CN110655197B

CN110655197B - 一种利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法

Info

Publication number: CN110655197B
Application number: CN201810694733.8A
Authority: CN
Inventors: 孙巍; 夏春雨; 洪维祎; 宋玉文; 杨雅玲; 苏全榕; 阙才英; 魏清斯; 易艳玲; 宋雅坚; 林美琴
Original assignee: Longyan University
Current assignee: Longyan University
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2022-01-28
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: CN110655197A

Abstract

本发明公开了一种利用异养硝化‑好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法，废水中含有有机酸钠，C/N比值为25～100，该方法包括以下步骤：将异养硝化‑好氧反硝化的假单胞菌种子液接种于硝酸盐氮废水中，在温度为25℃～40℃，转速为90rpm～180rpm的条件下振荡反应6h～24h，完成对硝酸盐氮废水的处理；该菌株为假单胞菌LJ9，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60339。菌株LJ9具有耐受较高C/N的能力，且菌株LJ9能够耐受硝酸盐氮浓度可高达600mg·L^‑1，因此本发明在对高C/N和高硝酸盐氮废水脱氮方面具有巨大的应用价值。

Description

一种利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法。

背景技术

近年来，水体污染问题日益严峻，氮素是水体中一类重要污染因子，过多的氮素流入水里，易造成水体富营养化，引起水中的溶解氧不足，导致水质恶化，改变水体生态环境，危害水生生物的生存，对环境和人类健康危害极大。氮以有机氮和无机氮两种形态存在于水体中，有机氮主要来源与生活污水、农业氮肥和工业废水；无机氮是有机氮被微生物分解转化成的，主要包括氨氮、硝态氮、亚硝态氮，其中硝态氮在人体中可转变为亚硝态氮，过高地摄入亚硝酸盐，会诱发“高铁血红蛋白症”，严重时会导致窒息。含硝酸盐的食物和水对婴儿的危害更大，会导致蓝婴症。

解决环境水体氮污染问题刻不容缓。由于生物脱氮处理成本低，且对环境无二次污染，因此成为目前最常用的污水脱氮方法之一，受到国内外的重视。传统的生物脱氮方法主要通过好氧条件下自养微生物的硝化作用(NH₄ ⁺→NH₂OH→NO₂ ^-→NO₃ ^-)和厌氧条件下异养微生物的反硝化作用(NO₃ ^-→NO₂ ^-→NO→N₂O→N₂)。在技术上，需要利用自养菌和异养菌，自养菌以无机碳源为原料生长缓慢且对环境敏感性强，异养菌生长需要大量的有机质，能耗高。由于硝化和反硝化的过程营养物质及生长条件的不同，需要大规模的设备，同时时间长，理论脱氮效率低。1983，Robertson等首次发现了异养硝化-好氧反硝化菌Paracoccuspantotrophus，并提出了异养硝化-好氧反硝化(Heterotrophic Nitrification-AerobicDenitrification，HN-AD)过程的概念，突破了传统的生物脱氮理念，新型的生物脱氮技术顺势而生。与传统的氨化、硝化、反硝化作用相比，该新型的脱氮技术简化了工艺流程，在好氧条件下，同一个反应器中同步进行硝化和反硝化作用。菌的生长繁殖快，具有更高的脱氮效率，操作简单，更加经济实惠。因此，开展新型高效脱氮的异养硝化-好氧反硝化菌分离筛选及脱氮性能研究成为目前的研究热点。

近年来，陆续有学者筛选出一些同时具有HN-AD(NH₄ ⁺→NH₂OH→NO₂ ^-→NO→N₂O→N₂)的菌株。HN-AD菌的底物利用范围广，不仅可以利用各种无机氮还可以利用有机氮，而且这类菌对环境的适应力较强。但是，目前公开的HN-AD菌株耐高碳氮比和耐高浓度氮能力较差，制约了异养硝化-好氧反硝化生物脱氮技术在水体污染修复中的实际应用推广。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株LJ9处理高碳氮比和高硝酸盐氮废水的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法，所述硝酸盐氮废水中含有有机酸钠，所述硝酸盐氮废水的C/N比值为25～100，所述方法包括以下步骤：

将异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌种子液接种于硝酸盐氮废水中，在温度为25℃～40℃，转速为90rpm～180rpm的条件下振荡反应6h～24h，完成对硝酸盐氮废水的处理；

