CN111172061B - 一种好氧反硝化复合菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种好氧反硝化复合菌剂及其应用，由假单胞菌YG8、假单胞菌LJ9和副球菌LJ2的种子液复配而成，所述假单胞菌YG8、假单胞菌LJ9和副球菌LJ2种子液的体积比为30～35∶30～32∶35～40。C/N在20‑100范围内，该复合菌剂对NO₃ ^‑‑N去除率很高，说明该复合菌剂YJ能耐受较高浓度的有机物。且该复合菌剂可耐受NO₃ ^‑‑N浓度高达2000mg·L^‑1，且在低于NO₃ ^‑‑N800mg·L^‑1环境下，对NO₃ ^‑‑N去除率接近100％，显著优于目前报道的好氧反硝化菌剂。

Description

一种好氧反硝化复合菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物废水处理技术领域，尤其涉及一种好氧反硝化复合菌剂及其应用。

背景技术

工农业生产过量氮素的排放，导致自然水体富营养化，进而影响水资源利用和水生态安全。目前地下水和地表水的硝酸盐污染已经成为严重的环境问题，据报道，我国很多湖泊遭到严重污染，其中氨氮富营养化问题较突出。富营养化最开始会造成在水中生长的漂浮植物大量繁殖，比如藻类等等，使水中含氧量降低，加快了水质恶化速度，对生活在水体中的生物的生存造成威胁，引起一些鱼类和其他水生生物大量死亡的事件，对生态环境造成不好的影响，所以减少污水中氮排放量，降低水中氮含量是必要的。

传统的生物脱氮技术处理费用贵、效率又低，硝化和反硝化需要在两个不同的反应器进行，硝化反应是在有氧环境下废水中的NH₄ ⁺-N被自养硝化菌转化为NO₂ ^--N或NO₃ ^--N，反硝化反应则相反，即在缺氧环境下NO₂ ^--N或NO₃ ^--N被异养反硝化菌还原为含N₂，从废水中排出。近年来，一些新型高效的生物脱氮工艺技术逐步引起关注。与传统脱氮工艺相比，好氧反硝化菌可以进行同步硝化反硝化，能够将污水中的碳和氮同时去除掉，且不需要在生产过程中加入额外的碳源和氮源，培养过程中硝化和反硝化作用可以在同一个反应器中同时完成，将NH₄ ⁺-N直接转化为N₂从系统排出，此外，在培养过程中硝化反应和反硝化反应产生的酸碱可以相互中和，从而可以减少缓冲剂的使用。因此，利用高效好氧反硝化菌对污水进行处理，并通过生产工艺的优化提升好氧反硝化菌对氨氮、硝酸盐氮及亚硝酸盐氮的去除率，降低在污水处理中的成本，对于城市污水处理有着非常重要的意义。

微生物的生长受到诸多影响，除培养基成分外，还有接种量、pH值、装液量、转速、C/N等操作条件，因此需要研究人员对微生物生长条件进行优化。响应面法是一种数学统计方法，可以通过多种因子系统中找出最优的条件，较精确地研究各个因子之间的关系，从而获得最优方案，可以降低生产成本、对工艺条件进行优化。目前，响应面法大多数用于解决科学研究和生产过程中存在的实际问题，已应用于生化、农业、物理等领域，如陈丽娟等采用响应面法分析法对苯酚降解影响因素进行优化。

复合菌剂大多是由多种菌株组成的，该菌株具备降解目标污染物的能力。菌剂具有极高的降解能力、适应环境因子变化能力、功能性强、经济效益高等特点，因此常常用来处理水样中的COD、氨氮以及一些其他污染物质等。目前脱氮菌剂的研究已经取得了较好的成果，比如郑巧东等研究的由硝化菌、反硝化菌和亚硝化菌组成的菌剂用于研究模拟污水的脱氮效率，72h总氮去除率达76.7％；杨小龙研究的由具有净化和改善水质功能的菌株C-4和NGG1组成的复合菌剂处理水产养殖污水，72h氨氮去除率达84.4％；周家正研究的由蜡样芽孢杆菌、乳杆菌、水单胞菌等组成的复合菌剂YJ降解城镇生活污水中的COD，培养36hCOD去除率58％至77.3％。但目前脱氮除碳的复合菌剂仍存在一些问题，比如降解速率较慢、对高温低温和高NO₃ ^--N浓度耐受性低、操作处理难度大等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能耐受较高浓度的有机物、对高浓度NO₃ ^--N具有很强的耐受性且NO₃ ^--N去除率高的好氧反硝化复合菌剂，还相应提供该好氧反硝化复合菌剂在降低水体中硝酸盐氮含量中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种好氧反硝化复合菌剂，由假单胞菌YG8、假单胞菌LJ9和副球菌LJ2的种子液复配而成，所述假单胞菌YG8保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60340，所述假单胞菌LJ9保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60339，所述副球菌LJ2保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60338；所述假单胞菌YG8、假单胞菌LJ9和副球菌LJ2种子液的体积比为30～35∶30～32∶35～40。

上述的好氧反硝化复合菌剂，优选的，所述假单胞菌YG8、假单胞菌LJ9和副球菌LJ2种子液的体积比为32.12∶30.62∶37.26。

上述的好氧反硝化复合菌剂，优选的，各菌株种子液的制备方法为：将相应的菌株接入LB培养基，30℃、150rpm摇床培养24h，取菌悬液4000rpm冷冻离心机中离心10min，去上清液，沉淀，菌体用无菌水洗涤，再离心去上清液，重复2-3次，用无菌水将菌悬液的OD₆₀₀调至0.6-0.8，得到所述菌株的种子液。

上述的好氧反硝化复合菌剂，优选的，所述LB培养基的组分及配比为：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0-7.2。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的好氧反硝化复合菌剂在降低水体中硝酸盐氮含量中的应用。

上述的应用，优选的，所述应用包括以下步骤：

将异好氧反硝化复合菌剂和碳源加入硝酸盐氮浓度为200～2000mg·L^-1的水体中，至水体中C/N比值为15～100，好氧反硝化复合菌剂的接种量为3-10％，在温度为25℃～35℃，pH为7-7.44，转速为100rpm～200rpm的条件下振荡反应6h～7d。

上述的应用，优选的，所述碳源为丁二酸钠和/或乙酸钠

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、C/N在20-100范围内，本发明的好氧反硝化复合菌剂对NO₃ ^--N去除率很高，说明该复合菌剂YJ能耐受较高浓度的有机物，优于目前报道的好氧反硝化菌剂。

2、在较低初始NO₃ ^--N浓度环境下(低于800mg·L^-1)，本发明的复合菌剂的NO₃ ^--N去除率接近100％，高初始NO₃ ^--N浓度环境下(高于800mg·L^-1)，复合菌剂YJ的NO₃ ^--N去除率虽受到一定抑制，但当NO₃ ^--N浓度为2000mg·L^-1，复合菌剂YJ的NO₃ ^--N去除率仍可达到22.84％，说明好氧反硝化复合菌剂YJ对高浓度NO₃ ^--N具有较强的耐受性且NO₃ ^--N去除率高，优于纯菌YG8、LJ9、LJ2，也显著优于目前报道的好氧反硝化菌剂。

