JPS59500253A - 無機ピロリン酸塩による細菌生育刺激 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 無機ビロリン酸塩による細菌生育刺激 技術分野 この発明は、エネルギー源として無機ビロリン酸塩を利くの種の微生物、特に、 重要な商業的および工業的プロセスにおいて使用される微生物の生育が遅いとい う問題を克服するものである。

背景技術 無機ビロリン酸塩（ＰＰｉ）はアゾノンシン三リン＠（ＡＴＰ）の進化前駆体と して提案されている（Ｆ　、　Ｌ　ｉｐｍａｎｎ。

Ｔｈｅ　Ｑｒｉｇｉｎｓ　ｏｆ　ｐｒｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　３ｙｓｔｅａ＋ ｓ、　ｐｐ、　２６１−２７１Ｍ１ｒ、、〜ｊｏｓｃ’ｏｗ　、　１９６９）　 、さらに最近になってこの化合物は多数のエネルギー生成反応に関与しているこ とが証明された（Ｒ，Ｅ、　Ｒｅｅｖｅｓ　、’Ｔ　ＩＢＳユニ　５３．１９７ ６；Ｈ，Ｇ、　Ｗｏｏｄ　、　Ｗ’、　Ｅ、　０’　Ｂｒ１ｅｎ、　Ｑ、、　Ｍ ｉｃｈａｅｌｓ　。

Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、４５：８５．１９７７；　Ｋ、、　Ｓ、、　Ｌａ ｍ、　ｃ、　Ｂ。

ＫａＳＤｅｒ　、　Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ　、　３ｃｉ、、７ ７：　１９２７゜１９８０；Ｎ、〜Ｖ、　Ｃａｒｎａｌ　、　Ｃ１Ｃ，３１ａｃ ｋ、　３ｉｏｃｂｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　８６：　２０．１９７９：　 Ｄ、　Ｃ。

３　ａｂｕｌａｒｓｅおよ’Ｃ”Ｒ、Ｌ　、Ａ　ｎｄｅｒｓｏｎ　、３　ｉｏｃ ｈｅｍ、Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、１００：　１４２３ ．１９８１）　。米国特許第３．９６０．６６４　＠および米国特許第３，０１ ０，８７６号は無該ビロリン酸塩を生育培地の重要でない成分として開示してい る。

しかし米国特許第３，９６０，６６４号および米国特許第３，０１０゜８ｔ６号 は無機ビロリン酸塩をエネルギー源として利用することに言及していない。

発明の開示 硫酸塩還元細菌の二つの属すなわちデスルホビブリオ（［）　ｅｓｕｌｆｏｖｉ ｂｒｉｏ）およびデスルホトマクラム（［）　ｅｓｕｌｆｏ−ｔｏｍａｃｕｌｕ ｍ　）による呼吸的硫酸塩還元の生物エネルギー源はＭ本釣に異なっている（Ｃ ，Ｌ、Ｌｉｕ、Ｈ，Ｄ、Ｐｅｃｋ　。

Ｊ　ｒ、、　Ｊ　、　３ａｃｔｅｒｉ６１．、ユ４５：、９６６　、１９８１＞ 　。デスルホビブリオの場合には、呼吸的硫酸塩還元の第一酵素反応段階におい て酵素アデノシントリホスフェートスルフリラーゼ（式１）によってアデノシン 三リンＭ　（ＡＴＰ）から生産される無機ビロリン酸塩（−Ｐ　Ｐよ）は、無機 ピロホスファターゼ（式２）によってオルｌ−リン酸塩（Ｐｉ目こ加水分解さの 化学エネルギーは保存されない。乳酸塩−硫酸塩培地上における生育の際にアデ ノシン三リン酸（ＡＴＰ）の正味収量を得るために、デスルホビブリオ居はこの 生育モード　゛において電子移動で連結された１、、！ン酸化を行なってし）る 。

これとは対照的に、デスルホトマクラム屈は酵素すなわち無機ピロホスフェート アセテートホスホトランスフェラーゼ（式３）によってアデノシントリ゛ホスフ ェート（、へｊＰ）スルフリラーゼ（式１）により生吹するピロ１ノン西ン」菖 の↑ろ合エネルギーを保存することができる（　Ｒ、Ｅ　、ＲｅｅｖｅｓＪ　、 Ｂ　、Ｇｕｔｈｅｒｉｅ　、Ｂ　１ｏｃｈｅｓ、Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ ｏｗ−■ｕｎ、　、竺：　１３８９．１９７５）。

式３　酢酸塩＋Ｐ　Ｐｉ　→アセチルホスフェートーｐ＝アデノシン三すンｉｌ ｌ、（ＡＴＰ＞はアセテートキナーゼ（式４）によって７セチルボスフエートと ７デノシンジホスフエート（ＡＤ、Ｐ）からつくることができる。

式４　ＡＤＰ＋アセチルボスフェート →酢酸塩＋ＡＴＰ これらの２つの酵素反応によってデスルホトマクラム属は、乳酸塩−硫酸塩培地 上の乳酸塩により生育する際に硫化物に還元された１ａ酸塩当たり１個の高エネ ルギーリン酸塩を基質レベルリン酸化によって生成することができる。

デメルホトマクラム属は、乳酸塩と硫ｌ］！２塩による生育の際に電子移動によ り連結されたリン酸化を行なう必要がない。

微生物の生育のためのエネルギー源として熱願ビロリン酸塩を利用することは全 く新しい知見であり、嫌気性Ｉｌ＠およびある種の好気性微生物のエネルギー代 用に関するユニークな概念である。これは基礎生物学、微生物生態学および応用 微生物学にとって多くの重要な結果を有すると思われる。デスルホトマクラム属 に属する。硫酸塩還元菌において、エネルギー源として無機ビロリン酸塩を利用 することＵ、全体として、ただ一種の特定の酵素すなわちピロホスフェートアセ テートホスホトランスフェラーゼに加えていたるところ（存在するアセテートキ ナーゼを必要とする生物学分野において最も簡単なアデノシン三リン酸産生シス テムを示している。