所述菌株为假单胞菌LJ9(Pseudomonas indoloxydans LJ9)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60339。

在其中一个实施例中，所述硝酸盐氮废水，所述硝酸盐的浓度为100mg·L^-1～600mg·L^-1。

在其中一个实施例中，所述异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌种子液的接种量为3％～5％。

在其中一个实施例中，所述氨氮废水的pH值为6～9。

在其中一个实施例中，所述有机酸钠为柠檬酸钠、琥珀酸钠和乙酸钠中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌种子液通过以下方法制得：

将假单胞菌菌株接种到LB培养基中培养至对数期，所得菌悬液离心去除上清液，洗涤后加无菌水，得到假单胞菌种子液。

在其中一个实施例中，所述培养的过程为：在温度为25～35℃、转速为100～180rpm下振荡培养12～18h。

在其中一个实施例中，所述LB培养基的成分为：细菌学蛋白胨10g·L^-1，酵母浸膏5g·L^-1，NaCl 10g·L^-1，pH 7.0。

在其中一个实施例中，加无菌水至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明利用假单胞菌菌株LJ9经培养后的种子液处理氨氮废水，假单胞菌LJ9(Pseudomonas indoloxydans LJ9)，具有耐受很高浓度有机物、氨氮、硝酸盐氮及亚硝酸盐氮的能力，综合性能优异。好氧反硝化过程中，硝酸盐氮浓度为100mg·L^-1，C/N为25-75，24h硝酸盐氮去除率均达到99％以上；与大部分好氧反硝化菌相比，菌株LJ9具有耐受较高C/N的能力，且菌株LJ9能够耐受硝酸盐氮浓度可高达600mg·L^-1，且24h硝酸盐氮去除率可以高达90.05％，说明LJ9好氧反硝化反应过程受硝酸盐抑制的影响较小，其好氧反硝化性能优于目前报道的大部分好氧反硝化菌株，可为处理高C/N有机污染的高硝酸盐氮废水处理提供新的菌种资源。

另外，在好氧亚硝化过程中，亚硝酸盐氮浓度为100mg·L^-1，C/N为8-25时，菌株LJ9亚硝酸盐氮去除率都在55％以上，且菌株LJ9能够耐受亚硝酸盐氮浓度可高达300mg·L^-1，与大部分好氧反硝化菌相比，菌株LJ9具有耐受较高C/N的能力，且菌株LJ9能够耐受较高浓度的亚硝酸盐氮，能更有效的解决亚硝酸盐积累问题，好氧反硝化反应过程不易被亚硝酸盐抑制。此外，在异养硝化过程，菌株LJ9对C/N的适应范围较宽，氨氮浓度为100mg·L^-1，C/N为8-120时，LJ9氨氮去除率都达到80％以上，且氨氮浓度达500mg·L^-1时仍能去除氨氮，可见菌株LJ9对高C/N和高氨氮浓度废水耐受度高且对氨氮的去除率高。综上，假单胞菌菌株LJ9具有优异的处理氮污染废水的综合性能。

假单胞菌LJ9(Pseudomonas indoloxydans LJ9)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC NO：60339，保藏时间为2018年3月21日。

附图说明

图1为本发明所采用的假单胞菌LJ9的菌落形态图。

图2为本发明所采用的假单胞菌LJ9的透射电镜图。

图3为本发明所采用的假单胞菌LJ9的16S rRNAPCR电泳图。

图4为本发明所采用的假单胞菌LJ9的同源性分析。

图5为本发明所采用的假单胞菌LJ9功能基因napA的电泳图。

图6为本发明所采用的假单胞菌LJ9的生长和好氧反硝化脱氮曲线。

图7为不同C/N对本发明所采用的假单胞菌LJ9好氧反硝化脱氮性能的影响。

图8为不同硝酸盐氮浓度对本发明所采用的假单胞菌LJ9脱氮性能影响。

图9为不同C/N对本发明所采用的假单胞菌LJ9好氧亚硝化脱氮性能的影响。

图10为不同浓度亚硝酸盐氮对本发明所采用的假单胞菌LJ9脱氮性能影响。

图11为C/N对本发明所采用的假单胞菌LJ9异养硝化脱氮性能的影响。

图12为不同氨氮浓度对本发明所采用的假单胞菌LJ9生长的影响。

图13为不同氨氮浓度对本发明所采用的假单胞菌LJ9对脱氮性能影响。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例所采用的异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC)，保藏号为GDMCC NO：60339的菌株。该假单胞菌GDMCC NO：60339被命名为假单胞菌LJ9(Pseudomonas indoloxydans LJ9)。

