JP3276732B2 - １３ｃ標識アミノ酸の製造方法およびその装置 - Google Patents
１３ｃ標識アミノ酸の製造方法およびその装置Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、13Ｃ標識アミノ酸の製
造方法およびその装置、詳しくはメタン資化菌による均
一にラベルされた13Ｃ標識アミノ酸の製造方法およびそ
の装置に関する。
造方法およびその装置、詳しくはメタン資化菌による均
一にラベルされた13Ｃ標識アミノ酸の製造方法およびそ
の装置に関する。
【０００２】
【従来の技術およびその課題】特開昭５２−３８８８号
公報には、サンプルセルが培養室と連通され培養室の混
合気体を循環される赤外線分析器と、この赤外線分析器
により得られた炭酸ガス濃度の電気信号を受け培養室へ
の炭酸ガス流入路に設けられた電磁弁を作動させ培養室
内の炭酸ガス濃度を制御する制御機構とが付設されたこ
とを特徴とする炭酸ガス細胞培養装置が開示されてい
る。しかしながら、特開昭５２−３８８８号公報には、
メタン資化菌を完全閉鎖系において自動的に培養するメ
タン資化菌培養装置については記載されていない。
公報には、サンプルセルが培養室と連通され培養室の混
合気体を循環される赤外線分析器と、この赤外線分析器
により得られた炭酸ガス濃度の電気信号を受け培養室へ
の炭酸ガス流入路に設けられた電磁弁を作動させ培養室
内の炭酸ガス濃度を制御する制御機構とが付設されたこ
とを特徴とする炭酸ガス細胞培養装置が開示されてい
る。しかしながら、特開昭５２−３８８８号公報には、
メタン資化菌を完全閉鎖系において自動的に培養するメ
タン資化菌培養装置については記載されていない。
【０００３】特開昭６１−１７４９９９号公報には、槽
内に上部に気相を、下部に液相を存在させ、その液相中
で有機酸と微生物が関与する反応をさせるようにしたメ
タン発酵槽において、上記液相中の有機酸と準平衡状態
にある上記気相中の当該有機酸を連続的かつ自動的に分
析する手段好ましくは赤外線吸収測定装置を設け、その
分析する手段から得られる分析値により上記液相中の有
機酸を特定し、その結果に基いて自動制御による運転を
可能にしたことを特徴とするメタン発酵槽が開示されて
いる。しかしながら、特開昭６１−１７４９９９号公報
には、メタン資化菌を完全閉鎖系において自動的に培養
するメタン資化菌培養リアクターについては記載されて
いない。
内に上部に気相を、下部に液相を存在させ、その液相中
で有機酸と微生物が関与する反応をさせるようにしたメ
タン発酵槽において、上記液相中の有機酸と準平衡状態
にある上記気相中の当該有機酸を連続的かつ自動的に分
析する手段好ましくは赤外線吸収測定装置を設け、その
分析する手段から得られる分析値により上記液相中の有
機酸を特定し、その結果に基いて自動制御による運転を
可能にしたことを特徴とするメタン発酵槽が開示されて
いる。しかしながら、特開昭６１−１７４９９９号公報
には、メタン資化菌を完全閉鎖系において自動的に培養
するメタン資化菌培養リアクターについては記載されて
いない。
【０００４】特開昭６２−１３０６９２号公報には、13
ＣラベルＣ1 化合物を含む増殖炭素源を含有する栄養培
地中でメチロトローフ性微生物を培養することからな
る、同位体でラベルされた生化学製品の製造方法が開示
されている。特開昭６２−１３０６９２号公報には、13
Ｃメタンを増殖炭素源として存在させることができるこ
と、および13Ｃ化合物が単独増殖炭素源である場合、得
られたバイオマスおよび／または細胞外代謝産物は、13
Ｃ同位体原子で均一にラベルされており、例えば均一に
ラベルされた13Ｃ−ヘテロ多糖ポリ５４が得られること
が記載されている。しかしながら、特開昭６２−１３０
６９２号公報において具体的に記載されているのは、同
公報の実施例に記載されているように、13Ｃ−メタノー
ルを増殖炭素源として、メチロフィルス・ビスコゲネス
の菌株を培養して13Ｃラベルエキソ多糖が得られること
であって、13Ｃメタンを増殖炭素源として、メタン資化
菌を培養して得られる菌体から蛋白質を抽出し、該蛋白
質を加水分解して13Ｃで均一にラベルされたアミノ酸を
製造する方法については具体的な記載も、それを示唆す
る記載もなく、また上記メタン資化菌の培養を完全閉鎖
系において行なう方法についても具体的な記載も、それ
を示唆する記載もない。
ＣラベルＣ1 化合物を含む増殖炭素源を含有する栄養培
地中でメチロトローフ性微生物を培養することからな
る、同位体でラベルされた生化学製品の製造方法が開示
されている。特開昭６２−１３０６９２号公報には、13
Ｃメタンを増殖炭素源として存在させることができるこ
と、および13Ｃ化合物が単独増殖炭素源である場合、得
られたバイオマスおよび／または細胞外代謝産物は、13
Ｃ同位体原子で均一にラベルされており、例えば均一に
ラベルされた13Ｃ−ヘテロ多糖ポリ５４が得られること
が記載されている。しかしながら、特開昭６２−１３０
６９２号公報において具体的に記載されているのは、同
公報の実施例に記載されているように、13Ｃ−メタノー
ルを増殖炭素源として、メチロフィルス・ビスコゲネス
の菌株を培養して13Ｃラベルエキソ多糖が得られること
であって、13Ｃメタンを増殖炭素源として、メタン資化
菌を培養して得られる菌体から蛋白質を抽出し、該蛋白
質を加水分解して13Ｃで均一にラベルされたアミノ酸を
製造する方法については具体的な記載も、それを示唆す
る記載もなく、また上記メタン資化菌の培養を完全閉鎖
系において行なう方法についても具体的な記載も、それ
を示唆する記載もない。
