CN110656058A - 异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株、种子液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种异养硝化‑好氧反硝化的假单胞菌菌株、由该菌株培养得到的种子液及培养方法，所述菌株为假单胞菌LJ9(Pseudomonas indoloxydans LJ9)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60339。该假单胞菌菌株具有耐高碳氮比和耐高硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的能力，在高浓度有机废水处理问题具有潜在应用价值。

Description

异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株、种子液及其制备方法 和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株、种子液及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，水体污染问题日益严峻，氮素是水体中一类重要污染因子，过多的氮素流入水里，易造成水体富营养化，引起水中的溶解氧不足，导致水质恶化，改变水体生态环境，危害水生生物的生存，对环境和人类健康危害极大。氮以有机氮和无机氮两种形态存在于水体中，有机氮主要来源与生活污水、农业氮肥和工业废水；无机氮是有机氮被微生物分解转化成的，主要包括氨氮、硝态氮、亚硝态氮，其中硝态氮在人体中可转变为亚硝态氮，过高地摄入亚硝酸盐，会诱发“高铁血红蛋白症”，严重时会导致窒息。含硝酸盐的食物和水对婴儿的危害更大，会导致蓝婴症。

解决环境水体氮污染问题刻不容缓。由于生物脱氮处理成本低，且对环境无二次污染，因此成为目前最常用的污水脱氮方法之一，受到国内外的重视。传统的生物脱氮方法主要通过好氧条件下自养微生物的硝化作用(NH₄ ⁺→NH₂OH→NO₂ ^-→NO₃ ^-)和厌氧条件下异养微生物的反硝化作用(NO₃ ^-→NO₂ ^-→NO→N₂O→N₂)。在技术上，需要利用自养菌和异养菌，自养菌以无机碳源为原料生长缓慢且对环境敏感性强，异养菌生长需要大量的有机质，能耗高。由于硝化和反硝化的过程营养物质及生长条件的不同，需要大规模的设备，同时时间长，理论脱氮效率低。1983，Robertson等首次发现了异养硝化-好氧反硝化菌Paracoccuspantotrophus，并提出了异养硝化-好氧反硝化(Heterotrophic Nitrification-AerobicDenitrification，HN-AD)过程的概念，突破了传统的生物脱氮理念，新型的生物脱氮技术顺势而生。与传统的氨化、硝化、反硝化作用相比，该新型的脱氮技术简化了工艺流程，在好氧条件下，同一个反应器中同步进行硝化和反硝化作用。菌的生长繁殖快，具有更高的脱氮效率，操作简单，更加经济实惠。因此，开展新型高效脱氮的异养硝化-好氧反硝化菌分离筛选及脱氮性能研究成为目前的研究热点。

近年来，陆续有学者筛选出一些同时具有HN-AD(NH₄ ⁺→NH₂OH→NO₂ ^-→NO→N₂O→N₂)的菌株。HN-AD菌的底物利用范围广，不仅可以利用各种无机氮还可以利用有机氮，而且这类菌对环境的适应力较强。但是，目前公开的HN-AD菌株耐高碳氮比和耐高浓度氮能力较差，制约了异养硝化-好氧反硝化生物脱氮技术在水体污染修复中的实际应用推广。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种耐高碳氮比、耐氨氮、耐高硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株，还提供了由该菌株制备得到的菌剂及其制备方法，该菌剂可直接应用于高碳氮比和高浓度氮水体污染的修复。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株，所述菌株为假单胞菌LJ9(Pseudomonas indoloxydans LJ9)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60339。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种假单胞菌种子液，所述假单胞菌种子液由上述的假单胞菌菌株LJ9经活化培养后制备得到。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的假单胞菌种子液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将假单胞菌菌株LJ9接种到LB培养基中培养至对数期，所得菌悬液离心去除上清液，洗涤后加无菌水，得到假单胞菌种子液。

在其中一个实施例中，所述培养的过程为：在温度为25～35℃、转速为100～180rpm下振荡培养12～18h。

在其中一个实施例中，所述LB培养基的成分为：细菌学蛋白胨10g·L^-1，酵母浸膏5g·L^-1，NaCl 10g·L^-1，pH 7.0。

在其中一个实施例中，加无菌水至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株在处理含氮废水中的应用。

在其中一个实施例中，所述含氮废水含NH₄ ⁺、NO₃ ^-和NO₂ ^-中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述含氮废水中还含有碳源。

在其中一个实施例中，所述碳源为柠檬酸钠、琥珀酸钠和乙酸钠中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明的假单胞菌LJ9(Pseudomonas indoloxydans LJ9)，具有耐受很高浓度有机物、氨氮、硝酸盐氮及亚硝酸盐氮的能力，可为高浓度有机废水生物处理提供种菌资源，具有巨大的应用价值。在异养硝化过程，碳源为柠檬酸钠，氨氮浓度为100mg·L^-1，C/N为75，pH值为7.0，接种量3％，以180rpm的转速在25℃的摇床中培养24h，菌株LJ9氨氮去除率达到90％以上，几乎无亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的积累，当氨氮浓度为400mg·L^-1，7天内氨氮去除率可达99.49％。好氧反硝化过程中，硝酸盐氮浓度为100mg·L^-1，C/N为25-75，24h硝酸盐氮去除率均达到99％以上；在C/N为8，亚硝酸盐氮去除效果最高达到66.60％。菌株LJ9硝酸盐氮和亚硝酸盐氮浓度分别为300mg·L^-1和200mg·L^-1，24h去除率分别达到96.82％和15.36％。