综上，本发明的好氧反硝化复合菌剂在高浓度有机物硝酸盐氮废水生物脱氮方面，具有巨大的应用前景。

本发明中的副球菌LJ2、假单胞菌YG8和假单胞菌LJ9均从龙津污水处理厂采集的活性污泥中分离筛选获得，副球菌LJ2(Paracoccus versutus LJ2)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60338；假单胞菌菌株YG8(Pseudomonas mendocina YG8)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60340；假单胞菌LJ9(Pseudomonas indoloxydans LJ9)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60339。

附图说明

图1为本发明的副球菌LJ2的菌落形态图。

图2为本发明的副球菌LJ2的透射电镜图。

图3为本发明的副球菌LJ2的16S rDNA扩增电泳图。

图4为本发明的副球菌LJ2的系统进化树。

图5为本发明的副球菌LJ2的napA基因PCR扩增电泳图。

图6为本发明的副球菌LJ2的nosZ基因PCR扩增电泳图。

图7为本发明的假单胞菌LJ9的菌落形态图。

图8为本发明的假单胞菌LJ9的透射电镜图。

图9为本发明的假单胞菌LJ9的16S rRNA PCR电泳图。

图10为本发明的假单胞菌LJ9的同源性分析。

图11为本发明的假单胞菌LJ9功能基因napA的电泳图。

图12为本发明的假单胞菌YG8的菌落形态图。

图13为本发明的假单胞菌YG8的透射电镜图。

图14为本发明的假单胞菌YG8的16S rDNA扩增电泳图。

图15为本发明的假单胞菌YG8的系统进化树。

图16为本发明的假单胞菌YG8 napA基因PCR扩增电泳图。

图17为好氧反硝化菌YG8脱氮性能影响因素的响应面立体分析图及相应等高图，其中，上图左图为初始pH与C/N交互作用对YG8好氧反硝化脱氮性能影响的响应面立体分析图，上图右图为初始pH与C/N交互作用对YG8好氧反硝化脱氮性能影响的等高图；中图左图为温度与C/N交互作用对YG8好氧反硝化脱氮性能影响的响应面立体分析图，中图右图为温度与C/N交互作用对YG8好氧反硝化脱氮性能影响的等高图；下图左图为温度与初始pH交互作用对YG8好氧反硝化脱氮性能影响的响应面立体分析图，下图右图为温度与初始pH交互作用对YG8好氧反硝化脱氮性能影响的等高图。

图18为菌株YG8、LJ2、LJ9混合培养NO₃ ^--N去除率随时间变化的折线图。

图19为不同组合比例复合菌剂对NO₃ ^--N去除率影响的响应面图和等高线图，其中，左图为响应面图，右图为等高线图。

图20为不同碳源对本发明的复合菌剂脱氮性能的变化图。

图21为不同C/N对本发明的复合菌剂脱氮性能的变化图。

图22为本发明的好氧反硝化复合菌剂脱氮性能影响因素的响应面立体分析图及相应等高图；上图左图为温度与初始pH交互作用对复合菌剂好氧反硝化脱氮性能影响的响应面立体分析图，上图右图为温度与初始pH交互作用对复合菌剂好氧反硝化脱氮性能影响的等高图；中图左图为温度与装液量交互作用对复合菌剂好氧反硝化脱氮性能影响的响应面立体分析图，中图右图为温度与装液量交互作用对复合菌剂好氧反硝化脱氮性能影响的等高图；下图左图为初始pH与装液量交互作用对复合菌剂好氧反硝化脱氮性能影响的响应面立体分析图，下图右图为初始pH与装液量交互作用对复合菌剂好氧反硝化脱氮性能影响的等高图。

图23为不同NO₃ ^--N初始浓度对本发明的复合菌剂NO₃ ^--N去除率的影响图。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

1.材料和方法

本实验所采用的主要设备名称、型号及生产厂家见表1。

表1仪器设备表

培养基：本实验所用的主要培养基如表2所示。

表2主要培养基及其配制方法

注：所有的LB培养基和好氧反硝化培养基均装于250mL的三角瓶。

菌株来源：本研究中所用到的菌株具有高效的脱氮性能，来源于龙津污水处理厂，是由本课题组前期从活性污泥中分离纯化筛选出来的，分别为好氧反硝化菌Pseudomonasmendocina YG8、Pseudomonas indoloxydans LJ9、Paracoccus versutus LJ2，以下简称YG8、LJ9、LJ2。复配后的好氧反硝化复合化菌剂命名为好氧反硝化复合化菌剂YJ。

上述本实施例的副球菌LJ2主要通过以下方法筛选得到：

将从福建省龙岩市龙津污水厂采集的活性污泥100mL活性污泥加入到200mL反硝化富集培养基中，培养基中加入无菌玻璃珠。30℃，150rpm·min^-1摇床震荡，连续培养5天，将以上细菌悬液以10％的接种量转接于新鲜的DM培养基中，以这种培养方式重复培养两次，得到富集的细菌悬液。

采用10倍稀释法，将0.2mL的富集细菌悬液涂布于DM琼脂培养基中(1.5％的琼脂)，于30℃培养。挑选具有明显不同特征的细菌菌落，进行平板划线，获得单菌落。纯化的菌落再重新接种于新鲜的琼脂培养基中。将分离出的菌株培养于KNO₃为唯一氮源的DM初筛培养基中进行初筛，将能存活于DM初筛培养基的菌株接种到LB斜面培养基中-4℃保存。然后，测定初筛菌株NH₄ ⁺-N以及NO₃ ^--N去除率，得到脱氮性能较好的菌株LJ2再进行研究。

上述本实施例的副球菌LJ2菌种鉴定过程及结果如下：

形态学鉴定：对微生物形态结构的观察采用肉眼观察法、光学显微镜观察法及投射电子显微镜观察法。菌株LJ2在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落形态如图1所示：菌落为乳白色，边缘整齐，圆形微微隆起，表面光滑湿润，不透明。LJ-2革兰氏染色鉴定为革兰氏阴性菌。LJ2透射电镜图如图2所示：菌体呈短杆状，无荚膜，无芽孢，无鞭毛，LJ2横直径约为0.49μm，长度约为1.07μm。

生理生化鉴定：细菌详细分类的典型做法是以生理生化试验的结果为基础的，本实验中菌株的生理生化特性参照文献及《伯杰明细菌鉴定手册》进行实验。测定菌株LJ2进行生理生化特性，结果见表3：LJ2的糖发酵实验均为阴性，不产酸不产气；接触酶与氧化酶实验均为阳性，初步判断LJ2与副球菌(Paracoccus versutus)的生理生化特性相符：

表3菌株LJ2生理生化实验特性

实验名称	实验结果	实验名称	实验结果
				氧化酶	+	V.P	-
接触酶	+	油脂水解	+
				葡萄糖氧化发酵	-	乙酸氧化	-
乳糖氧化发酵	-	石蕊牛奶	产酸
				尿素水解	-	吲哚实验	+
淀粉水解	-	氨基酸脱羧酶	-
				甲基红	-	硝酸盐还原	-

