JP7190322B2 - 組換え細胞およびペンタメチレンジアミンの生産方法 - Google Patents
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Description
特許文献2: 特開2001-120292号公報
特許文献3: WO2015/155791号パンフレット
非特許文献2: Irla,M. et al.,Genome-based genetic tool development for Bacillus methanolicus: theta- and rolling circle-replicating plasmids for inducible gene expression and application to methanol-based cadaverine production.,Front.Microbiol.,Vol.7,1481(2016)
非特許文献3: Brautaset et al.,Bacillus methanolicus: a candidate for industrial production of amino acids from methanol at 50℃.,Appl. Microbiol. Biotechnol.,Vol. 74(2007)
非特許文献4: Kalyuzhnaya,M.G. et al.,Metabolic engineering in methanotrophic bacteria.,Metab.Eng.,Vol.29,142-152(2015)
非特許文献5: Lee,O.K. et al.,Metabolic engineering of methanotrophs and its application to production of chemicals and biofuels from methane.,Biofuels, Bioprod. Bioref.,Vol. 10,6(2016)
非特許文献6: Henard,C.A. et al.,Biological conversion of methane to lactate by an obligate methanotrophic bacterium.,Sci.Rep.,Vol.6,21585(2016)
(1)ペンタメチレンジアミン生産のための酵素をコードする遺伝子を含有する組換えメタン資化性菌であって、当該酵素の発現が誘導されることによって、当該酵素を欠いているメタン資化性菌と比較して、ペンタメチレンジアミンの生産増加をもたらすことを特徴とする、組換えメタン資化性菌;
(2)前記酵素は、誘導剤の添加により、その発現が誘導されることを特徴とする、上記(1)のメタン資化性菌;
(3)前記酵素の発現が、テオフィリンの添加によって誘導されることを特徴とする、上記(1)または(2)のメタン資化性菌;
(4)前記ペンタメチレンジアミン生産のための酵素は、L-リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする、上記(1)~(3)いずれかのメタン資化性菌;
(5)前記L-リジン脱炭酸酵素は、Escherichia coliのCadAおよびLdc、Aliivibrio salmonicidaのCadA、並びにKlebsiella pneumoniaeのCadAからなる群より選択されるいずれか一種以上であることを特徴とする、上記(4)のメタン資化性菌;
(6)前記ペンタメチレンジアミン生産のための酵素は、アスパラギン酸キナーゼ(LysC)、ジヒドロジピコリン酸合成酵素(DapA)、meso-ジアミノピメリン酸脱水素酵素(DDH)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素(LysA)、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)、トランスヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspC)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)、およびピルビン酸カルボキシラーゼ(PYC)からなる群より選択されるいずれか1種以上である、上記(1)~(5)いずれかのメタン資化性菌;
(7)前記LysC、DapA、PEPC、PYCは、フィードバック阻害が解除された変異型酵素であることを特徴とする、上記(6)のメタン資化性菌;
(8)前記GAPDHが、NADPH依存性であることを特徴とする、上記(6)のメタン資化性菌;
(9)前記GAPDHは、対応する野生型酵素と比較して、NADPHに対する親和性が向上した変異型酵素であることを特徴とする、上記(8)のメタン資化性菌;
(10)前記酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも1つが、宿主微生物の染色体上に組み込まれていることを特徴とする、上記(1)~(9)いずれかのメタン資化性菌;