假单胞菌LJ9(Pseudomonas indoloxydans LJ9)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC NO：60339，保藏时间为2018年3月21日。

附图说明

图1为本发明的假单胞菌LJ9的菌落形态图。

图2为本发明的假单胞菌LJ9的透射电镜图。

图3为本发明的假单胞菌LJ9的16S rRNAPCR电泳图。

图4为本发明的假单胞菌LJ9的同源性分析。

图5为本发明的假单胞菌LJ9功能基因napA的电泳图。

图6为本发明的假单胞菌LJ9生长和异养硝化脱氮曲线。

图7为本发明的假单胞菌LJ9的生长和好氧亚硝化脱氮曲线。

图8为本发明的假单胞菌LJ9的生长和好氧反硝化脱氮曲线。

图9为不同碳源对本发明的假单胞菌LJ9异养硝化脱氮性能的影响。

图10为C/N对本发明的假单胞菌LJ9异养硝化脱氮性能的影响。

图11为不同pH值对本发明的假单胞菌LJ9异养硝化脱氮性能的影响。

图12为接种量对本发明的假单胞菌LJ9异养硝化脱氮性能的影响。

图13为温度对本发明的假单胞菌LJ9异养硝化脱氮性能的影响。

图14为溶氧量对本发明的假单胞菌LJ9异养硝化脱氮性能的影响。

图15为不同氨氮浓度对本发明的假单胞菌LJ9生长的影响。

图16为不同氨氮浓度对本发明的假单胞菌LJ9对脱氮性能影响。

图17为不同C/N对本发明的假单胞菌LJ9好氧亚硝化脱氮性能的影响。

图18为不同C/N对本发明的假单胞菌LJ9好氧反硝化脱氮性能的影响。

图19为不同硝酸盐氮浓度对本发明的假单胞菌LJ9脱氮性能影响。

图20为不同浓度亚硝酸盐氮对本发明的假单胞菌LJ9脱氮性能影响。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例中用到的培养基配方如下：

反硝化富集培养基(DM)(g·L^-1)：Na₂HPO₄·7H₂O 7.9，KH₂PO₄1.5，NH₄Cl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.1，琥珀酸钠(CH₂COONa)₂·6H₂O 4.7，KNO₃0.3，微量元素溶液2mL·L^-1，pH7.0-7.5。

微量元素溶液(g·L^-1)：EDTA50，ZnSO₄2.2，CaCl 5.5，MnCl₂·4H₂O 5.1，FeSO₄·7H₂O 5.0，钼酸铵(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1，CuSO₄·5H₂O 1.6，CoCI₂·6H₂O 1.6，pH 7.0。

牛肉膏蛋白胨培养基(g·L^-1)：细菌学蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 10，pH 7.0-7.2。

LB液体培养基(g·L^-1)：细菌学蛋白胨10，酵母浸膏5，NaCl 10，pH 7.0。

异养硝化培养基(g·L^-1)：(NH₄)2SO₄0.47，琥珀酸钠(CH₂COONa)₂·6H₂O 4.5，柠檬酸钠C₆H₅Na₃O₇·2H₂O 3.27，维氏盐溶液50mL·L^-1，pH 7.0。

维氏盐溶液(g·L^-1)：K₂HPO₄6.54，MgSO₄·7H₂O 2.5，NaCl 2.5，MnSO₄·H₂O 0.04，

FeSO₄·7H₂O 0.05。

反硝化培养基(g·L^-1)：KNO₃0.72，琥珀酸钠(CH₂COONa)₂·6H₂O 4.5，(柠檬酸钠

C₆H₅Na₃O₇·2H₂O 3.27)，维氏盐溶液50mL，pH 7.0。

亚硝化培养基(g·L^-1)：NaNO₂0.49，琥珀酸钠(CH₂COONa)₂·6H₂O 4.5(柠檬酸钠C₆H₅Na₃O₇·2H₂O 3.27)，维氏盐溶液50mL，pH 7.0。

注：固体培养基在以上液体培养基中添加1.5～2％琼脂，所有培养基均在121℃条件下灭菌20min后备用。

实施例中用到的实验仪器如表1所示：

表1实验仪器

实施例中的水质检测分析项目及方法如表2所示：

表2水质检测分析的项目及方法

指标	测定方法
		氨态氮(NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N)	纳氏试剂分光光度法
硝氮(NO<sub>3</sub><sup>-</sup>-N)	麝香草酚分光光度法
		亚硝氮(NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N)	N-(1-萘基)-乙二胺光度法
总氮(TN)	碱性过硫酸钾消解分光光度计
		化学需氧量(COD)	COD仪器消解法
pH	UB-7精密pH计
		菌体生物量吸光度OD<sub>600</sub>	采用超微量分光光度计在波长600nm处测定

实施例：

一种本发明的异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC)，保藏号为GDMCC NO：60339的菌株。该假单胞菌GDMCC NO：60339被命名为假单胞菌LJ9(Pseudomonas indoloxydans LJ9)。

1)菌种分离筛选与纯化

上述本实施例的假单胞菌LJ9主要通过以下方法筛选得到：

1.1)富集培养：将采自福建省龙岩市龙津污水处理厂的活性污泥50mL加入到100mLDM培养基中，同时培养基中加入2-4颗无菌玻璃珠，以便打散泥样。30℃，150rpm摇床震荡连续培养5天。将以上细菌悬液以10％的接种量转接于新的DM培养基中，以这种方式重复培养两次，得到富集的细菌悬液。