【０００５】特開平２−２９１２８４号公報には、炭素
源として13Ｃ標識炭素源を使用して、アミノ酸発酵菌株
を培養して、全ての炭素原子が13Ｃであるもの及びカル
ボキシル基の炭素原子のみが13Ｃであるものを除く、炭
素原子１個以上が13Ｃ標識されていることを特徴とする
アミノ酸の製造方法が開示されている。しかしながら、
特開平２−２９１２８４号公報には、13Ｃメタンを増殖
炭素源として、メタン資化菌を培養して得られる菌体か
ら蛋白質を抽出し、該蛋白質を加水分解して13Ｃで均一
にラベルされたアミノ酸を製造する方法については具体
的な記載も、それを示唆する記載もなく、また上記メタ
ン資化菌の培養を完全閉鎖系において行なう方法につい
ても具体的な記載も、それを示唆する記載もない。
源として13Ｃ標識炭素源を使用して、アミノ酸発酵菌株
を培養して、全ての炭素原子が13Ｃであるもの及びカル
ボキシル基の炭素原子のみが13Ｃであるものを除く、炭
素原子１個以上が13Ｃ標識されていることを特徴とする
アミノ酸の製造方法が開示されている。しかしながら、
特開平２−２９１２８４号公報には、13Ｃメタンを増殖
炭素源として、メタン資化菌を培養して得られる菌体か
ら蛋白質を抽出し、該蛋白質を加水分解して13Ｃで均一
にラベルされたアミノ酸を製造する方法については具体
的な記載も、それを示唆する記載もなく、また上記メタ
ン資化菌の培養を完全閉鎖系において行なう方法につい
ても具体的な記載も、それを示唆する記載もない。
【０００６】13Ｃで均一にラベルされた13Ｃ標識アミノ
酸は、蛋白工学などにおいて物質の立体構造を解析する
ため、あるいは生体内での代謝などを研究するために有
用であり、その工業的に有利な製造方法の開発が要望さ
れている。
酸は、蛋白工学などにおいて物質の立体構造を解析する
ため、あるいは生体内での代謝などを研究するために有
用であり、その工業的に有利な製造方法の開発が要望さ
れている。
【０００７】本発明は、13Ｃメタンを炭素源としてメタ
ン資化菌を培養し、13Ｃメタンおよび13Ｃ二酸化炭素を
系外に損失させることなく、13Ｃで均一にラベルされた
13Ｃ標識アミノ酸を工業的に有利に製造する方法および
その装置を提供することを目的としている。
ン資化菌を培養し、13Ｃメタンおよび13Ｃ二酸化炭素を
系外に損失させることなく、13Ｃで均一にラベルされた
13Ｃ標識アミノ酸を工業的に有利に製造する方法および
その装置を提供することを目的としている。
【０００８】
【問題点を解決するための手段】本発明は、リアクター
内の栄養培地中に13Ｃ標識メタンおよび酸素を通しなが
ら、該栄養培地中でメタン資化菌を培養して菌体を得、
得られた菌体から蛋白質を抽出・回収し、回収された蛋
白質を加水分解して13Ｃ標識混合アミノ酸を得、好まし
くは該13Ｃ標識混合アミノ酸より各アミノ酸を単離する
13Ｃ標識アミノ酸の製造方法であって、該メタン資化菌
の培養が完全閉鎖系において自動的に行なわれ、好まし
くは、該メタン資化菌の培養が該リアクターを通して、
13Ｃ標識メタン、酸素、該培養によって生成する13Ｃ標
識二酸化炭素および必要に応じて添加される窒素ガスよ
りなるガス状成分を循環させて循環ラインを形成させ、
リアクターガス成分出口側の循環ライン上で、該ガス成
分の一部を抜き出して含有されている13Ｃ標識二酸化炭
素を完全閉鎖条件下に吸収・回収した後、残りのガスの
全量を循環ラインに再循環させて第１再循環ラインを形
成させ、13Ｃ標識二酸化炭素の吸収・回収後の循環ライ
ン上に、ガス圧力変動吸収装置を設け、該ガス圧力変動
吸収装置に新たに13Ｃ標識メタンおよび酸素を供給する
と共に該ガス圧力変動吸収装置内のガスの一部を抜き出
し、さらに分枝してそれぞれ13Ｃ標識メタン、13Ｃ標識
二酸化炭素および酸素を完全閉鎖条件下に分析した後、
合流させて全量を該ガス圧力変動吸収装置に再循環させ
る第２再循環ラインを形成させ、該ガス圧力変動吸収装
置より出るガスの全量をリアクター内の栄養培地中に循
環させ、シーケンサー制御手段により13Ｃ標識メタン、
13Ｃ標識二酸化炭素および酸素の分析値に基いて新たに
供給される13Ｃ標識メタンおよび酸素の量、ならびに第
１再循環ラインのガス量を自動的に制御することにより
行なわれ、得られる13Ｃ標識アミノ酸が均一にラベルさ
れていることを特徴とする前記13Ｃ標識アミノ酸の製造
方法を提供するものである。本発明は、さらに本発明の
上記13Ｃ標識アミノ酸の製造方法に用いられる装置であ
って、好ましくは、栄養培地中に13Ｃ標識メタンおよび
酸素を通しながら、該栄養培地中でメタン資化菌を培養
するリアクター；該リアクターを通して13Ｃ標識メタ
ン、酸素、該培養によって生される13Ｃ標識二酸化炭素
および必要に応じて添加される窒素ガスよりなるガス成
分を循環させる循環ライン；リアクターガス成分出口側
の循環ライン上で該ガス成分の一部を抜き出して含有さ
れている13Ｃ標識二酸化炭素を完全閉鎖条件下に吸収・
回収した後、残りのガスの全量を循環ラインに再循環さ
せる第１再循環ライン；13Ｃ標識二酸化炭素の吸収・回
収後の循環ライン上に設けられたガス圧力変動吸収装
置；該ガス圧力変動吸収装置に新たに13Ｃ標識メタンお
よび酸素を供給するライン；該ガス圧力変動吸収装置内
のガスの一部を抜き出し、さらに分枝してそれぞれ13Ｃ
標識メタン、13Ｃ標識二酸化炭素および酸素を完全閉鎖
条件下に分析した後、合流させて全量を該ガス圧力変動
吸収装置に再循環させる第２再循環ライン；13Ｃ標識メ
タン、13Ｃ標識二酸化炭素および酸素の分析値に基いて
新たに供給される13Ｃ標識メタンおよび酸素の量、なら
