JP2001120292A - 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 医薬、飼料、食品などに有用なＬ−アミノ酸
を、メタンを主炭素源として製造する方法を提供する。 【解決手段】 メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ
酸生産能を有する微生物、例えばメチロモナス・アルバ
ス、メチロコッカス・カプスラツスまたはメチロシナス
・トリコスポリウム等のメタン資化性菌の系統的分類に
おいてタイプＩ、タイプＸまたはタイプIIに属する細菌
を、メタンを主たる炭素源として用いて培養し、培養物
中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物からＬ−ア
ミノ酸を採取する。
を、メタンを主炭素源として製造する方法を提供する。 【解決手段】 メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ
酸生産能を有する微生物、例えばメチロモナス・アルバ
ス、メチロコッカス・カプスラツスまたはメチロシナス
・トリコスポリウム等のメタン資化性菌の系統的分類に
おいてタイプＩ、タイプＸまたはタイプIIに属する細菌
を、メタンを主たる炭素源として用いて培養し、培養物
中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物からＬ−ア
ミノ酸を採取する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、医薬、飼料、食品
などに広く利用されているＬ−アミノ酸の発酵法による
製造法に関する。
などに広く利用されているＬ−アミノ酸の発酵法による
製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖を炭素源として微生物によりＬ−アミ
ノ酸を製造する方法としては、ブレビバクテリウム属の
微生物を用いる方法（特公昭５１−１９１８６号公
報）、エシェリヒア属の微生物を用いる方法(特願平７
−５１６０８７号公報)などが知られている。また、メ
タノールを炭素源として微生物によりＬ−アミノ酸を製
造する方法としては、アクロモバクター属およびシュー
ドモナス属の微生物を用いる方法（特公昭４５−２５２
７３号公報）などが知られている。しかし、メタンを炭
素源として微生物によりＬ−アミノ酸を製造した例は知
られていない。
ノ酸を製造する方法としては、ブレビバクテリウム属の
微生物を用いる方法（特公昭５１−１９１８６号公
報）、エシェリヒア属の微生物を用いる方法(特願平７
−５１６０８７号公報)などが知られている。また、メ
タノールを炭素源として微生物によりＬ−アミノ酸を製
造する方法としては、アクロモバクター属およびシュー
ドモナス属の微生物を用いる方法（特公昭４５−２５２
７３号公報）などが知られている。しかし、メタンを炭
素源として微生物によりＬ−アミノ酸を製造した例は知
られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、医
薬、飼料、食品などに有用なＬ−アミノ酸を、メタンを
主炭素源として製造する方法を提供することにある。
薬、飼料、食品などに有用なＬ−アミノ酸を、メタンを
主炭素源として製造する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、メタン資化
性菌、特にその系統的分類においてタイプＩ、タイプＸ
またはタイプIIに属する細菌が、メタンを主炭素源とし
てＬ−アミノ酸を生産し得ることを見い出し、本発明を
完成するに至った。すなわち本発明は、以下のとおりで
ある。
性菌、特にその系統的分類においてタイプＩ、タイプＸ
またはタイプIIに属する細菌が、メタンを主炭素源とし
てＬ−アミノ酸を生産し得ることを見い出し、本発明を
完成するに至った。すなわち本発明は、以下のとおりで
ある。
【０００５】（１）メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−ア
ミノ酸生産能を有する微生物を、メタンを主たる炭素源
として、メタンを含む気体と接する培地で培養し、培地
中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培地からＬ−アミ
ノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方
法。 （２）メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能
を有する微生物が、メタン資化性菌の系統的分類におい
てタイプＩ、タイプＸまたはタイプIIに属する（１）の
Ｌ−アミノ酸の製造方法。 （３）タイプＩ、タイプＸまたはタイプIIに属するメタ
ン資化性菌が、それぞれメチロモナス属、メチロコッカ
ス属またはメチロシナス属に属する細菌である（２）の
Ｌ−アミノ酸の製造方法。 （４）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレ
オニン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリ
ン、Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ
−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロ
イシン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニールアラニン、Ｌ−
リジン、Ｌ−ヒスチジン及びＬ−アルギニンから選ばれ
る（１）のＬ−アミノ酸の製造法。 （５）メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能
を有する微生物が野生株である（１）のＬ−アミノ酸の
製造方法。
ミノ酸生産能を有する微生物を、メタンを主たる炭素源
として、メタンを含む気体と接する培地で培養し、培地
中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培地からＬ−アミ
ノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方
法。 （２）メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能
を有する微生物が、メタン資化性菌の系統的分類におい
てタイプＩ、タイプＸまたはタイプIIに属する（１）の
Ｌ−アミノ酸の製造方法。 （３）タイプＩ、タイプＸまたはタイプIIに属するメタ
ン資化性菌が、それぞれメチロモナス属、メチロコッカ
ス属またはメチロシナス属に属する細菌である（２）の
Ｌ−アミノ酸の製造方法。 （４）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレ
オニン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリ
ン、Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ
−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロ
イシン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニールアラニン、Ｌ−
リジン、Ｌ−ヒスチジン及びＬ−アルギニンから選ばれ
る（１）のＬ−アミノ酸の製造法。 （５）メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能
を有する微生物が野生株である（１）のＬ−アミノ酸の
製造方法。
【０００６】（６）メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−ア
ミノ酸生産能を有する微生物がＬ−アミノ酸またはその
アナログに耐性を有する（１）のＬ−アミノ酸の製造方
法。 （７）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、そのアナ
ログがＳ−（２−アミノエチル）−システインである
（６）のＬ−アミノ酸の製造方法。 （８）メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能
を有する微生物は、少なくとも１つのＬ−アミノ酸の生
合成酵素の活性が増強された変異株又は組換え体である
（１）のＬ−アミノ酸の製造方法。 （９）メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能
を有する微生物は、少なくとも１つのＬ−アミノ酸の生
合成酵素の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片
と、ベクターＤＮＡとを含む組換え体ベクターを保有す
る形質転換体である（８）のＬ−アミノ酸の製造方法。 （１０）Ｌ−アミノ酸の生合成酵素が、Ｌ−リジンによ
るフィードバック阻害が解除された変異型ジヒドロジピ
コリン酸合成酵素、Ｌ−リジンによるフィードバック阻
害が解除された変異型アスパルトキナーゼ、ジヒドロジ
ピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロ
ゲナーゼから選ばれる１種又は２種以上である（８）又
は（９）のＬ−アミノ酸の製造方法。
ミノ酸生産能を有する微生物がＬ−アミノ酸またはその
アナログに耐性を有する（１）のＬ−アミノ酸の製造方
法。 （７）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、そのアナ
ログがＳ−（２−アミノエチル）−システインである
（６）のＬ−アミノ酸の製造方法。 （８）メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能
を有する微生物は、少なくとも１つのＬ−アミノ酸の生
合成酵素の活性が増強された変異株又は組換え体である
（１）のＬ−アミノ酸の製造方法。 （９）メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能
を有する微生物は、少なくとも１つのＬ−アミノ酸の生
合成酵素の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片
と、ベクターＤＮＡとを含む組換え体ベクターを保有す
る形質転換体である（８）のＬ−アミノ酸の製造方法。 （１０）Ｌ−アミノ酸の生合成酵素が、Ｌ−リジンによ
るフィードバック阻害が解除された変異型ジヒドロジピ
コリン酸合成酵素、Ｌ−リジンによるフィードバック阻
害が解除された変異型アスパルトキナーゼ、ジヒドロジ
ピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロ
ゲナーゼから選ばれる１種又は２種以上である（８）又
は（９）のＬ−アミノ酸の製造方法。
【０００７】（１１）メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−
アミノ酸生産能を有する微生物であって、Ｌ−アミノ酸
またはそのアナログに耐性を有する変異株。 （１２）メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産
能を有する微生物であって、少なくとも１つのＬ−アミ
ノ酸の生合成酵素の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａ断片と、ベクターＤＮＡとを含む組換え体ベクターを
保有する形質転換体。
アミノ酸生産能を有する微生物であって、Ｌ−アミノ酸
またはそのアナログに耐性を有する変異株。 （１２）メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産
能を有する微生物であって、少なくとも１つのＬ−アミ
ノ酸の生合成酵素の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａ断片と、ベクターＤＮＡとを含む組換え体ベクターを
保有する形質転換体。
【０００８】尚、本発明において、「Ｌ−アミノ酸生産
能」とは、本発明に用いる微生物を培地に培養したとき
に、同培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積する能力をい
う。
能」とは、本発明に用いる微生物を培地に培養したとき
に、同培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積する能力をい
う。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明のＬ−アミノ酸の製造法に用いる微生物は、
メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能を有す
る微生物である。
る。本発明のＬ−アミノ酸の製造法に用いる微生物は、
メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能を有す
る微生物である。
【００１０】メタン資化能を有する微生物としては、Ｌ
−アミノ酸生産能を元来有するか、又は、Ｌ−アミノ酸
生産能を付与され得る微生物であれば特に制限されない
が、具体的には、メタン資化性菌の系統的分類において
タイプＩ、タイプＸまたはタイプIIに属する微生物が挙
げられる。命名法によるメタン資化性細菌の分類は確立
されているとはいえないのが現状であり、主要炭素源同
化経路、膜形状、独立栄養的炭酸固定能により大きく３
つのタイプに分類されている（Peter N. Green, "Taxon
omy of Methylotrophic Bacteria" in Methane and Met
hanol Utilizers, Edited by J. Colin Murrell and Ho
ward Dalton, p.25-27, p48-49, PlenumPublishing Cor
poration, 233 Spring Street, New York, New York 10
013-1578, USA）。本発明者は、これらの３つのタイ
プ、すなわちタイプＩ、タイプＸ及びタイプIIに属する
細菌について研究を行ったところ、いずれの細菌もメタ
ンからＬ−アミノ酸を生産するのに好適であることを見
いだした。したがって、本発明は、広くメタン資化性細
菌に適用することができると考えられる。尚、タイプ
Ｉ、タイプＸまたはタイプIIに属するメタン資化性菌と
して具体的には、それぞれ順にメチロモナス（Methylom
onas）属、メチロコッカス（Methylococcus）属及びメ
チロシナス（Methylosinus）属に属する細菌が挙げられ
る。より具体的には、メチロモナス・アルバス（Methyl
omonas albus）、メチロコッカス・カプスラツス（Meth
ylococcus capsulatus ）またはメチロシナス・トリコ
スポリウム（Methylosinus trichosporium）が挙げられ
る。
−アミノ酸生産能を元来有するか、又は、Ｌ−アミノ酸
生産能を付与され得る微生物であれば特に制限されない
が、具体的には、メタン資化性菌の系統的分類において
タイプＩ、タイプＸまたはタイプIIに属する微生物が挙
げられる。命名法によるメタン資化性細菌の分類は確立
されているとはいえないのが現状であり、主要炭素源同
化経路、膜形状、独立栄養的炭酸固定能により大きく３
つのタイプに分類されている（Peter N. Green, "Taxon
omy of Methylotrophic Bacteria" in Methane and Met
hanol Utilizers, Edited by J. Colin Murrell and Ho
ward Dalton, p.25-27, p48-49, PlenumPublishing Cor
poration, 233 Spring Street, New York, New York 10
013-1578, USA）。本発明者は、これらの３つのタイ
プ、すなわちタイプＩ、タイプＸ及びタイプIIに属する
細菌について研究を行ったところ、いずれの細菌もメタ
ンからＬ−アミノ酸を生産するのに好適であることを見
いだした。したがって、本発明は、広くメタン資化性細
菌に適用することができると考えられる。尚、タイプ
Ｉ、タイプＸまたはタイプIIに属するメタン資化性菌と
して具体的には、それぞれ順にメチロモナス（Methylom
onas）属、メチロコッカス（Methylococcus）属及びメ
チロシナス（Methylosinus）属に属する細菌が挙げられ
る。より具体的には、メチロモナス・アルバス（Methyl
omonas albus）、メチロコッカス・カプスラツス（Meth
ylococcus capsulatus ）またはメチロシナス・トリコ
スポリウム（Methylosinus trichosporium）が挙げられ
る。
【００１１】また、メタン資化能を有する微生物は、自
然界から分離してもよい。メタン資化能を有する微生物
を自然界から分離する方法としては、河川、湖沼、海等
の水、泥、土、岩石、動植物等の生物の部分及び生物の
死骸、排泄物、又は空気などからサンプルを採取し、こ
のサンプルをそれぞれ液体培地に混合または固体培地に
塗布し、メタンを唯一の炭素源として培養し、生育可能
な微生物を選択する方法が挙げられる。
然界から分離してもよい。メタン資化能を有する微生物
を自然界から分離する方法としては、河川、湖沼、海等
の水、泥、土、岩石、動植物等の生物の部分及び生物の
死骸、排泄物、又は空気などからサンプルを採取し、こ
のサンプルをそれぞれ液体培地に混合または固体培地に
塗布し、メタンを唯一の炭素源として培養し、生育可能
な微生物を選択する方法が挙げられる。
【００１２】本発明に用いる微生物は、上記のようなメ
タン資化性菌であって、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能を有
する微生物である。本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生
産能を元来有する野生株であってもよく、さらに育種に
よってＬ−アミノ酸生産能を増強又は付与された変異株
又は組換え体であってもよい。本発明が適用されるＬ−
アミノ酸としては、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニ
ン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ
−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシ
ン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニールアラニン、Ｌ−リジ
ン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトフ
ァン（以下、それぞれ順に、L-Asp、L-Thr、L-Ser、L-G
lu、L-Pro、L-Gly、L-Ala、L-Cys、L-Val、L-Met、L-Il
e、L-Leu、L-Tyr、L-Phe、L-Lys、L-His、L-Arg、L-Trp
と略すことがある）などがあげられる。尚、本発明によ
って製造されるアミノ酸は単独であってもよく、任意の
２種以上のアミノ酸を同時に製造してもよい。
タン資化性菌であって、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能を有
する微生物である。本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生
産能を元来有する野生株であってもよく、さらに育種に
よってＬ−アミノ酸生産能を増強又は付与された変異株
又は組換え体であってもよい。本発明が適用されるＬ−
アミノ酸としては、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニ
ン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ
−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシ
ン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニールアラニン、Ｌ−リジ
ン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−トリプトフ
ァン（以下、それぞれ順に、L-Asp、L-Thr、L-Ser、L-G
lu、L-Pro、L-Gly、L-Ala、L-Cys、L-Val、L-Met、L-Il
e、L-Leu、L-Tyr、L-Phe、L-Lys、L-His、L-Arg、L-Trp
と略すことがある）などがあげられる。尚、本発明によ
って製造されるアミノ酸は単独であってもよく、任意の
２種以上のアミノ酸を同時に製造してもよい。
【００１３】メタン資化性菌の野生株にＬ−アミノ酸生
産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸
アナログ耐性株、又は代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミ
ノ酸生合成系酵素遺伝子が増強された組換え株の創製
等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育
種に採用されてきた方法を適用することができる（アミ
ノ酸発酵 第７７〜１００頁参照）。
産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸
アナログ耐性株、又は代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミ
ノ酸生合成系酵素遺伝子が増強された組換え株の創製
等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育
種に採用されてきた方法を適用することができる（アミ
ノ酸発酵 第７７〜１００頁参照）。
【００１４】例えば、Ｌ−リジン生産菌は、Ｌ−ホモセ
リン、又はＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンを要求す
る変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、イ
ノシトールまたは酢酸を要求する変異株（特開昭55-978
4号、特開昭56-8692号）、又はオキサリジン、リジンハ
イドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−システ
イン、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、
ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−
ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルフ
ァ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を有す
る変異株として育種することができる。
リン、又はＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンを要求す
る変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、イ