1)菌种分离筛选与纯化

上述本实施例的假单胞菌LJ9主要通过以下方法筛选得到：

1.1)富集培养：将采自福建省龙岩市龙津污水处理厂的活性污泥50mL加入到100mLDM培养基中，同时培养基中加入2-4颗无菌玻璃珠，以便打散泥样。30℃，150rpm摇床震荡连续培养5天。将以上细菌悬液以10％的接种量转接于新的DM培养基中，以这种方式重复培养两次，得到富集的细菌悬液。

1.2)分离纯化：采用10倍稀释法，将0.2mL的细菌悬液涂布于DM固体培养基平板中，于30℃培养箱培养。待平板长出单菌落，挑选具有明显不同特征的细菌菌落，进一步多次平板划线，得到纯化的单菌落。

1.3)初筛：为了测定菌株的反硝化能力，将纯化的菌株培养于KNO₃为唯一氮源的DM固体培养基平板中，将能够在平板上生长的菌落挑出完成初筛。

1.4)复筛：初筛后的菌株接种到异养培养基与反硝化培养基中，筛选出氨氮和硝酸盐氮降解率分别为66％和96％的菌株LJ9。

1.5)保存：本实验采用了4℃牛肉膏蛋白胨斜面保藏和甘油悬液低温冷冻保藏方法保存菌种。甘油悬液低温冷冻保藏方法：50％的甘油蒸馏水，与LB培养的菌种悬液1∶1混合，在-80℃低温保存，甘油的终浓度在25％左右。

2)菌种鉴定

上述本实施例的假单胞菌LJ9菌种鉴定过程及结果如下：

2.1)形态学鉴定

观察分离的菌株在固体平板上的单菌落形态。采用革兰氏染色法和透射电镜观察菌体形态。

菌株LJ9在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上划线培养48h，如图1所示：大菌落呈圆形边缘整齐，湿润，表面光滑，乳白色半透明，小凸起。革兰氏染色鉴定该菌革兰氏阴性。菌种形态如图2透射电镜图所示：菌体呈杆状，大小为6×12.5μm，有鞭毛、无芽孢。

2.2)生理生化鉴定

细菌详细分类的典型做法是以细菌生理生化实验结果为基础的，本实验中菌株的生理生化特性参照《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰明细菌鉴定手册》进行鉴定。

对菌株LJ9进行多种生理生化特性鉴定，结果如表1所示：LJ9在无氧和有氧条件下都能存活，氧化酶、接触酶、淀粉水解、甲基红、油脂水解、柠檬酸盐、吲哚实验、硝酸盐还原实验为阳性，葡萄糖氧化发酵、乳糖氧化发酵、尿素水解、V.P反应、明胶液化、乙酸氧化、果胶水解、产硫化氢、绿脓菌素实验为阴性。以上结果表明：LJ9与假单胞菌的生理生化特性相似，会分泌许多胞外酶，氧化糖类，产少量酸不发酵。

表1菌株LJ9生理生化特性

实验名称	实验结果	实验名称	实验结果
				氧化酶	+	硝酸盐还原	+
接触酶	+	绿脓菌素	-
				葡萄糖氧化发酵	-	吲哚实验	+
乳糖氧化发酵	-	石蕊牛奶	+
				尿素水解	-	产硫化氢	-
淀粉水解	+	柠檬酸盐	+
				甲基红	+	果胶水解	-
V.P	-	乙酸氧化	-
				油脂水解	+	明胶液化	-
有石蜡封口(无氧)	+	无石蜡封口(有氧)	+

注：表3中“+”代表阳性，有此项反应；“-”代表阴性，无此项反应。在糖发酵实验中，“+”表示产酸不产气；“-”表示不产酸不产气。

2.3)分子生物学鉴定

细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。rRNA基因由保守区和可变区组成，其中16S rRNA基因的相对分子量适中，序列分析的重现性极高。因此，现在普遍采用16S rRNA基因作为序列分析对象对微生物进行测序分析，用于判定细菌的种属。