びに第１再循環ラインのガス量を自動的に制御するシー
ケンサー制御手段よりなる前記装置を提供するものであ
る。
内の栄養培地中に13Ｃ標識メタンおよび酸素を通しなが
ら、該栄養培地中でメタン資化菌を培養して菌体を得、
得られた菌体から蛋白質を抽出・回収し、回収された蛋
白質を加水分解して13Ｃ標識混合アミノ酸を得、好まし
くは該13Ｃ標識混合アミノ酸より各アミノ酸を単離する
13Ｃ標識アミノ酸の製造方法であって、該メタン資化菌
の培養が完全閉鎖系において自動的に行なわれ、好まし
くは、該メタン資化菌の培養が該リアクターを通して、
13Ｃ標識メタン、酸素、該培養によって生成する13Ｃ標
識二酸化炭素および必要に応じて添加される窒素ガスよ
りなるガス状成分を循環させて循環ラインを形成させ、
リアクターガス成分出口側の循環ライン上で、該ガス成
分の一部を抜き出して含有されている13Ｃ標識二酸化炭
素を完全閉鎖条件下に吸収・回収した後、残りのガスの
全量を循環ラインに再循環させて第１再循環ラインを形
成させ、13Ｃ標識二酸化炭素の吸収・回収後の循環ライ
ン上に、ガス圧力変動吸収装置を設け、該ガス圧力変動
吸収装置に新たに13Ｃ標識メタンおよび酸素を供給する
と共に該ガス圧力変動吸収装置内のガスの一部を抜き出
し、さらに分枝してそれぞれ13Ｃ標識メタン、13Ｃ標識
二酸化炭素および酸素を完全閉鎖条件下に分析した後、
合流させて全量を該ガス圧力変動吸収装置に再循環させ
る第２再循環ラインを形成させ、該ガス圧力変動吸収装
置より出るガスの全量をリアクター内の栄養培地中に循
環させ、シーケンサー制御手段により13Ｃ標識メタン、
13Ｃ標識二酸化炭素および酸素の分析値に基いて新たに
供給される13Ｃ標識メタンおよび酸素の量、ならびに第
１再循環ラインのガス量を自動的に制御することにより
行なわれ、得られる13Ｃ標識アミノ酸が均一にラベルさ
れていることを特徴とする前記13Ｃ標識アミノ酸の製造
方法を提供するものである。本発明は、さらに本発明の
上記13Ｃ標識アミノ酸の製造方法に用いられる装置であ
って、好ましくは、栄養培地中に13Ｃ標識メタンおよび
酸素を通しながら、該栄養培地中でメタン資化菌を培養
するリアクター；該リアクターを通して13Ｃ標識メタ
ン、酸素、該培養によって生される13Ｃ標識二酸化炭素
および必要に応じて添加される窒素ガスよりなるガス成
分を循環させる循環ライン；リアクターガス成分出口側
の循環ライン上で該ガス成分の一部を抜き出して含有さ
れている13Ｃ標識二酸化炭素を完全閉鎖条件下に吸収・
回収した後、残りのガスの全量を循環ラインに再循環さ
せる第１再循環ライン；13Ｃ標識二酸化炭素の吸収・回
収後の循環ライン上に設けられたガス圧力変動吸収装
置；該ガス圧力変動吸収装置に新たに13Ｃ標識メタンお
よび酸素を供給するライン；該ガス圧力変動吸収装置内
のガスの一部を抜き出し、さらに分枝してそれぞれ13Ｃ
標識メタン、13Ｃ標識二酸化炭素および酸素を完全閉鎖
条件下に分析した後、合流させて全量を該ガス圧力変動
吸収装置に再循環させる第２再循環ライン；13Ｃ標識メ
タン、13Ｃ標識二酸化炭素および酸素の分析値に基いて
新たに供給される13Ｃ標識メタンおよび酸素の量、なら
びに第１再循環ラインのガス量を自動的に制御するシー
ケンサー制御手段よりなる前記装置を提供するものであ
る。
【０００９】図１により、本発明の製造方法およびその
装置について以下説明する。図１において、１は栄養培
地を収容し、該培地中でメタン資化菌の培養を行なうリ
アクターであり、２はリアクター１内に設けられた攪拌
機であり、３はリアクター１内に挿入されたｐＨセンサ
ーであり、４はリアクター１内に挿入された溶存酸素セ
ンサーであり、ｐＨおよび溶存酸素はセンサー３および
４に接続されたレコーダー５により記録される。リアク
ター１を出たガス成分はリフラックス６で含有される水
分が除去され、ライン７、１２および１５はガス圧力変
動吸収装置１３、例えばガスホルダーを介して循環ライ
ンを形成し、コック８、ライン９および１０、および13
Ｃ二酸化炭素吸収装置１１により第１再循環ラインが形
成され、ガス圧力変動吸収装置１３中のガスの一部をポ
ンプ２５、クーラー２６およびライン２７を通り、該ラ
イン２７を13Ｃメタン、13Ｃ二酸化炭素および酸素を分
析用に分枝し、バルブ２８，２９および３０、フローメ
ーター３１，３２および３３を通って、13Ｃメタン分析
装置３４、例えば赤外線式分析計、13Ｃ二酸化炭素分析
装置３５、例えば赤外線式分析計、酸素分析装置３６、
例えば磁気式酸素計に通し、ガス中の13Ｃメタン、13Ｃ
二酸化炭素および酸素を分析した後、合流させて、全量
をライン３７を通ってガス圧力変動吸収装置１３に再循
環させて第２再循環ラインを形成させる。13Ｃ二酸化炭
素の分析値が設定値を越えた場合には、シーケンサー制
御手段３８により、制御ライン４０および４２を通して
前記第１再循環ラインを作動させて13Ｃ二酸化炭素の吸
収・回収をアルカリ溶液を用いる公知の手段により自動
的に行ない、13Ｃメタンおよび酸素の分析値が設定値以
下になると、シーケンサー制御手段３８により制御ライ
ン４０および４１を通して電磁弁１９および２０を作動
させて、それぞれ酸素供給源１７および１８より電磁弁
１９および２０、フローメーター２１および２２、酸素
供給ライン２３および13Ｃメタン供給ライン２４を通っ
て、酸素および13Ｃメタンが新たにガス圧力変動吸収装
置１３に供給される。３９はシーケンサー制御手段３８
のレコーダーである。ガス圧力変動吸収装置１３より出
たガスはポンプ１４により循環ライン１５を通ってリア
クター１の底部に全量循環させることによりメタン資化