ノシトールまたは酢酸を要求する変異株（特開昭55-978
4号、特開昭56-8692号）、又はオキサリジン、リジンハ
イドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−システ
イン、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、
ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−
ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルフ
ァ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を有す
る変異株として育種することができる。
【００１５】また、Ｌ−グルタミン酸生産菌はオレイン
酸要求変異株等として、Ｌ−スレオニン生産菌はα−ア
ミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性変異株として、Ｌ−ホ
モセリン生産菌はＬ−スレオニン要求変異株又はＬ−フ
ェニルアラニンアナログ耐性変異株として、Ｌ−フェニ
ルアラニン生産菌は、Ｌ−チロシン要求変異株として、
Ｌ−イソロイシン生産菌はＬ−ロイシン要求変異株とし
て、Ｌ−プロリン生産菌は、Ｌ−イソロイシン要求変異
株として、育種することができる。
酸要求変異株等として、Ｌ−スレオニン生産菌はα−ア
ミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性変異株として、Ｌ−ホ
モセリン生産菌はＬ−スレオニン要求変異株又はＬ−フ
ェニルアラニンアナログ耐性変異株として、Ｌ−フェニ
ルアラニン生産菌は、Ｌ−チロシン要求変異株として、
Ｌ−イソロイシン生産菌はＬ−ロイシン要求変異株とし
て、Ｌ−プロリン生産菌は、Ｌ−イソロイシン要求変異
株として、育種することができる。
【００１６】メタン資化性菌から変異株を得るための変
異処理としては、紫外線照射、またはN−メチル−N'−
ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸
等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理
する方法が挙げられる。また、メタン資化性菌の自然突
然変異株を選択することによっても、Ｌ−アミノ酸生産
能を有するメタン資化性菌を得ることできる。
異処理としては、紫外線照射、またはN−メチル−N'−
ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸
等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理
する方法が挙げられる。また、メタン資化性菌の自然突
然変異株を選択することによっても、Ｌ−アミノ酸生産
能を有するメタン資化性菌を得ることできる。
【００１７】目的とする変異株は、変異処理を施した、
又は変異処理を施していないメタン資化性菌を、通常の
野生株が生育できないような濃度のＬ−アミノ酸または
そのアナログを含有する培地に接種し、生育できるよう
な変異株を分離することによって取得することができ
る。尚、変異株の中には、Ｌ−アミノ酸生産能が親株と
同程度であるか、又は親株よりも低下した株も出現する
場合もあるので、得られた変異株からＬ−アミノ酸生産
能が親株より増加した株を選択することが好ましい。
又は変異処理を施していないメタン資化性菌を、通常の
野生株が生育できないような濃度のＬ−アミノ酸または
そのアナログを含有する培地に接種し、生育できるよう
な変異株を分離することによって取得することができ
る。尚、変異株の中には、Ｌ−アミノ酸生産能が親株と
同程度であるか、又は親株よりも低下した株も出現する
場合もあるので、得られた変異株からＬ−アミノ酸生産
能が親株より増加した株を選択することが好ましい。
【００１８】次に、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素遺伝子の
増強によってＬ−アミノ酸生産能を付与又は増強する方
法を、以下に例示する。
増強によってＬ−アミノ酸生産能を付与又は増強する方
法を、以下に例示する。
【００１９】〔Ｌ−リジン〕Ｌ−リジン生産能は、例え
ば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルト
キナーゼ活性、さらに必要に応じて、ジヒドロジピコリ
ン酸レダクターゼ活性及びジアミノピメリン酸デヒドロ
ゲナーゼ活性を増強することによって付与することがで
きる。
ば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルト
キナーゼ活性、さらに必要に応じて、ジヒドロジピコリ
ン酸レダクターゼ活性及びジアミノピメリン酸デヒドロ
ゲナーゼ活性を増強することによって付与することがで
きる。
【００２０】メタン資化性菌のジヒドロジピコリン酸合
成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性を増強するに
は、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子
断片及びアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片
を、メタン資化性菌で機能するベクター、好ましくはマ
ルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製
し、これをメタン資化性菌の宿主に導入して形質転換す
ればよい。形質転換株の細胞内のジヒドロジピコリン酸
合成酵素をコードする遺伝子及びアスパルトキナーゼを
コードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの
酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸
合成酵素をDDPS、アスパルトキナーゼをAK、アスパルト
キナーゼIIIをAKIII、ジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼをDDPR、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをDDH
と略すことがある。
成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性を増強するに
は、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子
断片及びアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片
を、メタン資化性菌で機能するベクター、好ましくはマ
ルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製
し、これをメタン資化性菌の宿主に導入して形質転換す
ればよい。形質転換株の細胞内のジヒドロジピコリン酸
合成酵素をコードする遺伝子及びアスパルトキナーゼを
コードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの
酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸
合成酵素をDDPS、アスパルトキナーゼをAK、アスパルト
キナーゼIIIをAKIII、ジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼをDDPR、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをDDH
と略すことがある。
【００２１】上記酵素をコードする遺伝子の供与微生物
としては、メタン資化性菌中で各々の酵素の活性を発現
することができる微生物であれば、いかなる微生物でも
使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変
異株のいずれでもよい。具体的にはE. coli（エシェリ
ヒア・コリ(Escherichia coli)）K-12株、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム等が挙げられる。エシェ
リヒア属細菌由来のDDPSをコードする遺伝子（dapA、Ri
chaud, F. et al. J. Bacteriol., 297 (1986)）及びAK
IIIをコードする遺伝子（lysC、Cassan, M., Parsot,
C., Cohen, G.N.and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 26
1, 1052(1986)）、DDPRをコードする遺伝子（dapB、Bou
vier, J. et al., J. Biol. Chem., 259, 14829 (198
4)）、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のDDHを
コードする遺伝子（Ishino, S. etal., Nucleic Acids
Res., 15, 3917 (1987)）は、いずれも塩基配列が明ら
かにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づ
いてプライマーを合成し、E. coli K-12、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869等の微生物の
染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺
伝子を取得することが可能である。以下、E. coli由来
のdapA及びlysCを例として説明するが、本発明に用いる
遺伝子は、これらに限定されるものではない。
としては、メタン資化性菌中で各々の酵素の活性を発現
することができる微生物であれば、いかなる微生物でも
使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変
異株のいずれでもよい。具体的にはE. coli（エシェリ
ヒア・コリ(Escherichia coli)）K-12株、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム等が挙げられる。エシェ
リヒア属細菌由来のDDPSをコードする遺伝子（dapA、Ri
chaud, F. et al. J. Bacteriol., 297 (1986)）及びAK
IIIをコードする遺伝子（lysC、Cassan, M., Parsot,
C., Cohen, G.N.and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 26
1, 1052(1986)）、DDPRをコードする遺伝子（dapB、Bou
vier, J. et al., J. Biol. Chem., 259, 14829 (198
4)）、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のDDHを
コードする遺伝子（Ishino, S. etal., Nucleic Acids
Res., 15, 3917 (1987)）は、いずれも塩基配列が明ら
かにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づ
いてプライマーを合成し、E. coli K-12、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869等の微生物の
染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺
伝子を取得することが可能である。以下、E. coli由来
のdapA及びlysCを例として説明するが、本発明に用いる
遺伝子は、これらに限定されるものではない。
【００２２】本発明に用いるDDPS及びAKは、Ｌ−リジン
によるフィードバック阻害を受けないものであることが
好ましい。E. coli由来の野生型DDPSはＬ−リジンによ
るフィードバック阻害を受けることが知られており、E.
coli由来の野生型AKIIIはＬ−リジンによる抑制及びフ
ィードバック阻害を受けることが知られている。したが
って、メタン資化性菌に導入するdapA及びlysCは、それ
ぞれＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される
変異を有するDDPS及びAKIIIをコードするものであるこ
とが好ましい。以下、Ｌ−リジンによるフィードバック
阻害が解除される変異を有するDDPSを「変異型DDPS」、
変異型DDPSをコードするＤＮＡを「変異型dapA」又は
「dapA*」と呼ぶことがある。また、Ｌ−リジンによる
フィードバック阻害が解除される変異を有するE. coli
由来のAKIIIを「変異型AKIII」、変異型AKIIIをコード
するＤＮＡを「変異型lysC」と呼ぶことがある。
によるフィードバック阻害を受けないものであることが
好ましい。E. coli由来の野生型DDPSはＬ−リジンによ
るフィードバック阻害を受けることが知られており、E.
coli由来の野生型AKIIIはＬ−リジンによる抑制及びフ
ィードバック阻害を受けることが知られている。したが
って、メタン資化性菌に導入するdapA及びlysCは、それ
ぞれＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される
変異を有するDDPS及びAKIIIをコードするものであるこ
とが好ましい。以下、Ｌ−リジンによるフィードバック
阻害が解除される変異を有するDDPSを「変異型DDPS」、
変異型DDPSをコードするＤＮＡを「変異型dapA」又は
「dapA*」と呼ぶことがある。また、Ｌ−リジンによる
フィードバック阻害が解除される変異を有するE. coli
由来のAKIIIを「変異型AKIII」、変異型AKIIIをコード
するＤＮＡを「変異型lysC」と呼ぶことがある。
【００２３】尚、本発明においては、DDPS及びAKは必ず
しも変異型である必要はない。例えば、コリネバクテリ
ウム属細菌由来のDDPSはもともとＬ−リジンによるフィ
ードバック阻害を受けないことが知られている。E. col
i由来の野生型dapAの塩基配列を配列番号１に、同塩基
配列によってコードされる野生型DDPSのアミノ酸配列を
配列番号２に例示する。
しも変異型である必要はない。例えば、コリネバクテリ
ウム属細菌由来のDDPSはもともとＬ−リジンによるフィ
ードバック阻害を受けないことが知られている。E. col
i由来の野生型dapAの塩基配列を配列番号１に、同塩基
配列によってコードされる野生型DDPSのアミノ酸配列を
配列番号２に例示する。
【００２４】Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受
けない変異型DDPSをコードするＤＮＡとしては、配列番
号２に示すアミノ酸配列において118位のヒスチジン残
基がチロシン残基に置換された配列を有するDDPSをコー
ドするＤＮＡが挙げられる。
けない変異型DDPSをコードするＤＮＡとしては、配列番
号２に示すアミノ酸配列において118位のヒスチジン残
基がチロシン残基に置換された配列を有するDDPSをコー
ドするＤＮＡが挙げられる。
【００２５】遺伝子のクローニングに使用されるプラス
ミドとしては、エシェリヒア属細菌等の微生物において
複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pT
WV228、pMW119、pUC19等が挙げられる。
ミドとしては、エシェリヒア属細菌等の微生物において
複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pT
WV228、pMW119、pUC19等が挙げられる。
【００２６】また、メタン資化性菌で機能するベクター
とは、例えばメタン資化性菌で自律複製出来るプラスミ
ドである。具体的には、広宿主域ベクターであるRSF101
0及びその誘導体、例えばpAYC32（Chistorerdov, A.Y.,
Tsygankov, Y.D. Plasmid,1986, 16, 161-167）、pMFY
42（gene, 44, 53(1990)）、pRP301、pTB70（Nature, 2
87, 396, (1980)）、あるいは後記実施例に示すpRS等が
挙げられる。
とは、例えばメタン資化性菌で自律複製出来るプラスミ
ドである。具体的には、広宿主域ベクターであるRSF101
0及びその誘導体、例えばpAYC32（Chistorerdov, A.Y.,
Tsygankov, Y.D. Plasmid,1986, 16, 161-167）、pMFY
42（gene, 44, 53(1990)）、pRP301、pTB70（Nature, 2
87, 396, (1980)）、あるいは後記実施例に示すpRS等が
挙げられる。
【００２７】dapA及び／又はlysCとメタン資化性菌で機
能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するに
は、dapA及びlysCを含むＤＮＡ断片の末端に合うような
制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。da
pA及びlysCは、それぞれ別個のベクターに搭載してもよ
く、同一のベクターに搭載してもよい。
能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するに
は、dapA及びlysCを含むＤＮＡ断片の末端に合うような
制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。da
pA及びlysCは、それぞれ別個のベクターに搭載してもよ
く、同一のベクターに搭載してもよい。
【００２８】変異型DDPSをコードする変異型dapAを含む
プラスミドとして、広宿主域プラスミドRSF24Pが知られ
ている（WO95/16042号）。同プラスミドで形質転換され
たE.coli JM109株は、AJ12395と命名され、1993年10月2
8日に工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305
-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託
番号FERM P-13935として寄託され、1994年11月1日にブ
ダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-48
58の受託番号のもとで寄託されている。
プラスミドとして、広宿主域プラスミドRSF24Pが知られ
ている（WO95/16042号）。同プラスミドで形質転換され
たE.coli JM109株は、AJ12395と命名され、1993年10月2
8日に工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305
-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託
番号FERM P-13935として寄託され、1994年11月1日にブ
ダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-48
58の受託番号のもとで寄託されている。
【００２９】また、変異型DDPSをコードする変異型dapA
及び変異型AKIIIをコードする変異型lysCを含むプラス
ミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80が知られている
（WO95/16042号）。同プラスミドで形質転換されたE. c
oli JM109株は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月
28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託
番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブ
ダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-48
59の受託番号のもとで寄託されている。RSF24P及びRSFD
80は、AJ12395及びAJ12396株から、公知の方法によって
取得することができる。RSFD80に含まれている変異型da
pAは、配列番号１に示す野生型dapAの塩基配列において
塩基番号597のＣがＴに変化した配列を有し、それによ
って、コードされる変異型DDPSは、配列番号２に示すア
ミノ酸配列において118位のヒスチジン残基がチロシン
残基に置換された配列を有する。
及び変異型AKIIIをコードする変異型lysCを含むプラス
ミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80が知られている
（WO95/16042号）。同プラスミドで形質転換されたE. c
oli JM109株は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月
28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託
番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブ
ダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-48
59の受託番号のもとで寄託されている。RSF24P及びRSFD
80は、AJ12395及びAJ12396株から、公知の方法によって
取得することができる。RSFD80に含まれている変異型da
pAは、配列番号１に示す野生型dapAの塩基配列において
塩基番号597のＣがＴに変化した配列を有し、それによ
って、コードされる変異型DDPSは、配列番号２に示すア
ミノ酸配列において118位のヒスチジン残基がチロシン
残基に置換された配列を有する。
【００３０】上記のように調製した組換えＤＮＡをメタ
ン資化性菌に導入するには、十分な形質転換効率が得ら
れる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例え
ば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of
Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。また、
組換え体ベクターを保持したE. coli S17-1株と受容菌
（メタン資化性菌）を混合し、寒天平板上に置いたフィ
ルター上で接合させることにより同組換え体ベクターを
受容菌へ導入する方法も用いることができる（FEMS Mic
robiology Letters 41、p.185-188(1987)）。組換え体ベ
クターを含む形質転換体は、ベクターの薬剤選択性によ
り容易に同定することができる。さらに、自己伝達可能
なプラスミド（self-transmissible plasmid）を保持す
るエシェリヒア・コリと、目的とする組換えベクターを
保持するエシェリヒア・コリと、受容菌（メタン資化性
菌）との三者を用い、三親接合伝達（triparental conj
ugaltransfer：Snyder, L and Champness, W., Molecul
ar Genetics of Bacteria,ASM Press, Washington, D.