微生物生態学の見地から、無機ビロリン酸塩の利用が広く起こることは無機ビロ リン酸塩が新しいタイプのエネルギー移動系として機能していることを示唆する ものである。

無機ビＯリン＠塩がリンサイクルの重要な一部を成していることの論証は、塩水 沼地および沈降物、淡水沼地および沈降物、嫌気性スラッジ消化菌およびルーメ ンのようなくなる生態・系における微生物およびそれらの関係についての理解に 大きな寄与を示すことになろう。無渫ビロリンＭ塩による微生物の生育の刺激は 応用微生物学において多数の潜在的な応用を有するものであり、無機ビロリン酸 塩は普通のしかも安価な化学物質である。

本発明は、熱願ビロリン酸塩をエネルギー源として利用する微生物の生育方法で ある。

本発明の目的は、固定炭素の存在下に生育のためのアデノシン三リン酸源として 無機ビロリン酸塩を利用する方法を提供することである。

この発明のこれらの目的およびその他の目的、特徴および効果は、後述の説明お よび請求の範囲を考羅することにより明らかになろう。

低品位硫化鉄鉱のリーチング、石炭の脱硫、バイオマスのエタノールへの転換お よびバイオマスのメタンへの転換のような商業的および工業的由途に使用される 微生物の一生ｒｔｉ塩を使用する方法を提供することもこの発明の目的である。

図面の簡単な説明 第１図はデスルホトマクラム・ルミニス（Ｄ　ｅｓｕｌｆｏｔｏｓａ−ｃｕｌｕ ■ｒｕｍｉｎｉｓ　）の生育に対する無機とδ、シリン塩濃度の効果を示すもの である。生育条件は以下に示す実施例■と同じであり、基本培地と種々の濃度の 無機ビロリン酸塩を使用している。第２図は以下の実施例■に示すような塩化ナ トリウム２．５％を加えた基本培地を用いて無機ビロリン酸塩（ＰＰλ）を富化 した海底の泥の中で生育する微生物の２枚の顕微鏡写真を示している。

発明を実施するための態様 無機ビロリン酸塩、酢Ｍ塩、酵母エキス、硫酸塩および塩類を含む培地でデスル ホトマクラム・ニグリフィカンス（［）ｅｓｕｌｆｏｔｏｉｅａｃｕｌｕｍ　ｎ ｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ　）　、デスルホトマクラム番ルミニス（［ｌｅｓｕｌｆ ｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ　ｒｕｍｉｎｉｓ　）およびデスルホトマクラム・オリエ ンチス（Ｄ　ｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ　ｏｒｉｅ−ｎｔｉｓ）を生育さ せた。硫酸塩還元菌デスルホトマクラム属の微生物の場合には、生育のプロセス においてエネルギー源として無機ビロリン酸塩を利用するとただ一種の特定の酵 素すなわちピロホスフェートアセテートホスホトランスフェラーゼを必要とする 。８存酵素アセテートキナーゼも必要とされる。アデノシンニリン酸がこの系に おいてつくられる。また海水沼地（ａ　ｍａｒｉｎｅ　５ｐａｒｔｉｎａ　ｍａ ｒｓｈ）および淡水沼地から１ｑられた相増菌培養物も同様にエネルギー源とし て無機ビロリン酸塩を用いて生育させた。

後述の実施例■は無機ビロリン酸塩によるデスルホトマクラム・ニグリフィカン スの嫌気性生育条件を説明している。下記の第１表は種々の培地における生育を 比較したものである。酢酸塩、酵母エキス、硫該塩および塩類を含む基本培地は この微生物の生育を持続させない。この基本培地に無機ビロリン酸塩を加えると 、生育は乳酸塩プラス硫酸塩での通常の生育条件におけるよりも良好になった。

この基本培地において−は、無機ビロリン酸塩はデスルホビプリオ・ブルガリス ＜　［）ｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　）の生育を刺激しない 。添加した無機ビロリン酸塩と均等物であるオルトリン酸塩は、デスルホトマク ラム・ニグリフィカンス。

デスルホトマクラム・ルミニスおよびデスルホトマクラム・オリエンチスの生育 を維持しない。無機ビロリン酸塩培地においてデスルホトマクラム・ニグリフィ カンスの生育を最適にするためには、酢酸塩、酵母エキスおよび硫酸塩が必要で あった。酢酸塩および酵母エキスは固定炭素源であり、硫酸塩はこれらの微生物 にこの基本培地の固定炭素源の酸化レベルを調節するためのエレクトロンシンク を与える。硫酸塩の濃度は通常の乳酸塩−Ｉａｌｌ塩培地に使用されるもののわ ずかに１／１０であったが、酢酸塩に対する要求は予想外に高く、濃度が０．２ ％より低いと殆んど生育しなかった。この酢酸塩に対Ｊる高い要求の生理学的な 根隠は、デスルホトマクラム・ニグリフィカンス中に酢酸塩が浸透するという生 物エネルギー論と関連をもつかもしれない。無機ビロリン酸塩が生育に及ぼす刺 激効果は、酢酸塩の消失対硫化物の生成の比が３：１４であり予想される比１： １よりかなり大きいことから、無機ビロリン酸塩による嫌気的酢酸塩酸化の促進 によるものとは思われない。同様の生育応答がデスルホトマクラム・ルミニスお よびデスルホトマクラム・オリエンチスにっ′いても見出された。従って、無機 ビロリン酸塩はこれらの婚気性硫酸塩還元微生物の生育のためのエネルギー源と して働いたものである。

第１表：エネルギー源として無機ビロリン酸塩（ＰＰ、）を利用するデスルホト マクラム生育の要求性生育＊ 追加および／または削除　（０，Ｄ、）（基本培地）　０．０１９ 〔基本培地〕＋〔ＰＰ、〕０．６２Ｂ 〔基本培地〕−〔硫酸塩）　＋　（Ｐ　Ｐ、〕０．０１９〔基本培地〕−〔酢酸 塩）＋（ＰＰ・）　０．０９５（基本培地）−（ｌｉｅ母エ生エキス＋〔ｐ　ｐ ＝　０．０４２＋　（Ｐ　Ｐ、）　０．０３６ 乳酸塩−硫酸塩培地　０．５０５ 註　＊　５８０ｎｍで測定：アルゴン中５５℃で４８時間培養後の２個の・フラ スコの平均値。