菌の培養を完全閉鎖系において自動的に行なうことがで
きる。
装置について以下説明する。図１において、１は栄養培
地を収容し、該培地中でメタン資化菌の培養を行なうリ
アクターであり、２はリアクター１内に設けられた攪拌
機であり、３はリアクター１内に挿入されたｐＨセンサ
ーであり、４はリアクター１内に挿入された溶存酸素セ
ンサーであり、ｐＨおよび溶存酸素はセンサー３および
４に接続されたレコーダー５により記録される。リアク
ター１を出たガス成分はリフラックス６で含有される水
分が除去され、ライン７、１２および１５はガス圧力変
動吸収装置１３、例えばガスホルダーを介して循環ライ
ンを形成し、コック８、ライン９および１０、および13
Ｃ二酸化炭素吸収装置１１により第１再循環ラインが形
成され、ガス圧力変動吸収装置１３中のガスの一部をポ
ンプ２５、クーラー２６およびライン２７を通り、該ラ
イン２７を13Ｃメタン、13Ｃ二酸化炭素および酸素を分
析用に分枝し、バルブ２８，２９および３０、フローメ
ーター３１，３２および３３を通って、13Ｃメタン分析
装置３４、例えば赤外線式分析計、13Ｃ二酸化炭素分析
装置３５、例えば赤外線式分析計、酸素分析装置３６、
例えば磁気式酸素計に通し、ガス中の13Ｃメタン、13Ｃ
二酸化炭素および酸素を分析した後、合流させて、全量
をライン３７を通ってガス圧力変動吸収装置１３に再循
環させて第２再循環ラインを形成させる。13Ｃ二酸化炭
素の分析値が設定値を越えた場合には、シーケンサー制
御手段３８により、制御ライン４０および４２を通して
前記第１再循環ラインを作動させて13Ｃ二酸化炭素の吸
収・回収をアルカリ溶液を用いる公知の手段により自動
的に行ない、13Ｃメタンおよび酸素の分析値が設定値以
下になると、シーケンサー制御手段３８により制御ライ
ン４０および４１を通して電磁弁１９および２０を作動
させて、それぞれ酸素供給源１７および１８より電磁弁
１９および２０、フローメーター２１および２２、酸素
供給ライン２３および13Ｃメタン供給ライン２４を通っ
て、酸素および13Ｃメタンが新たにガス圧力変動吸収装
置１３に供給される。３９はシーケンサー制御手段３８
のレコーダーである。ガス圧力変動吸収装置１３より出
たガスはポンプ１４により循環ライン１５を通ってリア
クター１の底部に全量循環させることによりメタン資化
菌の培養を完全閉鎖系において自動的に行なうことがで
きる。
【００１０】本発明におけるメタン資化菌の培養は、バ
ッチ方式、一定周期で培地の半量を取り出すと同時に培
地の半量を同時に供給する半連続方式またはリアクター
の一方より培地の一定量を連続的に取り出しながら、リ
アクターの他方に培地の一定量を新たに連続的に供給す
る連続方式により行なうことができる。
ッチ方式、一定周期で培地の半量を取り出すと同時に培
地の半量を同時に供給する半連続方式またはリアクター
の一方より培地の一定量を連続的に取り出しながら、リ
アクターの他方に培地の一定量を新たに連続的に供給す
る連続方式により行なうことができる。
【００１１】
【発明の効果】本発明によれば、13Ｃメタンを炭素源と
してメタン資化菌を培養し、13Ｃメタンおよび13Ｃ二酸
化炭素を系外に損失させることなく、13Ｃで均一にラベ
ルされた13Ｃ標識アミノ酸を工業的に有利に製造する方
法およびその装置が提供される。
してメタン資化菌を培養し、13Ｃメタンおよび13Ｃ二酸
化炭素を系外に損失させることなく、13Ｃで均一にラベ
ルされた13Ｃ標識アミノ酸を工業的に有利に製造する方
法およびその装置が提供される。
【００１２】
【実施例】以下実施例により本発明をさらに詳しく説明
する。
する。
【００１３】実施例１〜６ 図１において、リアクター１として５リットルのリアク
ターを用い、ガスホルダー１３として３０リットルのガ
スホルダーを用い、メタン資化菌として［メチロモナス
・アルブス（Ｎ２３）（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ａ
ｌｂｕｓ）（実施例１）］、［メチロシヌス・スポリウ
ム（Ｎ２６）（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｓｐｏｒｉ
ｕｍ）（実施例２）］、［メチロシスティス・パルバム
（Ｎ２９）（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｒｖｕ
ｍ）（実施例３）］、［メチロコッカス・カプスラツス
（Ｎ３２）（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕ
ｌａｔｕｓ）（実施例４）］、ＭＨ（実施例５）および
ＫＯ（実施例６）を用い、表１に示す培地成分、ｐＨお
よび温度の条件下に、バッチ培養を行なった。ＭＨおよ
びＫＯ以外は、英国のＮＣＩＭＢ社（Ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ
Ｌｔｄ）より入手することができる。ＭＨ菌は、東京
大学農学部農芸化学科微生物利用学研究室のスクリーニ
ングした菌である。ＫＯ菌は、東京瓦斯株式会社鶴見工
場の活性汚泥よりスクリーニングしたものであり、単一
菌ではなく二種の菌の共生したものである。
ターを用い、ガスホルダー１３として３０リットルのガ
スホルダーを用い、メタン資化菌として［メチロモナス
・アルブス（Ｎ２３）（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ａ
ｌｂｕｓ）（実施例１）］、［メチロシヌス・スポリウ