1.2)分离纯化：采用10倍稀释法，将0.2mL的细菌悬液涂布于DM固体培养基平板中，于30℃培养箱培养。待平板长出单菌落，挑选具有明显不同特征的细菌菌落，进一步多次平板划线，得到纯化的单菌落。

1.3)初筛：为了测定菌株的反硝化能力，将纯化的菌株培养于KNO₃为唯一氮源的DM固体培养基平板中，将能够在平板上生长的菌落挑出完成初筛。

1.4)复筛：初筛后的菌株接种到异养培养基与反硝化培养基中，筛选出氨氮和硝酸盐氮降解率分别为66％和96％的菌株LJ9。

1.5)保存：本实验采用了4℃牛肉膏蛋白胨斜面保藏和甘油悬液低温冷冻保藏方法保存菌种。甘油悬液低温冷冻保藏方法：50％的甘油蒸馏水，与LB培养的菌种悬液1∶1混合，在-80℃低温保存，甘油的终浓度在25％左右。

2)菌种鉴定

上述本实施例的假单胞菌LJ9菌种鉴定过程及结果如下：

2.1)形态学鉴定

观察分离的菌株在固体平板上的单菌落形态。采用革兰氏染色法和透射电镜观察菌体形态。

菌株LJ9在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上划线培养48h，如图1所示：大菌落呈圆形边缘整齐，湿润，表面光滑，乳白色半透明，小凸起。革兰氏染色鉴定该菌革兰氏阴性。菌种形态如图2透射电镜图所示：菌体呈杆状，大小为6×12.5μm，有鞭毛、无芽孢。

2.2)生理生化鉴定

细菌详细分类的典型做法是以细菌生理生化实验结果为基础的，本实验中菌株的生理生化特性参照《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰明细菌鉴定手册》进行鉴定。

对菌株LJ9进行多种生理生化特性鉴定，结果如表3所示：LJ9在无氧和有氧条件下都能存活，氧化酶、接触酶、淀粉水解、甲基红、油脂水解、柠檬酸盐、吲哚实验、硝酸盐还原实验为阳性，葡萄糖氧化发酵、乳糖氧化发酵、尿素水解、V.P反应、明胶液化、乙酸氧化、果胶水解、产硫化氢、绿脓菌素实验为阴性。以上结果表明：LJ9与假单胞菌的生理生化特性相似，会分泌许多胞外酶，氧化糖类，产少量酸不发酵。

表3菌株LJ9生理生化特性

实验名称	实验结果	实验名称	实验结果
				氧化酶	+	硝酸盐还原	+
接触酶	+	绿脓菌素	-
				葡萄糖氧化发酵	-	吲哚实验	+
乳糖氧化发酵	-	石蕊牛奶	+
				尿素水解	-	产硫化氢	-
淀粉水解	+	柠檬酸盐	+
				甲基红	+	果胶水解	-
V.P	-	乙酸氧化	-
				油脂水解	+	明胶液化	-
有石蜡封口(无氧)	+	无石蜡封口(有氧)	+

注：表3中“+”代表阳性，有此项反应；“-”代表阴性，无此项反应。在糖发酵实验中，“+”表示产酸不产气；“-”表示不产酸不产气。

2.3)分子生物学鉴定

细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。rRNA基因由保守区和可变区组成，其中16S rRNA基因的相对分子量适中，序列分析的重现性极高。因此，现在普遍采用16S rRNA基因作为序列分析对象对微生物进行测序分析，用于判定细菌的种属。

2.3.1)细菌基因组DNA提取

细菌的基因组DNA提取使用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒具体操作步骤操作。

提取菌株DNA作为PCR模板进行扩增。引物选用通用引物:上游27F：

5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，在PCR扩增仪反应。

2.3.2)16S rRNA基因的扩增和测序

PCR扩增体系(Total 25μl)：10×Buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，27F 0.5μl，1492R0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶0.25μl，无菌水19.75μl。

PCR反应程序设定如表4所示：

表4

预变性	95℃	3min
			变性	95℃	45s
退火	55℃	45s
			延伸	72℃	45s

总共运行35个循环，其中第35个循环在72℃下补充延伸5min。4℃保存。

PCR产物经的琼脂糖凝胶电泳检测合格后，委托上海华大基因公司完成序列测定，测序结果再进行同源性分析，得到菌株的系统发育地位。

菌株LJ916S rRNA基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳成像结果见图3所示：PCR产物条带较亮，通道无杂质，条带位置在1000bp以上，说明得到了16S rRNA基因目标条带。对菌株LJ9的16S rRNA基因PCR产物纯化后进行测序，得到的序列长度为1362bp，经BLAST进行同源性分析，结果如图4所示：菌株LJ9与Pseudomonas indoloxydans菌株相似度99％，命名为Pseudomonas indoloxydans LJ9。

2.3.3)NapA功能基因的扩增

硝酸还原酶分为膜结合硝酸还原酶(Nar)和周质硝酸盐还原酶(Nap)两类，在好氧条件下，周质硝酸盐还原酶基因优先表达，并且在无氧和有氧条件下均能发挥作用。利用引物nap1：5`-TCTGGACCATGG-GCTTCAACCA-3`，nap2:5’-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3’，在PCR仪上进行扩增。

PCR扩增体系(Total 25μl)：10×Buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，nap10.5μl，nap20.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶0.25μl，无菌水定容至25μl。

