CN112877247A - 一种利用芽孢杆菌处理高氨氮废水的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种利用芽孢杆菌处理高氨氮废水的方法，属于微生物技术领域。该芽孢杆菌名称为B.subtilis subsp.stercoris C5，保藏编号：GDMCC No：61393。C5具有较高的氨氮耐受性且对氨氮的降解率高，在氨氮浓度为320mg/L的养殖废水和488mg/L的模拟废水中培养72h后氨氮降解率分别为94.7％和86.8％。当养殖废水中初始氨氮浓度为470mg/L，以淀粉作碳源时，72h的氨氮降解率为78.1％。因此，C5在水体污染方面具有巨大的应用价值，尤其具有高浓度氨氮降解处理的优势与潜能；为养殖废水氨氮降解提供了优良的土著菌种，对于水体污染治理意义重大。

Description

一种利用芽孢杆菌处理高氨氮废水的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种利用芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.stercoris)处理高氨氮废水的方法。
背景技术
近年来，一些中小城市养殖场排泄物的污水随意排放，养殖废水具有高有机物、高氨氮、臭味大等特点，对地表水和地下水等造成严重污染。当前养猪废水处理存在难题：污水氨氮含量高且处理难度大、效率低，大部分厂家污水处理后的氨氮均不达标，故养猪废水处理关键在于氨氮能否快速分解去除。
水体中氨氮的毒性主要取决于游离氨气，目前关于控制氨气的方法主要包括物理、化学、饲料调控、改良堆肥以及微生物调控等多种技术。其中，基于硝化作用的微生物调控技术具有成本低、收效大、无二次污染等优点，其在废水治理领域得到了广泛地应用。氨气挥发前在废水中的主要存在形式是氨态氮(NH4 +-N)，利用微生物的硝化作用将废水中的NH4 +-N转化为硝酸盐或亚硝酸盐，改变废水中NH4 +→NH3+H+的动态平衡，是减少氨气挥发量的一条有效途径。
芽孢杆菌是一类具有异养硝化-好氧反硝化功能的细菌：一方面，芽孢杆菌通过同化作用降解氨氮进行吸收利用，转化为自身营养物质；另一方面，它可以促进水体的硝化作用，将氨氮转化为硝酸盐，降低了水体的氨氮和亚硝酸盐的含量；另外，芽孢杆菌可以分泌大量淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，能迅速降解鱼虾残留饵料和排泄物，起到减少氨氮的产生，从源头上解决氨氮偏高的问题。
目前，国内外普遍认为生物脱氮方法可有效地降解养殖废水中无机氮化合物。迄今为止绝大多数脱氮菌无法耐受高氨氮废水，关于耐受高氨氮废水的菌株研究鲜有报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌C5(Bacillus subtilis subsp.stercoris C5)。
本发明的另一目的在于提供上述芽孢杆菌的应用。
本发明的另一目的在于提供一种利用芽孢杆菌处理高氨氮废水的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种芽孢杆菌，菌株命名为Bacillus subtilis subsp.stercorisC5，是从养殖废水中分离纯化获得。
所述的Bacillus subtilis subsp.stercoris C5的保藏信息，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC No：61393，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2021年1月5日。
所述的Bacillus subtilis subsp.stercoris C5，具有以下表型特征：在LB固体培养基平板上倒置培养24h后，在自然光下肉眼可观察，该菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，乳白色半透明；革兰氏染色鉴定该菌为革兰氏阳性菌，芽孢染色可以看到芽孢呈椭圆到柱状。
一种生物制剂，基于上述芽孢杆菌制备得到。
上述芽孢杆菌或生物制剂在处理高氨氮废水中的应用。
所述的高氨氮废水包括养殖废水或模拟废水中至少一种。
一种利用上述Bacillus subtilis subsp.stercoris C5处理高氨氮废水的方法，包括以下步骤：
将B.subtilis subsp.stercoris C5种子液接种于高氨氮废水中，震荡反应，完成对高氨氮废水的处理；
优选的，所述的震荡反应的条件为在温度为24℃～36℃，转速为80rpm～200rpm的条件下震荡反应72～75h。
进一步的，所述的震荡反应的条件为在温度为24℃～32℃，转速为120rpm～200rpm的条件下震荡反应72h。