ム（Ｎ２６）（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｓｐｏｒｉ
ｕｍ）（実施例２）］、［メチロシスティス・パルバム
（Ｎ２９）（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｒｖｕ
ｍ）（実施例３）］、［メチロコッカス・カプスラツス
（Ｎ３２）（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕ
ｌａｔｕｓ）（実施例４）］、ＭＨ（実施例５）および
ＫＯ（実施例６）を用い、表１に示す培地成分、ｐＨお
よび温度の条件下に、バッチ培養を行なった。ＭＨおよ
びＫＯ以外は、英国のＮＣＩＭＢ社（Ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ
Ｌｔｄ）より入手することができる。ＭＨ菌は、東京
大学農学部農芸化学科微生物利用学研究室のスクリーニ
ングした菌である。ＫＯ菌は、東京瓦斯株式会社鶴見工
場の活性汚泥よりスクリーニングしたものであり、単一
菌ではなく二種の菌の共生したものである。
【００１４】
【表１】
【００１５】リアクターでバッチ培養を行う前に種菌を
前培養した。１００ｍｌの坂口フラスコに各培地をリア
クター培地容量の５％入れ、保存菌をその培地量の１％
添加し、気相ガスを交換して１日振とう培養した。リア
クターへの通気ガス組成を13Ｃメタン１０容量％、酸素
１０容量％、その他のガス、例えば窒素ガス８０容量％
に維持し、13Ｃ二酸化炭素は５容量％以下に保持した。
リアクターでの計測は、温度、ｐＨおよび溶存酸素濃度
について行なった。攪拌機２の攪拌数は培養初期に２０
０ｒｐｍで、ＯＤ（５４０ｎｍ）が１を超えると４００
〜６００ｒｐｍに変化させた。
前培養した。１００ｍｌの坂口フラスコに各培地をリア
クター培地容量の５％入れ、保存菌をその培地量の１％
添加し、気相ガスを交換して１日振とう培養した。リア
クターへの通気ガス組成を13Ｃメタン１０容量％、酸素
１０容量％、その他のガス、例えば窒素ガス８０容量％
に維持し、13Ｃ二酸化炭素は５容量％以下に保持した。
リアクターでの計測は、温度、ｐＨおよび溶存酸素濃度
について行なった。攪拌機２の攪拌数は培養初期に２０
０ｒｐｍで、ＯＤ（５４０ｎｍ）が１を超えると４００
〜６００ｒｐｍに変化させた。
【００１６】実施例５の前記培地を用いた場合、図２に
示されるようにＯＤが５で生育がストップし、図３に示
されるようにｐＨも生育とともに低下したが、その原因
が培地中のアンモニアから亜硝酸の生合成によるもので
あることが判明したので、培地中からアンモニアを除い
て培養したところ、図２および図３に示されるように、
ＯＤが１０をこえる生育をみせ、ｐＨの急激な低下もみ
られず、亜硝酸も生合成されないことが確認された。
示されるようにＯＤが５で生育がストップし、図３に示
されるようにｐＨも生育とともに低下したが、その原因
が培地中のアンモニアから亜硝酸の生合成によるもので
あることが判明したので、培地中からアンモニアを除い
て培養したところ、図２および図３に示されるように、
ＯＤが１０をこえる生育をみせ、ｐＨの急激な低下もみ
られず、亜硝酸も生合成されないことが確認された。
【００１７】ＭＨ菌（実施例５）以外の各メタン資化菌
をバッチ培養して得られた生育曲線を図４に示した。３
日間の培養で定常期に達したのはＮ２３（実施例１）、
Ｎ２６（実施例２）、ＫＯ（実施例６）、Ｎ３２（実施
例４）およびＮ２９（実施例３）であり、制限因子はい
ずれも硝酸イオンであった。ただし、ＫＯだけは制限因
子が不明である。制限因子の判明した菌は、硝酸イオン
の濃度を上げることにより、高濃度培養の検討が可能と
なる。生育曲線より最大比増殖速度μ（ｍａｘ）を求
め、その結果を表２に示した。表２には、各菌体につい
ての菌体収量（ｇ／ｌ）、蛋白含量（％）、糖含量
（％）および供給13Ｃメタンに対する菌体収率（％）を
示した。Ｎ２９（実施例３）は、菌体収量および菌体収
率が高く、菌体生産に利用するのに優れている。ＫＯ
（実施例６）およびＭＨ（実施例５）は、蛋白含量が高
かったが、菌体収率は２５％と低かった。どのメタン資
化菌も収率は４０％以下であった。菌体に固定されなか
った13Ｃメタンは、13Ｃ二酸化炭素に変換される。菌に
よって菌体収率が異なっているのは炭素固定経路の違い
によるものと思われる。その経路とは、燃焼した13Ｃ二
酸化炭素を資化することのできるセリン経路と、資化し
ないリブロースモノリン酸経路である。Ｎ２６（実施例
２）はセリン経路で、Ｎ３２（実施例４）はリブロース
モノリン酸経路をもつことが知られている。Ｎ２６（実
施例２）の菌体収率は３２％で、Ｎ３２（実施例４）の
菌体収率は２３％となっており、セリン経路をもつ菌の
収率が高い。菌体収率により、他菌の代謝経路を分類す
ると、セリン経路がＮ２３（実施例１）およびＮ２９
（実施例３）で、リブロースモノリン酸経路をもつ菌が
ＭＨ（実施例５）およびＫＯ（実施例６）であると推定
される。表２において、Ｎ２３（実施例１）およびＮ２
６（実施例２）は糖含量が５０％を超えた。Ｎ２９（実
施例３）以外は、蛋白含量と糖含量の合計が７５％以上
であった。残りの２５％未満は細胞膜などの脂質であろ
う。
をバッチ培養して得られた生育曲線を図４に示した。３
日間の培養で定常期に達したのはＮ２３（実施例１）、
Ｎ２６（実施例２）、ＫＯ（実施例６）、Ｎ３２（実施
例４）およびＮ２９（実施例３）であり、制限因子はい
ずれも硝酸イオンであった。ただし、ＫＯだけは制限因
子が不明である。制限因子の判明した菌は、硝酸イオン
の濃度を上げることにより、高濃度培養の検討が可能と