C.）により目的の組換えベクターを受容菌に導入するこ
ともできる。前記自己伝達可能なプラスミドを保持する
エシェリヒア・コリとしては、エシェリヒア・コリHB10
1/pRK2013（Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., a
nd Helinski, D.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,
7347(1980)）が挙げられる。
ン資化性菌に導入するには、十分な形質転換効率が得ら
れる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例え
ば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of
Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。また、
組換え体ベクターを保持したE. coli S17-1株と受容菌
（メタン資化性菌）を混合し、寒天平板上に置いたフィ
ルター上で接合させることにより同組換え体ベクターを
受容菌へ導入する方法も用いることができる（FEMS Mic
robiology Letters 41、p.185-188(1987)）。組換え体ベ
クターを含む形質転換体は、ベクターの薬剤選択性によ
り容易に同定することができる。さらに、自己伝達可能
なプラスミド（self-transmissible plasmid）を保持す
るエシェリヒア・コリと、目的とする組換えベクターを
保持するエシェリヒア・コリと、受容菌（メタン資化性
菌）との三者を用い、三親接合伝達（triparental conj
ugaltransfer：Snyder, L and Champness, W., Molecul
ar Genetics of Bacteria,ASM Press, Washington, D.
C.）により目的の組換えベクターを受容菌に導入するこ
ともできる。前記自己伝達可能なプラスミドを保持する
エシェリヒア・コリとしては、エシェリヒア・コリHB10
1/pRK2013（Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., a
nd Helinski, D.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,
7347(1980)）が挙げられる。
【００３１】DDPS活性及び／又はAK活性の増強は、dapA
及び／又はlysCをメタン資化性菌の染色体ＤＮＡ上に多
コピー存在させることによっても達成できる。メタン資
化性菌の染色体ＤＮＡ上にdapA及び又はlysCを多コピー
で導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配
列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮ
Ａ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤ
ＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リ
ピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報
に開示されているように、dapA及び／又はlysCをトラン
スポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に
多コピー導入することも可能である。いずれの方法によ
っても形質転換株内のdapA及lysCのコピー数が上昇する
結果、DDPS活性及びAK活性が増幅される。
及び／又はlysCをメタン資化性菌の染色体ＤＮＡ上に多
コピー存在させることによっても達成できる。メタン資
化性菌の染色体ＤＮＡ上にdapA及び又はlysCを多コピー
で導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配
列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮ
Ａ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤ
ＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リ
ピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報
に開示されているように、dapA及び／又はlysCをトラン
スポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に
多コピー導入することも可能である。いずれの方法によ
っても形質転換株内のdapA及lysCのコピー数が上昇する
結果、DDPS活性及びAK活性が増幅される。
【００３２】DDPS活性及び／又はAK活性の増幅は、上記
の遺伝子増幅による以外に、dapA及び又はlysCのプロモ
ーター等の発現調節配列を強力なものに置換することに
よっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。た
とえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔ
ｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファー
ジのＰRプロモーター、ＰLプロモーター、ｔｅｔプロモ
ーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター
等が強力なプロモーターとして知られている。これらの
プロモーターへの置換により、dapA及び／又はlysCの発
現が強化されることによってDDPS活性及び／又はAK活性
が増幅される。発現調節配列の増強は、dapA及び／又は
lysCのコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
の遺伝子増幅による以外に、dapA及び又はlysCのプロモ
ーター等の発現調節配列を強力なものに置換することに
よっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。た
とえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔ
ｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファー
ジのＰRプロモーター、ＰLプロモーター、ｔｅｔプロモ
ーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター
等が強力なプロモーターとして知られている。これらの
プロモーターへの置換により、dapA及び／又はlysCの発
現が強化されることによってDDPS活性及び／又はAK活性
が増幅される。発現調節配列の増強は、dapA及び／又は
lysCのコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００３３】遺伝子断片とベクターを連結して組換えＤ
ＮＡを調製するには、遺伝子断片の末端に合うような制
限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ＤＮＡ
の切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、
プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして
用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者に
よく知られている通常の方法を採用することができる。
これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and M
aniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manua
l, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory
Press, (1989)等に記載されている。
ＮＡを調製するには、遺伝子断片の末端に合うような制
限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ＤＮＡ
の切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、
プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして
用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者に
よく知られている通常の方法を採用することができる。
これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and M
aniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manua
l, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory
Press, (1989)等に記載されている。
【００３４】DDPS及びAKの増強に加えて、他のＬ−リジ
ン生合成に関与する酵素を増強してもよい。そのような
酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジ
アミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリ
ン酸デヒドロゲナーゼ（WO96/40934号参照）、ホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭60-87788
号）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（特公
平6-102028号）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝
子等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモア
コニット酸ヒドラターゼ遺伝子等のアミノアジピン酸経
路の酵素等が挙げられる。
ン生合成に関与する酵素を増強してもよい。そのような
酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジ
アミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリ
ン酸デヒドロゲナーゼ（WO96/40934号参照）、ホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭60-87788
号）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（特公
平6-102028号）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝
子等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモア
コニット酸ヒドラターゼ遺伝子等のアミノアジピン酸経
路の酵素等が挙げられる。
【００３５】さらに、本発明の微生物は、Ｌ−リジンの
生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成
する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損してい
てもよい。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リ
ジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素として
は、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある（WO 95/23864
参照）。
生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成
する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損してい
てもよい。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リ
ジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素として
は、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある（WO 95/23864
参照）。
【００３６】上記のＬ−リジン生合成に関与する酵素の
活性を増強する手法は、以下に示す他のアミノ酸につい
ても同様に適用することができる。
活性を増強する手法は、以下に示す他のアミノ酸につい
ても同様に適用することができる。
【００３７】〔Ｌ−グルタミン酸〕メタン資化性菌への
Ｌ−グルタミン酸生産能は、例えば、グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ（特開昭６１−２６８１８５号）、グルタ
ミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエ
ン酸デヒドロゲナーゼ（特開昭６２−１６６８９０号、
特開昭６３−２１４１８９号）、アコニット酸ヒドラタ
ーゼ（特開昭６２−２９４０８６号）、クエン酸シンタ
ーゼ（特開昭６２−２０１５８５号、特開昭６３−１１
９６８８号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ（特開昭６０−８７７８８号、特開昭６２−５５０
８９号）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キ
ナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラ
ーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キ
ナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビス
リン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ（特開昭
６３−１０２６９２号）、グルコースリン酸イソメラー
ゼ、グルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェ
ラーゼ（ＷＯ９９／０７８５３）等の酵素をコードする
ＤＮＡを導入することによって、付与することができ
る。
Ｌ−グルタミン酸生産能は、例えば、グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ（特開昭６１−２６８１８５号）、グルタ
ミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエ
ン酸デヒドロゲナーゼ（特開昭６２−１６６８９０号、
特開昭６３−２１４１８９号）、アコニット酸ヒドラタ
ーゼ（特開昭６２−２９４０８６号）、クエン酸シンタ
ーゼ（特開昭６２−２０１５８５号、特開昭６３−１１
９６８８号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ（特開昭６０−８７７８８号、特開昭６２−５５０
８９号）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キ
ナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラ
ーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キ
ナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビス
リン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ（特開昭
６３−１０２６９２号）、グルコースリン酸イソメラー
ゼ、グルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェ
ラーゼ（ＷＯ９９／０７８５３）等の酵素をコードする
ＤＮＡを導入することによって、付与することができ
る。
【００３８】さらに、本発明の微生物は、Ｌ−グルタミ
ン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の
化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下また
は欠損していてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路
から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する
反応を触媒する酵素としては、αケトグルタール酸デヒ
ドロゲナーゼ（αＫＧＤＨ）、イソクエン酸リアーゼ、
リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、ア
セトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、
ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナー
ゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリン酸
デヒドロゲナーゼ等がある。
ン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の
化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下また
は欠損していてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路