PCR反应程序设定如表5所示：

表5

预变性	94℃	10min
			变性	94℃	1min
退火	55℃	1min
			延伸	72℃	1.5min

总共运行30个循环，其中第30个循环在72℃下补充延伸10min。4℃保存。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，电压220V，电泳30min，凝胶成像系统成像拍照。

利用引物nap1/nap2对LJ9菌株的周质硝酸盐还原酶基因进行扩增，琼脂糖凝胶电泳图如图5所示：目标条带在750bp-1000bp之间。周质硝酸盐还原酶亚基的napA基因均在870bp左右，因此可初步判断，LJ9含有napA基因，这表明菌株LJ9具有好氧反硝化功能。

本实施例的假单胞菌LJ9具有良好的异养硝化-好氧反硝化性能，而且具有耐高碳氮比和耐高硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的性能，可用于高C/N比和高硝酸盐氮及高亚硝酸盐氮废水的脱氮处理。应用时，先将假单胞菌LJ9制成假单胞菌LJ9种子液，再进行废水脱氮处理，该假单胞菌LJ9种子液采用以下方式制得：

将菌株LJ9在LB培养基中活化，培养至对数期，取菌悬液4000rpm，离心10min，去上清，用无菌水洗涤，再离心去上清，重复2-3次，用无菌水将菌液OD600调至0.6～0.8，作为种子液。

应用实施例：

(1)异养硝化性能研究

以3％的接种量将种子液分别接入装有200ml异养硝化培养基的三角锥瓶(规格500ml)中，初始氨氮浓度100mg·L^-1，C/N为8，pH为7.5，30℃、150rpm，摇床培养48小时，每隔6小时取样，测定COD、NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N、NO₃ ^--N和TN的含量，及其OD₆₀₀和pH值。异养硝化性能研究结果

菌株LJ9以琥珀酸钠为碳源，NH₄ ⁺-N为唯一氮源，培养48h的生长与异养脱氮曲线如图6所示：菌株LJ9，0-6h菌的生长速度较慢，说明菌的适应期为6h左右，6-18h菌株快速生长，为对数生长期，生长到18h，生物量达到最大，OD₆₀₀为0.502，18h后由于营养物质被消耗，菌株进入稳定生长期，36h菌的死亡率增加，生物量下降。因此，18-24h为菌株生长的最佳时间。pH值随着时间变化而提高，从初始的6.66到7.94，这说明菌株LJ9生长过程具有产碱的特性。

菌株LJ9在0-6h氨氮的降解率较低为3.86％，同时NO₃ ^--N和NO₂ ^--N不断积累分别达到0.383mg·L^-1、0.408mg·L^-1。在6-18h氨氮快速降解；18h氨氮去除率接近100％，总氮去除率达到82％；24h之后NO₃ ^--N基本不再积累，NO₂ ^--N积累量较少，COD去除率基本处于稳定状态，达到80％左右。36h之后菌种处于缓慢衰退，氨氮和总氮去除率下降，这可能由于菌体细胞代谢也会产氮，氨氮可能又重新积累。NH₄ ⁺-N的降解曲线与菌株的生长曲线基本吻合，在18h氨氮去除率达到最高，18h菌株进入稳定期或衰退期，细胞裂解，氨氮含量上升。有亚硝酸盐氮和硝酸盐氮积累，说明在进行异养硝化的同时也发生反硝化作用。

(2)好氧反硝化性能研究

以3％的接种量将种子液分别接入装有200ml好氧反硝化或亚硝化培养基的三角锥瓶(规格500ml)中，初始硝酸盐氮浓度或亚硝酸盐氮浓度为100mg·L^-1，C/N＝8，30℃、150rpm，摇床培养24小时，每隔6小时取样测定。以NaNO₂为唯一氮源的培养基中，测定NO₃ ^--N积累量、pH值，NO₂ ^--N，TN和COD的含量；以NaNO₃为唯一氮源，测定NO₂ ^--N积累量、pH值，NO₃ ^--N、TN和COD的含量。

好氧反硝化性能研究结果

菌株LJ9以琥珀酸钠为碳源，NaNO₂为唯一氮源，培养24h的生长曲线和亚硝化脱氮曲线如图7所示：因为菌体生长延滞期，0-6h的生长明显比6-12h缓慢，OD₆₀₀在6-12h呈指数生长。12h时，OD₆₀₀达到最高值0.347。12-18h OD₆₀₀下降，营养物质缺乏，代谢产物积累，抑制菌的生长，同时菌种死亡率上升。18-24h处于稳定期。COD的去处率在18-24h趋于稳定，24h达到87.79％。pH值随时间的增加而增加，从7.37最终达到7.98。

亚硝化脱氮过程有少量的NO₃ ^--N生成，在6h生成了0.394mg·L^-1的NO₃ ^--N，随后又降解了，24h只有0.163mg·L^-1的NO₃ ^--N积累，若时间培养延长，可能没有NO₃ ^--N的积累。说明菌株LJ9具有好氧反硝化能力。24h菌株LJ9亚硝酸盐氮和总氮的去除率分别为68.89％和40.62％。甘美军等筛选的Flavobacterium sp.FL211T对NO₂ ^--N的脱氮能力低，在12h亚硝酸钠盐氮去除率达到最大，但仅为30％左右。菌株LJ9的亚硝化脱氮性能优于FL211T。