なる。生育曲線より最大比増殖速度μ（ｍａｘ）を求
め、その結果を表２に示した。表２には、各菌体につい
ての菌体収量（ｇ／ｌ）、蛋白含量（％）、糖含量
（％）および供給13Ｃメタンに対する菌体収率（％）を
示した。Ｎ２９（実施例３）は、菌体収量および菌体収
率が高く、菌体生産に利用するのに優れている。ＫＯ
（実施例６）およびＭＨ（実施例５）は、蛋白含量が高
かったが、菌体収率は２５％と低かった。どのメタン資
化菌も収率は４０％以下であった。菌体に固定されなか
った13Ｃメタンは、13Ｃ二酸化炭素に変換される。菌に
よって菌体収率が異なっているのは炭素固定経路の違い
によるものと思われる。その経路とは、燃焼した13Ｃ二
酸化炭素を資化することのできるセリン経路と、資化し
ないリブロースモノリン酸経路である。Ｎ２６（実施例
２）はセリン経路で、Ｎ３２（実施例４）はリブロース
モノリン酸経路をもつことが知られている。Ｎ２６（実
施例２）の菌体収率は３２％で、Ｎ３２（実施例４）の
菌体収率は２３％となっており、セリン経路をもつ菌の
収率が高い。菌体収率により、他菌の代謝経路を分類す
ると、セリン経路がＮ２３（実施例１）およびＮ２９
（実施例３）で、リブロースモノリン酸経路をもつ菌が
ＭＨ（実施例５）およびＫＯ（実施例６）であると推定
される。表２において、Ｎ２３（実施例１）およびＮ２
６（実施例２）は糖含量が５０％を超えた。Ｎ２９（実
施例３）以外は、蛋白含量と糖含量の合計が７５％以上
であった。残りの２５％未満は細胞膜などの脂質であろ
う。
【００１８】
【表２】
【００１９】表３には、各菌のアミノ酸組成のモル比を
示した。すべてメタン資化菌ということもあるためか、
アミノ酸組成のモル比に大きな違いは認められなかっ
た。
示した。すべてメタン資化菌ということもあるためか、
アミノ酸組成のモル比に大きな違いは認められなかっ
た。
【００２０】
【表３】
【００２１】実施例７ 実施例５のバッチ培養に代えて連続培養実験を行なった
以外、実施例５と同様の実験を行なった。得られた結果
を表４に示す。表４に示されるように、菌体収量は５
７．１ｇであった。これに対し、バッチ培養において
は、１サイクル６日間で凍結乾燥菌体収量７．５ｇであ
り、１８日間では２２．５ｇになり、連続培養に比べて
少ない。図５および図６に、生育曲線、蛋白含量、糖含
量、硝酸、硫酸、リン酸、マグネシウムおよびカルシウ
ムの濃度について経時変化を示した。蛋白含量の経時変
化は、やや増加する傾向がみられた。糖含量は、蛋白含
量と逆の傾向を示した。図７に菌体中の必須アミノ酸の
経時変化を示した。１１日目にロイシンが増加し、メチ
オニンが減少した程度で、他のアミノ酸についても大き
な変化を示さなかった。この培養で安定したアミノ酸が
生産されることが示された。
以外、実施例５と同様の実験を行なった。得られた結果
を表４に示す。表４に示されるように、菌体収量は５
７．１ｇであった。これに対し、バッチ培養において
は、１サイクル６日間で凍結乾燥菌体収量７．５ｇであ
り、１８日間では２２．５ｇになり、連続培養に比べて
少ない。図５および図６に、生育曲線、蛋白含量、糖含
量、硝酸、硫酸、リン酸、マグネシウムおよびカルシウ
ムの濃度について経時変化を示した。蛋白含量の経時変
化は、やや増加する傾向がみられた。糖含量は、蛋白含
量と逆の傾向を示した。図７に菌体中の必須アミノ酸の
経時変化を示した。１１日目にロイシンが増加し、メチ
オニンが減少した程度で、他のアミノ酸についても大き
な変化を示さなかった。この培養で安定したアミノ酸が
生産されることが示された。
【００２２】
【表４】
【００２３】実施例８ 実施例５で得られた菌体より、各アミノ酸を分離する実
験を行なった。すなわち、得られた菌体から、アミノ酸
のポリマーである蛋白質を抽出し、それを加水分解して
混合アミノ酸とし、その混合物から高速液体クロマトグ
ラフィーで各アミノ酸を単離する実験を行なった。蛋白
回収量を上げるのに有効な因子は、温度：８０℃と、抽
出酸の種類：トリクロロ酢酸であることが判明した。一
方、阻害物質となる糖の量を減少させるのに有効な因子
は、すべての因子が有効であり、抽出時間・３０分、抽
出温度・９０℃、抽出酸の種類・過塩素酸、酸濃度・１
０％という抽出条件が最も有効であることが判明した。
しかし、この条件では蛋白含量が他の条件のおよそ半分
程度となってしまう。糖含量を下げると、蛋白含量も下
がってしまう。今回の実験結果より、糖を少なくすると
蛋白質の回収率が極端に減り、一方、蛋白質を多く回収
しようとすると糖含量が多くなる、という相反する２つ
の条件を１度に満たす条件を見い出すことはできないこ
とが、明らかになった。そこで、なるべく蛋白含量を多
く回収することを第一に、次にその中でなるべく糖含量
の少ない条件を選択することにする。結果の中からこれ
らの条件を満たすものをピックアップしたのが表５であ
る。表５より総アミノ酸量に差がないことが分かる。Ｎ
ｏ．１，２は、抽出物中の蛋白含量は多いが、糖含量も
多いので塩酸加水分解を行う際に損失が大きいことがわ
かる。総アミノ酸に差がないので、次の評価値である糖
含量について見ると、適当な抽出条件は、Ｎｏ．３とＮ
ｏ．６ということになる。Ｎｏ．３とＮｏ．６の抽出条
件を比較すると、酸の種類・（トリクロロ酢酸）、濃度
・（１０％）は共通で、時間・（３０分と１５分）、温
度・（８０℃と９０℃）となっている。温度が低い場合
は抽出時間が長くなり、温度が高い場合は抽出時間が短
くなるという温度と時間が逆転しており、温度と時間は
この抽出にとって同一の状況を生む因子であり、相関が
あることが示された。酸加水分解条件としては、塩酸濃