から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する
反応を触媒する酵素としては、αケトグルタール酸デヒ
ドロゲナーゼ（αＫＧＤＨ）、イソクエン酸リアーゼ、
リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、ア
セトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、
ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナー
ゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリン酸
デヒドロゲナーゼ等がある。
【００３９】〔Ｌ−スレオニン〕Ｌ−スレオニン生産能
は、例えば、スレオニンオペロンを含有した組換えプラ
スミド（特開昭 ５５−１３１３９７号公報、特開昭５
９−３１６９１号公報、特開昭５６−１５６９６号公
報、および特表平３−５０１６８２号公報参照）でメタ
ン資化性菌を形質転換することにより、付与又は増強す
ることができる。
は、例えば、スレオニンオペロンを含有した組換えプラ
スミド（特開昭 ５５−１３１３９７号公報、特開昭５
９−３１６９１号公報、特開昭５６−１５６９６号公
報、および特表平３−５０１６８２号公報参照）でメタ
ン資化性菌を形質転換することにより、付与又は増強す
ることができる。
【００４０】また、Ｌ−スレオニンによるフィードバッ
ク阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺
伝子を有するスレオニンオペロン（特公平１−２９５５
９号公報）、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子（特開昭６０−０１２９９５号）、又はホモセリ
ンキナーゼ及びホモセリンデヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子（特開昭６１−１９５６９５号）を増強するこ
とによっても、生産性を付与又は増強することができ
る。
ク阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺
伝子を有するスレオニンオペロン（特公平１−２９５５
９号公報）、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子（特開昭６０−０１２９９５号）、又はホモセリ
ンキナーゼ及びホモセリンデヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子（特開昭６１−１９５６９５号）を増強するこ
とによっても、生産性を付与又は増強することができ
る。
【００４１】さらに、アスパラギン酸によるフィードバ
ック阻害を解除する変異を有する変異型ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡを導入
することによって、Ｌ−スレオニン生産能を向上させる
ことができる。
ック阻害を解除する変異を有する変異型ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡを導入
することによって、Ｌ−スレオニン生産能を向上させる
ことができる。
【００４２】〔Ｌ−バリン〕Ｌ−バリンの生産能の付与
は、例えば、制御機構が実質的に解除されたＬ−バリン
生合成系遺伝子をメタン資化性菌に導入することによっ
て行うことができる。また、エシェリヒア属に属する微
生物が保持するＬ−バリン生合成系遺伝子の制御機構が
実質的に解除されるような変異を導入してもよい。
は、例えば、制御機構が実質的に解除されたＬ−バリン
生合成系遺伝子をメタン資化性菌に導入することによっ
て行うことができる。また、エシェリヒア属に属する微
生物が保持するＬ−バリン生合成系遺伝子の制御機構が
実質的に解除されるような変異を導入してもよい。
【００４３】Ｌ−バリン生合成系遺伝子としては、例え
ばE. coliのｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが挙げられる。
尚、ｉｌｖＡ遺伝子がコードするスレオニンデアミナー
ゼは、Ｌ−イソロイシン生合成系の律速段階であるＬ−
スレオニンから２−ケト酪酸への脱アミノ化反応を触媒
する。したがって、Ｌ−バリン合成系の反応を効率よく
進行させるためには、スレオニンデアミナーゼ活性を発
現しないオペロンを用いることが好ましい。このような
スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないｉｌｖＧＭＥ
ＤＡオペロンとしては、スレオニンデアミナーゼ活性を
失うような変異がｉｌｖＡに導入された、又はｉｌｖＡ
が破壊されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン、あるいはｉｌ
ｖＡが欠失したｉｌｖＧＭＥＤオペロンが挙げられる。
ばE. coliのｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが挙げられる。
尚、ｉｌｖＡ遺伝子がコードするスレオニンデアミナー
ゼは、Ｌ−イソロイシン生合成系の律速段階であるＬ−
スレオニンから２−ケト酪酸への脱アミノ化反応を触媒
する。したがって、Ｌ−バリン合成系の反応を効率よく
進行させるためには、スレオニンデアミナーゼ活性を発
現しないオペロンを用いることが好ましい。このような
スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないｉｌｖＧＭＥ
ＤＡオペロンとしては、スレオニンデアミナーゼ活性を
失うような変異がｉｌｖＡに導入された、又はｉｌｖＡ
が破壊されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン、あるいはｉｌ
ｖＡが欠失したｉｌｖＧＭＥＤオペロンが挙げられる。
【００４４】また、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、Ｌ−
バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又はＬ−ロイ
シンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）
を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解
除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去
又は変異されていることが好ましい。
バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又はＬ−ロイ
シンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）
を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解
除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去
又は変異されていることが好ましい。
【００４５】上記のような、スレオニンデアミナーゼ活
性を発現せず、アテニュエーションが解除されたｉｌｖ
ＧＭＥＤＡオペロンは、野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロ
ンを変異処理し、または遺伝子組換え技術を用いて改変
することにより得られる（以上、ＷＯ９６／０６９２６
参照）。
性を発現せず、アテニュエーションが解除されたｉｌｖ
ＧＭＥＤＡオペロンは、野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロ
ンを変異処理し、または遺伝子組換え技術を用いて改変
することにより得られる（以上、ＷＯ９６／０６９２６
参照）。
【００４６】スレオニンオペロンを含むプラスミドｐＶ
ＩＣ４０（WO90/04636、特表平３−５０１６８２号公
報）を保持するエシェリヒア・コリＢ−３９９６株は、
１９８７年１１月１９日よりAll-Union Scientific Cen
tre of Antibiotis(VNIIA)（住所：Nagatinskaya Stree
t 3-a, Moscow 113105, Russian Federation）に、登録
番号RIA 1867のもとに寄託されている。また、同株は、
Russian National Collection of Industrial Microorg
anisms (VKPM)（住所：Dorozhny proezd. 1, Moscow 11
3545, Russian Federation）に受託番号Ｂ−３９９６の
もとに寄託されている。
ＩＣ４０（WO90/04636、特表平３−５０１６８２号公
報）を保持するエシェリヒア・コリＢ−３９９６株は、
１９８７年１１月１９日よりAll-Union Scientific Cen
tre of Antibiotis(VNIIA)（住所：Nagatinskaya Stree
t 3-a, Moscow 113105, Russian Federation）に、登録
番号RIA 1867のもとに寄託されている。また、同株は、
Russian National Collection of Industrial Microorg
anisms (VKPM)（住所：Dorozhny proezd. 1, Moscow 11
3545, Russian Federation）に受託番号Ｂ−３９９６の
もとに寄託されている。
【００４７】〔Ｌ−ロイシン〕Ｌ−ロイシンの生産能の
付与または増強は、例えば、上記Ｌ−バリン生産に必要
な性質に加えて、制御機構が実質的に解除されたＬ−ロ
イシン生合成系遺伝子をメタン資化性菌に導入すること
によって行われる。また、Ｌ−ロイシン生合成系遺伝子
の制御機構が実質的に解除されるような変異を導入して
もよい。このような遺伝子として、例えば、Ｌ−ロイシ
ンによる阻害が実質的に解除されたｌｅｕＡ遺伝子が挙
げられる。
付与または増強は、例えば、上記Ｌ−バリン生産に必要
な性質に加えて、制御機構が実質的に解除されたＬ−ロ
イシン生合成系遺伝子をメタン資化性菌に導入すること
によって行われる。また、Ｌ−ロイシン生合成系遺伝子
の制御機構が実質的に解除されるような変異を導入して
もよい。このような遺伝子として、例えば、Ｌ−ロイシ
ンによる阻害が実質的に解除されたｌｅｕＡ遺伝子が挙
げられる。
【００４８】〔Ｌ−イソロイシン〕Ｌ−イソロイシン
は、例えば、E. coli由来のＬ−スレオニンによる阻害
が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリ
ンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含
むｔｈｒＡＢＣオペロンと、Ｌ−イソロイシンによる阻
害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコー
ドするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに
必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとを
導入することにより、Ｌ−イソロイシン生産性を付与す
ることができる（特開平８−４７３９７参照）。
は、例えば、E. coli由来のＬ−スレオニンによる阻害
が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリ
ンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含
むｔｈｒＡＢＣオペロンと、Ｌ−イソロイシンによる阻
害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコー
ドするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに
必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとを
導入することにより、Ｌ−イソロイシン生産性を付与す
ることができる（特開平８−４７３９７参照）。
【００４９】〔その他のアミノ酸〕Ｌ−トリプトファ
ン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオ
ニン及びＬ−イソロイシンは、メタン資化性菌のホスホ
エノールピルビン酸の生産能を上昇させることによっ
て、生合成が強化され得る（ＷＯ９７／０８３３３）。
ン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオ
ニン及びＬ−イソロイシンは、メタン資化性菌のホスホ
エノールピルビン酸の生産能を上昇させることによっ
て、生合成が強化され得る（ＷＯ９７／０８３３３）。
【００５０】Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン
は、脱感作型コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒ
ドラターゼ（ＣＭ−ＰＤＴ）遺伝子（特開平５−２３６
９４７号、特開昭６２−１３０６９３号公報参照）、脱
感作型ＤＳ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸
−７−リン酸シンターゼ）遺伝子（特開平５−２３６９
４７号、特開昭６１−１２４３７５号公報参照）を増強
することによって、生産性が向上する。
は、脱感作型コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒ
ドラターゼ（ＣＭ−ＰＤＴ）遺伝子（特開平５−２３６
９４７号、特開昭６２−１３０６９３号公報参照）、脱
感作型ＤＳ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸
−７−リン酸シンターゼ）遺伝子（特開平５−２３６９
４７号、特開昭６１−１２４３７５号公報参照）を増強
することによって、生産性が向上する。
【００５１】また、Ｌ−トリプトファンは、脱感作型ア
ントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプ
トファンオペロン（特開昭５７−７１３９７号、特開昭
６２−２４４３８２号、米国特許第4,371,614）を増強
することによって、生産性が向上する。
ントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプ
トファンオペロン（特開昭５７−７１３９７号、特開昭
６２−２４４３８２号、米国特許第4,371,614）を増強
することによって、生産性が向上する。
【００５２】上記のようにして得られるＬ−アミノ酸生
産能を有するメタン資化性菌をメタンを主炭素源とし
て、メタンを含む気体と接する培地に培養し、該培地中
にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培地からＬ−アミノ
酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造すること
ができる。本発明で用いられる培地は、窒素源、無機イ
オン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地
であれば、天然培地、合成培地のいずれでも用いられ
る。
産能を有するメタン資化性菌をメタンを主炭素源とし
て、メタンを含む気体と接する培地に培養し、該培地中
にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培地からＬ−アミノ
酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造すること
ができる。本発明で用いられる培地は、窒素源、無機イ
オン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地
であれば、天然培地、合成培地のいずれでも用いられ
る。
【００５３】培養は、メタン資化性菌の培養に通常用い
られる方法で行われる。炭素源は主としてメタンを用
い、例えば、密閉系で振とうあるいは静置培養を行う場
合には、培地と接する気相中にメタンガスを１〜70%添
加する。開放系で通気培養を行う場合には培地中にメタ
ンガスを0.001〜10VVM吹き込む。
られる方法で行われる。炭素源は主としてメタンを用
い、例えば、密閉系で振とうあるいは静置培養を行う場
合には、培地と接する気相中にメタンガスを１〜70%添
加する。開放系で通気培養を行う場合には培地中にメタ
ンガスを0.001〜10VVM吹き込む。
【００５４】窒素源としては、硝酸カリウム、硝酸ナト
リウム、硝酸、アンモニアガス、アンモニア水、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢
酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、尿素などを0.01〜
10%培地に添加して用いる。これらのほかに、通常、燐
酸カリウム、燐酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化
カルシウム、鉄−EDTA、硫酸銅などの微量成分が少量添
加される。
リウム、硝酸、アンモニアガス、アンモニア水、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢
酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、尿素などを0.01〜
10%培地に添加して用いる。これらのほかに、通常、燐
酸カリウム、燐酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化
カルシウム、鉄−EDTA、硫酸銅などの微量成分が少量添
加される。
【００５５】培養は、振とう培養、静置培養または通気
攪拌培養などが行われるが、いずれの培養方法において
も好気的条件下で行われる。培養は１５〜８０℃、培地