菌株LJ9以KNO₃为唯一氮源，培养24h的生长曲线如图8所示：0-6h的生长曲线较平缓，菌株LJ9处于延滞期，6-24h处于指数生长，OD₆₀₀从0.098生长到0.385。由于营养物质有限，后期菌株生长趋势明显变缓。24h菌株LJ9COD的去除率达到87.92％，pH值为8.03。18h时，LJ9硝酸盐氮去除率达到最大达到84.71％，同时亚硝酸盐氮积累量达到最大值。亚硝酸盐的毒性比硝酸盐高，由于亚硝酸的积累，对菌株产生毒害作用抑制反硝化过程，同时亚硝酸盐氮进行硝化作用，18-24h时NO₃ ^--N含量增加。24h，菌株LJ9对硝酸盐氮和总氮的去除率分别为76.69％和53.30％。在12h根据氮平衡计算，实际转化成氮气脱除的亚硝酸盐氮和硝酸盐氮氮分别为6.70％和36.46％。根据LJ9对亚硝酸盐氮的利用情况推测，如果培养时间延长，LJ9也会继续降解积累的NO₂ ^--N。

(3)菌种异养硝化性能影响因素

(3.1)碳源对LJ9异养硝化性能影响

碳源是构成生物细胞或代谢产物中碳架来源的营养物质。常用的有机碳源包括：有机酸、小分子醇、糖类、油脂以及有机酯。本实验选用有机物酸中的琥珀酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠，低碳醇的乙醇，以及糖类中的葡萄糖、蔗糖作为碳源。由于异养菌是利用外源有机物作为碳源，自养菌则是利用CO₂等无机碳为碳源，因此，选用无机碳源-碳酸氢钠作为对照组，考察该菌是否为异养菌。

对异养硝化培养基中的C源进行等摩尔质量替换，其他成分不变，配制不同碳源的培养基。以3％的接种量，将种子液分别接入装有100ml不同碳源异养硝化培养基的三角锥瓶(规格250ml)中，30℃、150rpm，摇床培养24小时，取样测定NH₄ ⁺-N、TN含量及其pH值和OD₆₀₀。

碳源对LJ9异养硝化性能影响结果

不同碳源类型影响异养硝化-好氧反硝化菌的生长速率，从而影响其降解氨氮能力。不同碳源对LJ9异养硝化脱氮性能的影响结果如图9所示：LJ9以柠檬酸钠、琥珀酸钠和乙酸钠为碳源，OD₆₀₀分别为0.392、0.359、0.338，氨氮去除率分别达到87.61％、77.85％、60.27％，总氮去除率分别达到86.90％、77.77％、60.77％，说明以有机酸为碳源时，菌株LJ9的脱氮效果较好，生物量(OD₆₀₀)比较高；以碳酸氢钠为碳源时，OD₆₀₀仅为0.060，氨氮降解率仅为37.49％，说明菌株LJ9可以利用无机碳源，具有自养硝化的能力，但无机碳源不适合菌株LJ9的生长和氨氮降解；与蔗糖相比，以葡萄糖为碳源，LJ9的生物量0.195略高于蔗糖0.184。而乙醇为碳源，LJ9生物量几乎没有增加，说明菌株LJ9不能利用乙醇作为碳源，在糖类和乙醇为碳源时，pH下降到3-4，说明菌种生长过程中产酸了，这影响了菌体的生长。此外，以蔗糖、葡萄糖和乙醇为碳源时，LJ9氨氮去除率较低，依次为24.77％、5.39％和14.84％；无碳源的培养基不发生降解，同时生物量没有增加，说明LJ9的生长需要碳源，没有碳源无法生长。综上所述，所选择的有机酸类碳源适合LJ9生长和脱氮，其中柠檬酸钠为碳源时，LJ9生物量最大，且氨氮和总氮去除率最高，因此，选择柠檬酸钠为LJ9脱氮性能研究的碳源。

(3.2)C/N对LJ9异养硝化性能影响

氨氮浓度100mg·L^-1，以柠檬酸钠为碳源，改变碳源含量，以3％的接种量将种子液分别接入C/N比值为4、8、12、16、20、25、30、35、50、75、100、120的异养硝化培养基中，30℃、150rpm，摇床培养24小时，取样测NH₄ ⁺-N、TN含量及其pH值和OD₆₀₀。

C/N对LJ9异养硝化性能的影响结果

C/N直接影响到细菌的生长和脱氮效率，低C/N没有足够的能源供菌体生长，会抑制菌种的脱氮效率；C/N过高超过菌体所需的量，会降低异养硝化的速率。C/N对菌株LJ9的脱氮性能影响结果如图10所示：菌株LJ9对C/N的适应范围较宽，C/N为8-120时，LJ9氨氮去除率都达到80％以上。与目前报道的大部分异养硝化-好氧反硝化菌相比，LJ9生长和脱氮耐C/N比性能很高。

易于被生物降解的高浓度有机物废水，按其性质来源可分为：一类以农牧产品为原料的工业废水，如食品工业废水等；一类是轻工和冶金工业废水，如制药业废水等。柠檬酸是广泛应用于食品、医药、日化等行业最重要的有机酸。菌株LJ9耐高碳氮比，说明能对高浓度有机污染的耐受性较好，而且它以柠檬酸钠为碳源脱氮效果较好，这表明LJ9具有高浓度柠檬酸废水脱氮处理的优势与潜能。

(3.3)pH对LJ9异养硝化性能影响

以3％的接种量将种子液分别接入pH值为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的异养硝化培养基中，30℃、150rpm，摇床培养24小时，取样测定NH₄ ⁺-N、TN含量及其pH值和OD₆₀₀。pH对LJ9异养硝化性能影响结果