度：４Ｎ、塩酸容量：抽出蛋白１ｇ当たり１００ｍｌ、
分解温度１１５℃、分解時間：２４時間が良いことが明
らかになった。そして、得られた酸加水分解液中の各種
アミノ酸は特開平４−１０４０５３号公報記載の高速液
体クロマトグラフィーで分取することが可能となった。
験を行なった。すなわち、得られた菌体から、アミノ酸
のポリマーである蛋白質を抽出し、それを加水分解して
混合アミノ酸とし、その混合物から高速液体クロマトグ
ラフィーで各アミノ酸を単離する実験を行なった。蛋白
回収量を上げるのに有効な因子は、温度：８０℃と、抽
出酸の種類：トリクロロ酢酸であることが判明した。一
方、阻害物質となる糖の量を減少させるのに有効な因子
は、すべての因子が有効であり、抽出時間・３０分、抽
出温度・９０℃、抽出酸の種類・過塩素酸、酸濃度・１
０％という抽出条件が最も有効であることが判明した。
しかし、この条件では蛋白含量が他の条件のおよそ半分
程度となってしまう。糖含量を下げると、蛋白含量も下
がってしまう。今回の実験結果より、糖を少なくすると
蛋白質の回収率が極端に減り、一方、蛋白質を多く回収
しようとすると糖含量が多くなる、という相反する２つ
の条件を１度に満たす条件を見い出すことはできないこ
とが、明らかになった。そこで、なるべく蛋白含量を多
く回収することを第一に、次にその中でなるべく糖含量
の少ない条件を選択することにする。結果の中からこれ
らの条件を満たすものをピックアップしたのが表５であ
る。表５より総アミノ酸量に差がないことが分かる。Ｎ
ｏ．１，２は、抽出物中の蛋白含量は多いが、糖含量も
多いので塩酸加水分解を行う際に損失が大きいことがわ
かる。総アミノ酸に差がないので、次の評価値である糖
含量について見ると、適当な抽出条件は、Ｎｏ．３とＮ
ｏ．６ということになる。Ｎｏ．３とＮｏ．６の抽出条
件を比較すると、酸の種類・（トリクロロ酢酸）、濃度
・（１０％）は共通で、時間・（３０分と１５分）、温
度・（８０℃と９０℃）となっている。温度が低い場合
は抽出時間が長くなり、温度が高い場合は抽出時間が短
くなるという温度と時間が逆転しており、温度と時間は
この抽出にとって同一の状況を生む因子であり、相関が
あることが示された。酸加水分解条件としては、塩酸濃
度：４Ｎ、塩酸容量：抽出蛋白１ｇ当たり１００ｍｌ、
分解温度１１５℃、分解時間：２４時間が良いことが明
らかになった。そして、得られた酸加水分解液中の各種
アミノ酸は特開平４−１０４０５３号公報記載の高速液
体クロマトグラフィーで分取することが可能となった。
【００２４】
【表５】
【００２５】分析方法 菌体濃度は、抜き出した培養液を適当に希釈して、ＯＤ
（５４０ｎｍ）が０．１〜０．６の範囲におさまるよう
にして分光分析した。集菌後に凍結乾燥を行い、その重
量を測定して菌体収量（ｇ／ｌ）を算出した。菌体、及
び、酸抽出の蛋白含量（重量％）は、Ｌｏｗｒｙの変法
を用いた。それらの糖含量（重量％）は、フェノールー
硫酸法を用いた。それらのアミノ酸組成（モル％）は、
ウォーターズ（株）製のピコタグワークステーションで
サンプルを酸加水分解処理後、高速液体クロマトグラフ
ィーを用いたポスト−ＯＰＡ法で分析を行った。各菌体
の対13Ｃメタン収率は、１００×｛（得られた菌体量）
×０．７／１３｝／（消費13Ｃメタン量）で算出した。
菌体中の13Ｃ炭素含量は、７０（重量％）である。培地
中の各種無機イオンについては、イオンクロマト装置に
より分析した。
（５４０ｎｍ）が０．１〜０．６の範囲におさまるよう
にして分光分析した。集菌後に凍結乾燥を行い、その重
量を測定して菌体収量（ｇ／ｌ）を算出した。菌体、及
び、酸抽出の蛋白含量（重量％）は、Ｌｏｗｒｙの変法
を用いた。それらの糖含量（重量％）は、フェノールー
硫酸法を用いた。それらのアミノ酸組成（モル％）は、
ウォーターズ（株）製のピコタグワークステーションで
サンプルを酸加水分解処理後、高速液体クロマトグラフ
ィーを用いたポスト−ＯＰＡ法で分析を行った。各菌体
の対13Ｃメタン収率は、１００×｛（得られた菌体量）
×０．７／１３｝／（消費13Ｃメタン量）で算出した。
菌体中の13Ｃ炭素含量は、７０（重量％）である。培地
中の各種無機イオンについては、イオンクロマト装置に
より分析した。
【図１】本発明の方法に用いられる装置の一態様を示す
略図である。
略図である。
【図２】培地成分の相違による発酵時間と生育量との関
係を示すグラフである。
係を示すグラフである。
【図３】培地成分の相違による発酵時間とｐＨとの関係
を示すグラフである。
を示すグラフである。
【図４】各菌について、発酵時間と生育量との関係を示
すグラフである。
すグラフである。
【図５】ＭＨ菌の連続培養における発酵時間と無機イオ
ンの残留率との関係を示すグラフである。
ンの残留率との関係を示すグラフである。
【図６】ＭＨ菌の連続培養における発酵時間と生育量あ
るいは蛋白および糖の含有量との関係を示すグラフであ
る。
るいは蛋白および糖の含有量との関係を示すグラフであ
る。
【図７】ＭＨ菌の連続培養における発酵時間と各アミノ
酸の含有量との関係を示すグラフである。
酸の含有量との関係を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (4)
- 【請求項１】 リアクター内の栄養培地中に13Ｃ標識メ
タンおよび酸素を通しながら、該栄養培地中でメタン資
化菌を培養して菌体を得、得られた菌体から蛋白質を抽
出・回収し、回収された蛋白質を加水分解して13Ｃ標識
混合アミノ酸を得る13Ｃ標識アミノ酸の製造方法であっ
て、該メタン資化菌の培養が、該リアクターを通して、
