CN105441497B - 一种利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法，利用基因工程技术，将不同来源的赖氨酸脱羧酶基因克隆至高产赖氨酸的大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌中进行分泌表达，将重组菌株进行发酵，第一阶段主要是重组菌株合成赖氨酸，第二阶段诱导赖氨酸脱羧酶基因进行分泌表达，并将赖氨酸转化成尸胺。本发明微生物发酵和微生物转化偶联的生产尸胺的方法，为生产尸胺提供了新途径，具有巨大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。

Description

一种利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法

技术领域

本发明属于尸胺生产技术领域，是一种通过微生物发酵合成赖氨酸和微生物转化赖氨酸偶联来生产尸胺方法，涉及到能分泌表达赖氨酸脱羧酶的高产赖氨酸的重组菌的构建、重组菌发酵生产赖氨酸和重组菌表达赖氨酸脱羧酶转化赖氨酸三个方面。

背景技术

尸胺(Cadaverine)是一种多胺，即1,5-戊二胺(简称戊二胺)，在生物体内由赖氨酸脱羧生成，是广泛存在于生物体中的具有生物活性的含氮碱，但也作为一种肉毒胺存在于腐败物中。尸胺是合成新型材料聚酰胺-54(由尸胺和琥珀酸缩合而成)和聚酰胺-56(由尸胺和乙二酸缩合而成)的重要原料，具有重要的工业用途。

目前合成尸胺的方法有化学合成法和酶转化法。化学合成法条件苛刻、污染环境，酶转化法过程复杂、成本较高。利用基因工程技术构造代谢工程菌来直接规模化制备人类所需产品是最经济、环保和最有前途的方法，是代谢工程研究的方向和热点。

微生物发酵法生产尸胺就是微生物利用糖类进行发酵，通过代谢直接大量合成尸胺，这种方法简单、经济、环保和高效，但要求微生物既能高效合成L-赖氨酸脱羧酶，又能高效合成L-赖氨酸，同时还能将尸胺转运到培养基中，防止尸胺对赖氨酸脱羧酶产生竞争抑制。虽然大肠杆菌、尸杆菌、蜂房哈夫尼菌等可以直接合成尸胺，也对尸胺合成调节进行了广泛研究，但这些菌不能大量合成赖氨酸，尸胺合成量低，不适合直接发酵生产。

专利201180010538.5公布了一种利用微生物转化合成尸胺的方法，它构建了能分泌表达赖氨酸脱羧酶的微生物，在发酵生产赖氨酸脱羧酶，然后向微生物培养基中投入赖氨酸，从而把赖氨酸转化为尸胺。这种方法需要一定纯度的赖氨酸，需要另外的赖氨酸生产和纯化工艺。

专利201410004636.3公布了一种向赖氨酸发酵液中加入赖氨酸脱羧酶的方法来生产尸胺。这种方法虽然不需要纯化赖氨酸，但需要生产和纯化赖氨酸脱羧酶，这是一个非常复杂的工艺过程。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同，本发明具有能高效生产赖氨酸的大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，而且有它们成熟的发酵工艺，该工艺条件下，在10吨生物反应器里发酵，赖氨酸的产量分别达到126g/L和148g/L。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过微生物发酵合成赖氨酸和微生物转化赖氨酸偶联来生产尸胺方法。

本发明实现目的的技术手段如下：

一种利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法，所述方法利用重组工程菌株，通过微生物发酵合成赖氨酸和微生物转化赖氨酸偶联来生产尸胺，所述重组工程菌株含有可诱导型的启动子-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的转录单元。

而且，所述重组工程菌株为高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌或大肠杆菌重组菌。

而且，所述谷氨酸棒杆菌重组菌能够诱导分泌表达赖氨酸脱羧酶基因；或者，所述大肠杆菌重组菌能够诱导分泌表达赖氨酸脱羧酶基因，或者，其自身的赖氨酸脱羧酶基因CadA、LDC和赖氨酸尸胺反向转运蛋白基因CadB以及它们的启动子或它们的表达调控系统被删除，不能进行胞内表达。