微生物的生长有一定的pH耐受范围。培养基不同初始pH对菌株LJ9下脱氮性能影响结果如图11所示：pH值6.5时，LJ9OD₆₀₀没有增长，氨氮去除率仅为8.97％，说明LJ9不适合在酸性条件下生长。在pH值为7-8.5时，培养24h的氨氮去除率都在90％以上，总氮去除率都在80％以上，其中pH值为7时，氨氮和总氮的去除率最高，分别达到94.21％和89.69％。当pH值9时，LJ9生物量下降明显，24h氨氮和总氮去除率也下降，接近80％，这说明中性和弱碱条件更有利于菌株LJ9生长和脱氮。

一般来说，大部分异养硝化-好氧反硝化菌适合生长的pH范围为6-9，说明在中性和弱酸弱碱等较温和的环境，更有利于该类菌生长和发挥脱氮作用。

(3.4)接种量对LJ9异养硝化性能影响

分别以3％、5％、7％、10％、12％、15％的接种量将种子液接入异养硝化培养基中，30℃、150rpm，摇床培养24小时，取样测定NH₄ ⁺-N、TN含量及其pH值和OD₆₀₀。

接种量对LJ9异养硝化性能影响结果

接种量会直接影响菌体生长的延滞期长短和代时。不同的接种量对菌株LJ9脱氮性能的影响如图12所示：接种量3％、5％、7％、10％时，LJ9的氨氮去除率分别为95.13％、94.36％、94.45％和92.42％，总氮去除率分别为93.57％、94.89％、85.05％和83.46％，接种量7％时总氮去除率明显降低。随着接种量的增大，pH呈下降趋势，说明细胞代谢产酸。不同的接种量，培养24h后，菌体OD₆₀₀较为接近，其中接种量3％时，OD₆₀₀最大为0.438，而接种量15％时OD₆₀₀最小为0.376。这是由于接种量越大，菌种繁殖达到高峰的时间越短，营养物质消耗快，容易竞争性抑制，后期营养无法满足菌体生长需要，大量菌体死亡。由于3％的接种量，24h，OD₆₀₀和氨氮去除率均达到最大，同时总氮去除率与5％的接种量相差不大，选择3％的接种量为最佳接种量。

(3.5)温度对LJ9异养硝化性能影响

以3％的接种量将种子液接入异养培养基中，分别在温度为25℃、30℃、35℃、40℃的摇床中150rpm，培养24小时，取样测定NH₄ ⁺-N、TN含量及其pH值和OD₆₀₀。

温度对LJ9异养硝化性能影响结果

低温使微生物酶活性受抑制，高温导致蛋白质或核酸变性失活，适宜的温度会使微生物生长繁殖更快，代谢旺盛。温度对菌株LJ9脱氮性能的影响如图13所示：菌株LJ9生长与脱氮的适宜温度范围比较广，在25-40℃时OD₆₀₀0.3-0.5之间，氨氮的去除率均在90％以上，总氮去除率均在80％以上，当25℃时，LJ9的OD₆₀₀最大为0.486，氨氮和总氮去除最高达到95.86％和87.41％，因此，选择25℃作为LJ9培养温度。

一般来说，不同菌株最佳生长和脱氮温度存在差异，但大多数异养硝化-好氧反硝化菌生长和脱氮都有比较宽的温度范围，适应能力较强。

(3.6)溶解氧对LJ9异养硝化性能影响

以3％的接种量将种子液接入异养硝化培养基中，在温度为25℃的摇床中分别以90rpm、150rpm、180rpm的转速，培养24小时，同时在25℃培养箱静置培养24h作为对照组。取样测定NH₄ ⁺-N、TN含量及其pH值和OD₆₀₀。

溶解氧对LJ9异养硝化性能影响结果

一般来说，不同的菌对溶解的氧含量的敏感度不同。溶解氧含量对硝化作用的影响明显，甚至可控制硝化代谢产物。由于溶氧量与转速成正相关，通过改变摇床转速来改变溶解氧含量。菌株LJ9受不同溶解氧含量影响的结果如图14所示：在转速为0，即静置培养时，LJ9的OD₆₀₀仅有0.192，氨氮和总氮的去除只有52.78％和45.46％，说明静置培养溶氧不足，硝化不彻底。LJ9生物量随着转速的增加而增长，转速为180rpm时，OD₆₀₀最大为0.518，但转速90-180rpm氨氮去除率皆为94％左右，相差不明显，而转速180rpm总氮去除率最高94.08％，说明溶氧量在一定程度上影响菌株的脱氮效率，综合考虑生物量与氨氮和总氮降解率，选取180rpm转速为后续实验条件。

(3.7)氨氮含量对LJ9异养硝化性能的影响

以3％的接种量将种子液接入氨氮浓度分别为100、200、300、400、500mg·L^-1的异养硝化培养基中，25℃、180rpm摇床连续培养7天，每天定时取样，测定NH₄ ⁺-N的含量，NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的累计量，及其pH值和OD₆₀₀。选择生物量(OD₆₀₀)最高的一天测COD和TN的含量。

氨氮浓度对LJ9异养硝化性能的影响结果

菌株LJ9在不同初始氨氮浓度下培养7天，其生长曲线如图15所示：初始氨氮浓度100-400mg·L^-1，LJ9的OD₆₀₀随着氨氮含量的提高，生长停滞期延长，当氨氮浓度为500mg·L^-1时，菌株LJ9基本不生长，说明该浓度是LJ9氨氮耐受的极限，但此浓度下LJ9仍能去除氨氮。初始氨氮浓度为200-400mg·L^-1时，培养至第7天，LJ9生长已经处于稳定期，OD₆₀₀均达到1.3左右，所以LJ9生长耐受氨氮浓度范围较宽。