(11)前記酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも1つが、該遺伝子を含むベクターとして宿主微生物に導入されていることを特徴とする、上記(1)~(9)いずれかのメタン資化性菌;
(12)前記宿主微生物は、メチロモナス(Methylomonas)、メチロバクター(Methylobacter)、メチロコッカス(Methylococcus)、メチロサイナス(Methylosinus)、メチロシスチス(Methylocystis)、メチロマイクロビウム(Methylomicrobium)、メチロアシドフィラム(Methyloacidophilum)、からなる群から選択されることを特徴とする、上記(1)~(11)いずれかのメタン資化性菌;
(13)前記宿主微生物が、Methylococcus capsulatus Bath(NCIMB 11132)であることを特徴とする、上記(12)のメタン資化性菌;
(14)上記(1)~(13)いずれかのメタン資化性菌にメタンを接触させ、当該微生物の生育に適した条件下で培養することによりペンタメチレンジアミンを生産させることを特徴とする、ペンタメチレンジアミンの生産方法。
組成は次のとおりである:20g/L LB培地、レノックス(ディフコ社製)。
[120℃、20分間蒸気滅菌を行った。必要に応じて、終濃度50mg/L カナマイシン硫酸塩、1.5% Bacto agar(ディフコ社製)を加えた。]
組成は次のとおりである:0.8mM MgSO4・7H2O、10mM NaNO3、0.14mM CaCl2、1.2mM NaHCO3、2.35mM KH2PO4、3.4mM K2HPO4、20.7μM Na2MoO4・2H2O、1μM CuSO4・5H2O、10μM FeIII-Na-EDTA、1mL trace metal solution(500mg/L FeSO4・7H2O、400mg/L ZnSO4・7H2O、20mg/L MnCl2・7H2O、50mg/L CoCl2・6H2O、10mg/L NiCl2・6H2O、15mg/L H3BO3、250mg/L EDTA)
[必要に応じて、7.5~10mg/L カナマイシン硫酸塩、25mg/L ナリジクス酸、1.5% Bacto agarも加えた。また、Phosphate、bicarbonate、CuSO4・5H2O、FeIII-Na-EDTA、NaHCO3は、120℃、20分間蒸気滅菌後、添加した。]
プラスミド構築に必要な核酸断片のPCR増幅には、Phusion polymerase(New England BioLabs社製)を用いた。プラスミド構築には、In-Fusion HD Cloningキット(Clontech社製)を用いた。広域宿主ベクターであるpBHR1(MoBiTec社製)へリボスイッチとtrcプロモーターのハイブリッド(Ptrc E*)、sfGFP遺伝子をクローニングすることによりpmk61Aを構築した。Ptrc E*およびsfGFPは、Genscript社により合成された。まず、Ptrc E*断片をmk316およびmk173Rにより増幅した。次に、sfGFP断片をmk176およびmk317Rにより増幅した。最後に、ベクター骨格をmk318およびmk319Rにより増幅した。これらの3つの断片をIn-Fusion HD Cloningキットにより連結し、pmk61Aを有するE.coli XL1-Blue(ニッポン・ジーン社製)のクローンを得た。プラスミドDNAを細胞から抽出・精製後、シーケンス解析により、pmk61Aが正しく得られていることを確認した。図1にpmk61Aの概要を示す。また、上記配列を以下に示す。
pmk61Aは、Aliらにより報告された接合伝達を用いた形質転換法により、Methylococcus capsulatus Bathへ導入した(Ali et al.,Microbiology,Vol.152 , 2931-2942(2009))。
形質転換体コロニーを、10mg/Lカナマイシンおよび0、0.1、2、5、7.5または10mMいずれかの濃度のテオフィリンを加えたNMS培地10mLを含んだ130mL容の血清ボトルへ植菌した。また、コントロールとして、野生株をテオフィリンを含まない同培地へ植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、60mLのボトル内空気を同体積の10%メタン/90%窒素の混合ガスと交換した。ボトルは、43℃で24時間培養した。培養液を新鮮なNMS培地で10倍希釈し、蛍光強度(Ex:488nm、Em:530nm)を蛍光プレートリーダー(infinite200Pro、Tecan社製)で測定した。蛍光強度値はそれぞれのOD600で割った後、野生株(ブランク)におけるそれから差し引いた。図2に結果を示す。非誘導時の蛍光は検出されず、テオフィリン濃度依存的に良好な発現誘導を示し、発現量の調整に最適なシステムであることがわかった(図2)。