而且，所述转录单元以游离的质粒形式存在于重组工程菌株中，或者整合到重组工程菌株的基因组中。

而且，步骤如下：

⑴利用重组菌株发酵来高效生产赖氨酸；

⑵诱导赖氨酸脱羧酶基因进行分泌表达，将赖氨酸转化成尸胺。

根据权利要求5所述的利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法，其特征在于：所述步骤⑴按照赖氨酸发酵的常规生产工艺进行；

或者，所述步骤⑵是在步骤⑴即将结束时，添加诱导剂和/或营养物质，诱导赖氨酸脱羧酶表达至发酵液或周质腔，并将发酵液中的赖氨酸转化成尸胺。

而且，所述诱导剂为IPTG或乳糖；或者，所述营养物质为菌体生长的培养基，或者为有助于赖氨酸脱羧酶转化的辅助因子磷酸吡哆醛、磷酸吡哆醇或磷酸吡哆胺。

而且，所述步骤⑴和步骤⑵在一个生物反应器里进行，或者，所述步骤⑴和步骤⑵在不同的生物反应器里进行。

本发明的优点和积极效果：

本发明方法将微生物发酵合成赖氨酸和微生物转化赖氨酸生成尸胺的过程偶联起来，既不需要纯化赖氨酸，提高了尸胺的产量，也不需要纯化赖氨酸脱羧酶，具有生产工艺简单、时间短、经济、生产效益高等优点，为生产尸胺提供了新途径，具有巨大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。

附图说明

图1为本发明cadB和cadA基因敲除的重组菌株EcoliLYS的PCR鉴定图；其中，1为CadB和CadA基因敲除的重组菌株EcoliLYS；2为没有进行CadB和CadA基因敲除的菌株EcoliLYS；

图2为本发明中构建的含启动子-信号肽-cadA--终止子的转录单元的重组质粒pTrc99a-CgR0040-cadA；

图3为本发明中各菌株的尸胺产量图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域内的常规方法；本发明中所使用的试剂，如无特殊说明，均为本领域内的常用试剂。

本发明所涉及的技术术语的含义：

“尸胺”即1,5-戊二胺。

“重组菌株”指非野生型菌株，包括通过诱变育种、基因工程育种或其它任何方法获得的非野生型菌株。

“基因敲除”指敲除或突变目的基因、目的基因的核糖体结合位点、目的基因的启动子或目的基因的调控基因，使目的基因不能表达或者不能表达成有活性的蛋白质(酶)。

“分泌表达”指表达的赖氨酸脱羧酶被运送到细胞外的培养基/发酵液中，或者是运送大肠杆菌细胞的周质腔中。

“可诱导型的启动子”指通过诱导才能启动基因表达的启动子，诱导可以是添加某种化学物质进行诱导，也可以改变温度进行诱导，例如温敏型的启动子。

“生物反应器”指任何可以提供适合细胞生长繁殖、赖氨酸发酵和微生物转化的容器，可以是试管、摇瓶和发酵罐或其他定制的容器。

“高产赖氨酸的大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌”可以是直接筛选的野生型菌株，也可以是通过赖氨酸代谢途径的改造和或者通过诱变育种获得的重组菌株。

本发明所运用的技术手段：

本发明的出发菌株可以为高产赖氨酸的大肠杆菌EcoliLYS或谷氨酸棒杆菌GluLYS，它们可以通过直接从自然界中筛选获得，也可以通过赖氨酸代谢途径的改造和或者通过诱变育种获得。本发明的分泌表达的赖氨酸脱羧酶基因没有特别的限制，可以来源于大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、鼠伤寒沙门氏菌等，但优选为L-赖氨酸脱羧酶。本发明的启动子必须是可诱导型的启动子，可以是Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、lPL(l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。本发明的信号肽是任意一种可以引导赖氨酸脱羧酶分泌至培养基或周质腔的氨基酸序列，它可以是来自于pET系列质粒上的pelB信号肽，也可以是来源于大肠杆菌的SufI(fts I抑制剂)信号肽，来源于枯草芽孢杆菌的PhoD(磷酸酯酶)、LipA(脂肪酶)和arpE信号肽，来源于谷氨酸棒杆菌R的CgR0079、CgR0120、CgR0124和CgR0040等信号肽。这些基因、启动子和信号肽序列都可以在GenBank、有关质粒图谱和相应的参考文献上查阅到，对于本领域的技术人员而言是公开的。