不同初始氨氮浓度对菌株LJ9脱氮性能影响结果如图16所示：经过7天培养，LJ9氨氮的去除率分别为91.29％、94.50％、98.27、99.49％、17.47％。在初始氨氮浓度100-400mg·L^-1范围内，随着初始氨氮浓度的升高，氨氮去除率提高，并有少量硝酸盐氮积累；在初始氨氮浓度100-300mg·L^-1，总氮去除率随着初始氨氮浓度升高而升高，但初始氨氮浓度为400mg·L^-1时，生物量、总氮和COD均下降，OD₆₀₀下降到1.211，总氮和COD去除率分别下降到79.16％和49.91％，说明氮浓度过高对菌的生长和脱氮性能产生抑制作用，菌株LJ9最高氨氮耐受浓度约为500mg·L^-1。

不同菌对高氨氮的耐受能力不同。异养硝化-好氧反硝化菌Pseudomonas putidaLY1和Acinetobacte sp.HY2在初始氨氮浓度为50mg·L^-1，氨氮去除效率最高，分别为64％和74％，随着氨氮浓度的升高，氨氮降解率逐渐下降。颜薇芝等分离的菌株Acinetobacter.sp YN3在1天内，随着初始氨氮浓度的提高，对氨氮的去除能力越低，初始氨氮浓度提高到200mg·L^-1时，几乎不发生脱氮反应，在初始氨氮浓度为150mg·L^-1，24h氨氮去除率仅为18.7％。与上述菌株相比，初始氨氮浓度分别为100、200、300、400、500mg·L^-1时，培养24h，菌株LJ9氨氮的去除率分别为87.86％、41.55％、9.37％、8.69％、10.38％。说明LJ9有更好氨氮浓度耐受性。

(4)LJ9好氧反硝化性能影响因素

(4.1)C/N对LJ9好氧反硝化与好氧亚硝化性能影响

以柠檬酸钠为碳源，亚硝酸盐氮或硝酸盐氮浓度为100mg·L^-1，以3％的接种量将种子液分别接入C/N为8、25、50、75、100、120的亚硝态氮培养基或硝态氮培养基中，25℃、180rpm，摇床培养24小时后，取样测NO₂ ^--N、NO₃ ^--N和TN的含量及其pH值和OD₆₀₀。

C/N对LJ9好氧反硝化性能影响结果

菌株LJ9分别以NaNO₂和KNO₃为唯一氮源，初始N浓度为100mg·L^-1，培养24h，在不同C/N下，菌株LJ9对NO₂ ^--N降解的情况如图17所示：随着C/N的增加，亚硝酸盐氮、总氮的去除率及OD₆₀₀、pH都呈下降的趋势。在C/N为8时，菌株LJ9的OD₆₀₀达到0.373，亚硝酸盐氮和总氮去除率最高，分别为66.6％和60.22％；在C/N高于50时，亚硝酸盐氮的去除率低于20％。这可能由于高C/N容易造成溶氧量的不足，满足菌体生长代谢需求后，过剩的碳源产生的中间产物发生积累，抑制了好氧亚硝化的进行。同时亚硝酸盐可能对菌体有毒害作用，导致LJ9对亚硝酸盐的利用较差。

在不同C/N条件下，菌株LJ9对NO₃ ^--N降解的情况如图18所示：当C/N为25-75时，硝酸盐氮的去除率达到99.5％以上，总氮去除率分为84.84％、85.65％、88.45％，在C/N＝100，硝酸盐氮和总氮的去除率略有所下降，分别达到98.68％和80.01％，总体来说LJ9好氧反硝化的C/N较高，适用范围较大。

不同的C/N条件下，不同菌种具有不同的反硝化的能力，有一定的适应范围，且当C/N达到一定值后，好氧反硝化速率处于稳定的状态。易立等分离研究的菌株Bacilluscereus CZ1以硝酸钾为氮源，最适宜C/N为6，当C/N继续升高，其脱氮效率略有下降。黄廷林筛选的HN-AD菌Acinetobacterpittii A14，当C/N＝16时，NO₃ ^--N完全去除，C/N＝8或20时，NO₃ ^--N去除率有所下降。综上所述，C/N过低，导致碳源不足影响脱氮效率，C/N过高容易降低菌体脱氮性能，一般好氧反硝化菌脱氮的最适C/N为5-8，较少达到20以上。与大部分好氧反硝化菌相比，菌株LJ9具有耐受较高C/N的能力，可为处理高C/N有机污染的提供新的菌种资源。

(4.2)硝酸盐氮含量对LJ9好氧反硝化性能影响

以柠檬酸钠为碳源，C/N为25，以3％的接种量将种子液接入硝酸氮浓度分别为100、150、200、300、400、500mg·L^-1的硝态氮培养基中，25℃、180rpm，摇床培养24小时后，取样测NO₃ ^--N和TN的含量及其pH值和OD₆₀₀。