第１図に示した後述の実施例■のデータは、無償とロリ１情８８５り−５００２ ５３（４） ン酸塩の増加に対するデスルホトマクラム・ルミニスの生育応答を説明している 。生育応答は０．０４％まで無機ビロリン酸塩ｍ度に比例しており、また生育は 無機ビロリン酸塩の加水分解を伴うものであった。生育しない場合には。

添加した無機ビロリン酸塩の加水分解は殆んどなかった。

０．０５％以上では無機ビロリン酸塩による生育は阻害された。これは無機ビロ リン酸塩の加水分解によって培地がアルカリ性化（１）Ｈ８，５）　Ｌ、たため であるかも知れない。同じような結果がデスルホトマクラム・ニグリフィカンス とデスルホトマクラム・オリエンチスについても得られた。

乳酸塩−硫酸塩培地で生育したデスルホトマクラム・オリエンチスの細胞の酵素 補体を、基本培地プラス無機ビロリン酸塩で生育した細胞のそれと比較した。生 育培地は後述の実施例■に示す。無頭ビロリン酸塩と乳酸塩−ｔＶｔ塩で生育し たデスルホトマクラム・オリエンチスの細胞に見出された各種酵素の特異的な活 性を以下の第２表に示す。

呼吸的硫酸塩還元のレダクターゼ類、ＡＰＳレダクターゼチオスルフェートレダ クターゼ、ピスルファイトレダクターゼおよびアデノシントリホスフェートスル フリラーゼはそれぞれの細胞調製物中でほぼ同じレベルの活性をもっていた。フ マレートレダクターゼは無機リン釜塩で生育した細胞および乳酸塩−硫酸塩で生 育した細胞のいずれにも存在しなかった。ナイトライドレダクターゼ、ホルメー トデゼ、ピロホスファターゼおよびピルベートデヒドロゲナーゼは同様の比活性 濃度で存在していた。無機ビロリン酸塩で生育した細胞中のヒドロゲナーゼが有 意に高い理由は検定方法の難しさによるものかも知れない。これらの酵素の特異 な存在は、デスルホトマクラム・ニグリフィヵンスとデスルホトマクラム・ルミ ニスについても確認さ、れた。これは無機ビロリン酸塩で生育した細胞がその代 謝パターンに基本的な変化を示さないことを示している。

酵素活性は次の標準的な検定方法により測定した（　Ｏｄｏ−１１１、Ｊ、Ｍ、 およびＰｅｃｋ　、　Ｈ，Ｄ、　Ｊｒ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌ、工： 　１６１−１６９．１９８１．　Ｅｎｚｙｍｅ　ａｓｓａｙｓ、　）　。ベンジ ルビオロゲン−またはメチルビオロゲン−結合したナイトライド、スルファイト 、フマレートおよびチオスルフェートレダクターゼ類およびヒドロゲナーゼはす べて検圧法により検定した。反応混合物は総量１．０ｍη中に、リン酸塩１００ ｍＭ　（ｐＨ７，４）　、ベンジルビオロゲンまたはメチルビオロゲンＳ、０ｍ Ｍ１および亜硫酸塩、フマル酸塩またはチオ硫酸塩２０．０　ｍＭ、、または亜 硝＠Ｆａ　５．０　ｍ〜１を含んでいた。

デスルホビブリオ・ブリガリス由来の部分的に精製したヒドロゲナーゼ（第１． 　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅカラム通過）　（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｓ−ｔｅｎ　、　Ｈ， 、、Ｓ　、　Ｇ、　ＭａｙｈｅＶｖ　、およびＣ，Ｖｅｅａｅｒ　、　ＦＥＢＳ 　Ｌｅｔｔ　、　８６：　１２２−１２６．１９７８）をヒドロゲナーピ検定を 除くすべての検圧法ビオロゲン結合した検定試料中に加えた。ピルベート−ＢＶ ’＋およびホルメート−ＢＶ２＋レダクターゼ類をペックマンモデル２５分光光 度計により５４５ｎｍで分光測定した。ホルター１−−’　Ｂ　Ｖ”＋反応用の 反応（１０） ２＋ 混合物はＢＶ　５．ＯｍＭ、ジチオスレイｉ−−ル１０．ＯｍＭ、リン酸カリウ ム緩衝液（ｐＨ７，４）　１００ｍ〜１、およびギ酸す２十 トリウム２０Ｉｌ１Ｍを含んでおり、またピルベート−ＢＶ反応用の反応混合物 はＢ　Ｖ”　５．０　ｍＭ、；２元型補酵素Ａ２、Ｏｍ〜１、リン萌カリウムＭ 　面’Ｔｉ　（ｐＨ７，４）　１００ｍＮ−１、およびピルビン酸ナトリウム２ ０．０　ｍ〜１を含んでいた。いずれの検定もツンベルク・コベット（Ｔ　ｈｕ ｎｂｅｒｇ　ｃｏｖｅｔｔｃｓ）中アルゴン雰囲気下で行なった。スクシネート −フェリシアナイドレダクターゼとＡＰＳレダクターゼの検定は、ＡＰＳレダク ターゼ反応についてはアデノシン−リン酸４０．０ｍＭ、亜硫酸塩３０．０　ｍ 〜１、フェリシアナイドｉ、ｏｍＭｑリン酸カリウム１００ｍＭ　、ｐＨ７，４ を用イ（８ｒａｍｌｅｔｔ　、　Ｒ。