本发明所进行的分子生物学操作，如PCR、酶切、链接、转化和转化子的筛选等，均按照《分子克隆实验指南》(第三版，黄培堂等译)进行。大肠杆菌的基因敲除所用的质粒pKD3、pKD46和pCP20及其基因敲除方法按照DatsenkoKA等的论文(Proc Natl Acad SciUSA,2000,97(12):6640～6645)进行。文献按照大肠杆菌质粒pTrc99a，谷氨酸棒杆菌质粒pK18mobsacB、微生物培养技术及尸胺的检测等，对于本领域的技术人员而言都是公知的。

一种利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法，该方法利用重组工程菌株，通过微生物发酵合成赖氨酸和微生物转化赖氨酸偶联来生产尸胺。

较优地，所述重组工程菌株为高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。

较优地，所述的高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌，它能够诱导分泌表达赖氨酸脱羧酶基因。

较优地，所述重组工程菌株含有可诱导型的启动子-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的转录单元。

较优地，所述的转录单元可以以游离的质粒形式存在于高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌中，也可以整合到高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌基因组中。

较优地，所述的高产赖氨酸的大肠杆菌重组菌，它自身的赖氨酸脱羧酶基因CadA、LDC和赖氨酸尸胺反向转运蛋白基因CadB以及它们的启动子或它们的表达调控系统被删除，不能进行胞内表达。

较优地，所述的高产赖氨酸的大肠杆菌重组菌，它能够诱导分泌表达赖氨酸脱羧酶基因。

较优地，所述的转录单元可以以游离的质粒形式存在于高产赖氨酸的大肠杆菌中，也可以整合到高产赖氨酸的大肠杆菌基因组中。

较优地，本发明方法的整个生产过程可以分为两个阶段，第一个阶段利用重组菌株发酵来高效生产赖氨酸，第二个阶段诱导赖氨酸脱羧酶基因进行分泌表达，将赖氨酸转化成尸胺。

较优地，所述的第一阶段利用重组菌株发酵来高效生产赖氨酸的方法按照赖氨酸发酵的生产工艺进行。

较优地，所述的第二阶段诱导赖氨酸脱羧酶基因进行分泌表达，将赖氨酸转化成尸胺，是在第一阶段快要结束时，向生物反应器里添加诱导剂和/或营养物质，诱导赖氨酸脱羧酶表达至发酵液或周质腔，并将发酵液中的赖氨酸转化成尸胺。

较优地，向生物反应器里添加诱导剂可以是IPTG，也可以是乳糖。

较优地，向生物反应器里添加的营养物质可以是菌体生长的培养基，也可以有助于赖氨酸脱羧酶转化的辅助因子磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醇，磷酸吡哆胺等。

较优地，偶联的两个阶段可以在一个生物反应器里进行，也可以在不同的生物反应器里进行。

具体地，上述一种利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法，若以高效生产赖氨酸的大肠杆菌为出发菌株，就先敲除出发菌株自身存在的赖氨酸脱羧酶基因cadA、LDC和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因，使它们自身不能进行表达，然后将可诱导型的启动子-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子组成的转录单元转化进去，构建成能分泌表达赖氨酸脱羧酶的高产赖氨酸的大肠杆菌重组菌株。若以高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，将可诱导型的启动子-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子组成的转录单元转化到出发菌株中，也构建成能分泌表达赖氨酸脱羧酶的重组菌株。重组菌株先按赖氨酸的生产工艺来合成赖氨酸，赖氨酸合成快结束时，加入诱导剂、赖氨酸脱羧酶的辅酶，诱导重组菌株由赖氨酸的合成向赖氨酸脱羧酶的分泌表达转变，从而将赖氨酸转化成尸胺。