注：表中“+”代表阳性，有此项反应；“-”代表阴性，无此项反应。在糖发酵实验中，“o+”表示产酸产气；“+”表示产酸不产气；“-”表示不产酸不产气。

分子生物学鉴定：本实验中菌株DNA按Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒的操作步骤提取细菌基因组DNA。16S rRNA基因的扩增和测序：细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。16S rRNA基因的相对分子量适中，序列分析的重现性极高，16S rRNA基因是细菌的系统分类研究中最常用的方法之一。现在普遍采用16S rRNA基因作为序列分析对象鉴定细菌的种属。本实验中采用通用引物27F和1492R对菌株的16SrRNA进行PCR扩增，纯化后进行测序。

16S rRNA基因的PCR反应体系见表4。

表4 16S rRNA基因的PCR反应体系

10×PCR buffer	2.5μL
		dNTP	0.5μL
F	0.5μL
		R	0.5μL
Taq酶	0.25μL
		ddH2O	20.75μL
Total	25μL

16SrRNA基因PCR扩增结果如图3，片段长度1400bp左右，条带扩增位置正确。测序分析结果如图4所示：菌株LJ-2与副球菌(Paracoccus vereutus)的相似度为99％，因此判定LJ2为一株副球菌(Paracoccus versutus)，该菌株命名为Paracoccus versutus LJ2。

功能基因鉴定：好氧反硝化过程中，有氧条件下，周质硝酸还原酶基因(nap基因)会优先表达，NO₃ ^--N无需通过细胞膜就可以到达周质硝酸还原酶所在的活性区域，周质硝酸还原酶能够直接将NO₃ ^--N还原生成NO₂ ^--N；氧化亚氮还原酶(NOSZ)能够将NO₂ ^--N还原生成N₂，在细菌的反硝化过程中也起着关键作用。所以为了进一步验证菌株的好氧反硝化功能，本实验对菌株周质硝酸还原酶基因(napA，片段长度为800bp～900bp)和氧化亚氮还原酶基因(nosZ，片段长度约为300bp)进行PCR扩增，PCR所利用的引物对分别为nap1/nap2(nap1：5’-TCTGGACCATGG-GCTTCAACCA-3’，nap2：5’-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3’)和nosZ-F/nosZ-R(nosZ-F：5’-CGYTGTTCMTCGACAGCCAG-3’，nosZ-R：5’-CGSACCTTSTTGCCSTYGCG-3’)。

16S rRNA、napA基因、nosZ基因的PCR反应程序见表5。

表5 16S rRNA、napA基因、nosZ基因的PCR反应程序

LJ2菌株基因扩增片段电泳结果如图5所示：得到片段大小为700bp～1000bp左右的特异条带，大小与预测片段大小相符，因此可初步判断，该菌含有napA基因，这表明菌株LJ2具有将NO₃ ^--N转化为NO₂ ^--N的功能。利用引物nos1/nos2对LJ2菌株基因进行扩增，扩增片段电泳结果如图6所示：得到片段大小为250bp～500bp左右的特异条带，大小与预测大小相符。因此也可判断，该菌含有nosZ基因，这表明了菌株LJ2具有将NO₂ ^--N转化为N₂的功能。

上述本实施例的假单胞菌LJ9主要通过以下方法筛选得到：

富集培养：将采自福建省龙岩市龙津污水处理厂的活性污泥50mL加入到100mL DM培养基中，同时培养基中加入2-4颗无菌玻璃珠，以便打散泥样。30℃，150rpm摇床震荡连续培养5天。将以上细菌悬液以10％的接种量转接于新的DM培养基中，以这种方式重复培养两次，得到富集的细菌悬液。

分离纯化：采用10倍稀释法，将0.2mL的细菌悬液涂布于DM固体培养基平板中，于30℃培养箱培养。待平板长出单菌落，挑选具有明显不同特征的细菌菌落，进一步多次平板划线，得到纯化的单菌落。

初筛：为了测定菌株的反硝化能力，将纯化的菌株培养于KNO₃为唯一氮源的DM固体培养基平板中，将能够在平板上生长的菌落挑出完成初筛。

复筛：初筛后的菌株接种到异养培养基与反硝化培养基中，筛选出氨氮和硝酸盐氮降解率分别为66％和96％的菌株LJ9。

保存：本实验采用了4℃牛肉膏蛋白胨斜面保藏和甘油悬液低温冷冻保藏方法保存菌种。甘油悬液低温冷冻保藏方法：50％的甘油蒸馏水，与LB培养的菌种悬液1∶1混合，在-80℃低温保存，甘油的终浓度在25％左右。

上述本实施例的假单胞菌LJ9菌种鉴定过程及结果如下：

形态学鉴定：观察分离的菌株在固体平板上的单菌落形态。采用革兰氏染色法和透射电镜观察菌体形态。菌株LJ9在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上划线培养48h，如图7所示：大菌落呈圆形边缘整齐，湿润，表面光滑，乳白色半透明，小凸起。革兰氏染色鉴定该菌革兰氏阴性。菌种形态如图8透射电镜图所示：菌体呈杆状，大小为6×12.5μm，有鞭毛、无芽孢。

生理生化鉴定：细菌详细分类的典型做法是以细菌生理生化实验结果为基础的，本实验中菌株的生理生化特性参照《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰明细菌鉴定手册》进行鉴定。

对菌株LJ9进行多种生理生化特性鉴定，结果如表6所示：LJ9在无氧和有氧条件下都能存活，氧化酶、接触酶、淀粉水解、甲基红、油脂水解、柠檬酸盐、吲哚实验、硝酸盐还原实验为阳性，葡萄糖氧化发酵、乳糖氧化发酵、尿素水解、V.P反应、明胶液化、乙酸氧化、果胶水解、产硫化氢、绿脓菌素实验为阴性。以上结果表明：LJ9与假单胞菌的生理生化特性相似，会分泌许多胞外酶，氧化糖类，产少量酸不发酵。

表6菌株LJ9生理生化特性

注：表3中“+”代表阳性，有此项反应；“-”代表阴性，无此项反应。在糖发酵实验中，“+”表示产酸不产气；“-”表示不产酸不产气。

分子生物学鉴定：细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23SrRNA。rRNA基因由保守区和可变区组成，其中16S rRNA基因的相对分子量适中，序列分析的重现性极高。因此，现在普遍采用16S rRNA基因作为序列分析对象对微生物进行测序分析，用于判定细菌的种属。

细菌基因组DNA提取：细菌的基因组DNA提取使用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒具体操作步骤操作。提取菌株DNA作为PCR模板进行扩增。引物选用通用引物:上游27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，在PCR扩增仪反应。16S rRNA基因的扩增和测序：PCR扩增体系(Total 25μl)：10×Buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，27F 0.5μl，1492R 0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶0.25μl，无菌水19.75μl。