2.3.1)细菌基因组DNA提取

细菌的基因组DNA提取使用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒具体操作步骤操作。

提取菌株DNA作为PCR模板进行扩增。引物选用通用引物:上游27F：

5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，在PCR扩增仪反应。

2.3.2)16S rRNA基因的扩增和测序

PCR扩增体系(Total 25μl)：10×Buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，27F 0.5μl，1492R0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶0.25μl，无菌水19.75μl。

PCR反应程序设定如表2所示：

表2

预变性	95℃	3min
			变性	95℃	45s
退火	55℃	45s
			延伸	72℃	45s

总共运行35个循环，其中第35个循环在72℃下补充延伸5min。4℃保存。

PCR产物经的琼脂糖凝胶电泳检测合格后，委托上海华大基因公司完成序列测定，测序结果再进行同源性分析，得到菌株的系统发育地位。

菌株LJ916S rRNA基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳成像结果见图3所示：PCR产物条带较亮，通道无杂质，条带位置在1000bp以上，说明得到了16S rRNA基因目标条带。对菌株LJ9的16S rRNA基因PCR产物纯化后进行测序，得到的序列长度为1362bp，经BLAST进行同源性分析，结果如图4所示：菌株LJ9与Pseudomonas indoloxydans菌株相似度99％，命名为Pseudomonas indoloxydans LJ9。

2.3.3)NapA功能基因的扩增

硝酸还原酶分为膜结合硝酸还原酶(Nar)和周质硝酸盐还原酶(Nap)两类，在好氧条件下，周质硝酸盐还原酶基因优先表达，并且在无氧和有氧条件下均能发挥作用。利用引物nap1：5`-TCTGGACCATGG-GCTTCAACCA-3`，nap2:5’-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3’，在PCR仪上进行扩增。

PCR扩增体系(Total 25μl)：10×Buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，nap10.5μl，nap20.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶0.25μl，无菌水定容至25μl。

PCR反应程序设定如表3所示：

表3

预变性	94℃	10min
			变性	94℃	1min
退火	55℃	1min
			延伸	72℃	1.5min

总共运行30个循环，其中第30个循环在72℃下补充延伸10min。4℃保存。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，电压220V，电泳30min，凝胶成像系统成像拍照。

利用引物nap1/nap2对LJ9菌株的周质硝酸盐还原酶基因进行扩增，琼脂糖凝胶电泳图如图5所示：目标条带在750bp-1000bp之间。周质硝酸盐还原酶亚基的napA基因均在870bp左右，因此可初步判断，LJ9含有napA基因，这表明菌株LJ9具有好氧反硝化功能。

本实施例的假单胞菌LJ9具有良好的异养硝化-好氧反硝化性能，而且具有耐高碳氮比和耐高硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的性能，可用于高C/N比和高硝酸盐氮及高亚硝酸盐氮废水的脱氮处理。应用时，先将假单胞菌LJ9制成假单胞菌LJ9种子液，再进行废水脱氮处理，该假单胞菌LJ9种子液采用以下方式制得：

将菌株LJ9在LB培养基中活化，培养至对数期，取菌悬液4000rpm，离心10min，去上清，用无菌水洗涤，再离心去上清，重复2-3次，用无菌水将菌液OD600调至0.6～0.8，作为种子液。

上述用到的培养基配方如下：

反硝化富集培养基(DM)(g·L^-1)：Na₂HPO₄·7H₂O 7.9，KH₂PO₄1.5，NH₄Cl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.1，琥珀酸钠(CH₂COONa)₂·6H₂O 4.7，KNO₃0.3，微量元素溶液2mL·L^-1，pH7.0-7.5。

微量元素溶液(g·L^-1)：EDTA50，ZnSO₄2.2，CaCl 5.5，MnCl₂·4H₂O 5.1，FeSO₄·7H₂O 5.0，钼酸铵(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1，CuSO₄·5H₂O 1.6，CoCI₂·6H₂O 1.6，pH 7.0。

牛肉膏蛋白胨培养基(g·L^-1)：细菌学蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 10，pH 7.0-7.2。

LB液体培养基(g·L^-1)：细菌学蛋白胨10，酵母浸膏5，NaCl 10，pH 7.0。

异养硝化培养基(g·L^-1)：(NH₄)2SO₄0.47，琥珀酸钠(CH₂COONa)₂·6H₂O 4.5，柠檬酸钠C₆H₅Na₃O₇·2H₂O 3.27，维氏盐溶液50mL·L^-1，pH 7.0。