具体步骤可以如下：

(1)大肠杆菌EcoliLYS的CadA和CadB基因敲除

由于大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶基因CadA和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因CadB以及它们的调控蛋白基因CadC共同组成了一个操纵子CadBA，三个基因是串联在一起的，因此可以一次地进行敲除。基因敲出按照DatsenkoK A等的论文(Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12):6640～6645)进行。根据报道的CadBA操纵子序列和质粒pKD3序列，设计引物CadBFRTF(cagctgatgcatatctcaccgcctttaatttacgcccaggggcaaacaccTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG)和引物CadAFRTR(caggctgtgagggtgttttcatgtgttctccttatgagcaaaaaagggaagTAACGGCTGACATGGGAATTAGC)，其中CadBFRTF引物的5’-端的50nt为CadBA操纵子的5’端的同源臂序列，CadAFRTR引物的5’-端的50nt为CadBA操纵子的3’-端的同源臂序列，两条引物的3’-端为pKD3上的FLP识别位点的FRT序列。以CadBFRTF和CadAFRTR为引物，以质粒pKD3为模板，按照常规的PCR法，扩增出含有CadB和CadA的同源臂、FRT序列及氯霉素抗性基因Cat的片段，将这个片段转化已经含有pKD46的高产赖氨酸的大肠杆菌EcoliLYS感受态细胞。由于pKD46是温敏型质粒并且含有阿拉伯糖诱导的ParaB启动子控制的λRed同源重组系统的Red重组酶基因γ、β和exo，在阿拉伯糖的诱导下表达时可以导致含有同源臂的外源片段和基因组的同源位点之间发生高频率的重组。转化细胞在含有氯霉素的LB平板上培养，筛选出氯霉素抗性的重组体。然后在含有氯霉素抗性的LB平板上于42℃进行2次继代培养，所得菌群在氨苄青霉素的抗性培养基上进行验证，获得了pKD46质粒消除了青霉素敏感菌。用PCR对该菌株上的CadBA操纵子的缺失进行验证，结果如图1所示，cadB和cadA敲除菌扩增得到1000bp左右的片段(泳道1)，而原始菌株扩增得到约4000bp左右的片段(泳道2)，分别与敲除后的青霉素筛选maker和敲除之前cadBA操纵子片段的大小一致，表明基因敲除成功。获得CadB和CadA基因敲除的重组菌株EcoliLYS。

制备该菌株的感受态，将质粒pCP20转化到该感受态细胞，在30℃下用含有50mg/L的氨苄青霉素的LB平板上培养，选择阳性克隆。然后在LB平板上于42℃进行2次继代培养，所得菌群在氨苄青霉素和氯霉素的抗性培养基上进行验证，获得了pCP20质粒消除了青霉素和氯霉素敏感菌。该菌株即为CadB和CadA基因敲除以及不会氯霉素基因的重组菌株EcoliLYSΔCadBA。

(2)大肠杆菌EcoliLYSΔCadBA的ldcC基因敲除

根据报道的ldcC基因序列和质粒pKD3序列，设计引物ldcFRTF(atgaacatcattgccattatgggaccgcatggcgtcttttataaagatgagTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG)和引物ldcFRTR(ttatcccgccatttttaggactcgtacgcggtaaacgccgtcttcgtcctgTAACGGCTGACATGGGAATTAGC)，其中ldcFRTF引物的5’-端的50nt为ldcC基因的5’-端的同源臂序列，ldcFRTR引物的5’-端的50nt为ldcC基因的3’端的同源臂序列，两条引物的3’-端为pKD3上的FLP识别位点的FRT序列。以ldcFRTF和ldcAFRTR为引物，以质粒pKD3为模板，按照常规的PCR法，扩增出含有ldcC基因的同源臂、FRT序列及氯霉素抗性基因Cat的片段，将这个片段转化已经含有pKD46的大肠杆菌重组菌株EcoliLYSΔCadBA感受态细胞。然后按照上述敲除CadB和CadA基因的方法和步骤，获得ldcC基因敲除的重组菌株EcoliLYSΔCadBAΔLdcC。