のｐＨは４〜９で行われ、通常１６〜２００時間で終了
する。
攪拌培養などが行われるが、いずれの培養方法において
も好気的条件下で行われる。培養は１５〜８０℃、培地
のｐＨは４〜９で行われ、通常１６〜２００時間で終了
する。
【００５６】培養物からのＬ−アミノ酸の採取は、通常
イオン交換樹脂法、沈殿法、その他の公知の方法を組み
合わせることにより実施できる。
イオン交換樹脂法、沈殿法、その他の公知の方法を組み
合わせることにより実施できる。
【００５７】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【実施例１】メチロモナス・アルバス由来Ｌ−アミノ酸
生産株の取得 （１）メチロモナス・アルバス由来Ｌ−リジン耐性株の
取得 メチロモナス・アルバスの野生株ＮＣＩＭＢ １１１２
３株を、下記ＮＭＳ培地でメタン存在下、３０℃、４８
時間培養して得られた菌体を、常法によりＮＴＧによっ
て変異処理（ＮＴＧ ５０μg/ml、３０℃、３０分）し
た。ＮＣＩＭＢ１１１２３株は、The National Collect
ions of Industrial and Marine Bacteria Ltd.（住
所：NCIMB Lts., Torry Research Station 135 Abbey R
oad, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）から入手す
ることができる。
生産株の取得 （１）メチロモナス・アルバス由来Ｌ−リジン耐性株の
取得 メチロモナス・アルバスの野生株ＮＣＩＭＢ １１１２
３株を、下記ＮＭＳ培地でメタン存在下、３０℃、４８
時間培養して得られた菌体を、常法によりＮＴＧによっ
て変異処理（ＮＴＧ ５０μg/ml、３０℃、３０分）し
た。ＮＣＩＭＢ１１１２３株は、The National Collect
ions of Industrial and Marine Bacteria Ltd.（住
所：NCIMB Lts., Torry Research Station 135 Abbey R
oad, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）から入手す
ることができる。
【００５８】〔ＮＭＳ培地の組成〕硝酸カリウム1ｇ／
Ｌ、 硫酸マグネシウム１ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．
２ｇ／Ｌ、鉄−EDTA ３．８ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナ
トリウム０．２６ｍｇ／Ｌ、硫酸銅０．２ｍｇ／Ｌ、硫
酸鉄０．５ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛０．４ｍｇ／Ｌ、ホウ酸
０．０１５ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト０．０５ｍｇ／Ｌ、
ナトリウムＥＤＴＡ０．２５ｍｇ／Ｌ、 塩化マンガン
０．０２ｍｇ／Ｌ、塩化ニッケル０．０１ｍｇ／Ｌ、燐
酸二ナトリウム０．７１６ｇ／Ｌ、燐酸カリウム０．２
６ｇ／Ｌ（ｐＨ６．８）。上記の変異処理した菌体をＬ
−リジン１０ｍＭを含有するＮＭＳ寒天培地に塗布し、
培地と接する気相中にメタンガスを５０％添加して（以
下、「５０％メタン存在下」という）、３０℃で３〜４
０日間培養した。出現したコロニーを分離してＮＭＳ寒
天培地に植菌し、５０％メタン存在下、３０℃で３〜３
０日間培養した。この様にして得たリジン耐性株１／１
０白金耳量を、３０ｍｌ容耐圧試験管内の３ｍｌのＮＭ
Ｓ培地に植菌し、メタン１５ｍｌを封入後、３０℃で１
４日間振とう培養した。
Ｌ、 硫酸マグネシウム１ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．
２ｇ／Ｌ、鉄−EDTA ３．８ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナ
トリウム０．２６ｍｇ／Ｌ、硫酸銅０．２ｍｇ／Ｌ、硫
酸鉄０．５ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛０．４ｍｇ／Ｌ、ホウ酸
０．０１５ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト０．０５ｍｇ／Ｌ、
ナトリウムＥＤＴＡ０．２５ｍｇ／Ｌ、 塩化マンガン
０．０２ｍｇ／Ｌ、塩化ニッケル０．０１ｍｇ／Ｌ、燐
酸二ナトリウム０．７１６ｇ／Ｌ、燐酸カリウム０．２
６ｇ／Ｌ（ｐＨ６．８）。上記の変異処理した菌体をＬ
−リジン１０ｍＭを含有するＮＭＳ寒天培地に塗布し、
培地と接する気相中にメタンガスを５０％添加して（以
下、「５０％メタン存在下」という）、３０℃で３〜４
０日間培養した。出現したコロニーを分離してＮＭＳ寒
天培地に植菌し、５０％メタン存在下、３０℃で３〜３
０日間培養した。この様にして得たリジン耐性株１／１
０白金耳量を、３０ｍｌ容耐圧試験管内の３ｍｌのＮＭ
Ｓ培地に植菌し、メタン１５ｍｌを封入後、３０℃で１
４日間振とう培養した。
【００５９】培養終了後、菌体を遠心分離で除去し、得
られた培養上清に含まれるアミノ酸をアミノ酸アナライ
ザー(日立Ｌ−８５００)で分析した。親株である野生株
と比較して、とくに Ｌ−バリン及びＬ−ロイシンの蓄
積量が増加した菌株を選び、Ｎｏ．１０７−４菌と命名
した。Ｎｏ．１０７−４は、プライベートナンバーAJ13
630が付与され、１９９９年８月６日に、通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566
日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ
Ｐ−１７５０７の託受番号で寄託され、2000年7月27日
にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番
号FERM BP-7250が付与されている。
られた培養上清に含まれるアミノ酸をアミノ酸アナライ
ザー(日立Ｌ−８５００)で分析した。親株である野生株
と比較して、とくに Ｌ−バリン及びＬ−ロイシンの蓄
積量が増加した菌株を選び、Ｎｏ．１０７−４菌と命名
した。Ｎｏ．１０７−４は、プライベートナンバーAJ13
630が付与され、１９９９年８月６日に、通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566
日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ
Ｐ−１７５０７の託受番号で寄託され、2000年7月27日
にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番
号FERM BP-7250が付与されている。
【００６０】（２） メチロモナス・アルバス由来ＡＥ
Ｃ耐性株の取得 メチロモナス・アルバスの野生株に、Ｌ−リジン１０ｍ
Ｍの代わりに、ＡＥＣ１、３または４．５ｍＭを用いる
以外は（１）と同様の操作を行い、ＡＥＣ耐性株を得
た。得られた74株のＡＥＣ耐性株について（１）と同様
に試験管培養を行った。これらの株のＬ−リジン蓄積の
分布を表１に示す。
Ｃ耐性株の取得 メチロモナス・アルバスの野生株に、Ｌ−リジン１０ｍ
Ｍの代わりに、ＡＥＣ１、３または４．５ｍＭを用いる
以外は（１）と同様の操作を行い、ＡＥＣ耐性株を得
た。得られた74株のＡＥＣ耐性株について（１）と同様
に試験管培養を行った。これらの株のＬ−リジン蓄積の
分布を表１に示す。
【００６１】
【表１】 表１ メチロモナス・アルハ゛ス由来AEC耐性株のL-リシ゛ン蓄積の分布 ─────────────────────────── L-Lys(mg/L) 菌 株 ─────────────────── 0 〜 0.50 〜 1.00 ─────────────────────────── 野生株 1 0 0 1mM AEC耐性株 34 2 0 3mM AEC耐性株 2 16 16 4.5mM AEC耐性株 0 1 1 ───────────────────────────
【００６２】野生株ではＬ−リジンの蓄積は認められな
かったが、１ｍＭ ＡＥＣ耐性株では３６株中２株でＬ
−リジンの蓄積が認められた。３ｍＭ ＡＥＣ 耐性株で
は３４株中３２株でリジンの蓄積が認められ、うち１６
株のＬ−リジン蓄積は０．５０ｍｇ／Ｌより多かった。
４．５ｍＭ ＡＥＣ耐性株では２株中２株ともＬ−リジ
ンの蓄積が認められ、うち１株のＬ−リジン蓄積は０．
５０ｍｇ／Ｌより多かった。これらのＡＥＣ耐性株の中
で最もＬ−リジン蓄積の高かった株をＮｏ．１３５−３
−６３菌と命名した。Ｎｏ．１３５−３−６３は、プラ
イベートナンバーAJ13631が付与され、１９９９年８月
６日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１
番３号）にＦＥＲＭ Ｐ−１７５０８の受託番号で寄託
され、2000年7月27日にブダペスト条約に基づく国際寄
託に移管され、受託番号FERM BP-7251が付与されてい
る。
かったが、１ｍＭ ＡＥＣ耐性株では３６株中２株でＬ
−リジンの蓄積が認められた。３ｍＭ ＡＥＣ 耐性株で
は３４株中３２株でリジンの蓄積が認められ、うち１６
株のＬ−リジン蓄積は０．５０ｍｇ／Ｌより多かった。
４．５ｍＭ ＡＥＣ耐性株では２株中２株ともＬ−リジ
ンの蓄積が認められ、うち１株のＬ−リジン蓄積は０．
５０ｍｇ／Ｌより多かった。これらのＡＥＣ耐性株の中
で最もＬ−リジン蓄積の高かった株をＮｏ．１３５−３
−６３菌と命名した。Ｎｏ．１３５−３−６３は、プラ
イベートナンバーAJ13631が付与され、１９９９年８月
６日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１
番３号）にＦＥＲＭ Ｐ−１７５０８の受託番号で寄託
され、2000年7月27日にブダペスト条約に基づく国際寄
託に移管され、受託番号FERM BP-7251が付与されてい
る。
【００６３】
【実施例２】メチロモナス・アルバスのＬ−リジン耐性
株を用いたＬ−アミノ酸の製造 メチロモナス・アルバスの野生株及びＮｏ．１０７−４
株を、それぞれ寒天を１．５％含むＮＭＳ培地に２白金
耳量植菌し、５０％メタン存在下、３０℃、７日間培養
した。得られた菌体の全量を、１Ｌ容培養槽（バイオッ
ト(株)製）に入った５００ｍｌのＣｕＳＯ4 ４μＭを添
加したＡＭＳ培地に植菌し、３０℃、４００ｒｐｍ以上
の攪拌、溶存酸素濃度≧５ｐｐｍ、空気２００ｍｌ/
分、メタン１００ｍｌ/分の条件で培養した。ＡＭＳ培
地は、ＮＭＳ培地のＫＮＯ3を窒素として等量のＮＨ4Ｃ
ｌに置き換えた培地である。なお、培養中、培養液のｐ
ＨはアンモニアガスでｐＨ６．５に自動調節した。ま
た、培養３９時間目及び６５時間目に１ｍＭ ＣｕＳＯ4
を１０ｍｌ添加した。
株を用いたＬ−アミノ酸の製造 メチロモナス・アルバスの野生株及びＮｏ．１０７−４
株を、それぞれ寒天を１．５％含むＮＭＳ培地に２白金
耳量植菌し、５０％メタン存在下、３０℃、７日間培養
した。得られた菌体の全量を、１Ｌ容培養槽（バイオッ
ト(株)製）に入った５００ｍｌのＣｕＳＯ4 ４μＭを添
加したＡＭＳ培地に植菌し、３０℃、４００ｒｐｍ以上
の攪拌、溶存酸素濃度≧５ｐｐｍ、空気２００ｍｌ/
分、メタン１００ｍｌ/分の条件で培養した。ＡＭＳ培
地は、ＮＭＳ培地のＫＮＯ3を窒素として等量のＮＨ4Ｃ
ｌに置き換えた培地である。なお、培養中、培養液のｐ
ＨはアンモニアガスでｐＨ６．５に自動調節した。ま
た、培養３９時間目及び６５時間目に１ｍＭ ＣｕＳＯ4
を１０ｍｌ添加した。
【００６４】培養終了後、菌体を遠心分離で除去し、得
られた培養上清に含まれるＬ−アミノ酸をアミノ酸アナ
ライザーで定量した。結果を表２に示す。Ｎｏ．１０７
−４株の培養上清中のＬ−アミノ酸は、野生株のそれと
比べてL-Valは１３倍、L-Leuは４倍、L-Tyrは３倍、L-P
heは２倍、L-ILeは１．７倍に増加していた。また、野
生株ではL-Lysは検出されなかったが、Ｎｏ．１０７−
４株では3.9mg/L蓄積していた。
られた培養上清に含まれるＬ−アミノ酸をアミノ酸アナ
ライザーで定量した。結果を表２に示す。Ｎｏ．１０７
−４株の培養上清中のＬ−アミノ酸は、野生株のそれと
比べてL-Valは１３倍、L-Leuは４倍、L-Tyrは３倍、L-P
heは２倍、L-ILeは１．７倍に増加していた。また、野
生株ではL-Lysは検出されなかったが、Ｎｏ．１０７−
４株では3.9mg/L蓄積していた。
【００６５】
【表２】
【００６６】
【実施例３】メチロモナス・アルバスのＡＥＣ耐性株を
用いたＬ−リジンの製造 メチロモナス・アルバスの野生株及びＡＥＣ耐性株Ｎ
ｏ．１３５−３−６３のコロニー１個を、それぞれ寒天
を１．５％含むＮＭＳ培地に植菌し、５０％メタン存在
下、３０℃、７日間培養した。この種培養を１/１０白
金耳量、３０ｍｌ容耐圧試験管に入った３ｍｌのＮＭＳ
培地に植菌し、メタン１５ｍｌを封入後、３０℃で７２
時間振とう培養した。培養終了後、菌体を遠心分離で除
去し、得られた培養上清に含まれるＬ−アミノ酸を、ア
ミノ酸アナライザーで定量した。結果を表３に示す。
野生株では培養上清中にL-Lysは検出されなかったが、
Ｎｏ．１３５−３−６３株では0.86mg/LのL-Lysが蓄積
した。
用いたＬ−リジンの製造 メチロモナス・アルバスの野生株及びＡＥＣ耐性株Ｎ
ｏ．１３５−３−６３のコロニー１個を、それぞれ寒天
を１．５％含むＮＭＳ培地に植菌し、５０％メタン存在
下、３０℃、７日間培養した。この種培養を１/１０白
金耳量、３０ｍｌ容耐圧試験管に入った３ｍｌのＮＭＳ
培地に植菌し、メタン１５ｍｌを封入後、３０℃で７２
時間振とう培養した。培養終了後、菌体を遠心分離で除
去し、得られた培養上清に含まれるＬ−アミノ酸を、ア
ミノ酸アナライザーで定量した。結果を表３に示す。
野生株では培養上清中にL-Lysは検出されなかったが、
Ｎｏ．１３５−３−６３株では0.86mg/LのL-Lysが蓄積
した。
【００６７】
【表３】 表３ メチロモナス・アルハ゛ス由来AEC耐性株のL-リシ゛ン蓄積 ─────────────────────── 菌 株 L-Lys(mg/L) ─────────────────────── 野生株 0.00 No.135-3-63 0.86 ───────────────────────
【００６８】
【実施例４】メチロコッカス・カプスラツス バス株由
来ＡＥＣ耐性株の取得 メチロコッカス・カプスラツス バス株の野生株ＮＣＩ
ＭＢ １１１３２株を、ＮＭＳ培地でメタン存在下、３
７℃、４８時間培養して得られた菌体を、常法によりＮ
ＴＧによって変異処理（ＮＴＧ ２５μg/ml、３０℃、
３０分）した。ＮＣＩＭＢ １１１３２株は、The Natio
nal Collections of Industrial and Marine Bacteria
Ltd.（住所：NCIMB Lts., Torry Research Station 135
Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）か
ら入手することができる。上記の変異処理した菌体を、
ＡＥＣ ３ｍＭを含有するＮＭＳ寒天培地に塗布し、５
０％メタン存在下、３７℃で３〜３０日間培養した。出
現したコロニーを分離してＮＭＳ寒天培地に植菌し、５
０％メタン存在下、３７℃で３〜３０日間培養した。こ
の様にして得たAEC耐性株１／１０白金耳量を、３０ｍ
ｌ容耐圧試験管内の３ｍｌのＮＭＳ培地に植菌し、メタ
ン１５ｍｌを封入後、３７℃で３日間振とう培養した。
来ＡＥＣ耐性株の取得 メチロコッカス・カプスラツス バス株の野生株ＮＣＩ
ＭＢ １１１３２株を、ＮＭＳ培地でメタン存在下、３
７℃、４８時間培養して得られた菌体を、常法によりＮ
ＴＧによって変異処理（ＮＴＧ ２５μg/ml、３０℃、
３０分）した。ＮＣＩＭＢ １１１３２株は、The Natio
nal Collections of Industrial and Marine Bacteria
Ltd.（住所：NCIMB Lts., Torry Research Station 135
Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）か
ら入手することができる。上記の変異処理した菌体を、
ＡＥＣ ３ｍＭを含有するＮＭＳ寒天培地に塗布し、５
０％メタン存在下、３７℃で３〜３０日間培養した。出
現したコロニーを分離してＮＭＳ寒天培地に植菌し、５
０％メタン存在下、３７℃で３〜３０日間培養した。こ
の様にして得たAEC耐性株１／１０白金耳量を、３０ｍ
ｌ容耐圧試験管内の３ｍｌのＮＭＳ培地に植菌し、メタ
ン１５ｍｌを封入後、３７℃で３日間振とう培養した。
【００６９】培養終了後、菌体を遠心分離で除去し、得
られた培養上清に含まれるアミノ酸をアミノ酸アナライ
ザー(日立Ｌ−８５００)で分析した。親株である野生株
と比較して、Ｌ−アミノ酸の蓄積量が増加した菌株を選
び、Ｎｏ．１６７−２２、Ｎｏ．１６７−８７菌と命名
した。Ｎｏ．１６７−２２は、プライベートナンバーAJ
13618が付与され、１９９９年８月６日に、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566
日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ
Ｐ−１７５０６の受託番号で寄託され、2000年7月27
日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託
番号FERM BP-7249が付与されている。
られた培養上清に含まれるアミノ酸をアミノ酸アナライ
ザー(日立Ｌ−８５００)で分析した。親株である野生株
と比較して、Ｌ−アミノ酸の蓄積量が増加した菌株を選
び、Ｎｏ．１６７−２２、Ｎｏ．１６７−８７菌と命名
した。Ｎｏ．１６７−２２は、プライベートナンバーAJ
13618が付与され、１９９９年８月６日に、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566
日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ
Ｐ−１７５０６の受託番号で寄託され、2000年7月27