13 Ｃ標識メタン、酸素、該培養によって生成する 13 Ｃ標
識二酸化炭素および必要に応じて添加される窒素ガスよ
りなるガス状成分を循環させて循環ラインを形成させ、
リアクターガス成分出口側の循環ライン上で、該ガス成
分の一部を抜き出して含有されている 13 Ｃ標識二酸化炭
素を完全閉鎖条件下に吸収・回収した後、残りのガスの
全量を循環ラインに再循環させて第１再循環ラインを形
成させ、 13 Ｃ標識二酸化炭素の吸収・回収後の循環ライ
ン上に、ガス圧力変動吸収装置を設け、該ガス圧力変動
吸収装置に新たに 13 Ｃ標識メタンおよび酸素を供給する
と共に該ガス圧力変動吸収装置内のガスの一部を抜き出
し、さらに分枝してそれぞれ 13 Ｃ標識メタン、 13 Ｃ標識
二酸化炭素および酸素を完全閉鎖条件下に分析した後、
合流させて全量を該ガス圧力変動吸収装置に再循環させ
る第２再循環ラインを形成させ、該ガス圧力変動吸収装
置より出るガスの全量をリアクター内の栄養培地中に循
環させ、シーケンサー制御手段により 13 Ｃ標識メタン、
13 Ｃ標識二酸化炭素および酸素の分析値に基いて新たに
供給される 13 Ｃ標識メタンおよび酸素の量、ならびに第
１再循環ラインのガス量を自動的に制御し、完全閉鎖系
において自動的に行なわれ、得られる 13 Ｃ標識アミノ酸
が均一にラベルされていることを特徴とする前記 13 Ｃ標
識アミノ酸の製造方法。 - 【請求項２】 該メタン資化菌の培養が、リアクターの
一方より培地の一定量を連続的に取り出しながら、リア
クターの他方に培地の一定量を新たに連続的に供給する
連続方式により行なわれることを特徴とする請求項１記
載の製造方法。 - 【請求項３】 該13Ｃ標識混合アミノ酸より各アミノ酸
を単離することを特徴とする請求項１記載の製造方法。 - 【請求項４】 栄養培地中に13Ｃ標識メタンおよび酸素
を通しながら、該栄養培地中でメタン資化菌を培養する
リアクター；該リアクターを通して13Ｃ標識メタン、酸
素、該培養によって生される13Ｃ標識二酸化炭素および
必要に応じて添加される窒素ガスよりなるガス成分を循
環させる循環ライン；リアクターガス成分出口側の循環
ライン上で該ガス成分の一部を抜き出して含有されてい
る13Ｃ標識二酸化炭素を完全閉鎖条件下に吸収・回収し
た後、残りのガスの全量を循環ラインに再循環させる第
１再循環ライン；13Ｃ標識二酸化炭素の吸収・回収後の
循環ライン上に設けられたガス圧力変動吸収装置；該ガ
ス圧力変動吸収装置に新たに13Ｃ標識メタンおよび酸素
を供給するライン；該ガス圧力変動吸収装置内のガスの
一部を抜き出し、さらに分枝してそれぞれ13Ｃ標識メタ
ン、13Ｃ標識二酸化炭素および酸素を完全閉鎖条件下に
分析した後、合流させて全量を該ガス圧力変動吸収装置
に再循環させる第２再循環ライン； 13Ｃ標識メタン、
13Ｃ標識二酸化炭素および酸素の分析値に基いて新たに
供給される13Ｃ標識メタンおよび酸素の量、ならびに第
１再循環ラインのガス量を自動的に制御するシーケンサ
ー制御手段よりなる請求項１記載の方法に用いられる装
置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22668093A JP3276732B2 (ja) | 1993-08-20 | 1993-08-20 | １３ｃ標識アミノ酸の製造方法およびその装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22668093A JP3276732B2 (ja) | 1993-08-20 | 1993-08-20 | １３ｃ標識アミノ酸の製造方法およびその装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0759583A JPH0759583A (ja) | 1995-03-07 |
| JP3276732B2 true JP3276732B2 (ja) | 2002-04-22 |
Family
ID=16848976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22668093A Expired - Fee Related JP3276732B2 (ja) | 1993-08-20 | 1993-08-20 | １３ｃ標識アミノ酸の製造方法およびその装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3276732B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001120292A (ja) * | 1999-08-17 | 2001-05-08 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2002078499A (ja) * | 2000-06-21 | 2002-03-19 | Tokyo Gas Co Ltd | 化合物を分解する生物を検出する方法 |
| JP7387537B2 (ja) * | 2020-03-27 | 2023-11-28 | 東邦瓦斯株式会社 | オフガス処理システム |
-
1993
- 1993-08-20 JP JP22668093A patent/JP3276732B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0759583A (ja) | 1995-03-07 |
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