维氏盐溶液(g·L^-1)：K₂HPO₄6.54，MgSO₄·7H₂O 2.5，NaCl 2.5，MnSO₄·H₂O 0.04，FeSO₄·7H₂O 0.05。

反硝化培养基(g·L^-1)：KNO₃0.72，琥珀酸钠(CH₂COONa)₂·6H₂O 4.5，(柠檬酸钠C₆H₅Na₃O₇·2H₂O 3.27)，维氏盐溶液50mL，pH 7.0。

亚硝化培养基(g·L^-1)：NaNO₂0.49，琥珀酸钠(CH₂COONa)₂·6H₂O 4.5(柠檬酸钠C₆H₅Na₃O₇·2H₂O 3.27)，维氏盐溶液50mL，pH 7.0。

注：固体培养基在以上液体培养基中添加1.5～2％琼脂，所有培养基均在121℃条件下灭菌20min后备用。

实施例中用到的实验仪器如表4所示：

表4实验仪器

实施例中的水质检测分析项目及方法如表5所示：

表5水质检测分析的项目及方法

指标	测定方法
		氨态氮(NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N)	纳氏试剂分光光度法
硝氮(NO<sub>3</sub><sup>-</sup>-N)	麝香草酚分光光度法
		亚硝氮(NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N)	N-(1-萘基)-乙二胺光度法
总氮(TN)	碱性过硫酸钾消解分光光度计
		化学需氧量(COD)	COD仪器消解法
pH	UB-7精密pH计
		菌体生物量吸光度OD<sub>600</sub>	采用超微量分光光度计在波长600nm处测定

实施例1：

一种利用上述异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株LJ9种子液处理硝酸盐氮废水的方法，包括以下步骤：

以3％的接种量将种子液分别接入装有200ml好氧反硝化培养基的三角锥瓶(规格500ml)中，初始硝酸盐氮浓度为100mg·L^-1，C/N＝8，30℃、150rpm，摇床培养24小时，每隔6小时取样测定。以NaNO₃为唯一氮源，测定NO₂ ^--N积累量、pH值，NO₃ ^--N、TN和COD的含量。结果如下：

菌株LJ9以琥珀酸钠为碳源，以KNO₃为唯一氮源，培养24h的生长曲线如图6所示：0-6h的生长曲线较平缓，菌株LJ9处于延滞期，6-24h处于指数生长，OD₆₀₀从0.098生长到0.385。由于营养物质有限，后期菌株生长趋势明显变缓。24h菌株LJ9COD的去除率达到87.92％，pH值为8.03。18h时，LJ9硝酸盐氮去除率达到最大达到84.71％，同时亚硝酸盐氮积累量达到最大值。亚硝酸盐的毒性比硝酸盐高，由于亚硝酸的积累，对菌株产生毒害作用抑制反硝化过程，同时亚硝酸盐氮进行硝化作用，18-24h时NO₃ ^--N含量增加。24h，菌株LJ9对硝酸盐氮和总氮的去除率分别为76.69％和53.30％。在12h根据氮平衡计算，实际转化成氮气脱除的亚硝酸盐氮和硝酸盐氮氮分别为6.70％和36.46％。根据LJ9对亚硝酸盐氮的利用情况推测，如果培养时间延长，LJ9也会继续降解积累的NO₂ ^--N。

实施例2：

以柠檬酸钠为碳源，硝酸盐氮浓度为100mg·L^-1，以3％的接种量将种子液分别接入C/N为8、25、50、75、100、120的硝态氮培养基中，以柠檬酸钠为碳源，25℃、180rpm，摇床培养24小时后，取样测NO₂ ^--N、NO₃ ^--N和TN的含量及其pH值和OD₆₀₀。

C/N对LJ9好氧反硝化性能影响结果

菌株LJ9以KNO₃为唯一氮源，初始KNO₃浓度为100mg·L^-1，培养24h，在不同C/N条件下，菌株LJ9对NO₃ ^--N降解的情况如图7所示：当C/N为25-75时，硝酸盐氮的去除率达到99.5％以上，总氮去除率分为84.84％、85.65％、88.45％，在C/N＝100，硝酸盐氮和总氮的去除率略有所下降，分别达到98.68％和80.01％，总体来说LJ9好氧反硝化的C/N较高，适用范围较大。