日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託
番号FERM BP-7249が付与されている。
【００７０】
【実施例５】メチロコッカス・カプスラツス バス株の
ＡＥＣ耐性株を用いたＬ−アミノ酸の製造 メチロコッカス・カプスラツス バス株の野生株及びＡ
ＥＣ耐性株Ｎｏ．１６７−２２、Ｎｏ．１６７−８７の
コロニー１個をそれぞれ寒天を１．５％含むＮＭＳ培地
に植菌し、５０％メタン存在下、３７℃、７日間培養し
た。この種培養１/１０白金耳量を、３０ｍｌ容耐圧試
験管に入った３ｍｌのＮＭＳ培地に植菌し、メタン１５
ｍｌを封入後、３７℃で７２時間振とう培養した。培養
終了後、菌体を遠心分離で除去し、得られた培養上清に
含まれるＬ−アミノ酸をアミノ酸アナライザーで定量し
た。結果を表４に示す。
ＡＥＣ耐性株を用いたＬ−アミノ酸の製造 メチロコッカス・カプスラツス バス株の野生株及びＡ
ＥＣ耐性株Ｎｏ．１６７−２２、Ｎｏ．１６７−８７の
コロニー１個をそれぞれ寒天を１．５％含むＮＭＳ培地
に植菌し、５０％メタン存在下、３７℃、７日間培養し
た。この種培養１/１０白金耳量を、３０ｍｌ容耐圧試
験管に入った３ｍｌのＮＭＳ培地に植菌し、メタン１５
ｍｌを封入後、３７℃で７２時間振とう培養した。培養
終了後、菌体を遠心分離で除去し、得られた培養上清に
含まれるＬ−アミノ酸をアミノ酸アナライザーで定量し
た。結果を表４に示す。
【００７１】培養上清中のＬ−アミノ酸は、野生株と比
べて、Ｎｏ．１６７−２２ではL-Aspは２倍、L-Thrは２
倍、L-Serは３倍、L-Gluは２倍、L-Valは１０倍、L-Ile
は１７倍、L-Leuは６９倍、L-Tyrは２倍、L-Pheは１３
倍に、Ｎｏ．１６７−８７ではL-Aspは６倍、L-Thrは３
倍、L-Serは４倍、L-Gluは３倍、L-Ileは３倍、L-Leuは
７倍、L-Pheは４倍、L-Lysは２倍、L-Hisは２倍、L-Arg
は４倍に、それぞれ増加していた。また、L-Alaは、野
生株では検出されなかったが、Ｎｏ．１６７−２２及び
Ｎｏ．１６７−８７では、それぞれ1.73mg/L、1.74mg/L
蓄積した。
べて、Ｎｏ．１６７−２２ではL-Aspは２倍、L-Thrは２
倍、L-Serは３倍、L-Gluは２倍、L-Valは１０倍、L-Ile
は１７倍、L-Leuは６９倍、L-Tyrは２倍、L-Pheは１３
倍に、Ｎｏ．１６７−８７ではL-Aspは６倍、L-Thrは３
倍、L-Serは４倍、L-Gluは３倍、L-Ileは３倍、L-Leuは
７倍、L-Pheは４倍、L-Lysは２倍、L-Hisは２倍、L-Arg
は４倍に、それぞれ増加していた。また、L-Alaは、野
生株では検出されなかったが、Ｎｏ．１６７−２２及び
Ｎｏ．１６７−８７では、それぞれ1.73mg/L、1.74mg/L
蓄積した。
【００７２】
【表４】
【００７３】
【実施例６】メチロシナス・トリコスポリウム ＯＢ３
ｂ株由来ＡＥＣ耐性株の取得 メチロシナス・トリコスポリウム ＯＢ３ｂ株の野生株
ＮＣＩＭＢ １１１３１株をＮＭＳ培地でメタン存在
下、３０℃、４８時間培養して得られた菌体を、常法に
よりＮＴＧによって変異処理（ＮＴＧ ３０μg/ml、３
０℃、３０分）した。ＮＣＩＭＢ １１１３１株は、The
National Collections of Industrial andMarine Bact
eria Ltd.（住所：NCIMB Lts., Torry Research Statio
n 135 AbbeyRoad, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdo
m）から入手することができる。上記の変異処理した菌
体をＡＥＣ ３ｍＭを含有するＮＭＳ寒天培地に塗布
し、５０％メタン存在下、３７℃で７〜３０日間培養し
た。出現したコロニーを分離してＮＭＳ寒天培地に植菌
し、５０％メタン存在下、３７℃で７〜３０日間培養し
た。この様にして得たＡＥＣ耐性株1/１０白金耳量を、
３０ｍｌ容耐圧試験管内の３ｍｌのＮＭＳ培地に植菌
し、メタン１５ｍｌを封入後、３０℃で５日間振とう培
養した。
ｂ株由来ＡＥＣ耐性株の取得 メチロシナス・トリコスポリウム ＯＢ３ｂ株の野生株
ＮＣＩＭＢ １１１３１株をＮＭＳ培地でメタン存在
下、３０℃、４８時間培養して得られた菌体を、常法に
よりＮＴＧによって変異処理（ＮＴＧ ３０μg/ml、３
０℃、３０分）した。ＮＣＩＭＢ １１１３１株は、The
National Collections of Industrial andMarine Bact
eria Ltd.（住所：NCIMB Lts., Torry Research Statio
n 135 AbbeyRoad, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdo
m）から入手することができる。上記の変異処理した菌
体をＡＥＣ ３ｍＭを含有するＮＭＳ寒天培地に塗布
し、５０％メタン存在下、３７℃で７〜３０日間培養し
た。出現したコロニーを分離してＮＭＳ寒天培地に植菌
し、５０％メタン存在下、３７℃で７〜３０日間培養し
た。この様にして得たＡＥＣ耐性株1/１０白金耳量を、
３０ｍｌ容耐圧試験管内の３ｍｌのＮＭＳ培地に植菌
し、メタン１５ｍｌを封入後、３０℃で５日間振とう培
養した。
【００７４】培養終了後、菌体を遠心分離で除去し、得
られた培養上清に含まれるアミノ酸をアミノ酸アナライ
ザー(日立Ｌ−８５００)で分析した。親株である野生株
と比較して、Ｌ−アミノ酸の蓄積量が増加した菌株を選
び、Ｎｏ．１７１−１５、Ｎｏ．１７１−３５菌と命名
した。Ｎｏ．１７１−３５は、プライベートナンバーAJ
13677が付与され、２０００年５月１５日に、通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-85
66 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に国際寄
託され、受託番号FERM BP-7159が付与されている。
られた培養上清に含まれるアミノ酸をアミノ酸アナライ
ザー(日立Ｌ−８５００)で分析した。親株である野生株
と比較して、Ｌ−アミノ酸の蓄積量が増加した菌株を選
び、Ｎｏ．１７１−１５、Ｎｏ．１７１−３５菌と命名
した。Ｎｏ．１７１−３５は、プライベートナンバーAJ
13677が付与され、２０００年５月１５日に、通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-85
66 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に国際寄
託され、受託番号FERM BP-7159が付与されている。
【００７５】
【実施例７】メチロシナス・トリコスポリウム ＯＢ３
ｂ株のＡＥＣ耐性株を用いたＬ−アミノ酸の製造 メチロシナス・トリコスポリウム ＯＢ３ｂ株の野生株
及びＡＥＣ耐性株Ｎｏ．１７１−１５、Ｎｏ．１７１−
３５のコロニー１個を、それぞれ寒天を１．５％含むＮ
ＭＳ培地に植菌し、５０％メタン存在下、３７℃、１４
日間培養した。この種培養１/１０白金耳量を、３０ｍ
ｌ容耐圧試験管に入った３ｍｌのＮＭＳ培地に植菌し、
メタン１５ｍｌを封入後、３０℃で１２０時間振とう培
養した。培養終了後、菌体を遠心分離で除去し、得られ
た培養上清に含まれるＬ−アミノ酸をアミノ酸アナライ
ザーで定量した。結果を表５に示す。
ｂ株のＡＥＣ耐性株を用いたＬ−アミノ酸の製造 メチロシナス・トリコスポリウム ＯＢ３ｂ株の野生株
及びＡＥＣ耐性株Ｎｏ．１７１−１５、Ｎｏ．１７１−
３５のコロニー１個を、それぞれ寒天を１．５％含むＮ
ＭＳ培地に植菌し、５０％メタン存在下、３７℃、１４
日間培養した。この種培養１/１０白金耳量を、３０ｍ
ｌ容耐圧試験管に入った３ｍｌのＮＭＳ培地に植菌し、
メタン１５ｍｌを封入後、３０℃で１２０時間振とう培
養した。培養終了後、菌体を遠心分離で除去し、得られ
た培養上清に含まれるＬ−アミノ酸をアミノ酸アナライ
ザーで定量した。結果を表５に示す。
【００７６】培養上清中のＬ−アミノ酸は、野生株と比
べて、Ｎｏ．１７１−１５ではL-Thrは３倍、L-Alaは３
倍、L-Valは１０倍、L-Ileは３倍、L-Leuは１１倍、L-P
heは３倍に、Ｎｏ．１７１−３５ではL-Alaは２倍、L-L
euは３９倍、L-Pheは２倍に、それぞれ増加していた。
また、L-Lysは、野生株では検出されなかったが、Ｎ
ｏ．１７１−１５及びＮｏ．１７１−３５では、それぞ
れ0.19mg/L、0.27mg/L蓄積した。
べて、Ｎｏ．１７１−１５ではL-Thrは３倍、L-Alaは３
倍、L-Valは１０倍、L-Ileは３倍、L-Leuは１１倍、L-P
heは３倍に、Ｎｏ．１７１−３５ではL-Alaは２倍、L-L
euは３９倍、L-Pheは２倍に、それぞれ増加していた。
また、L-Lysは、野生株では検出されなかったが、Ｎ
ｏ．１７１−１５及びＮｏ．１７１−３５では、それぞ
れ0.19mg/L、0.27mg/L蓄積した。
【００７７】
【表５】
【００７８】
【実施例８】メチロモナス・アルバス及びメチロコッカ
ス・カプスラツスバスの野生株へのdapA*の導入 メチロモナス・アルバスまたはメチロコッカス・カプス
ラツス バス株へのdapA*の導入には、WO95/16042号に
記載されたＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除
された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロ
ジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードするＤＮＡ（da
pA*）を有するプラスミドＲＳＦ２４Ｐを用いた。ＲＳ
Ｆ２４Ｐは、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に
置換された変異型DDPSをコードするdapA*を、スレオニ
ンオペロンを含むプラスミドｐＶＩＣ４０（WO90/0463
6、特表平３−５０１６８２号公報）のテトラサイクリ
ン耐性遺伝子プロモーターの下流に連結して構築された
プラスミドである（図１参照）。尚、スレオニンオペロ
ンは、dapA*を連結する過程でｐＶＩＣ４０から削除さ
れている。ＲＳＦ２４Ｐプラスミドを エシェリヒア・
コリ JM109株に導入したものは、ＡＪ１２３９５と命名
され、１９９３年１０月２８日に工業技術院生命工学工
業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば
市東一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３９
３５として寄託され、１９９４年１１月１日にブダペス
ト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4858の受
託番号のもとで寄託されている。
ス・カプスラツスバスの野生株へのdapA*の導入 メチロモナス・アルバスまたはメチロコッカス・カプス
ラツス バス株へのdapA*の導入には、WO95/16042号に
記載されたＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除
された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロ
ジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードするＤＮＡ（da
pA*）を有するプラスミドＲＳＦ２４Ｐを用いた。ＲＳ
Ｆ２４Ｐは、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に
置換された変異型DDPSをコードするdapA*を、スレオニ
ンオペロンを含むプラスミドｐＶＩＣ４０（WO90/0463
6、特表平３−５０１６８２号公報）のテトラサイクリ
ン耐性遺伝子プロモーターの下流に連結して構築された
プラスミドである（図１参照）。尚、スレオニンオペロ
ンは、dapA*を連結する過程でｐＶＩＣ４０から削除さ
れている。ＲＳＦ２４Ｐプラスミドを エシェリヒア・
コリ JM109株に導入したものは、ＡＪ１２３９５と命名
され、１９９３年１０月２８日に工業技術院生命工学工
業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば
市東一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３９
３５として寄託され、１９９４年１１月１日にブダペス
ト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4858の受
託番号のもとで寄託されている。
【００７９】一方、コントロールとして、ＲＳＦ２４Ｐ
を作製する際に用いたｐＶＩＣ４０よりスレオニンオペ
ロンをコードするＤＮＡ領域が削除され、ベクター部分
のみを持つプラスミドｐＲＳ（WO90/04636、特表平３−
５０１６８２号公報参照）を用いた。ｐＲＳは、以下の
ようにして作製された。ｐＶＩＣ４０をＥｃｏＲＩで切
断し、約６．５ｋｂのスレオニンオペロン含有断片を除
去した。この操作により、ストレプトマイシン耐性遺伝
子のプロモーターが削除され、同遺伝子の発現が不安定
になるため、次にそのＥｃｏＲＩサイトにアテニュエー
ターを除去したスレオニンオペロンプロモーターをスト
レプトマイシン耐性遺伝子に対して正方向に挿入した。
スレオニンオペロンプロモーターは、常法に従い下記の
オリゴヌクレオチドＰＴ−４、ＰＴ−５をプライマーと
し、ｐＶＩＣ４０を鋳型とするＰＣＲによって調製した
２２４ｂｐの断片をＥｃｏＲＩ及びＭｕｎＩで切断後、
ＥｃｏＲＩで切断したｐＶＩＣ４０に連結することによ
り、同プラスミドに挿入した。得られたプラスミドでエ
シェリヒア・コリJM109を形質転換し、各形質転換株に
ついてＰＴ−４と下記のプライマーＳＭ−１を用いてＰ
ＣＲを行い、約２７０ｂｐのバンドが検出されたものを
ストレプトマイシン耐性遺伝子に正方向にプロモーター
が挿入されたものとして選択した。
を作製する際に用いたｐＶＩＣ４０よりスレオニンオペ
ロンをコードするＤＮＡ領域が削除され、ベクター部分
のみを持つプラスミドｐＲＳ（WO90/04636、特表平３−
５０１６８２号公報参照）を用いた。ｐＲＳは、以下の
ようにして作製された。ｐＶＩＣ４０をＥｃｏＲＩで切
断し、約６．５ｋｂのスレオニンオペロン含有断片を除
去した。この操作により、ストレプトマイシン耐性遺伝
子のプロモーターが削除され、同遺伝子の発現が不安定
になるため、次にそのＥｃｏＲＩサイトにアテニュエー
ターを除去したスレオニンオペロンプロモーターをスト
レプトマイシン耐性遺伝子に対して正方向に挿入した。
スレオニンオペロンプロモーターは、常法に従い下記の
オリゴヌクレオチドＰＴ−４、ＰＴ−５をプライマーと
し、ｐＶＩＣ４０を鋳型とするＰＣＲによって調製した
２２４ｂｐの断片をＥｃｏＲＩ及びＭｕｎＩで切断後、
ＥｃｏＲＩで切断したｐＶＩＣ４０に連結することによ
り、同プラスミドに挿入した。得られたプラスミドでエ
シェリヒア・コリJM109を形質転換し、各形質転換株に
ついてＰＴ−４と下記のプライマーＳＭ−１を用いてＰ
ＣＲを行い、約２７０ｂｐのバンドが検出されたものを
ストレプトマイシン耐性遺伝子に正方向にプロモーター
が挿入されたものとして選択した。
【００８０】 〔プライマー〕 PT-4： GCGCGAATTCCAACGGGCAATATGTCTCTG（配列番号
３） PT-5： GCGCCAATTGGATGTACCGCCGAACTTCAA（配列番号
４） SM-1： CAGTTTTCTGATGAAGCGCG（配列番号５）
３） PT-5： GCGCCAATTGGATGTACCGCCGAACTTCAA（配列番号
４） SM-1： CAGTTTTCTGATGAAGCGCG（配列番号５）
【００８１】上記のようにして得られたｐＲＳまたはＲ
ＳＦ２４Ｐを、常法に従いエシェリヒア・コリ菌Ｓ１７
−１に導入し、Ｓ１７−１／ｐＲＳまたはＳ１７−１／
ＲＳＦ２４Ｐを得た。
ＳＦ２４Ｐを、常法に従いエシェリヒア・コリ菌Ｓ１７
−１に導入し、Ｓ１７−１／ｐＲＳまたはＳ１７−１／
ＲＳＦ２４Ｐを得た。
【００８２】Ｓ１７−１／ｐＲＳまたはＳ１７−１／Ｒ
ＳＦ２４Ｐを、３０ｍｌ容試験管に入ったストレプトマ
イシン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地３ｍｌに植菌し、
３７℃で１８時間振とう培養した。一方、メチロモナス
・アルバスまたはメチロコッカス・カプスラツス バス
株の野生株を、３０ｍｌ容耐圧試験管に入ったＮＭＳ培
地３ｍｌに植菌し、メタン１５ｍｌを封入し、メチロモ
ナス・アルバスは３０℃で、メチロコッカス・カプスラ
ツス バス株は３７℃で、２日間振とう培養した。
ＳＦ２４Ｐを、３０ｍｌ容試験管に入ったストレプトマ
イシン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地３ｍｌに植菌し、
３７℃で１８時間振とう培養した。一方、メチロモナス
・アルバスまたはメチロコッカス・カプスラツス バス
株の野生株を、３０ｍｌ容耐圧試験管に入ったＮＭＳ培
地３ｍｌに植菌し、メタン１５ｍｌを封入し、メチロモ
ナス・アルバスは３０℃で、メチロコッカス・カプスラ
ツス バス株は３７℃で、２日間振とう培養した。
【００８３】Ｓ１７−１／ｐＲＳまたはＳ１７−１／Ｒ
ＳＦ２４Ｐの培養液０．１ｍｌと、メチロモナス・アル
バスまたはメチロコッカス・カプスラツス バス株の野
生株の培養液１．４ｍｌを、１．５ｍｌ容マイクロチュ
ーブ中で混合後、遠心して上清を除いた。得られた菌体
のペレットを５０℃、１分間ヒートショックを与えた
後、少量のＮＭＳ培地にけん濁してメンブレンフィルタ
ー上に移した。このメンブレンフィルターを寒天１．５
％を含むＮＭＳ培地に載せ、メチロモナス・アルバスは
３０℃で、メチロコッカス・カプスラツス バスは３７
℃で静置した。４時間後メンブレンフィルターを少量の
ＮＭＳ培地で洗い、菌体をマイクロチューブ中に回収し
た。この菌体をストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ及び
寒天１．５％を含むＮＭＳ培地に塗布し、メチロモナス