PCR反应程序设定如表7所示：

表7

预变性	95℃	3min
			变性	95℃	45s
退火	55℃	45s
			延伸	72℃	45s

总共运行35个循环，其中第35个循环在72℃下补充延伸5min。4℃保存。

PCR产物经的琼脂糖凝胶电泳检测合格后，委托上海华大基因公司完成序列测定，测序结果再进行同源性分析，得到菌株的系统发育地位。

菌株LJ916S rRNA基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳成像结果见图9所示：PCR产物条带较亮，通道无杂质，条带位置在1000bp以上，说明得到了16S rRNA基因目标条带。对菌株LJ9的16S rRNA基因PCR产物纯化后进行测序，得到的序列长度为1362bp，经BLAST进行同源性分析，结果如图10所示：菌株LJ9与Pseudomonas indoloxydans菌株相似度99％，命名为Pseudomonas indoloxydans LJ9。

NapA功能基因的扩增：硝酸还原酶分为膜结合硝酸还原酶(Nar)和周质硝酸盐还原酶(Nap)两类，在好氧条件下，周质硝酸盐还原酶基因优先表达，并且在无氧和有氧条件下均能发挥作用。利用引物nap1：5`-TCTGGACCATGG-GCTTCAACCA-3`，nap2:5’-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3’，在PCR仪上进行扩增。

PCR扩增体系(Total 25μl)：10×Buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，nap1 0.5μl，nap20.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶0.25μl，无菌水定容至25μl。PCR反应程序设定如表8所示：

表8

预变性	94℃	10min
			变性	94℃	1min
退火	55℃	1min
			延伸	72℃	1.5min

总共运行30个循环，其中第30个循环在72℃下补充延伸10min。4℃保存。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，电压220V，电泳30min，凝胶成像系统成像拍照。利用引物nap1/nap2对LJ9菌株的周质硝酸盐还原酶基因进行扩增，琼脂糖凝胶电泳图如图11所示：目标条带在750bp-1000bp之间。周质硝酸盐还原酶亚基的napA基因均在870bp左右，因此可初步判断，LJ9含有napA基因，这表明菌株LJ9具有好氧反硝化功能。

上述本实施例的假单胞菌YG8主要通过以下方法筛选得到：

初筛：将采自福建省龙岩市龙津污水处理厂的活性污泥，加至装有玻璃珠的富集培养基的锥形瓶中进行富集培养。富集结束后，将菌液稀释涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板。待长出单菌落，再进一步划线纯化。挑取纯化后的菌株接入灭菌的异养硝化培养基中，每隔2d取菌液滴加格林斯试剂以确认菌株是否具有硝化活性。初步筛选出的异养硝化菌株再接种到BTB初筛培养基上进行涂布培养，每个菌株至少2个平行样，于30℃恒温培养箱中培养。反硝化过程会使BTB培养基pH升高，从而菌落周围会产生蓝色晕圈，挑选出现蓝色晕圈的单菌落，在DM固体培养基划线分离，重复分离操作3次，待生长后挑取单菌落保存。筛选出的菌株兼具异养硝化和好氧反硝化活性。

复筛：挑取初筛得到的菌株分别接入灭菌的异养硝化和好氧反硝化培养基中，在30℃，转速150rpm的摇床震荡培养，48h后检测培养基中的氨氮和硝酸盐氮含量，筛选出氨氮和硝酸盐氮降解率高的菌株，选取该菌株进行后续脱氮性能的研究。

上述本实施例的假单胞菌YG8菌种鉴定过程及结果如下：

形态学鉴定：培养挑取待鉴定的菌种分别划线于牛肉膏蛋白胨平板培养基，培养48h后观察菌落形态。YG8平板菌落形态结果如图12所示：菌落表面显黄色，不透明，边缘清晰圆整，呈粘性质地。

革兰氏染色观察：挑取对数生长期(18-24h)的菌落涂片，自然风干后在火焰上固定，然后进行革兰氏染色。用光学显微镜观察菌体颜色和大小。结果表明：YG8为革兰氏阴性菌，呈杆状。

透射电镜形态结果如图13所示：单个细菌呈现短杆状，菌体大小为362×253nm。

生理生化鉴定：按照《伯杰鉴定细菌学手册》进行操作，部分参照其他文献操作。细菌的生理生化反应是对细菌分类鉴定的重要依据之一。参照《伯杰鉴定细菌学手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对YG8菌株进行鉴定。鉴定结果如表9所示：YG8能够在4℃和41℃生长，在接触酶、淀粉水解、尿素水解、果胶水解、乙酸氧化等实验中均能发生反应，实验结果为阳性。经生理生化实验鉴定：YG8与Pseudomonas mendocina(假单胞门多萨菌属)相似。

表9 YG8的生理生化实验结果

检测指标	结果	检测指标	结果
				接触酶	+	尿素水解	+
氧化酶	-	果胶水解	+
				V.P	-	乙酸氧化	+
甲基红	-	产硫化氢	-
				葡萄糖发酵	--	柠檬酸盐	+
乳糖发酵	--	石蕊牛奶	酸性
				绿脓菌素	+	硝酸盐还原	+
明胶液化	+	吲哚实验	+
				淀粉水解	+	氧化发酵	++
油脂水解	-	生长温度	4℃和41℃都生长

注：+表示阳性结果，出现反应；表示阴性结果，无该反应。葡萄糖发酵中，第一个+/-表示产酸/不产酸，第二个+/-表示产气/不产气。氧化发酵中，第一个+/-表示有氧条件下反应/不反应，第二个+/-表示无氧条件下反应/不反应。

菌种分子生物学鉴定：提取菌株DNA作为PCR模板进行扩增。引物选用通用引物:27F：5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系(50ul)：无菌水41.5ul，Buffer 5ul，1492R 1ul，27F 1ul，taq酶0.5ul，dNTP 1ul。PCR反应条件为:①95℃预变性3min；②95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s；③第2步循环30次；④72℃最终延伸10min，4℃保存。得到的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后，送至上海华大基因公司完成菌株16S rDNA序列测定，根据结果进行菌株同源性分析，确定菌株的系统发育地位。

NapA功能基因的扩增。硝酸还原酶分为膜结合硝酸还原酶(Nar)和周质硝酸盐还原酶(Nap)两类，在好氧条件下，周质硝酸盐还原酶基因优先表达，并且在无氧和有氧条件下均能发挥作用。利用引物nap1：5`-TCTGGACCATGG-GCTTCAACCA-3`，nap2：5`-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3`，在PCR仪上进行扩增。反应体系(25ul)：10×Buffer2.5ul，dNTP0.5ul，NAP1 0.5ul，NAP2 0.5ul，模板DNA 1ul，Taq酶0.25ul，无菌水19.75ul。PCR条件设定：①94℃预变性10min；②94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min；③第2步循环30次；④72℃最终延伸10min，4℃保存。得到的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化和凝胶成像系统成像拍照后，送至上海华大基因公司完成序列测定。

YG8菌株16S rDNA扩增如图14所示：PCR产物条带较亮且通道无其他杂带，位于1000-2000bp之间，说明得到YG8的16S rDNA目标条带。菌株YG8的16S rDNAPCR产物经纯化后进行测序，测得序列长度为1294bp。根据测序结果进行菌种系统发育分析，结果如图15所示：YG8与Pseudomonas mendocina相似度100％，可判断YG8属于假单胞门多萨菌属(Pseudomonas mendocina)，命名为Pseudomonas mendocina YG8(以下简称YG8)。