(3)启动子-信号肽-cadA--终止子转录单元的构建

大肠杆菌质粒pGEX-含有可诱导的Ptac启动子和终止子，因此只需要在该质粒的启动子和终止子之间插入信号肽和cadA基因构建成完整的启动子-信号肽-cadA-终止子的转录单元，而且将该质粒转化大肠杆菌，就能表达赖氨酸脱羧酶。构建的含有该转录单元的质粒不能在谷氨酸棒杆菌中复制，因此只能利用该转录单元插入到谷氨酸棒杆菌的基因组中进行表达。

本发明可以选用任何导致赖氨酸脱羧酶基因分泌的信号肽。在本实施例中，使用用谷氨酸棒杆菌的信号肽序列CgR0040(atggaaaattctaagttattattaattgctgctgtttctactgcttctattttattagcttcttgt)，赖氨酸脱羧酶选用大肠杆菌的CadA。根据该信号肽序列和CadA序列，设计引物CgRF1(gctgctgtttctactgcttctattttattagcttcttgtatgaacgttattgcaatattg)，CgRF2(AGACCatggaaaattctaagttattattaattgctgctgtttctactgcttcta)和CadAR(ccAGATCTttattttttgctttcttctttcaataccttaacg)。先以CgRF1和CadAR为引物，以大肠杆菌基因组DNA为模板，按照常规的PCR方法扩增出含部分信号肽的CadA基因片段；再以该片段为模板，以CgRF2和CadAR为引物，按照常规的PCR方法扩增出含CgR0040信号肽-cadA基因的片段。将该片段用Nco I和Bgl II酶切后，链接到经过Nco I和BamH I(BamH I和Bgl II是同尾酶)酶切后的pTrc99a质粒上，构建出重组质粒pTrc99a-CgR0040-cadA(图2)。该质粒就含有完整的诱导型的启动子pTac--信号肽CgR0040-赖氨酸脱羧酶基因cadA-终止子的转录单元。

(4)启动子-信号肽-cadA--终止子的转录单元转化大肠杆菌重组菌株EcoliLYSΔCadBAΔLdcC

由于构建的含诱导型的启动子pTac--信号肽CgR0040-赖氨酸脱羧酶基因cadA-终止子的转录单元存的重组质粒pTrc99a-CgR0040-cadA可以在大肠杆菌中直接复制，并在IPTG的诱导下分泌表达赖氨酸脱羧酶，所以，用重组质粒pTrc99a-CgR0040-cadA直接转化大肠杆菌重组菌株EcoliLYSΔCadBAΔLdcC，通过在氨苄青霉素筛选，获得含有启动子-信号肽-cadA--终止子的转录单元的大肠杆菌重组菌株EcoliLYSΔCadBAΔLdcC-CadA。