・アルバスは３０℃で、メチロコッカス・カプスラツス
バス株は３７℃で、３〜１４日間培養した。出現した
コロニーを３０ｍｌ容耐圧試験管に入ったストレプトマ
イシン１０μｇ／ｍｌを含むＮＭＳ培地３ｍｌに植菌
し、メタン１５ｍｌを封入し、メチロモナス・アルバス
は３０℃で、メチロコッカス・カプスラツス バス株は
３７℃で１０日間振とう培養した。
ＳＦ２４Ｐの培養液０．１ｍｌと、メチロモナス・アル
バスまたはメチロコッカス・カプスラツス バス株の野
生株の培養液１．４ｍｌを、１．５ｍｌ容マイクロチュ
ーブ中で混合後、遠心して上清を除いた。得られた菌体
のペレットを５０℃、１分間ヒートショックを与えた
後、少量のＮＭＳ培地にけん濁してメンブレンフィルタ
ー上に移した。このメンブレンフィルターを寒天１．５
％を含むＮＭＳ培地に載せ、メチロモナス・アルバスは
３０℃で、メチロコッカス・カプスラツス バスは３７
℃で静置した。４時間後メンブレンフィルターを少量の
ＮＭＳ培地で洗い、菌体をマイクロチューブ中に回収し
た。この菌体をストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ及び
寒天１．５％を含むＮＭＳ培地に塗布し、メチロモナス
・アルバスは３０℃で、メチロコッカス・カプスラツス
バス株は３７℃で、３〜１４日間培養した。出現した
コロニーを３０ｍｌ容耐圧試験管に入ったストレプトマ
イシン１０μｇ／ｍｌを含むＮＭＳ培地３ｍｌに植菌
し、メタン１５ｍｌを封入し、メチロモナス・アルバス
は３０℃で、メチロコッカス・カプスラツス バス株は
３７℃で１０日間振とう培養した。
【００８４】培養終了後、培養液より遠心により菌体を
分離し、常法によりプラスミドの存在を確認した。以
下、ｐＲＳまたはＲＳＦ２４Ｐを保持するメチロモナス
・アルバスを、メチロモナス・アルバス／ｐＲＳまたは
メチロモナス・アルバス／ＲＳＦ２４Ｐと呼称する。ｐ
ＲＳまたはＲＳＦ２４Ｐを保持するメチロコッカス・カ
プスラツス バス株を、メチロコッカス・カプスラツス
バス／ｐＲＳまたはメチロコッカス・カプスラツス
バス／ＲＳＦ２４Ｐと呼称する。
分離し、常法によりプラスミドの存在を確認した。以
下、ｐＲＳまたはＲＳＦ２４Ｐを保持するメチロモナス
・アルバスを、メチロモナス・アルバス／ｐＲＳまたは
メチロモナス・アルバス／ＲＳＦ２４Ｐと呼称する。ｐ
ＲＳまたはＲＳＦ２４Ｐを保持するメチロコッカス・カ
プスラツス バス株を、メチロコッカス・カプスラツス
バス／ｐＲＳまたはメチロコッカス・カプスラツス
バス／ＲＳＦ２４Ｐと呼称する。
【００８５】
【実施例９】メチロモナス・アルバスにおけるdapA*遺
伝子増幅効果 メチロモナス・アルバスの野生株、 メチロモナス・ア
ルバス/ｐＲＳ(ベクターのみ)、及びメチロモナス・ア
ルバス/ＲＳＦ２４Ｐ（ｄａｐＡ*）を、プラスミド保持
菌についてはＮＭＳ培地の代わりにストレプトマイシン
１０μｇ／ｍｌを含むＮＭＳ培地を用いる以外は実施例
３と同様に培養し、培養上清に含まれるアミノ酸を定量
した。結果を表６に示す。dapA*増幅株では、L-Lys蓄積
の増加がみられた。
伝子増幅効果 メチロモナス・アルバスの野生株、 メチロモナス・ア
ルバス/ｐＲＳ(ベクターのみ)、及びメチロモナス・ア
ルバス/ＲＳＦ２４Ｐ（ｄａｐＡ*）を、プラスミド保持
菌についてはＮＭＳ培地の代わりにストレプトマイシン
１０μｇ／ｍｌを含むＮＭＳ培地を用いる以外は実施例
３と同様に培養し、培養上清に含まれるアミノ酸を定量
した。結果を表６に示す。dapA*増幅株では、L-Lys蓄積
の増加がみられた。
【００８６】
【表６】 表６ メチロモナス・アルハ゛スにおけるdapA*増幅効果 ────────────────────────── 菌 株 L-Lyｓ蓄積(mg/L) ────────────────────────── メチロモナス・アルバス 0.00 メチロモナス・アルバス/pRS 0.00 メチロモナス・アルバス/RSF24P 0.48 ──────────────────────────
【００８７】
【実施例１０】メチロコッカス・カプスラツス バス株
におけるdapA*遺伝子増幅効果 メチロコッカス・カプスラツス バスの野生株、 メチ
ロコッカス・カプスラツス バス/ｐＲＳ(ベクターの
み)、及びメチロコッカス・カプスラツス バス/ＲＳＦ
２４Ｐ（dapA*）を、３０℃の代わりに３７℃で培養す
る以外は実施例９と同様に培養し、培養上清に含まれる
アミノ酸を定量した。結果を表７に示す。dapA*増幅株
では、L-Lys蓄積の増加がみられた。
におけるdapA*遺伝子増幅効果 メチロコッカス・カプスラツス バスの野生株、 メチ
ロコッカス・カプスラツス バス/ｐＲＳ(ベクターの
み)、及びメチロコッカス・カプスラツス バス/ＲＳＦ
２４Ｐ（dapA*）を、３０℃の代わりに３７℃で培養す
る以外は実施例９と同様に培養し、培養上清に含まれる
アミノ酸を定量した。結果を表７に示す。dapA*増幅株
では、L-Lys蓄積の増加がみられた。
【００８８】
【表７】 表７ メチロコッカス・カフ゜スラツス ハ゛ス株におけるdapA*増幅効果 ───────────────────────────── 菌 株 L-Lys蓄積(mg/L) ───────────────────────────── メチロコッカス・カプスラツス バス 0.23 メチロコッカス・カプスラツス バス/pRS 0.25 メチロコッカス・カプスラツス バス/RSF24P 3.07 ─────────────────────────────
【００８９】
【実施例１１】メチロコッカス・カプスラツス バス株
を用いたＬ−アミノ酸の製造 メチロコッカス・カプスラツス バスの野生株、メチロ
コッカス・カプスラツス バス/ｐＲＳ、及びメチロコ
ッカス・カプスラツス バス/ＲＳＦ２４Ｐを、３０℃
の代わりに３７℃で培養した以外は、実施例２と同様の
条件で培養した。なお、プラスミドを有する菌を培養す
る培地には、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加
した。また、培養１９時間目、６５時間目に、１ｍＭ
ＣｕＳＯ4を１０ｍｌ追加した。
を用いたＬ−アミノ酸の製造 メチロコッカス・カプスラツス バスの野生株、メチロ
コッカス・カプスラツス バス/ｐＲＳ、及びメチロコ
ッカス・カプスラツス バス/ＲＳＦ２４Ｐを、３０℃
の代わりに３７℃で培養した以外は、実施例２と同様の
条件で培養した。なお、プラスミドを有する菌を培養す
る培地には、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加
した。また、培養１９時間目、６５時間目に、１ｍＭ
ＣｕＳＯ4を１０ｍｌ追加した。
【００９０】培養終了後、菌体を遠心分離で除去し、得
られた培養上清に含まれるＬ−アミノ酸をアミノ酸アナ
ライザーで定量した。結果を表８に示す。メチロコッカ
ス・カプスラツス バス／ＲＳＦ２４Ｐは223mg/LのL-L
ysを蓄積した。また、野生株及びメチロコッカス・カプ
スラツス バス／ｐＲＳは、それぞれ122mg/L、220mg/L
のL-Gluを蓄積した。
られた培養上清に含まれるＬ−アミノ酸をアミノ酸アナ
ライザーで定量した。結果を表８に示す。メチロコッカ
ス・カプスラツス バス／ＲＳＦ２４Ｐは223mg/LのL-L
ysを蓄積した。また、野生株及びメチロコッカス・カプ
スラツス バス／ｐＲＳは、それぞれ122mg/L、220mg/L
のL-Gluを蓄積した。
【００９１】
【表８】
【００９２】
【実施例１２】メチロコッカス・カプスラツス バスの
野生株へのdapA*、lysC*、dapB及びddhの導入 メチロコッカス・カプスラツス バス株へのdapA*、lys
C*、dapB及びddhの導入には、WO95/16042に記載され
た、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された
変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコ
リン酸合成酵素（DDPS）をコードするDNA(dapA*24)
と、L-リジンによるフィードバック阻害が解除された変
異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナー
ゼIIIをコードするDNA(lysC*80)と、エシェリヒア・コ
リ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードす
るDNA(dapB)と、及びブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼを
コードするDNA(ddh)を有するプラスミドpCABD2を用い
た。
野生株へのdapA*、lysC*、dapB及びddhの導入 メチロコッカス・カプスラツス バス株へのdapA*、lys
C*、dapB及びddhの導入には、WO95/16042に記載され
た、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された
変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコ
リン酸合成酵素（DDPS）をコードするDNA(dapA*24)
と、L-リジンによるフィードバック阻害が解除された変
異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナー
ゼIIIをコードするDNA(lysC*80)と、エシェリヒア・コ
リ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードす
るDNA(dapB)と、及びブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼを
コードするDNA(ddh)を有するプラスミドpCABD2を用い
た。
【００９３】上記のpCABD2を、常法に従いエシェリヒア
・コリJM109に導入し、JM109/pCABD2を得た。
・コリJM109に導入し、JM109/pCABD2を得た。
【００９４】JM109/pCABD2を、30ml容試験管に入ったス
トレプトマイシン20μg/mlを含むLB培地3mlに植菌し、3
7℃で18時間振とう培養した。同様に文献（Ditta, G.,
Stanfield, S., Corbin, D., and Helinski, D.R., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347(1980)）に記載の
エシェリヒア・コリHB101/pRK2013を、30ml容試験管に
入れたカナマイシン50μg/mlを含むLB培地に植菌し、37
℃で18時間振とう培養した。一方、メチロコッカス・カ
プスラツス バスの野生株は30ml容試験管に入れたNMS
培地3mlに植菌し、メタン15mlを封入し、37℃で、24時
間振とう培養した。
トレプトマイシン20μg/mlを含むLB培地3mlに植菌し、3
7℃で18時間振とう培養した。同様に文献（Ditta, G.,
Stanfield, S., Corbin, D., and Helinski, D.R., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347(1980)）に記載の
エシェリヒア・コリHB101/pRK2013を、30ml容試験管に
入れたカナマイシン50μg/mlを含むLB培地に植菌し、37
℃で18時間振とう培養した。一方、メチロコッカス・カ
プスラツス バスの野生株は30ml容試験管に入れたNMS
培地3mlに植菌し、メタン15mlを封入し、37℃で、24時
間振とう培養した。
【００９５】JM109/pCABD2及びHB101/pRK2013の培養液
各0.5mlを、それぞれ50mMリン酸バッファー(pH7.0)で２
回洗浄後、0.5mlの同バッファーに懸濁した。メチロコ
ッカス・カプスラツス バスの野生株の培養液1.3mlと、
JM109/pCABD2の菌懸濁液0.1ml及びHB101/pRK2013の菌懸
濁液0.1mlを混合後、遠心して上清を除いた。得られた
菌体に10μlのNMS培地を混合してNMSプレート上に移
し、50%メタン存在下、37℃で培養した。48時間後に菌
をプレートより回収し、ストレプトマイシン10μg/mlを
含むNMSプレートに蒔き、50%メタン存在下、37℃で1ヶ
月間培養した。
各0.5mlを、それぞれ50mMリン酸バッファー(pH7.0)で２
回洗浄後、0.5mlの同バッファーに懸濁した。メチロコ
ッカス・カプスラツス バスの野生株の培養液1.3mlと、
JM109/pCABD2の菌懸濁液0.1ml及びHB101/pRK2013の菌懸
濁液0.1mlを混合後、遠心して上清を除いた。得られた
菌体に10μlのNMS培地を混合してNMSプレート上に移
し、50%メタン存在下、37℃で培養した。48時間後に菌
をプレートより回収し、ストレプトマイシン10μg/mlを
含むNMSプレートに蒔き、50%メタン存在下、37℃で1ヶ
月間培養した。
【００９６】出現したコロニーをストレプトマイシン10
μg/mlを含むNMSプレートに植菌し、50%メタン存在下 3
7℃で6日間培養した。この菌を、30ml容試験管に入った
ストレプトマイシン10μg/mlを含むNMS培地3mlに植菌
し、メタン15mlを封入後、37℃で、41時間振とう培養し
た。
μg/mlを含むNMSプレートに植菌し、50%メタン存在下 3
7℃で6日間培養した。この菌を、30ml容試験管に入った
ストレプトマイシン10μg/mlを含むNMS培地3mlに植菌
し、メタン15mlを封入後、37℃で、41時間振とう培養し
た。
【００９７】培養終了後、培養液より遠心により菌体を
分離し、常法によりプラスミドの存在を確認した。以
下、pCABD2 を保持するメチロコッカス・カプスラツス
バス株を、メチロコッカス・カプスラツス バス/pCA
BD2と呼称する。
分離し、常法によりプラスミドの存在を確認した。以
下、pCABD2 を保持するメチロコッカス・カプスラツス
バス株を、メチロコッカス・カプスラツス バス/pCA
BD2と呼称する。
【００９８】
【実施例１３】メチロコッカス・カプスラツス バス株
におけるdapA*、lysC*、dapB 及び ddh遺伝子増幅効果 メチロコッカス・カプスラツス バス/pRS(ベクターの
み)、メチロコッカス・カプスラツス バス/RSF24P(dap
A*)、及びメチロコッカス・カプスラツス バス/pCABD2
(dapA*、lysC*、dapB及びddh)を、それぞれ30ml容試験
管に入ったNMS培地 3mlに植菌し、15mlのメタンを封入
し、37℃で、65時間振とう培養した。ただし、プラスミ
ド保持菌についてはNMS培地の代わりにストレプトマイ
シン10μg/mlを含むNMS培地を用いた。培養22時間目、4
2時間目に試験管内の気相を空気で置換し、新たにメタ
ン15mlを封入した。実施例３と同様に、培養終了時の培
養液の上清に含まれるアミノ酸を定量した。
におけるdapA*、lysC*、dapB 及び ddh遺伝子増幅効果 メチロコッカス・カプスラツス バス/pRS(ベクターの
み)、メチロコッカス・カプスラツス バス/RSF24P(dap
A*)、及びメチロコッカス・カプスラツス バス/pCABD2
(dapA*、lysC*、dapB及びddh)を、それぞれ30ml容試験
管に入ったNMS培地 3mlに植菌し、15mlのメタンを封入
し、37℃で、65時間振とう培養した。ただし、プラスミ
ド保持菌についてはNMS培地の代わりにストレプトマイ
シン10μg/mlを含むNMS培地を用いた。培養22時間目、4
2時間目に試験管内の気相を空気で置換し、新たにメタ
ン15mlを封入した。実施例３と同様に、培養終了時の培
養液の上清に含まれるアミノ酸を定量した。
【００９９】結果を表９に示す。dapA*、lysC*、dapB及
びddh増幅株（メチロコッカス・カプスラツス バス/pC
ABD2）は、dapA* のみを増幅した株（メチロコッカス・
カプスラツス バス/RSF24P）の約２倍のＬ−リジンを
蓄積した。
びddh増幅株（メチロコッカス・カプスラツス バス/pC
ABD2）は、dapA* のみを増幅した株（メチロコッカス・
カプスラツス バス/RSF24P）の約２倍のＬ−リジンを
蓄積した。
【０１００】
【表９】 表９ メチロコッカス・カフ゜スラツス ハ゛ス株における dapA*、lysC*、dapB及びddh増幅効果 ───────────────────────────── 菌 株 L-Lys蓄積(mg/L) ───────────────────────────── メチロコッカス・カプスラツス バス/pRS 0.75 メチロコッカス・カプスラツス バス/RSF24P 4.32 メチロコッカス・カプスラツス バス/pCABD2 9.37 ─────────────────────────────
【０１０１】
【発明の効果】本発明によれば、Ｌ−アミノ酸を、安価
な原料であるメタンから、効率よく生産することが可能
になる。
な原料であるメタンから、効率よく生産することが可能
になる。
【０１０２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> 発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法 <130> P-7716 <141> 2000-08-15 <150> JP 11-230347 <151> 1999-08-17 <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.0