周质硝酸盐还原酶亚基基因的扩增：利用引物nap1/nap2对YG8菌株的DNA样品进行扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，扩增结果如图16所示：750-1000bp左右有清晰的特异条带，杨基先等分离的周质硝酸盐还原酶亚基基因napA为870bp，可初步判断，该菌含有napA基因，表明菌株YG8具有好氧反硝化功能。

测定方法：本章实验所需要的主要检测项目及测定方法如表10所示。

表10主要检测项目及测定方法

测定指标	测定方法
		NO3 --N	麝香草酚紫外分光光度法
TN	碱性过硫酸钾消解光度法

好氧反硝化菌株种子液的制备：取好氧反硝化菌株接于100mL LB培养基中，30℃，180rpm培养24h，取种子液装于离心管，4000rpm冷冻离心机离心10min，在超净台弃去上清液，无菌水洗涤沉淀菌体，4000rpm离心，重复3次，用无菌水将种子液的OD₆₀₀调至0.75左右。

好氧反硝化菌YG8脱氮性能响应面优化：根据本课题组之前的单因素实验结果，确定温度、C/N和初始pH值的中心点分别为30℃、12和7.0。响应面优化菌株YG8的好氧反硝化影响因子及水平如表11所示。取YG8种子液接种到150mL反硝化培养基中，接种量3％，150rpm培养24h后，4000rpm离心10min，测定培养体系中的NO₃ ^--N含量，每个处理做3个重复。

表11响应面实验因素和水平因素对照表

好氧反硝复合化菌剂YJ配比研制

(1)三种好氧反硝化菌株的混合培养初探

为了验证好氧反硝化菌YG8、LJ2、LJ9能否进行良好共生培养，表现出更优良的脱氮性能。将菌株YG8、LJ2、LJ9的种子液按照表12的接种量接种到150mL的反硝化培养基中，NO₃ ^--N初始浓度为200mg·L^-1，C/N为15，pH为7，30℃，180rpm培养48h，每个处理做3个重复，每隔6h测定培养基的NO₃ ^--N含量，计算每一组培养体系NO₃ ^--N去除率。

表12菌株YG8、LJ2、LJ9的混合培养初探对照表

(2)不同菌株配比对复合菌剂YJ脱氮性能的影响

应用Design Expert 8.0.6软件设计实验，以Y₁(LJ2)、Y₂(LJ9)、Y₃(YG8)三株好氧反硝化菌的接种量为自变量，NO₃ ^--N去除率为响应值，3株菌接种量的最低值和最高值均设定为0和5mL，实验设计如表13：将菌株YG8、LJ2、LJ9的种子液按照设计结果的接种量接种到150mL的反硝化培养基中，NO₃ ^--N初始浓度为200mg·L^-1，C/N为15，30℃，180rpm培养48h，每隔6h测定培养基的NO₃ ^--N含量，计算每一组培养体系中的NO₃ ^--N去除率。

表13混料设计三种菌株配比对照表

1.2.4好氧反硝化复合菌剂YJ脱氮性能与影响因素

(1)碳源对好氧反硝化复合菌剂YJ脱氮性能的影响

电子受体无论是以氧气还是氮氧化物，只有碳源提供电子供体，反硝化过程才能完成^[23]。本实验选用琥珀酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖为碳源，以KNO₃为唯一氮源，培养基初始NO₃ ^--N浓度为200mg·L^-1，C/N为15，复合菌剂YJ各个菌株的种子液按优化配比接种到150mL的反硝化培养基中，接种量为5％，30℃、150rpm的培养36h，测定NO₃ ^--N含量、pH和OD₆₀₀。

(2)C/N对好氧反硝化复合菌剂YJ脱氮性能的影响

C/N会影响反硝化速率和反硝化的最终产物。本节实验中设定培养基初始NO₃ ^--N浓度为200mg·L^-1，C/N为20、30、60、100、200，以丁二酸钠为碳源，复合菌剂YJ各个菌株的种子液按优化配比接种到150mL的反硝化培养基中，接种量为5％，30℃、150rpm培养36h，测定NO₃ ^--N含量、pH和OD₆₀₀。

(3)好氧反硝化复合菌剂YJ培养条件的响应面优化

根据之前的单因素实验结果，确定X₁(装液量)、X₂(温度)和X₃(初始pH)的中心点分别为100mL、30℃和7.0。响应面优化好氧反硝化复合菌剂YJ的影响因子及水平如表14所示。设定培养基初始NO₃ ^--N浓度为200mg·L^-1，C/N为30，以丁二酸钠为碳源，复合菌剂YJ各个菌株的种子液按优化配比接种到150mL的反硝化培养基中，接种量为5％，按照响应面优化设定的各个不同因素条件，培养36h，每个处理做3个重复，测定培养体系中的NO₃ ^--N含量。

表14响应面实验因素和水平因素对照表

(4)验证实验

响应面法确定好氧反硝化菌剂的培养条件后，复合菌剂YJ各个菌株的种子液按优化配比接种到150mL的反硝化培养基中，接种量为5％，设定培养基初始NO₃ ^--N浓度为200mg·L^-1，

C/N为30，培养36h，每个处理做3个重复，测定培养体系中的NO₃ ^--N与TN含量。

(5)不同NO₃ ^--N浓度对好氧反硝化复合菌剂YJ脱氮性能的影响

本实验采用好氧反硝化培养基，C/N为20，培养基NO₃ ^--N初始浓度分别为200、300、500、800、1200、1500、2000mg·L^-1。复合菌剂YJ各个菌株的种子液按优化配比接种到150mL的反硝化培养基中，接种量为5％，30℃、150rpm培养7d，每隔1d测定NO₃ ^--N、TN含量、OD₆₀₀和pH。

2.结果与分析

2.1好氧反硝化菌YG8脱氮性能响应面优化

采用Design-ExpertV8.0.6.1软件对好氧反硝化菌YG8脱氮性能影响因素优化的实验结果如表15所示：好氧反硝化菌YG8在C/N12、温度30℃、初始pH7的条件下，NO₃ ^--N去除率最高达88.84％。进行3次回归方程预测及方差分析，结果如表16所示：根据好氧反硝化菌YG8的脱氮率建立的回归模型的F＝27.21，p<0.001，表明该模型的适应性极其显著，用该模型预测NO₃ ^--N去除率是非常可靠的。C/N(A)、温度(B)、pH(C)的一次系数由于p值低于0.001，对NO₃ ^--N去除率的影响极显著，温度和初始pH(BC)的交互作用对NO₃ ^--N去除率影响显著；C/N和温度(AB)、C/N和初始pH(AC)交互作用的p值均大于0.05，表明其对NO₃ ^--N去除率影响不显著。综上所述，该模型能够真实描述温度、C/N、初始pH之间的真实关系，可以用该模型确定好氧反硝化菌YG8的最佳条件。