L-リジン脱炭酸酵素をコードするcadA遺伝子をpmk61Aへクローニングすることによりpmk96およびpmk99を構築した(図3)。Kouらの報告をもとに、Aliivibrio salmonicida由来のcadAは、Genscript社により合成された(Kou et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, Vol. 133, 88-94 (2016))。さらに、メタン資化性菌で発現するL-リジン脱炭酸酵素として最適なものを選抜するために、Escherichia coliおよびKlebsiella pneumoniaeのL-リジン脱炭酸酵素をコードするcadA遺伝子をpmk61Aへクローニングすることによりpmk127およびpmk167を構築した(図3)。
実施例1に記載の方法と同様に、pmk96、99、127、および167のMethylococcus capsulatus Bathへの導入を接合伝達によりそれぞれ試みた。コロニーが得られた場合は、PCRによりプラスミドの存在を確認した。
pmk99、pmk127、およびpmk167のそれぞれの導入が確認された形質転換体コロニーを、10mg/Lカナマイシンおよび5mMテオフィリンを含むNMS培地10mLを含んだ130mL容の血清ボトルへ、OD600=0.2となるように植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、60mLのボトル内空気を同体積の10%メタン/90%窒素の混合ガスと交換した。ボトルは、43℃で振盪培養し、24時間ごとに1mLの培養液を回収し、ペンタメチレンジアミン濃度とOD600の定量に用い、上記と同様にボトル内空気を同体積の10%メタン/90%窒素の混合ガスと交換することで培養を継続した。OD600は、NanoDrop 2000c(Thermo Fisher Scientific社製)により600nmにおける吸光度を光路長10mmの条件でNMS培地をブランクとして測定した。ペンタメチレンジアミン濃度の定量には、回収した培養液を遠心分離することで得られる上清を8mMメタンスルホン酸(MSA)で4倍希釈したものを用いた。この希釈液をDionex IonPac CS19(内径2mm、長さ250mm)カラムを装着したDIONEX ICS-3000を用いてカチオンモードで分析した。流速を0.35mL/min、カラム恒温槽を30℃、検出器電流は72mAとし、8mM MSAと70mM MSAを移動相としたグラジエント溶出により分析した。ペンタメチレンジアミン濃度は絶対定量法により求めた。図4a、bに結果を示す。いずれの微生物種由来のcadAを発現した場合にも、細胞増殖、ペンタメチレンジアミン生産ともに同等であり、48時間で29~35mg/Lが生産された(図4a、b)。また、Methylococcus capsulatus Bathの野生株を同一条件にて培養した場合、ペンタメチレンジアミン濃度は検出下限以下であった。すなわち、Methylococcus capsulatus Bathは、生来ペンタメチレンジアミンを生産する能力を有しておらず、L-リジン脱炭酸酵素の発現によってペンタメチレンジアミンの生産増加がもたらされることが明らかとなった。
フィードバック阻害を解除したアスパラギン酸キナーゼ変異体(lysCT352I)およびジヒドロジピコリン酸合成酵素変異体(dapAE84T)の遺伝子をpmk99およびpmk127へクローニングすることによりpmk141およびpmk142を構築した(図3)。
実施例1と同様の方法で、pmk127、およびpmk142を導入して得られた形質転換体コロニーを、10mg/Lカナマイシンおよび5mM テオフィリンを含むNMS培地10mLを含んだ130mL容の血清ボトルへ、OD600=0.2となるように植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、60mLのボトル内空気を同体積の10%メタン/90%窒素の混合ガスと交換した。ボトルは、43℃で振盪培養した。24時間ごとに1mLの培養液を回収し、ペンタメチレンジアミン濃度とOD600の定量に用い、上記と同様にボトル内空気を同体積の10%メタン/90%窒素の混合ガスと交換することで培養を継続した。OD600は、NanoDrop 2000c(Thermo Fisher Scientific社製)により600nmにおける吸光度を光路長10mmの条件でNMS培地をブランクとして測定した。ペンタメチレンジアミン濃度の定量には、回収した培養液を遠心分離することで得られる上清を8mMメタンスルホン酸(MSA)で4倍希釈したものを用いた。この希釈液をDionex IonPac CS19(内径2mm、長さ250mm)カラムを装着したDIONEX ICS-3000を用いてカチオンモードで分析した。流速を0.35mL/min、カラム恒温槽を30℃、検出器電流は72mAとし、8mM MSAと70mM MSAを移動相としたグラジエント溶出により分析した。ペンタメチレンジアミン濃度は絶対定量法により求めた。図5a、bに結果を示す。アスパラギン酸キナーゼおよびジヒドロジピコリン酸合成酵素の発現に伴い、ペンタメチレンジアミンの生産濃度は向上しなかったが、細胞増殖は著しく低下した(図5a、b)。生産効率は、52mg/L/ODから103mg/L/ODと約2倍の改善を示した。すなわち、L-リジン生合成酵素(アスパラギン酸キナーゼおよびジヒドロジピコリン酸合成酵素)の発現によって、メタンからペンタメチレンジアミンの生産効率を著しく向上できることが明らかとなった。