不同的C/N条件下，不同菌种具有不同的反硝化的能力，有一定的适应范围，且当C/N达到一定值后，好氧反硝化速率处于稳定的状态。易立等分离研究的菌株Bacilluscereus CZ1以硝酸钾为氮源，最适宜C/N为6，当C/N继续升高，其脱氮效率略有下降。黄廷林筛选的HN-AD菌Acinetobacterpittii A14，当C/N＝16时，NO₃ ^--N完全去除，C/N＝8或20时，NO₃ ^--N去除率有所下降。综上所述，C/N过低，导致碳源不足影响脱氮效率，C/N过高容易降低菌体脱氮性能，一般好氧反硝化菌脱氮的最适C/N为5-8，较少达到20以上。与大部分好氧反硝化菌相比，菌株LJ9具有耐受较高C/N的能力，可为处理高C/N有机污染的提供新的菌种资源。

实施例3：

以柠檬酸钠为碳源，C/N为25，以3％的接种量将种子液接入硝酸氮浓度分别为100、150、200、300、400、500mg·L^-1的硝态氮培养基中，25℃、180rpm，摇床培养24小时后，取样测NO₃ ^--N和TN的含量及其pH值和OD₆₀₀。

硝酸盐氮含量对LJ9好氧反硝化性能影响结果

菌株LJ9在不同NO₃ ^--N浓度下，培养24h，NO₃ ^--N去除情况如图8所示：菌株LJ9，生物量、硝酸盐氮的去除率、和pH都与硝酸盐氮浓度呈负相关的关系，即随着硝酸盐氮含量提高，生物量和硝酸盐氮去除率下降，pH值降低。当NO₃ ^--N浓度分别为100、150、200、300、400、500、600mg·L^-1时，硝酸盐氮的去除率为分别为99.79％、98.49％、95.99％、96.82％、95.22％、92.34％、90.05％，对应的去除速率分别为4.16、6.16、8.00、12.10、15.87、19.24、22.51mg·(L·h)^-1；总氮的去除率分别为90.87％、72.27％、57.17％、48.45％、35.00％、28.00％、20.56％，对应的去除速率分别为3.79、4.83、4.76、6.06、5.83、5.83、5.14mg·(L·h)^-1。说明菌株LJ9可以耐受600mg·L^-1的硝酸盐氮浓度，且硝酸盐氮去除率高，如果培养时间延长，总氮的去除率可能会继续提高。

菌株的生长代谢和反硝化过程都需要酶的参与，硝酸盐氮浓度过高会影响水环境的底物浓度，不利于酶促反应的扩散；会与酶的激活剂相结合，降低酶促反应速率；同时过量的底物与酶分子结合形成中间产物，使酶失活，从而抑制菌株的脱氮效率。不同菌种对硝酸盐氮的负荷能力有所不同。据报道，Acinetobacte sp.HY2在初始氮浓度为100、200、300mg·L^-1时，48h硝酸盐氮去除率分别是85％、70％和47％；Pseudomonasputida LY1在初始氮浓度为300mg·L^-1时，硝酸盐氮去除率只有46％；可能是较高的硝酸盐氮对反硝化酶起了抑制作用。而菌株LJ9能够耐受硝酸盐氮浓度可高达600mg·L^-1，且24h硝酸盐氮去除率可以高达90.05％，说明LJ9好氧反硝化反应过程受硝酸盐抑制的影响较小，其好氧反硝化性能优于目前报道的大部分好氧反硝化菌株。可为高硝酸盐氮废水处理提供菌种来源。

1、LJ9好氧亚硝化研究

1.1、C/N对LJ9好氧亚硝化性能影响

以柠檬酸钠为碳源，亚硝酸盐氮或硝酸盐氮浓度为100mg·L^-1，以3％的接种量将种子液分别接入C/N为8、25、50、75、100、120的亚硝态氮培养基或硝态氮培养基中，25℃、180rpm，摇床培养24小时后，取样测NO₂ ^--N、NO₃ ^--N和TN的含量及其pH值和OD₆₀₀。