表15响应面法培养好氧反硝化菌YG8 24h的NO₃ ^--N去除率情况表

表16回归方程的方差分析表

变异来源	平方和	自由度	均方	F值	p值	显著性
							模型	10998.93	9	1222.10	27.21	0.0001	**
A	877.18	1	877.18	19.53	0.0031	**
							B	2796.40	1	2796.40	62.25	＜0.0001	**
C	1347.98	1	1347.98	30.61	0.0009	**
							AB	41.67	1	41.67	0.93	0.3676
AC	55.06	1	55.06	1.23	0.3048
							BC	286.29	1	286.29	6.37	0.0395	*
A2	1354.56	1	354.56	30.15	0.0009	**
							B2	2113.85	1	2113.85	47.06	0.0002	**
C2	1519.80	1	1519.80	33.83	0.0007	**
							残差	314.45	7	44.92
失拟项	314.45	3	104.82
							纯误差	0.00	4	0.00
总误差	11313.38	16

注：**表示影响极显著，p＜0.01；*表示影响显著，p＜0.05。

以好氧反硝化菌YG8 24h的NO₃ ^--N去除率为响应值，采用Design-ExpertV8软件对表16数据进行多元回归分析，得到回归方程式：

Y＝86.84+10.47A+18.7B+13.11C+3.23AB-3.71AC-8.46BC-17.94A²-22.41B²-19C²

式中：A为C/N，B为温度，C为pH值。

温度、C/N、pH值相互之间的交互作用对NO₃ ^--N去除率的影响如图17所示：其中，(a)(b)(c)分别代表2个独立变量之间交互作用对NO₃ ^--N去除率的影响，另外1个变量固定在中心水平不变。左边3个是3D曲面图，开口均向下；右边3个由是曲面图倒映的等高线图，可以直接看出两个影响因子之间交互作用的强弱，等高线形状为椭圆形说明两因子交互作用显著，越接近圆则说明两因子间交互作用越弱。

初始pH与C/N交互作用对YG8好氧反硝化脱氮性能影响如图17上图所示：初始pH和C/N的交互项不显著。当C/N不变时，随初始pH值的增加，NO₃ ^--N去除率先急剧升高后缓慢降低，当初始pH值超过7.0时，NO₃ ^--N去除率呈逐步下降趋势，说明pH值过高或者过低均不利于菌株YG8生长及好氧反硝化的进行，且pH值的条件为中性或者弱碱性最有利于菌株YG8生长及好氧反硝化效率最高，这与目前报导的大部分好氧反硝化菌相似，如邹艳艳等研究的反硝化菌Rhizobium sp.B612在酸性条件下培养36h的NO₃ ^--N去除率为56.29％，当初始pH为7、7.8、8.4时，培养36h的NO₃ ^--N去除率均达到80％以上，其中初始pH为7时NO₃ ^--N去除率最大，为85.99％。

温度与C/N交互作用对YG8好氧反硝化脱氮性能影响如图17中图所示：温度与C/N的交互项不显著。温度不变时，随着C/N的升高，NO₃ ^--N去除率先提高，当C/N为14时，NO₃ ^--N去除率呈下降趋势。C/N对好氧反硝化菌的NO₃ ^--N去除率影响较大。据研究表明，C/N过高或过低都会影响好氧反硝化菌株的生长及脱氮性能，在达到最适C/N后，继续增加C/N，产生的多余中间产物可能会抑制好氧反硝化进程，如分杨新萍离的好氧反硝化细菌Pseudomonasmendocina.AD6的最佳C/N是15，NO₃ ^--N去除率达93.73％；当菌株AD6的C/N为23时，NO₃ ^--N去除率下降至81.84％。

温度与初始pH交互作用对YG8好氧反硝化脱氮性能影响如图17下图所示：温度与初始pH的交互项显著，pH值不变时，随着温度的升高，NO₃ ^--N去除率先提高，当温度超过32℃时，NO₃ ^--N去除率呈逐步下降趋势，这表明温度过高或过低时都会阻碍好氧反硝化的进行，可能与YG8的生长及硝酸盐还原酶的耐热机制有关。温度对NO₃ ^--N去去除率影响较大，最适温度在32℃左右。这与唐婧等研究的好氧反硝化菌Halomonas sp.F10脱氮性能相似，该菌株的最佳温度为30℃，NO₃ ^--N去除率为95.94％，温度为35℃和25℃时，NO₃ ^--N去除率下降为91.75％和47.59％。

从图17可知，回归方程存在稳定点，即存在极大值点使得响应值取得最大值，由回归方程可得到好氧反硝化菌YG8最佳脱氮条件：温度32.31℃、C/N为16.00和初始pH值7.15，此时YG8的NO₃ ^--N去除率最高达95.11％。优于目前报导的某些好氧反硝化菌在类似条件下的脱氮性能，比如初始NO₃ ^--N浓度为100mg·L^-1、温度为31℃、C/N为10、pH值为6.75的条件下，培养48h好氧反硝化菌(QLLGFXH04)的NO₃ ^--N去除率为77.04％。

2.2好氧反硝化复合菌剂YJ配比研制

2.2.1三株菌株的混合培养初探

菌株YG8、LJ2、LJ9混合培养NO₃ ^--N去除率随时间变化如图18所示：培养30h，菌株YG8+LJ2+LJ9混合的脱氮效率最好，NO₃ ^--N去除率高达94.41％，LJ2+LJ9组合为89％，LJ2+YG8组合为82.75％，LJ9+YG8组合为88.94％。由此看出菌株YG8、LJ2、LJ9混合共生培养效果较好，三株菌混合培养表现出更优良的脱氮性能。

2.2.2不同菌株配比对好氧反硝化复合菌剂YJ脱氮性能的影响

测定好氧反硝化菌YG8、LJ2、LJ9在不同组合配比下对NO₃ ^--N的去除率结果如表17所示：培养30h，当菌株接种量比例为LJ2:LJ9:YG6＝3.3:0.8:0.8时，NO₃ ^--N去除率最大达96.77％。利用Design Expert 8.0.6软件拟合所得的结果，得出NO₃ ^--N去除率的回归方程，结果如下：

η＝84.57Y₁+79.71Y₂+82.31Y₃+35.42Y₁Y₂+32.43Y₁Y₃+49.98Y₂Y₃

式中:η为NO₃ ^--N的去除率。

对回归方程进行方差分析，结果如表18所示：本实验模型的F＝8.97，p＜0.001，表明该模型的适应性及显著，失拟项p＞0.05，说明该回归方程拟合度好，可以对不同菌株组合比例比下的NO₃ ^--N去除率进行分析和预测。菌株YG8与LJ2(Y₁Y₂)、YG8与LJ9(Y₁Y₃)、LJ2与LJ9(Y₂Y₃)的交互项对NO₃ ^--N去除率的影响是极显著的，通过对回归方程的方差进行分析表明，R²＝0.9913，说明该模型可以很好的拟合三株好氧反硝化菌的比例关系。

表17 24h不同组合比例的复合菌剂对NO₃ ^--N去除率情况表

表18 NO₃ ^--N去除率的特定立方混合模型的方差分析表

方差来源	平方和	自由度	平方和平均值	F	P	显著性
							模型	298.25	5	59.65	8.97	0.0018	**
线性混合	7.70	2	3.85	0.58	0.5783
							Y1Y2	122.70	1	122.70	18.45	0.0016	**
Y1Y3	94.82	1	94.82	14.26	0.0036	**
							Y2Y3	207.80	1	207.80	31.25	0.0002	**
剩余项	66.94	10	6.65
							失拟项	29.83	5	5.97	0.81	0.5868
纯误差	36.66	5	7.33
							所有项	364.73	15