およびＨ，Ｄ、　ｐｅｃｔｔ　、　Ｊｒ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、　ＣＩ）ａｍ 　、２５０：２９７９−２９８６．１９７５）、スクシネート−フェリシアナイ ドレダクターゼ反応についてはコハク酸カリウム２０．Ｏｍ〜１１フェリシアナ イド１０ｆｆｌ＼・１、リン酸カリウム１００ｍ〜１、ｐＨ７，４を用い、空気 中分光光度計により４２０ｎｍにおいて１１なった。Ｃ型チトクロームの分析は ５３８〜５！ｉｌｎｍ　（４０）における示差分光分析法によって行なった。、 膜画分およし；全細胞については、Ｏｚ−酸化されたおよびジチオネート−）２ 元された膜の示差スペクトルをＡ　ｍ１ｎｃｏ　Ｄ　Ｗ　−２分光光度計により １ｍｍの光路で液体窒素の温度において測定した。液体窒素温度における見掛上 の吸光係数の変化は、空）島における既知量のチトクロームＣ３の示差スペクト ル１ｌｒ＝１３．０００）を測定することによって考慮した（　Ｓ　ｈｉｐｐ、 〜■。

（１１） Ｓ２．△ｒｃｈ　、　１３ｉｏｃｈｅｍ、　［３ｉｏｐｈｙｓ、１５０：　４５ ９−４７２．１９７２）。チトクロームｂはそのピリジンへモクロモゲンの吸収 スペクトルの差によって測定した。フラビンアデニンジヌクレオチドおよびフラ ビンモノヌタレオチドは酸性および中性ｐＨにおける螢光によって測定した（Ｓ ｉｅｏａｌ　、　ｌ。

Ｍ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　［Ｅ−ｎＺｙｍｏｌ、　５３Ｄ　：　４１９−４２９． １９７９）　、メナキノンはクローガーの方法により測定した（　Ｋ　ｒｏｇｅ ｒ　。

Ａ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　５３Ｄ　：　５７９−５９１．１９ ７９＞　。非ヘム鉄は０−フェナントロリンによる色素生成を測定することによ り検定した＜Ｂｅ１ｎｅｒｔ、　Ｈ，、Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２０ ：３２５−３３４．１９６７）。蛋白質はビューレット法によって測定した（Ｇ ｏｒｎａｌｌ、　Ａ、　Ｇ、、Ｇ、　Ｊ、　３ａｒｄａｗｉ１１．　ａＪ：ヒＭ 。

メタントリホスフェートスルフリラーゼはウィルソンとバ− ンドルスキーにより記載されているＭｏＯ２を用いて測定した（Ｗｉｌｓｏｎ　 、　Ｌ、　Ｇ、およびＲ，Ｓ、　Ｂａｎｄｕｒｓｋｉ、　ＪＢｉｏｌ　、　Ｃｈ ｅｍ　、２３３：　９７５−９８１．１９５８）　、無機ピロホスファターゼは アカギとキャンプベルの方法により測定した（ＡｋａＯｉ、　Ｊ、　Ｍ、および Ｌ　、　Ｌ　、　Ｃａｍｐｂｅｌｌ　、’　Ｊ　、　１３ａｃ−ｔｅｒｉｏｌ、 ８４：　１１９４−１２０１．１９６２＞　、、無機ピロホスファターゼアセテ ートホスホトランスフェラーゼはリーブスとグスリーの条件を用いることにより 憶定した（　Ｒｅｅｖｅｓ　、　Ｒ，。

Ｅ、およヒＪ　、　Ｂ　、　Ｇｕｔｈｒｉｅ、　Ｅ３　ｉｏｃｈｅｍ、　ｆ３１ ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

持表昭５９−５ｔｌ（１２グＪ（５ン ２１−２８．４９４５）を測定した。硫化物はシーグルの方法により測定した（ Ｓｉｅｇｅｌ　、　Ｌ、　ＮＩｌ、、Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１： １２６−３２．１９６５）。蛋白質はヒユーレット法により測定した（　ｌ　ｅ ｖｉｎ、Ｒ、およびＲ，Ｗ、　Ｂｒａｕｅｒ　、　Ｊ、　１−ａｂ。

Ｃｌ１ｎ　、　１ｙｌｅｄ、　３８：　４７４−４７９．１９５１）　、、乳酸 塩および酢酸塩は水素炎イオン化デテクターを取付けたＶａｒｉａｎ　ＡｅｒＯ −ｇｒａｐｈ　２７００ガスクロマトグラフにより測定した。

第２表：〔基本培地〕＋（無機ビロリン酸塩（ＰＰ７＞〕およＵ乳醒塩−＠故塩 培地で生育したデスルホトマクラム・オリエンチスの抽出物中の酵素活卜 ｌｔ！　索　活　性 ビスルファイトリダクターゼ　６４．３　５７．１ナイトライドリダクターゼ　 １１９．６　１５３．８チオスルフエートリダクターゼ　２３．７　２１．５フ マレートリダクターゼ　ｏ　。

ＡＰＳリダクターゼ　３７９　３８５ ホルメートデヒドロゲナーゼ　６４　８７．１ヒトＯゲナーゼ　１６．２　８５ ．２ ピルベートデヒドロτナーゼ　１０７　１３９（Ｉ３） アデノシントリホスフェート スルフリラーゼ　１４０　１５１ ピロホスフエートアセテート ボスホトランスフェラーゼ　８２ｏ　１３１５無ｊ苅ピロホスフアターゼ　１４ ９　９８生育のためのエネルギー源として無機ビロリン酸塩を利用するものがデ スルホトマクラム属に限定されると信じる演栂的な理由はない。（基本培地〕− 〔無機ビロリン酸塩〕培地でその曲の属の微生物の生育を微生物の増菌培養物を 用いて試験した。具体的に説明すると、塩水沼地（ａｓａｌｔｉａｔｅｒ　５ｐ ａｒｔｉｎａ　ｍａｒｓｌ＋　＞から得られた泥試料から採取した微生物を使用 し、塩化ナトリウムを添加した基本培地に無機ビロリン酸塩を加えまたは加えず に接種し、後述の実施例ＩＶに示すような嫌気性条件において培養した。、３７ ℃２４１＋！Ｆ間以内に無罐”ビロリン酸塩を含む嫌気性培地は大量の微生物の 生育を示した。この増菌した微生物の顕微鏡写真を撮った。これらの増−菌培養 物の顕微鏡写真は驚＜　４ｆｆｉど多数の子ＩＩＩ］Ｖぬ数の形態の微生物項を 含んでいた。後述の実施例Ｖに示すように、同じ培地かｌう塩化ナトリウムを除 いた培地を用いて淡水環境から得られた無機ビロリン酸塩富化生育培養物につい ても同じような結果が得られた。細胞のに４類の多様停は、無機ビロリン酸塩を エネルギー源として利用するものが胞子形成桿状体によって待微付けら°れるデ スルホトマクラム属に制限されないことを示している。