(5)启动子-信号肽-cadA--终止子的转录单元转化谷氨酸棒杆菌GluLYS

由于构建的含诱导型的启动子pTac--信号肽CgR0040-赖氨酸脱羧酶基因cadA-终止子的转录单元存的重组质粒pTrc99a-CgR0040-cadA在谷氨酸棒杆菌中不能复制，所以只能将该质粒中的转录单元插入到谷氨酸棒杆菌的基因组中。本发明选择插入到磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pepck上。同时，由于启动子pTac的诱导表达需要该质粒上的lacIq调节基因的产物，所以需要将lacIq-启动子-信号肽-cadA-终止子作为一个整体插入到pepck位点上。根据这些原则和质粒pK18mobsacB、pepck序列以及限制性内切酶的要求，设计下列引物pck-LF(CCCAAGCTTTTAGTTCGGTAGTTGAGGG)(Hind III)、pck-LR(CTTGTTATTTAGCAGTTCTTATgcggccgCTTCTCCAGATTTTGTGTCATTC)(Not I)、pck-RF(GAATGACACAAAATCTGGAGAAGcggccgcATAAGAACTGCTAAATAACAAG)(Not I)、pck-RR(CGGGATCCTTTCTTCCCGATTCCTTTGACG)(BamHI)、lacIF(aaccgggcggccgcGTGAAACCAGTAACGTTATACG)(Not I)和rrnBR(aaccgggcggccgcGATGCCTGGCAGTTCCCTACTC)(Not I)。以pck-LF/pck-LR和为pck-RF/pck-RR为引物对，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板扩增出pepck的左臂pckL和右臂pckR。再以pck-LF和pck-RR为引物对，以左臂pckL和右臂pckR为模板，通过融合PCR，把左臂pck-L和右臂pck-R链接在一起，形成pck-L-R片段，然后用Hind III和BamH I酶切该片段，并链接到同样酶切的pK18mobsacB上，构建成载体pK18mobsacB-pckL-pckR R。以lacIF和rrnBR为引物对，以pTrc99a-CgR0040-cadA为模板，扩增出lacIq-启动子-信号肽-cadA-终止子rrnB片段，将该片段用Not I酶切后，链接到同样用Not I酶切的pK18mobsacB-pckL-pckR质粒上，构建成重组质粒pK18mobsacB-pckL-lacIq-启动子-信号肽-cadA--终止子rrnB-pckR，简称pK18-pck-cadA。这样含有lacIq调节Ptac启动子表达的启动子-信号肽-cadA-终止子rrnB转录单元就插入到质粒pK18-pck-cadA的pepck基因的左右臂之间。

用pK18-pck-cadA质粒转化谷氨酸棒杆菌GluLYS，并通过菌落PCR筛选出阳性克隆。把筛选出的阳性克隆接种到至蔗糖平板(质量百分数10％蔗糖的LB培养基)，长出菌落后分别接种到含有卡那霉素和不含有卡那霉素的LB平板上。含有卡那霉素的LB平板上不生长而不含有卡那霉素的LB平板上生长的菌落即为可能的lacIq-启动子-信号肽-cadA-终止子rrnB片段插入到pepck基因位点的重组菌株，然后再进行菌落PCR验证，若扩增出目的片段大小的条带，即为含有lacIq-启动子-信号肽-cadA-终止子rrnB转录片段的重组谷氨酸棒杆菌株GluLYS pepck::lacIq-Ptac-CgR0040-cadA-rrnB，命名为GluLYS-cadA。

(6)微生物发酵生产赖氨酸和微生物转化赖氨酸偶联生产尸胺

大肠杆菌EcoliLYS和EcoliLYSΔCadBAΔLdcC-CadA以及谷氨酸棒杆菌GluLYS和GluLYS-cadA的种子培养基为LB培养基(蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，氯化钠：1g/L，pH7.2)。发酵培养基为：甘油120g/L，硫酸铵50g/L，豆饼水解液30g/L，KH₂PO₄·3H₂O4.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.015g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 0.015g/L，生物素0.0005g/L，硫胺素盐酸盐0.007g/L，pH7.2。种子培养在1L的摇瓶中进行，发酵在5L的发酵罐中进行。

种子培养10-12h后，按照10％的接种量接种到装有3.5L发酵培养基的5L发酵罐中，培养22h，然后开始流加补料，按照10mL/h的速度流加发酵培养基，继续培养10h，检测赖氨酸的产量，EcoliLYS、EcoliLYSΔCadBAΔLdcC-CadA、GluLYS和GluLYS-cadA的赖氨酸的产量分别约为118.1g/L、132.5g、140.3g/L和146.8g/L。

发酵32后，一次性加入诱导培养基(乳糖100g/L，酵母膏5g/L，磷酸吡哆醛0.005g/L)400mL，继续诱导培养10h，诱导赖氨酸脱羧酶的表达和在赖氨酸脱羧酶的催化作用下，将赖氨酸转化成尸胺。同时流加50％的硫酸，维持pH在7左右。10h后，检测发酵液中的尸胺的产量，结果如图3所示。