用拟合的方程寻求复合菌剂YJ的最佳复配比，菌株YG8、LJ2、LJ9比例范围均为0～100％，NO₃ ^--N的目标降解率范围为95％～100％。软件得出的数据如表19所示：当YG8、LJ9和LJ2的组合比例分别为29.00％、33.76％、37.24％时，培养30h复合菌剂YJ对NO₃ ^--N去除率达到最大为95.34％。接下来的实验为了方便计算和操作，YG8和LJ9和LJ2三种菌的投入比例分别为30％、30％、40％。

表19回归方程的方差分析

变异来源	平方和	自由度	均方	F值	p值	显著性
							模型	56.41	9	6.27	4.16	0.0368	*
X1	0.22	1	0.22	0.15	0.7131
							X2	23.77	1	23.77	15.77	0.0054	*
X3	1.73	1	1.73	1.15	0.3196
							X1X2	6.50	1	6.50	4.13	0.0764
X1X3	0.95	1	0.95	0.63	0.4532
							X2X3	0.14	1	0.14	0.09	0.7689
X1 2	1.05	1	1.05	0.70	0.4310
							X2 2	16.34	1	16.34	10.84	0.0133	*
X3 2	3.98	1	3.98	2.64	0.1481
							残差	10.55	7	1.51
失拟项	1.55	3	3.52
							纯误差	0.00	4	0.00
总误差	66.96	16

菌株YG8、LJ2、LJ的不同组合比例对NO₃ ^--N去除率的影响情况如图19所示：3D响应曲面图存在最高点，最高点靠近曲面的中心，说明三株菌株YG8、LJ2、LJ9的交互作用对NO₃ ^--N去除率的影响显著，即3种菌混合培养对NO₃ ^--N去除率更高，脱氮性能优于单菌。

2.3好氧反硝化复合菌剂YJ脱氮性能

2.3.1碳源对好氧反硝化复合菌剂YJ脱氮性能的影响

有机碳源能够为菌株的生长提供充足的能量，碳源的增长有利于微生物的的生长和反硝化作用的进行，可促进氮的转化去除，但碳源过多又会抑制硝化菌的生长和硝化活性。所以充足又合适的碳源对菌株正常生长非常重要。

碳源对复合菌剂YJ的脱氮性能影响的实验结果如图20所示：丁二酸钠作为碳源时，复合菌剂YJ的OD₆₀₀为0.823，NO₃ ^--N去除率高达93.73％；以乙酸钠为碳源时，复合菌剂YJOD₆₀₀为0.793，NO₃ ^--N去除率为84.38％。当葡萄糖和柠檬酸钠作为碳源时，复合菌剂YJ的OD₆₀₀分别为0.663和0.291，NO₃ ^--N去除率分别为79.79％和58.21％。因此，复合菌剂YJ利用丁二酸钠和乙酸钠为碳源生长和脱氮性能较好，说明小分子碳源更容易被菌体利用，这与好氧反硝化菌株Pseudomonas sp.N6对乙酸钠和丁二酸钠的利用率高于对大分子有机物的利用率研究结论一致。综上所述，丁二酸钠作为碳源时，好氧反硝化复合菌剂YJ对NO₃ ^--N去除率最高，所以我们后续实验将选用丁二酸钠作为碳源。据报道，不同复合菌剂利用的碳源不尽相同，如：吴敏研究的异养硝化-好氧反硝化菌剂在以琥珀酸钠为碳源、初始NH₄ ⁺-N浓度为100mg·L^-1的培养基中培养48h，NH₄ ⁺-N去除率最高达89.72％。

2.2.2C/N对好氧反硝化复合菌剂YJ脱氮性能的影响

好氧反硝化菌的生长通常需要最佳的C/N负荷比例，不同C/N比下，复合菌剂的好氧反硝化能力有一定区别。C/N对复合菌剂YJ的脱氮性能影响结果如图21所示：当C/N为20时，复合菌剂YJ的生物量最大，达0.828，随着C/N增大，复合菌剂YJ的的生物量呈下降趋势，当C/N为200时，复合菌剂YJ的生物量下降至0.068，说明C/N过高抑制了菌株的生长。C/N比为30和60时，NO₃ ^--N去除率最高达99.00％；当C/N比为20时，NO₃ ^--N去除率为95.61％；当C/N为100时，复合菌剂YJ仍有较高的脱氮率，NO₃ ^--N去除率为91.27％；C/N比为200时，菌株生长非常缓慢，NO₃ ^--N去除率只有3.5％，可能是因为过高的C/N比会产生多余中间产物，抑制了好氧反硝化进程。

综上所述，C/N在20-100范围内，好氧反硝化复合菌剂YJ对NO₃ ^--N去除率很高，说明该复合菌剂YJ能耐受较高浓度的有机物，优于目前报道的好氧反硝化菌剂。例如洪利研究由好氧反硝化菌Pseudochrobactrum asaccharolyticum.LTD-03、Arthrobactersoli.LTD-05、Thauera mechernichensis.LTD-16组成的耐冷反硝化菌剂，当C/N为40时，NO₃ ^--N去除率为82.22％。好氧反硝化复合菌剂YJ脱氮的C/N高于目前报道的许多好氧反硝化纯菌，大部分好氧反硝化菌株脱氮性能的最适C/N一般为7-15，比如李雪等研究的好氧反硝化菌Pseudomonas sp.HG-7的C/N为8或10，NO₃ ^--N去除率最高到98％；王永霞等研究的好氧反硝化菌Pseudomonas sp.N15-6-1的C/N为7.5，NO₃ ^--N去除率最高达98.81％；冶青等研究的好氧反硝化菌株Pseudomonas sp.B的C/N为15，NO₃ ^--N去除率最高达98.60％。

2.2.3好氧反硝化复合菌剂YJ培养条件的响应面优化

采用Design-ExpertV8.0.6.1软件对好氧反硝化复合菌剂YJ脱氮性能影响因素优化的实验结果如表20所示：250mL三角瓶的装液量100mL、初始pH为7和温度为30时，复合菌剂YJ对NO₃ ^--N去除率最高达99.99％。进行3次回归方程预测及方差分析，结果如表21所示：根据复合菌剂YJ的脱氮率建立的回归模型的F＝4.16，p<0.05，说明模型在统计上是显著的，用该模型预测NO₃ ^--N去除率是可靠的。温度的一次系数(X₂)和二次系数(X₂ ²)的p值低于0.05，对NO₃ ^--N去除率有显著影响。此外，装液量和初始pH的一次系数(X₁)(X₃)和二次系数(X₁ ²)(X₃ ²)、装液量和温度(X₁X₂)、装液量和初始pH(X₁X₃)、温度和初始pH(X₂X₃)的交互项，p值均高于0.05，表明了对NO₃ ^--N去除率没有显著影响。采用Design-ExpertV8软件对表2-5数据进行多元回归分析，得到回归方程式：