（１４） これらの増菌培養物がらのいくっがの初期単離物はＭｌ塩還元微生物ではな（、 生育のために酢酸塩または硫酸塩を必要としなかった。

デスルホトマクラム属、メタノバクテリウム（Ｍ　ｅｔｈａｎｏ−ｂａｃｔｅｒ ｒｕｍ　）属およびメタノサルシナ＜　Ｍ　ｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ　”） 属は、バイオマスおよび有機廃棄物を始めとするセルロースをメタンおよび二酸 化炭素に転換する微生物群に直接に含まれている。デスルボトマクラム属は乳酸 塩、脂肪酸類およびアルコール類などの発酵生成物を酢酸、二酸化炭素および水 素に変換し、メタノバクテリウム属は二酸化炭素及び水素をメタンに変換し、メ タノサルシナ居は酢酸塩をメタンおよび二酸化炭素に変換する。上記の如く発酵 生成物を変換し酢酸塩または水素とｃｏ２がらメタンを製造することはこの重要 な生物学的プロセスにおけるステップを制限しており、これらの細菌を特徴づけ る生育すなわち生理学的プロセスは後述の実施例ハｉに示すように無機ビロリン 酸塩によって刺激される。淡水の沼地から得られた粗セルロース富化物を用いて 無機ビ０１ル酸塩によるメタン生成の刺激が後述の実施例■に示すように立証さ れた。

メタノサルシナ・バーケリーｒ　（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｂａｒｋｅｒ ｉ−１）は後述の実施例■に示すように無機ピロ１ル酸塩の存在下に酢酸塩から 速い速度でメタンを直接に生成することタノリカス（’Ｔ　ｈｅｒｍｏａｎａｅ ｒｏｂａｃｔｅｒ　ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ　）が無機（１５） ビロリン酸塩で生育するということは予想されなかったが、このような種類の嫌 気性菌が無機ビロリン酸塩を代謝する生成物のパターンを変化させる方法を示唆 している。サーモアナエロバクター・エタノリヵスはグルコース１．０モルから エタノール１．８主ル、酢酸塩０．１モル、乳酸塩１．０モルを生成するので、 酢酸塩と乳酸塩の蓄積によってサーモアナエロバクター・エタノリカスを使用し てエタノールを連続生産することは制限される。無機ビロリン酸塩を添加すると 酢酸塩と乳酸塩の生成が排除され少なくなりあるいは完全になくなるので、後述 の実施例ＩＸに示づようにサーモアナエ０バクター・エタノリカスによるエタノ ールの）型読生産が容易になる。

チオバチルス（Ｔｈｉｏｌ＋ａｃｉｌｌｕｓ　）　ａは低品位硫化鉄鉱のリーチ ングに商業的に用いられている微生物である。このリーチングは主としてこれら の微生物の生育速度のためにゆつ（すしたプロセスである。無機ビロリン酸塩を 添加すると後述の実施例Ｘに示すように、これらの微生物の初期生育速度が増大 し、リーチングプロセスが促進される。滞留時間が少なくなるためにこのプロセ スに使用されている現存設備の能力が増大する。

無機ビロリン酸塩を加えたチオバチルス属による微生物・リーチングの第二の特 徴雇、これらの微生物の初期生育速度を増大させることによって脱硫プロセスを 加速し、これによってプロセスに必要な菌体量を増加させるということ（１６） ７８表昭５９−５０Ｇ２郭（６） である。石炭スラリーの滞留時間が少なくなることによりこのプロセスは経済的 に実施することができる。

多数の酵素、ファインバイオケミカルズおよび医薬の工業的生産のために微生物 学的プロセスが利用されている。

製造培地に無機ビロリン酸塩を添加するとこれらの生成物の収量および微生物が 増加する。例えばメタノザルシナ・バーケリイによるビタミンＢ１□の収率は後 述の実施例ＸＴＩに示すように無機ビロリン酸塩を添加することによって増大す る。またクロストリジウム・サーモセラム（０，ｌｏｓｔｒｉ−ｄｉｕｍ　ｔｈ ｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ　）によって生産されるセルラーゼの量は後述の実施例Ｘ ■に示すように無機ピロリン酸塩を添加することによって増大する。

無機ピロホスフェートアセテートホスホトランスフェラーゼは基質からＡＴＰを 生産するための最も簡単な生物学的システムを示している。ある微生物から他の 微生物にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を移す従来の方法、すなわち米国特許第４ ．２３７１２．２４号（コーエンおよびボイヤーによる生物学的機能を有する分 子キメラを製造する方侍はこの技術分野において知られている方法である。微生 物中で外来遺伝子を複製し発現させる方法および組成物が提供される。

プラスミドまたはウィルスのデオキシリボ核酸を開裂して所望の表現特性をもつ 生物学的機能を・もつレプリコンをつくる。このレプリコンを形質転換にとって 微生物細胞中に挿入する。形質転換体を単離すると、改変プラスミド中に（１７ ） られる。この方法は遺伝能力を微生物中に導入して、医学的にまたは商業的に有 用な酵素のような蛋白質および核酸この方法はホルモン、抗生物質などの医薬の 製造、窒素の固定・発酵・特烹の材料の利用などに直接的−に有用性をもち利用 することができる）を用いて、酵素の生合成のためＸＩ■に示すようにこの微生 物に無機ビロリン酸塩で生育する能力を与える１゜このようにピロリーン酸塩で 生育町る能力は他の微生物に移入することができる。