由图3可知，大肠杆菌EcoliLYS的尸胺产量明显比大肠杆菌重组菌株EcoliLYSΔCadBAΔLdcC-CadA的尸胺产量偏低，可能的原因是EcoliLYS菌株中的赖氨酸脱羧酶基因cadA、ldcC和赖氨酸尸胺转运蛋白基因cadB没有被敲除，在前期的赖氨酸发酵过程中这些基因就会在细胞内表达，同时在细胞内合成尸胺，细胞内大量合成尸胺不仅会抑制细胞的生长和赖氨酸的合成，也会影响后期诱导时的赖氨酸脱羧酶的分泌表达，从而严重影响赖氨酸的转化和尸胺的产量。谷氨酸棒杆菌GluLYS和GluLYS-cadA合成赖氨酸的产量区别不大，但由于GluLYS本身并没有赖氨酸脱羧酶基因，所以不能将赖氨酸转化成尸胺。当GluLYS的基因组中插入启动子-信号肽-cadA--终止子的转录单元构建成GluLYS-cadA重组菌株后，由于诱导赖氨酸脱羧酶基因的分泌表达，所以合成的赖氨酸几乎全部被转化成尸胺，各菌株的赖氨酸转化率如表1。

表1：赖氨酸转化率表

*：负值是因为GluLYS菌株没有赖氨酸脱羧酶，不仅不能转化赖氨酸，而且在诱导过程中还有赖氨酸的合成。

因此，微生物发酵生产赖氨酸和微生物转化赖氨酸偶联生产尸胺不仅尸胺的产量高，而且生产过程简单、时间短，成本低。

Claims (3)

1.一种利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法，其特征在于：所述方法利用重组工程菌株，通过微生物发酵合成赖氨酸和微生物转化赖氨酸偶联来生产尸胺，所述重组工程菌株含有可诱导型的启动子-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的转录单元；

所述重组工程菌株为高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌株或大肠杆菌重组菌株；

所述谷氨酸棒杆菌重组菌能够诱导分泌表达赖氨酸脱羧酶基因；或者，所述大肠杆菌重组菌能够诱导分泌表达赖氨酸脱羧酶基因，并且其自身的赖氨酸脱羧酶基因CadA、LDC和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因CadB以及它们的启动子或它们的表达调控系统被删除，不能进行胞内表达；

所述重组工程菌株含有可诱导型的启动子-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的转录单元中所采用的信号肽，是有效引导赖氨酸脱羧酶分泌到细胞周质腔或培养基中的信号肽：所述信号肽为pET系列质粒上的pelB信号肽；或者为来源于大肠杆菌的SufI信号肽；或者为来源于枯草芽孢杆菌的磷酸酯酶PhoD、脂肪酶LipA和蛋白酶arpE的信号肽；或者为来源于谷氨酸棒杆菌R的CgR0079、CgR0120、CgR0124或CgR0040的信号肽；

所述转录单元以游离的质粒形式存在于重组工程菌株中，或者整合到重组工程菌株的基因组中；

所述利用微生物发酵合成赖氨酸和微生物转化赖氨酸偶联来生产尸胺的方法，其步骤如下：

⑴按照赖氨酸发酵的常规生产工艺，利用重组菌株发酵来高效生产赖氨酸；

⑵在赖氨酸发酵生产工艺即步骤⑴即将结束时，开始添加诱导剂和营养物质，诱导赖氨酸脱羧酶基因的分泌表达，并将发酵液中的赖氨酸转化成尸胺。

2.根据权利要求1所述的利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法，其特征在于：所述诱导剂为IPTG或乳糖；所述营养物质为含有有助于赖氨酸脱羧酶转化的辅助因子磷酸吡哆醛、磷酸吡哆醇或磷酸吡哆胺的菌体生长培养基。

3.根据权利要求1所述的利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法，其特征在于：所述步骤⑴和步骤⑵在一个生物反应器里进行，或者，所述步骤⑴和步骤⑵在不同的生物反应器里进行。

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