pmk141、およびpmk142を導入して得られた形質転換体コロニーを、10mg/Lカナマイシンを含むNMS培地10mLを含んだ130mL容の血清ボトルへ、OD600=0.15となるように植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、60mLのボトル内空気を同体積の10%メタン/90%窒素の混合ガスと交換した。37℃で6時間振盪培養した後、5mM テオフィリンを添加することで発現誘導を行った。その後、24時間ごとに1mLの培養液を回収し、ペンタメチレンジアミン濃度とOD600の定量に用い、上記と同様にボトル内空気を同体積の10%メタン/90%窒素の混合ガスと交換することで培養を継続した。OD600は、NanoDrop 2000c(Thermo Fisher Scientific社製)により600nmにおける吸光度を光路長10mmの条件でNMS培地をブランクとして測定した。ペンタメチレンジアミン濃度の定量には、回収した培養液を遠心分離することで得られる上清を8mMメタンスルホン酸(MSA)で4倍希釈したものを用いた。この希釈液をDionex IonPac CS19(内径2mm、長さ250mm)カラムを装着したDIONEX ICS-3000を用いてカチオンモードで分析した。流速を0.35mL/min、カラム恒温槽を30℃、検出器電流は72mAとし、8mM MSAと70mM MSAを移動相としたグラジエント溶出により分析した。ペンタメチレンジアミン濃度は絶対定量法により求めた。図6a~cに結果を示す。pmk141およびpmk142いずれのプラスミドの形質転換体においても、73mg/L/OD、96mg/L/ODと高い生産効率を示し、pmk141の形質転換体により124mg/Lものペンタメチレンジアミンの生産が見られた(図6b)。ここで得られた生産効率は、メタンからの生物的な物質生産において過去に前例のない水準を有するものであった(図6c)。
実施例3と同様の方法で、pmk142を導入して得られた形質転換体コロニーを、10mg/Lカナマイシンを含むNMS培地10mLを含んだ130mL容の血清ボトルへ、OD600=0.15となるように植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、60mLのボトル内空気を同体積の10%メタン/90%窒素の混合ガスと交換した。37℃で6時間振盪培養した後、0、0.5、2、5、7.5mM テオフィリンをそれぞれ添加することで発現誘導を行った。その後、24時間ごとに1mLの培養液を回収し、ペンタメチレンジアミン濃度とOD600の定量に用い、上記と同様にボトル内空気を同体積の10%メタン/90%窒素の混合ガスと交換することで培養を継続した。OD600は、NanoDrop 2000c(Thermo Fisher Scientific社製)により600nmにおける吸光度を光路長10mmの条件でNMS培地をブランクとして測定した。ペンタメチレンジアミン濃度の定量は、実施例3と同様に行った。図7に結果を示す。0.5mMテオフィリン添加時にはペンタメチレンジアミンは検出されなかったが、2mMからテオフィリン濃度依存的にペンタメチレンジアミンの生産濃度が上昇した。また、5mM以上のテオフィリンを添加すると、過去に前例のない生産効率を示した。すなわち、ペンタメチレンジアミン生産に必要な酵素を高いレベルで発現できるよう調節・最適化することが、高い生産効率を得るために本質的であることを示した。
[実施例5]通気攪拌培養でのMethylococcus capsulatus Bathによるペンタメチレンジアミン生産
メタンガスの連続通気攪拌による培養は、1Lの微生物培養装置BMJ-01P1(エイブル株式会社製)を用いて実施した。10mg/Lのカナマイシンを含む500mLのNMS1.0培地に、実施例3および実施例4と同様の方法にて培養したペンタメチレンジアミン生産株(pmk142プラスミドが導入されたMethylococcus capsulatus Bath)をOD600=0.1となるように懸濁し、培養開始時間とした。培養温度は43℃、攪拌速度は750rpmにて実施し、混合ガス(5%メタン、45%窒素、50%空気)は200ml/minにて吹き込んだ。培養液のpHは常時pH7.0を維持するよう1N硝酸にて都度調整した。培養開始16時間後、50ml培地を除去し、46mMテオフィリンを含むNMS培地50mlを添加して誘導を開始した。また、培養開始20時間後は、消泡剤ADEKA NOL LG-109(ADEKA) 50mgを培養中に加えた。排ガスは分離カラムとしてSHINCARBON ST(信和化工株式会社製)を設置した、TCD検出器を有するガスクロマトグラフィー(GC-2014T;株式会社島津製作所製)にて分析し、メタン消費、および酸素消費のモニタリングを行った。