C/N对LJ9好氧反硝化性能影响结果

菌株LJ9以NaNO₂为唯一氮源，初始NaNO₂浓度为100mg·L^-1，培养24h，在不同C/N下，菌株LJ9对NO₂ ^--N降解的情况如图9所示：随着C/N的增加，亚硝酸盐氮、总氮的去除率及OD₆₀₀、pH都呈下降的趋势。在C/N为8时，菌株LJ9的OD₆₀₀达到0.373，亚硝酸盐氮和总氮去除率最高，分别为66.6％和60.22％；在C/N高于50时，亚硝酸盐氮的去除率低于20％。

一般好氧反硝化菌脱氮的最适C/N为5-8，较少达到20以上。与大部分好氧反硝化菌相比，菌株LJ9具有耐受较高C/N的能力，可为处理高C/N有机污染的提供新的菌种资源。

1.2、亚硝酸盐氮含量对LJ9好氧亚硝化性能影响

以柠檬酸钠为碳源，C/N为8，以3％的接种量将种子液分别接入亚硝酸氮浓度分别为100、150、200、300、400、500mg·L^-1的亚硝态氮培养基中，25℃、180rpm，摇床培养24小时后，取样测NO₂ ^--N和TN的含量及其pH值和OD₆₀₀。

亚硝酸盐氮含量对LJ9好氧亚硝化性能影响结果

菌株LJ9在不同NO₂ ^--N浓度下，培养24h，NO₂ ^--N的去除情况如图10所示：随着亚硝酸盐氮浓度的提高，OD₆₀₀逐渐下降。当初始NO₂ ^--N浓度为100mg·L^-1和150mg·L^-1，菌株LJ9对亚硝酸盐氮和总氮去除率较高，分别是54.64％、45.84％和48.46％、44.60％；初始亚硝酸盐氮浓度为200mg·L^-1，亚硝酸盐氮的去除率较低；初始N浓度为300mg·L^-1时，亚硝酸盐氮没有降解。亚硝酸盐氮浓度分别为100、150、200、300mg·L^-1时，亚硝酸盐氮的去除速率分别为2.28、2.87、1.28、0.00mg·(L·h)^-1，总氮的去除速率分别为2.02、2.79、0.44、0.02mg·(L·h)^-1。

不同种类的菌对亚硝酸盐氮的耐受程度不同，当亚硝酸浓度过低，不能满足菌的生长所需的氮源，浓度过高会对微生物产生毒害作用，抑制脱氮作用。例如：PseudomonastolaasiiY-11当初始亚硝酸盐氮浓度10mg·L^-1，48h，亚硝酸盐氮和总氮去除率分别达到100％和63.1％，随着浓度的升高，亚硝酸盐氮去除率降低。Bacillus coagulans YX-6在初始亚硝酸盐氮浓度为20mg·L^-1时，亚硝酸盐氮去除率接近100％，当初始亚硝酸盐氮浓度提高到100mg·L^-1，亚硝酸盐氮的去除率仅为20％。与上述菌株相比，菌株LJ9能够耐受较高浓度的亚硝酸盐氮，能更有效的解决亚硝酸盐积累问题，好氧反硝化反应过程不易被亚硝酸盐抑制，可为高亚硝酸盐氮废水处理提供菌种来源。

2、LJ9异养硝化性能研究

2.1、C/N对LJ9异养硝化性能影响

氨氮浓度100mg·L^-1，改变碳源含量，以3％的接种量将种子液分别接入C/N比值为4、8、12、16、20、25、30、35、50、75、100、120的异养硝化培养基中，以柠檬酸钠为碳源，30℃、150rpm，摇床培养24小时，取样测NH₄ ⁺-N、TN含量及其pH值和OD₆₀₀。

结果如图11所示：菌株LJ9对C/N的适应范围较宽，C/N为8-120时，LJ9氨氮去除率都达到80％以上。与目前报道的大部分异养硝化-好氧反硝化菌相比，LJ9生长和脱氮耐C/N比性能很高。

易于被生物降解的高浓度有机物废水，按其性质来源可分为：一类以农牧产品为原料的工业废水，如食品工业废水等；一类是轻工和冶金工业废水，如制药业废水等。柠檬酸是广泛应用于食品、医药、日化等行业最重要的有机酸。本实施例表明，菌株LJ9耐高碳氮比，说明能对高浓度有机污染的耐受性较好，而且它以柠檬酸钠为碳源脱氮效果较好，这表明LJ9具有高浓度柠檬酸废水脱氮处理的优势与潜能。