実施例　工 地で生育させた。すなわら、基本培地；〔基本培地〕十ロリン酸塩〕：〔基本培 地〕−〔酵母工、キス〕＋〔無機ビ十〔無機ビロリン、酸塩〕：および乳酸塩− 硫酸塩培地を用いた。−基本培地は１ａ当り次の各成分を含む：すなわち酢酸ナ トリウム３．３ｇ：　Ｎ　ａ２Ｓ　Ｏ，０，４ｇ；　Ｍｃ＋　Ｓ　Ｏ４・、７　 Ｈ，ＯＣａ　ｃ’ｌ□＋　２　Ｈ２Ｏ０，２り　ＱディフコＷ母エキス２．ＯＱ 　；ＦｅＳＯ４１０ｍｇ：還元剤（２，５ｇシスティンｔ−Ｉ　ＣＩ　−１−２ ，５ｏ　Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２０／２００ｍ、ＩＩＨ２０）２０ｍＦを含んでい（１ ８） る、、ＫＯＨを用いてｐＨを７．２に調節した。無機ビロリン、酸塩（ＰＰｉ） （濾過滅菌したもの）を加える場合には最終濃度が培地１１中に０．０５％とな るように加えた。乳酸塩−硫酸塩培地は１ａ当り次の各成分を含む：すなわち、 乳酸ナトリウム（６０％＞　１２．５ｍｆに　Ｎ　Ｈ２ＯＪ２　２．０９　；　 Ｍ（ｌ　Ｓ　Ｏ４−７Ｈ，００，２ｇ；　Ｋ、ＨＰＯ４０，５（１；　Ｃａ　Ｃ ｌ□’−２Ｈρ０　、２（１、；　７　イア　ｍｌ　ｉｌｌ　ｆｆｉ　工；”Ｆ 　ス１．　Ｑｇ　；　Ｎ　”２　Ｓ、＋　９　、ＨｘＯｏ、２５ｇを含んでいる 。

前記第１表は４８時間後の生育を比較して示したものである。

実施例　■ デスルホトマクラム・ルミニスの細胞を、実施例■の基本培地に無段ビロリン酸 塩（ＰＰｉ）（濾過滅菌したもの）を最終濃度が１ｐ当り培地中で０．０１％、 ０．０２％。

０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％およびｏ、、ａｙ％となるよ １う（こ加えて生育させた。第１図は４８時、朋後の比較生育速度を示している 。

実施例　■ デスルホトマクラム・オ、リエンチスの細胞を実施例■の〔基本培地〕＋〔・無 機ビロリン酸塩〕および乳酸塩−硫酸実施例　ＩＶ 塩水沼地（ａ　５ａｌｔ　ｗａｔｅｒ　５ｐａｒｔｉｎａ　ｍＢす５）から得た 生試料を、塩化ナトリ、ウムを１β当り培地中２５％の濃度となるように加えた 実施例■の基本培地、および塩化ナト１−′ウム２．５％を加えた実施例工の〔 基本培地〕＋（無機ビロリン酸塩）に接種した。第２図のような顕微鏡写真は２ ４時間の嫌気的培養後の細胞の種類の多用性を示している。

実施例　Ｖ 淡水沼地ｈ）らｉｌＪられた土試料を実施例■の基本培地および実施例工の（基 本培地〕＋〔無頭リン酸塩〕の培地に接種した。２４時間嫌気的に培養した後、 培養物は塩水沼地からの増菌培養物について観察されたのと同程度の微生物の多 用性を示した。

実施例　Ｖｌ 従来の培地と生育条件を用いて、無液ビロリン酸塩が多数の多様な微生物の生理 学的プロセスと生育を刺激することを立証した。以下の第３表には無機ビロリン 酸塩によって影響を受けた微生物のリストが示されている。

第３表：各種微生物の生育に及ぼサビロリン酸塩の効果電子受容体 生育の維持　生育の刺激　固定炭素　（シンク）デスル／Ｊ・トンクラム・　＋ 　・・・　酢酸塩　硫酸塩二グリフィカンス　酵母エキス ゲスルホ１−マクラム・　↑　・・・　酢酸塩　硫酸塩ルミニス　酵母エキス デスルホトマクラム・　＋　・・・　酢酸塩　ｋ＋　ｍ塩オリエンチス　酵母エ キス チオバチルス・　？　＋　なし メタノバクテリウム　？十酵母エキス　ｃｏ２カシ１〜ン サーモオ−１−トロじカム メタノサルシナ・　？　→　酢酸塩　酢酸塩バーケリイ　（酢顔塩メ　酵母エキ ス タノール）　カシトン クロストリジウム・　＋　・・・　Ｈｍエキス　・・・サーモセラム ロドシュードモナス・　？　ｆ　酢酸塩　・・・カブスラータ　酢酸塩 サーモアナエロバクター・　十　ＲＩＤエキス　なし実施例　ｖ■ 淡水沼地から１ｑられた土を、０．０４％無機ビロリンＨｊＡを含むおよび含ま ないセルロース含有培地（［）ｉ１ｗｏｒ目］。

Ｇ　ハＶｉｅｇｅｌ　、　Ｊ、、Ｌ　ｊｕｎｇｄａｈｌ、　Ｉ−、Ｇ、およびｐ ｅｃｋ。

Ｈ，Ｄ、、Ｊｒ、、　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕ１．ｏｓｅ　〜＋　１ｃｒｏｂｉｅｎｎ ｅ、　Ｃ〜ＩＲ８゜カシトン（Ｃａｓｉｔｏｎｅ　）　２．５ｇ　／Ｊ！　；セ ロビオース０．２ａ　／ｊ２　；　Ｎａ　ＣＪ２　０．９ｇ／β：　（ＮＨ４） 、５ｏ４０．９ｇ／ｌ　；Ｋ　１１２　Ｐ　０４　０　、４５　ｆｌ　／　Ｊ２ 　：　ＩＶＩ　Ｇ　Ｓ　０４　ｏ、　０９　！ＩＩ　／　Ｊｔ　：　Ｃａ　Ｃｆ ｌ　２０．０９９／ｊ２　；　Ｋ、ＨＰＯ４０，４５ｇ／ｊ２　：　シスーｒイ ン０．５！Ｉ／ρ）に接種した。メタン生成速度の刺激を以下の第４表に示す。

