物。

18.生产乙酰尸胺的方法，所述方法包括发酵如权利要求13至16中任一项要求保护的微生物。

19.如权利要求1至12或15或16中任选一项要求保护的微生物用于生产尸胺的用途。

20.如权利要求13至16中任一项要求保护的微生物用于生产尸胺的用途。

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