2.2、氨氮浓度对LJ9异养硝化性能影响

以3％的接种量将种子液接入氨氮浓度分别为100、200、300、400、500mg·L^-1的异养硝化培养基中，以柠檬酸钠为碳源，C/N为50、25℃、180rpm摇床连续培养7天，每天定时取样，测定NH₄ ⁺-N的含量，NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的累计量，及其pH值和OD₆₀₀。选择生物量(OD₆₀₀)最高的一天测COD和TN的含量。

氨氮浓度对LJ9异养硝化性能的影响结果

菌株LJ9在不同初始氨氮浓度下培养7天，其生长曲线如图12所示：初始氨氮浓度100-400mg·L^-1，LJ9的OD₆₀₀随着氨氮含量的提高，生长停滞期延长，当氨氮浓度为500mg·L^-1时，菌株LJ9基本不生长，说明该浓度是LJ9氨氮耐受的极限，但此浓度下LJ9仍能去除氨氮。初始氨氮浓度为200-400mg·L^-1时，培养至第7天，LJ9生长已经处于稳定期，OD₆₀₀均达到1.3左右，所以LJ9生长耐受氨氮浓度范围较宽。

不同初始氨氮浓度对菌株LJ9脱氮性能影响结果如图13所示：经过7天培养，LJ9氨氮的去除率分别为91.29％、94.50％、98.27、99.49％、17.47％。在初始氨氮浓度100-400mg·L^-1范围内，随着初始氨氮浓度的升高，氨氮去除率提高，并有少量硝酸盐氮积累；在初始氨氮浓度100-300mg·L^-1，总氮去除率随着初始氨氮浓度升高而升高，但初始氨氮浓度为400mg·L^-1时，生物量、总氮和COD均下降，OD₆₀₀下降到1.211，总氮和COD去除率分别下降到79.16％和49.91％，说明氮浓度过高对菌的生长和脱氮性能产生抑制作用，菌株LJ9最高氨氮耐受浓度约为500mg·L^-1。

不同菌对高氨氮的耐受能力不同。异养硝化-好氧反硝化菌PseudomonasputidaLY1和Acinetobacte sp.HY2在初始氨氮浓度为50mg·L^-1，氨氮去除效率最高，分别为64％和74％，随着氨氮浓度的升高，氨氮降解率逐渐下降。颜薇芝等分离的菌株Acinetobacter.sp YN3在1天内，随着初始氨氮浓度的提高，对氨氮的去除能力越低，初始氨氮浓度提高到200mg·L^-1时，几乎不发生脱氮反应，在初始氨氮浓度为150mg·L^-1，24h氨氮去除率仅为18.7％。与上述菌株相比，初始氨氮浓度分别为100、200、300、400、500mg·L^-1时，培养24h，菌株LJ9氨氮的去除率分别为87.86％、41.55％、9.37％、8.69％、10.38％。说明LJ9有更好氨氮浓度耐受性。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims

1.一种利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法，其特征在于，所述硝酸盐氮废水中含有有机酸钠，所述硝酸盐氮废水的C/N比值为50～100，所述方法包括以下步骤：

所述菌株为假单胞菌LJ9(Pseudomonas indoloxydans LJ9)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60339；

所述硝酸盐的浓度为100mg·L^-1～600mg·L^-1。

2.根据权利要求1所述的利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法，其特征在于，所述异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌种子液的接种量为3％～5％。

3.根据权利要求2所述的利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法，其特征在于，所述硝酸盐氮废水的pH值为6～9。

4.根据权利要求3所述的利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法，其特征在于，所述有机酸钠为柠檬酸钠、琥珀酸钠和乙酸钠中的一种或多种。

5.根据权利要求1～4任一项所述的利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法，其特征在于，所述异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌种子液通过以下方法制得：

6.根据权利要求5所述的利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法，其特征在于，所述培养的过程为：在温度为25～35℃、转速为100～180rpm下振荡培养12～18h。

7.根据权利要求5所述的利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法，其特征在于，所述LB培养基的成分为：细菌学蛋白胨10g·L^-1，酵母浸膏5g·L^-1，NaCl 10g·L^-1，pH 7.0。

8.根据权利要求5所述的利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法，其特征在于，加无菌水至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8。