Y＝100.00-0.17X₁+1.72X₂+0.46X₃+1.27X₁X₂-0.49X₁X₃-0.19X₂X₃-0.50X₁ ²-1.97X₂ ²-0.97X₃ ²

式中：Y为NO₃ ^--N去除率，X₁为装量，X₂为初始pH值，X₃为温度。

表20响应面法培养好氧反硝化菌剂24h的NO₃ ^--N去除率情况表

表21回归方程的方差分析

注：**表示影响极显著，p＜0.01，*表示影响显著，p＜0.05。

根据回归方程做响应面图，分析装液量、温度和初始pH、温度对复合菌剂YJ的NO₃ ^--N去除率的影响如图22所示：每个响应面图分别代表2个独立变量之间的相互作用，而此时另外1个变量保持在中心点水平不变。该组图可以直观看出装液量、温度和初始pH、温度两两交互作用对NO₃ ^--N去除率的影响，可以判断各个因素的最佳水平范围，最佳水平范围为响应曲面顶点附近区域。图22上图响应曲面坡度比较陡峭，说明NO₃ ^--N去除率对初始pH的变化比较敏感，图22中图和下图响应曲面坡度相对平缓，说明温度与装液量、初始pH与装液量的交互作用对NO₃ ^--N去除率影响不大，可以忍受在该范围内条件的变异。

温度与初始pH交互作用对复合菌剂YJ好氧反硝化脱氮性能影响如图22上图所示：温度固定时，随着pH的增加，NO₃ ^--N去除率先增加后减少，这也证明了pH值过高或者过低均会对复合菌剂YJ的好氧反硝化性能的发挥产生影响。

温度与装液量交互作用对复合菌剂YJ好氧反硝化脱氮性能影响如图22中图所示：装液量固定时，NO₃ ^--N去除率随着温度的增加无明显变化，这说明了温度在25-35℃之间对复合菌剂YJ无明显影响。

初始pH与装液量交互作用对复合菌剂YJ好氧反硝化脱氮性能影响如图22下图所示：初始pH固定时，NO₃ ^--N去除率随着装液量的增加有呈下降的趋势，但变化不明显，说明了装液量在50-100mL之间对复合菌剂YJ无明显影响。

根据Design Expert 8.0.6软件的优化选择功能可以得出复合菌剂YJ最优的好氧反硝化脱氮条件：当温度31.11℃、250mL三角瓶装液量93.33mL和初始pH值7.22，复合菌剂YJ的NO₃ ^--N去除率最高达100％，脱氮速率达4.17mg·L^-1·h^-1，优于目前报道的某些复合菌剂，例如梁前才等研究的由沼泽红假单胞菌66.60％、枯草芽孢杆菌16.70％、地衣芽孢杆菌16.70％组成的好氧反硝化复合菌剂在渔业养殖水体培养，NO₃ ^--N去除率为99.74％，脱氮速率为1.39mg·L^-1·h^-1。

2.3.4验证实验

为了方便计算与操作，根据上述结果，我们把最优培养条件设定为温度31℃、250mL三角瓶装量95mL和初始pH值7，在此条件下进行验证实验，培养36h后复合菌剂YJ的NO₃ ^--N去除率达到99.37％，TN去除率为78.31％。实测值与模型预测值相对误差为0.2％，说明模型模拟效果较好。这说明采用响应面优化得到的复合菌剂YJ好氧反硝化条件准确可靠，具有利用价值。

2.3.5不同NO₃ ^--N初始浓度对好氧反硝化复合菌剂YJ脱氮性能的影响

初始NO₃ ^--N浓度对复合菌剂YJ好氧反硝化脱氮性能影响如图23所示：经过培养7d，随着NO₃ ^--N初始浓度的增加，复合菌剂YJ的生物量OD₆₀₀值呈下降趋势，当NO₃ ^--N初始浓度为200、300、500、800、1200、1500、2000mg·L^-1，OD₆₀₀值分别为0.984,、0.965、0.931、0.8460、0.699、0.545、0.347mg·L^-1。据研究表明，C/N一定时，初始NO₃ ^--N浓度越高，碳源越充足，可以保证微生物的生长需要，但当碳源达到一定时，继续增加碳源，未被微生物生长所利用，导致一定的碳源浪费，因此NO₃ ^--N浓度较低时，比如NO₃ ^--N浓度200、300、500mg·L^-1时，NO₃ ^--N去除率更高，分别为99.99％、99.96％、99.92％，TN去除率分别为94.51％、83.44％、57.08％；而NO₃ ^--N浓度高于500mg·L^-1时，即NO₃ ^--N浓度为800、1200、1500、2000mg·L^-1，菌剂生长量开始下降，影响了菌剂的脱氮效果，NO₃ ^--N去除率分别为97.99％、44.94％、25.93％、22.84％，TN去除率分别为34.22％、34.85％、27.27％、14.45％，由此可知，TN去除率随着NO₃ ^--N浓度增加而减小。

不同类型的好氧反硝化复合菌剂对NO₃ ^--N初始浓度的耐受程度不尽相同，例如：洪利研究的耐低温反硝化菌剂CM在NO₃ ^--N初始浓度为200mg·L^-1时，NO₃ ^--N去除率为89.8％，但是他没有测菌剂CM在NO₃ ^--N初始浓度高于200mg·L^-1时NO₃ ^--N去除率，因此无法清楚该菌剂对NO₃ ^--N的耐受情况；陈金楠研究的耐盐复合菌剂在NO₃ ^--N初始浓度为100mg·L^-1时，耐盐复合菌剂对NO₃ ^--N去除率为98.92％，但是在NO₃ ^--N初始浓度为200mg·L^-1时，NO₃ ^--N去除率仅有31.76％。相比陈金楠的耐盐复合菌剂，复合菌剂YJ对NO₃ ^--N的去除率更高，耐受的NO₃ ^--N浓度更大。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (3)

1. 一种好氧反硝化复合菌剂，其特征在于，由假单胞菌YG8、假单胞菌LJ9和副球菌LJ2的种子液复配而成，所述假单胞菌YG8保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60340，所述假单胞菌LJ9保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60339，所述副球菌LJ2保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2018年3月21日，保藏编号为GDMCC NO：60338；所述假单胞菌YG8、假单胞菌LJ9和副球菌LJ2种子液的体积比为30～35∶30～32∶35～40；

各菌株种子液的制备方法为：将相应的菌株接入LB培养基，30℃、150 rpm摇床培养24h，取菌悬液4000 rpm冷冻离心机中离心10min，去上清液，沉淀，菌体用无菌水洗涤，再离心去上清液，重复2-3次，用无菌水将菌悬液的OD₆₀₀调至0.6-0.8，得到所述菌株的种子液。

2. 根据权利要求1所述的好氧反硝化复合菌剂，其特征在于，所述 LB培养基的组分及配比为：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0-7.2。

3.根据权利要求1-2任一项所述的好氧反硝化复合菌剂在降低水体中硝酸盐氮含量中的应用；所述应用包括以下步骤：

将好氧反硝化复合菌剂和碳源加入硝酸盐氮浓度为200～2000 mg·L^-1的水体中，至水体中C/N比值为20～100，好氧反硝化复合菌剂的接种量为3%～10%，在温度为25℃～35℃，pH为7-7.44，转速为100 rpm～200 rpm的条件下振荡反应6h～7d，所述碳源为丁二酸钠和/或乙酸钠。

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