第４表：増菌培養物を用いた無機ビロリン酸塩によるセルロースからのメタン生 成の刺激メタン生成（ｍ　ｍｏｌｅｓ　） 実施例　Ｘジ メタノサルシナ・バーケリイを、０．０４％無賎ビロリン酸塩を含むおよび含ま ない酢酸塩（０，２％）含有培地に接種した。ビロリン酸塩によるメタン生成速 度の余り激を以下の第５表に示す。

第５表：メタノザルシナ・バーケリイを用いた無殿ビロリン酸塩による酢酸塩か らの メタン生成の刺激 ３　０．１８　０．２６ ９　１．６３　６．３８ １１　１．４３　７．３９ 実施例　ＩＸ グルコースまたは澱扮のような発酵性化名物を含む培地に発酵性嫌気性ａ菌例え ばサーモアナエロバクター・エタノリカスを接種し、無機ピロリン酸塩を加えお よびｈｉ］えずにその細菌の最適生育；品度で培養する。無瀕ビ［ｌリン酸塩が 存在すると、より高い濃度の所望の生成物が得られるように発酵生成物が変化づ る。

実施例　Ｘ 無液ピロリン酸塩を添加しまた１よ添加ばずに、均砕した低品位硫化鉄鉱の試料 にチオバチルス色を接種する。金鹿イオンの放出を３０℃において時間の関数と して追跡する。

無機ビロリン酸塩が存在すると余圧イオンの放出が増大し、これはチオバチルス 色の生育が速くなり鉱石のリーチング速度が増大していることを示している。

（２３） 実施例　ＸＩ ｆｉ機ビ０リンＩ！塩を添加しまたは添加せずに、９砕した硫黄含有量の高い石 炭の試料にチオバチルス菌を接種す゛る。

硫酸塩イ゛オンの生成を３０℃においてｖｆ間の関数として追料のＷ！硫速度が 高くなっていることを示している。

実施例　ｘ■ 無機ビロリン酸塩を含む標準培地（Ｗｅｉｎｅｒ　、　Ｐ　、　Ｊ　。

および７ｅｉｋｕｓ　、　−Ｊ　、　Ｇ、、Ａ　ｒｃｈ　、　Ｍ　１ｃｒｏｂｉ ｏｌ、ユ阻：４６−５７．１９７８．　ＫＨ，ＰＯ４１，５！１　／９８５　ｌ ｉｔガラス蒸溜水：に、ＨＰ　０４・３　Ｈ，０２，９１１／９８５−ガラス蒸 溜水；　Ｎ　Ｈ，Ｃぶ１、Ｏｒ＋　／　９８５　ｍｌガラス蒸溜水；　Ｎ　ａ　 （：、　Ｊ！　０．９＋１　／９８５　ｗｄｌガラス蒸溜水：ＭｏＣＪｔ、・６ ４−１２００．２ｏ　／９８５　ｍガラス蒸溜水；　Ｃａ　ＣＪ２．−２８，０ ０．０５Ｍ９８５１１Ｊｌカフス蒸溜水：Ｎａ　Ｓｅ　０３０，０１７１（＋／ ９８５−ガラス蒸溜水：ミネラル溶液　１０１１Ｎ／９８５−ガラス蒸溜水：ビ タミン溶１５■１７９８５−ガラス蒸溜水：リアズリン（Ｒｅａｚｕｒｉｎ　） 　（０，２％）１．０園１／９８５＠ｌガラス蒸溜水）にメタノサルシナζバー ケリイを接種する。この微生物をビタミンＢ１□の商業的生産に用いることがで きるほど高いビタミン”＋２の収率が得られる。

実璋例　ｘ■ 無機ビロリン酸塩を加えた標準培地（［）　ｉｌｗｏｒｔｈ　、　Ｇ、。

Ｗｉｅｇｅｌ　、　Ｊ、、Ｌ　ｊｕｎａｄａｈｌ、　Ｌ、　Ｇ、およびｐｅｆ、 に、Ｈ。

１１１ＫＢａ５９−５００２５３（８）Ｄ、、Ｊｒ−、ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌｏｓ ｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｅｎｎｅ、０ＭＲ８，Ｍａｒ−ｓｅｉｌｌｅ、　Ｆｒａｎｃ ｅ　、セルロース（アビセル）　５．０＜１　／ｆｔ　；Ｎａ　ＨＣＯ３４，Ｏ Ｑ　／Ｊ！　：酵母エキス　０．６（１／ｆｔ　；カシトン２．５９　／Ｉｔ　 ；セロビオース０．２（１／Ｊ！　；　Ｎａ　ＣＪｔ　Ｏ，９ａ　／１１　；　 （ＮＨ４）、５ｏ４ｏ、ｓｇ／１２　；　ＫＨ，ＰＯ４０，４５１）／ｆ　：Ｍ ９５ｏ４Ｇ、０９９／ｉ；　Ｃａ　Ｃｌ１Ｏ，０９Ｇ＃！　：に、ＨＰＯ４０， ４５ａ／ぶニジスティン　０．５（１／１２　）にクロストリジウム・サーモセ ラムを接種する。クロストリジウム・サーモセラムをセルラーゼの商業的生産に 使用することができる程度に高い収率でセルラーゼが得られる。