【０１０３】 <210> 1 <211> 1197 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (272)..(1147) <400> 1 ccaggcgact gtcttcaata ttacagccgc aactactgac atgacgggtg atggtgttca 60 caattccacg gcgatcggca cccaacgcag tgatcaccag ataatgtgtt gcgatgacag 120 tgtcaaactg gttattcctt taaggggtga gttgttctta aggaaagcat aaaaaaaaca 180 tgcatacaac aatcagaacg gttctgtctg cttgctttta atgccatacc aaacgtacca 240 ttgagacact tgtttgcaca gaggatggcc c atg ttc acg gga agt att gtc 292 Met Phe Thr Gly Ser Ile Val 1 5 gcg att gtt act ccg atg gat gaa aaa ggt aat gtc tgt cgg gct agc 340 Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser 10 15 20 ttg aaa aaa ctg att gat tat cat gtc gcc agc ggt act tcg gcg atc 388 Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile 25 30 35 gtt tct gtt ggc acc act ggc gag tcc gct acc tta aat cat gac gaa 436 Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu 40 45 50 55 cat gct gat gtg gtg atg atg acg ctg gat ctg gct gat ggg cgc att 484 His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile 60 65 70 ccg gta att gcc ggg acc ggc gct aac gct act gcg gaa gcc att agc 532 Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser 75 80 85 ctg acg cag cgc ttc aat gac agt ggt atc gtc ggc tgc ctg acg gta 580 Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly Ile Val Gly Cys Leu Thr Val 90 95 100 acc cct tac tac aat cgt ccg tcg caa gaa ggt ttg tat cag cat ttc 628 Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe 105 110 115 aaa gcc atc gct gag cat act gac ctg ccg caa att ctg tat aat gtg 676 Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val 120 125 130 135 ccg tcc cgt act ggc tgc gat ctg ctc ccg gaa acg gtg ggc cgt ctg 724 Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu 140 145 150 gcg aaa gta aaa aat att atc gga atc aaa gag gca aca ggg aac tta 772 Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu 155 160 165 acg cgt gta aac cag atc aaa gag ctg gtt tca gat gat ttt gtt ctg 820 Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu 170 175 180 ctg agc ggc gat gat gcg agc gcg ctg gac ttc atg caa ttg ggc ggt 868 Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly 185 190 195 cat ggg gtt att tcc gtt acg act aac gtc gca gcg cgt gat atg gcc 916 His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Met Ala 200 205 210 215 cag atg tgc aaa ctg gca gca gaa gaa cat ttt gcc gag gca cgc gtt 964 Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala Arg Val 220 225 230 att aat cag cgt ctg atg cca tta cac aac aaa cta ttt gtc gaa ccc 1012 Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro 235 240 245 aat cca atc ccg gtg aaa tgg gca tgt aag gaa ctg ggt ctt gtg gcg 1060 Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala 250 255 260 acc gat acg ctg cgc ctg cca atg aca cca atc acc gac agt ggt cgt 1108 Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg 265 270 275 gag acg gtc aga gcg gcg ctt aag cat gcc ggt ttg ctg taaagtttag 1157 Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu 280 285 290 ggagatttga tggcttactc tgttcaaaag tcgcgcctgg 1197
【０１０４】 <210> 2 <211> 292 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys 1 5 10 15 Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val 20 25 30 Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser 35 40 45 Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu 50 55 60 Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn 65 70 75 80 Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly 85 90 95 Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln 100 105 110 Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu 115 120 125 Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu 130 135 140 Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile 145 150 155 160 Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu 165 170 175 Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu 180 185 190 Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn 195 200 205 Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu 210 215 220 His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His 225 230 235 240 Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys 245 250 255 Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr 260 265 270 Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His 275 280 285 Ala Gly Leu Leu 290
【０１０５】 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 gcgcgaattc caacgggcaa tatgtctctg 30
【０１０６】 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 gcgccaattg gatgtaccgc cgaacttcaa 30
【０１０７】 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 cagttttctg atgaagcgcg 20
【０１０８】
【図１】 変異型dapAを有するプラスミドRSF24Pの製造
工程を示す図。「dapA*24」は、118位のヒスチジン残基
がチロシン残基に置換された変異型DDPSをコードする変
異型dapAを表す。
工程を示す図。「dapA*24」は、118位のヒスチジン残基
がチロシン残基に置換された変異型DDPSをコードする変
異型dapAを表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｄ 15/01 Ａ 15/09 ＺＮＡ Ｃ Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｂ 13/08 Ｃ Ｄ Ａ 13/08 13/10 Ｂ 13/12 Ｂ Ａ 13/10 13/14 13/12 13/20 13/22 Ｂ 13/14 Ｃ 13/20 Ａ 13/22 13/24 Ａ Ｃ (Ｃ１２Ｐ 13/04 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/04 //(Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｄ (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｄ (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｄ (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｄ (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/14 (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/14 (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/20 (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/20 (Ｃ１２Ｐ 13/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 13/20 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:26） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:26） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/24 15/00 Ｘ Ｃ１２Ｒ 1:01） ＺＮＡＡ (72)発明者 河原 義雄 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 杉本 愼一 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内
Claims (12)
- 【請求項１】 メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ
酸生産能を有する微生物を、メタンを主たる炭素源とし
て、メタンを含む気体と接する培地で培養し、培地中に
Ｌ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培地からＬ−アミノ酸
を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。 - 【請求項２】 メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ
酸生産能を有する微生物が、メタン資化性菌の系統的分
類においてタイプＩ、タイプＸまたはタイプIIに属する
請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 タイプＩ、タイプＸまたはタイプIIに属
するメタン資化性菌が、それぞれメチロモナス属、メチ
ロコッカス属またはメチロシナス属に属する細菌である
請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アスパラギン酸、
Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−
プロリン、Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイ
ン、Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、
Ｌ−ロイシン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニールアラニ
ン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン及び
Ｌ−トリプトファンから選ばれる請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ
酸生産能を有する微生物が野生株である請求項１記載の
方法。 - 【請求項６】 メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ
酸生産能を有する微生物がＬ−アミノ酸またはそのアナ
ログに耐性を有する請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、
そのアナログがＳ−（２−アミノエチル）−システイン
である請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ
酸生産能を有する微生物は、少なくとも１つのＬ−アミ
ノ酸の生合成酵素の活性が増強された変異株又は組換え
体である請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミノ
酸生産能を有する微生物は、少なくとも１つのＬ−アミ
ノ酸の生合成酵素の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａ断片と、ベクターＤＮＡとを含む組換え体ベクターを
保有する形質転換体である請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 Ｌ−アミノ酸の生合成酵素が、Ｌ−リ
ジンによるフィードバック阻害が解除された変異型ジヒ
ドロジピコリン酸合成酵素、Ｌ−リジンによるフィード
バック阻害が解除された変異型アスパルトキナーゼ、ジ
ヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸
デヒドロゲナーゼから選ばれる１種又は２種以上である
請求項８又は９記載の方法。 - 【請求項１１】 メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミ
ノ酸生産能を有する微生物であって、Ｌ−アミノ酸また
はそのアナログに耐性を有する変異株。 - 【請求項１２】 メタン資化能を有し、かつ、Ｌ−アミ
ノ酸生産能を有する微生物であって、少なくとも１つの
Ｌ−アミノ酸の生合成酵素の合成に関与する遺伝情報を
担うＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを含む組換え体ベ
クターを保有する形質転換体。
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| JP2000246307A JP2001120292A (ja) | 1999-08-17 | 2000-08-15 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
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| JP23034799 | 1999-08-17 | ||
| JP11-230347 | 1999-08-17 | ||
| JP2000246307A JP2001120292A (ja) | 1999-08-17 | 2000-08-15 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
Publications (2)
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| JP2001120292A true JP2001120292A (ja) | 2001-05-08 |
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|---|---|---|---|
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