硝酸盐氮含量对LJ9好氧反硝化性能影响结果

菌株LJ9在不同NO₃ ^--N浓度下，培养24h，NO₃ ^--N去除情况如图19所示：菌株LJ9，生物量、硝酸盐氮的去除率、和pH都与硝酸盐氮浓度呈负相关的关系，即随着硝酸盐氮含量提高，生物量和硝酸盐氮去除率下降，pH值降低。当NO₃ ^--N浓度分别为100、150、200、300、400、500、600mg·L^-1时，硝酸盐氮的去除率为分别为99.79％、98.49％、95.99％、96.82％、95.22％、92.34％、90.05％，对应的去除速率分别为4.16、6.16、8.00、12.10、15.87、19.24、22.51mg·(L·h)^-1；总氮的去除率分别为90.87％、72.27％、57.17％、48.45％、35.00％、28.00％、20.56％，对应的去除速率分别为3.79、4.83、4.76、6.06、5.83、5.83、5.14mg·(L·h)^-1。说明菌株LJ9可以耐受600mg·L^-1的硝酸盐氮浓度，且硝酸盐氮去除率高，如果培养时间延长，总氮的去除率可能会继续提高。

菌株的生长代谢和反硝化过程都需要酶的参与，硝酸盐氮浓度过高会影响水环境的底物浓度，不利于酶促反应的扩散；会与酶的激活剂相结合，降低酶促反应速率；同时过量的底物与酶分子结合形成中间产物，使酶失活，从而抑制菌株的脱氮效率。不同菌种对硝酸盐氮的负荷能力有所不同。据报道，Acinetobacte sp.HY2在初始氮浓度为100、200、300mg·L^-1时，48h硝酸盐氮去除率分别是85％、70％和47％；Pseudomonasputida LY1在初始氮浓度为300mg·L^-1时，硝酸盐氮去除率只有46％；可能是较高的硝酸盐氮对反硝化酶起了抑制作用。而菌株LJ9能够耐受硝酸盐氮浓度可高达600mg·L^-1，且24h硝酸盐氮去除率可以高达90.05％，说明LJ9好氧反硝化反应过程受硝酸盐抑制的影响较小，其好氧反硝化性能优于目前报道的大部分好氧反硝化菌株。

(4.3)亚硝酸盐氮含量对LJ9好氧亚硝化性能影响

以柠檬酸钠为碳源，C/N为8，以3％的接种量将种子液分别接入亚硝酸氮浓度分别为100、150、200、300、400、500mg·L^-1的亚硝态氮培养基中，25℃、180rpm，摇床培养24小时后，取样测NO₂ ^--N和TN的含量及其pH值和OD₆₀₀。

亚硝酸盐氮含量对LJ9好氧亚硝化性能影响结果

菌株LJ9在不同NO₂ ^--N浓度下，培养24h，NO₂ ^--N的去除情况如图20所示：随着亚硝酸盐氮浓度的提高，OD₆₀₀逐渐下降。当初始NO₂ ^--N浓度为100mg·L^-1和150mg·L^-1，菌株LJ9对亚硝酸盐氮和总氮去除率较高，分别是54.64％、45.84％和48.46％、44.60％；初始亚硝酸盐氮浓度为200mg·L^-1，亚硝酸盐氮的去除率较低；初始N浓度为300mg·L^-1时，亚硝酸盐氮没有降解。亚硝酸盐氮浓度分别为100、150、200、300mg·L^-1时，亚硝酸盐氮的去除速率分别为2.28、2.87、1.28、0.00mg·(L·h)^-1，总氮的去除速率分别为2.02、2.79、0.44、0.02mg·(L·h)^-1。

不同种类的菌对亚硝酸盐氮的耐受程度不同，当亚硝酸浓度过低，不能满足菌的生长所需的氮源，浓度过高会对微生物产生毒害作用，抑制脱氮作用。例如：PseudomonastolaasiiY-11当初始亚硝酸盐氮浓度10mg·L^-1，48h，亚硝酸盐氮和总氮去除率分别达到100％和63.1％，随着浓度的升高，亚硝酸盐氮去除率降低。Bacillus coagulans YX-6在初始亚硝酸盐氮浓度为20mg·L^-1时，亚硝酸盐氮去除率接近100％，当初始亚硝酸盐氮浓度提高到100mg·L^-1，亚硝酸盐氮的去除率仅为20％。与上述菌株相比，菌株LJ9能够耐受较高浓度的亚硝酸盐氮，能更有效的解决亚硝酸盐积累问题，好氧反硝化反应过程不易被亚硝酸盐抑制，可为高亚硝酸盐氮废水处理提供菌种来源。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株，其特征在于，所述菌株为假单胞菌LJ9(Pseudomonas indoloxydans LJ9)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60339。

2.一种假单胞菌种子液，其特征在于，所述假单胞菌种子液由权利要求1所述的假单胞菌菌株经活化培养后制备得到。

3.一种如权利要求2所述的假单胞菌种子液的制备方法，包括以下步骤：

将假单胞菌菌株LJ9接种到LB培养基中培养至对数期，所得菌悬液离心去除上清液，洗涤后加无菌水，得到假单胞菌种子液。

4.根据权利要求3所述的假单胞菌种子液的制备方法，其特征在于，所述培养的过程为：在温度为25～35℃、转速为100～180rpm下振荡培养12～18h。

5.根据权利要求3所述的假单胞菌种子液的制备方法，其特征在于，所述LB培养基的成分为：细菌学蛋白胨10g·L^-1，酵母浸膏5g·L^-1，NaCl 10g·L^-1，pH 7.0。

6.根据权利要求3所述的假单胞菌种子液的制备方法，其特征在于，加无菌水至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8。

7.一种如权利要求1所述的异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株在处理含氮废水中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述含氮废水含NH₄ ⁺、NO₃ ^-和NO₂ ^-中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述含氮废水中还含有碳源。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述碳源为柠檬酸钠、琥珀酸钠和乙酸钠中的一种或多种。

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