％論例　ＸＩＶ エシェリキア−・フリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｌ）は無機ビロリン 酸塩で生育することができず、酵母ピロホスフェートアセテートホスホトランス フェラーゼをもっていない。ある微生物から他の微生物にデオキシリポ核＆Ｉ　 （ＤＮＡ）を移入する公知の方法、すなわち米国特許第４，２３７，２２４号の 方法（コーエンおよびポイヤーによる生物学的機能を有する分子キメラをＷＪ造 する方法はこの技術分野において知られている方法である。微生物中で外来遺伝 子をＮ製し発現させる方法および組成物が提供される。プラスミドまたはウィル スのデオキシリボ核酸を開裂して所望の表現特性をもつ生物学的ｍ能をもつレプ リコンをつくる。このレプリコンを形質転換に′よって微生物細胞中に挿入する 。形質転換体を単離すると、改変プラスミド中に存在するデオキシリボ核酸分子 を複製し発現する細胞が得られる。この方法（２５） は遺伝能力を微生物中に導入して、医学的にまたは商業的に有用な酵素のよう− な蛋白質および核酸をｔＪ造する便利で効率のよい方法を提供するものである。

この方法はホルモン、抗生物質などの医薬の製造、窒素の固定、発酵、特定の材 料め利用などに直接的に有用性をもち利用することができる）−を用いてホスホ トランス”フェラーゼの生合成情報を有するデスルホトマクラムからのＤＮＡを エシェリキア・コリに移入し、この微生物が生育のためのエネルギー源として無 機ビロリン酸塩を利用できるようにする。

以上−の説明はこの発明の範囲内における特定の実ｔＭ態様を説明するものであ り、この発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。この発明を特定 の実ｔｌｉ！態様に関連して説明したが、本発明はこれに制限されるものではな い。本発明の範囲から逸脱することなく当業者がこれを変形し改変することがで きるということが理解されるべきである。

産業上の利用可能性 この発明は、ｓ機ビ０リン酸塩をエネルギー源として使用し、低品位硫化−鉄鉱 のリーチング、石炭の脱硫、バイオマスからエタノールへの変換およびバイオマ スからメタンへの変換のような商業的および工業的用途に使用されている微生物 の生育速度を刺激する方法である。

第　１　図 ピロリン＃県％ 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、固定炭素源を含む培地上で、アデノシン三リン酸を生成させるためのエネル ギー源として無機ピロリン酸塩を使用し、ピロホスフェートアセテートホスホト ランスフェラーゼ酵母とアセテートキナーゼ酵母とを有する微生物を用いること を特徴とする微生物の生育方法。 ２、前記微生物が塩水沼地、淡水沼地、下水！ｆｉｌ理スラッジおよびルーメン からなる群から選ばれた嫌気性生態系の泥状試料から得られたものである請求の 範囲第１項に記載の方法。 ３、前記微生物が好気性である請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、前記微生物が嫌気性である請求の範囲第１項に記載の方法。 ５、前記微生物がＴＪ７Ｉ酸還元性ではない請求の範囲第４項に記載の方法。 ６、前記微生物が＠酸遷元性である請求の範囲第４項に記載の方法。 ７、前記微生物がデスルホトマクラム属、メタノバクテリウム屈、メタノサルシ ナ属、サーモアナエロバクター属、チオバチルス属およし；クロストリジウム属 からスである請求の範囲第５項に記載の方法。 （２７） ９、前記微生物がデスルホトマクラム・ニグリフィカンス、デスルホトマクラム ・オリエンチスおよびデスルホトマクラム・ルミニスからなる群から選ばれる請 求の範囲第６項に記載の方法。 １０、前記固定炭素源が酢酸塩および酵母エキスからなる請求の範囲第９項に記 載の方法。 １１、前記培地が固定炭素源の酸化レベルを調節するためのエレクトロンシンク を含んでいる請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２、エレクトロンシンクが硫酸塩である請求の範囲第１１項に記載の方法。 １３、無機ピロリン酸塩の濃度が０．１％（Ｗ／Ｖ　）〜０．０６％（Ｗ／Ｖ　 ）である請求の範囲第１０項に記載の方法。 １４、無機ピロリン酸塩の濃度が０．０５９０　（ｗ／＼ｌ）である請求の範囲 第１０項に記載の方法。 １５、前記微生物がメタノサルシナ・バーケリイである請求の範囲第６項に記載 の方法。 １６、固定炭素源を含む培地上τアデノシン三リン酸を生成させるためのエネル ギー源として熱願ビロリン酸塩を使用し、ビロホスフエートアセテートホスホト ランスフエラーピ酵素およびアセテートキナーゼ酵素とを有する微生物を用いる ことを特徴とする微生物の生育速度を刺激する方法。 １７、前記微生物がセルロースをメタンと二酸化炭素に変（２８） 換する請求の範囲第１６項に記載の方法。 １８、前記微生物がバイオマスをメタンと二酸化炭素に変換する請求の範囲第１ ６項に記載の方法。 １９、前記微生物がセルロースをエタノールとその他の生成物に変換する請求の 範囲第１６項に記載の方法。 ２０、前記微生物が−バーイオマスをエタノールとその他の生成物に変換する請 求の範囲第１６項に記載の方法。 ２１　、＃ｉ記機微生物低品位ＪＥ鉄鉱をリーチングする請求の範囲第１６項に 記載の方法。 ２２、前記微生物が石炭を脱硫する請求の範囲第１６項に記載の方法。 ２３、前記微生物が酵素を生産するのに使用される請求の範囲第１６項に記載の 方法。 ２４、前記微生物がクロストリジウム・サーモセラムであり、前記酵素がセルラ ーゼである請求の範囲第２３項に記載の方法。 ２凱前記微生物がファインバイオケミカルおよび医薬からなる群から選ばれる化 合物を生産するのに使用される請求の範囲第１６項に記載の方法。 ２６、前記微生物がメタノサルシナ・バーケリイであり、前記ファインバイオケ ミカルがビタミンＢＩ２、特許請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２７、ピロホスフェートアセテートホスホトランスフェラーゼ酵素のための遺伝 情報が、ある微生物から他の、微生物にデオキシリポ核ｍ　（Ｄ　Ｎ　Ａ　）を 移すための技術（２９） １情唱９−５００２嵜（２） を用いて前記微生物に移入されている請求の範囲第１６項に記載の方法。 ２８、前記微生物がエシェリキア・コリである請求の範囲第２７項に記載の方法 。