所定の時間で1mlサンプリングをし、OD600の測定、ペンタメチレンジアミン濃度の定量を、実施例3および実施例4と同様に行った。培養開始後41時間では25mlの培地を除去し、20倍に濃縮したNMS培地25mlを追加成分として添加した。
図8に結果を示す。64時間培養時に、91mg/L/ODと実施例3で示した結果と同等の高い生産効率を示し、かつ182mg/Lのペンタメチレンジアミンの高い生産が見られ、通気培養においても高い生産効率を実現できることが示された。
本明細書に記載したプラスミドpmk61Aは寄託番号NITE P-02625として、プラスミドpmk96は寄託番号NITE P-02626として、およびプラスミドpmk99は寄託番号NITE P-02627として、日本国独立行政法人製品評価技術基盤機構に2018年2月1日付けで寄託されている。
Claims (13)
- ペンタメチレンジアミン生産のための酵素をコードする遺伝子を含有する組換えメタン資化性菌であって、
当該ペンタメチレンジアミン生産のための酵素が、L-リジン脱炭酸酵素を含み、
当該酵素の発現がリボスイッチにより誘導されることによって、当該酵素を欠いているメタン資化性菌と比較して、ペンタメチレンジアミンの生産増加をもたらすことを特徴とする、組換えメタン資化性菌。 - 前記酵素は、誘導剤の添加により、その発現が誘導されることを特徴とする、請求項1に記載のメタン資化性菌。
- 前記リボスイッチは、テオフィリン応答性リボスイッチであることを特徴とする、請求項1または2に記載のメタン資化性菌。
- 前記L-リジン脱炭酸酵素は、Escherichia coliのCadAおよびLdc、Aliivibrio salmonicidaのCadA、並びにKlebsiella pneumoniaeのCadAからなる群より選択されるいずれか一種以上であることを特徴とする、請求項3に記載のメタン資化性菌。
- 前記ペンタメチレンジアミン生産のための酵素は、アスパラギン酸キナーゼ(LysC)、ジヒドロジピコリン酸合成酵素(DapA)、meso-ジアミノピメリン酸脱水素酵素(DDH)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素(LysA)、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)、トランスヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspC)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)、およびピルビン酸カルボキシラーゼ(PYC)からなる群より選択されるいずれか1種以上をさらに含む、請求項1~4のいずれかに記載のメタン資化性菌。
- 前記LysC、DapA、PEPC、PYCは、フィードバック阻害が解除された変異型酵素であることを特徴とする、請求項5に記載のメタン資化性菌。
- 前記GAPDHが、NADPH依存性であることを特徴とする、請求項5に記載のメタン資化性菌。
- 前記GAPDHは、対応する野生型酵素と比較して、NADPHに対する親和性が向上した変異型酵素であることを特徴とする、請求項7に記載のメタン資化性菌。
- 前記酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも1つが、宿主微生物の染色体上に組み込まれていることを特徴とする、請求項1~8のいずれかに記載のメタン資化性菌。
- 前記酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも1つが、該遺伝子を含むベクターとして宿主微生物に導入されていることを特徴とする、請求項1~8のいずれかに記載のメタン資化性菌。
- 前記宿主微生物は、メチロモナス(Methylomonas)、メチロバクター(Methylobacter)、メチロコッカス(Methylococcus)、メチロサイナス(Methylosinus)、メチロシスチス(Methylocystis)、メチロマイクロビウム(Methylomicrobium)、メチロアシドフィラム(Methyloacidophilum)、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項9または10に記載のメタン資化性菌。
- 前記宿主微生物が、Methylococcus capsulatus Bath(NCIMB 11132)であることを特徴とする、請求項11に記載のメタン資化性菌。
- 請求項1~12のいずれかに記載のメタン資化性菌にメタンを接触させ、当該微生物の生育に適した条件下で培養することによりペンタメチレンジアミンを生産させることを特徴とする、ペンタメチレンジアミンの生産方法。
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