优选的，所述高氨氮废水中的碳源为葡萄糖、淀粉、乙酸钠、甘露醇、丁二酸钠和柠檬酸钠中的至少一种。
优选的，所述高氨氮废水的C/N比值为0.5～30，所述高氨氮废水中氨氮的浓度为310mg/L～500mg/L。C/N比值是指C与N的质量比。
进一步的，所述高氨氮废水的C/N比值为0.5～20。
优选的，所述B.subtilis subsp.stercoris C5种子液的接种量为1％～10％(v/v)；进一步为3％～10％(v/v)。
优选的，所述的高氨氮废水包括养殖废水或模拟废水中至少一种。
优选的，养殖废水中氨氮的浓度为100mg/L～500mg/L，模拟废水中所述氨氮的浓度为50mg/L～500mg/L。
进一步的，模拟废水中氨氮的浓度为64mg/L～488mg/L。
优选的，所述高氨氮废水中的无机盐为FeCl3、MgCl2、KCl、CoCl2、ZnCl2、MnCl2中的至少一种。
优选的，所述无机盐浓度为大量元素0.1～5g/L，微量元素0.01～1mg/L。
进一步的，所述无机盐浓度为大量元素0.1～1g/L，微量元素0.01～1mg/L。
优选的，所述高氨氮废水的pH值为5～9，进一步为7～9。
在其中一个实施例中，所选因素有5个，每个因素设4个水平。
优选的，所述B.subtilis subsp.stercoris C5种子液通过以下方法制得：
将B.subtilis subsp.stercoris C5接种到LB液体培养基中培养至对数期，所得菌悬液离心去除上清液，洗涤后加无菌水，得到B.subtilis subsp.stercoris C5种子液。
优选的，所述培养的过程为：在温度为30±2℃、转速为80～150rpm下震荡培养68～75h。
进一步的，所述培养的过程为：在温度为30℃、转速为100rpm下震荡培养72h。
在其中一个实施例中，所述LB液体培养基的成分为：细菌学蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。
优选的，加无菌水至菌液OD600为0.6～0.8。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明所利用的B.subtilis subsp.stercoris C5具有较高的氨氮耐受性且对氨氮的降解率高，在氨氮浓度为320mg/L的养殖废水和488mg/L的模拟废水中培养72h后氨氮降解率分别为94.7％和86.8％。当养殖废水中初始氨氮浓度为470mg/L，以淀粉作碳源时，72h的氨氮降解率为78.1％。并且从筛菌实验中可以看出，当模拟废水中氨氮浓度高达848mg/L时，培养72h后C5仍有36％的氨氮降解率。另外，当养殖废水和模拟废水中初始氨氮浓度分别低于200mg/L、170mg/L时，72h时均有98％以上的降解率，说明菌株C5对中低氨氮浓度降解速率快且基本完全。因此，C5在水体污染方面具有巨大的应用价值，尤其具有高浓度氨氮降解处理的优势与潜能。
(2)对于应用芽孢杆菌处理养殖废水的污染问题，已有一定的研究。芽孢杆菌好氧，能产生芽孢，制备成产品容易保存和运输，稳定性好、复活率高，因此，芽孢杆菌作为水产微生态制剂菌株具有广阔的应用前景，而我们从养殖废水中筛选出来的高效氨氮降解菌C5属于B.subtilis subsp.stercoris，还未见该菌用于氨氮降解的报道，并且由于菌株C5是养殖废水中的土著细菌，较其它来源的细菌具有更快适应废水环境、更迅速成为优势菌群、更有效发挥改善水质作用的优势。因此，菌株C5的分离、筛选为养殖废水氨氮降解提供了优良的土著菌种，对于水体污染治理意义重大。
附图说明
图1为本发明所采用的菌株C5的菌落形态图。
图2为本发明所采用的菌株C5革兰氏染色细胞形态。
图3为本发明所采用的菌株C5芽孢形态。
图4为本发明所采用的菌株C5的16S rDNA电泳图。
图5为本发明所采用的菌株C5的同源性分析。
图6为本发明所采用的菌株C5的生长曲线。
图7为养殖废水中菌株C5的筛选结果。
图8为模拟废水中菌株C5的筛选结果。
图9为养殖废水中不同碳源对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图10为模拟废水中不同碳源对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图11为养殖废水中C/N对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图12为模拟废水中C/N对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图13为养殖废水中接种量对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图14为模拟废水中接种量对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图15为养殖废水中初始氨氮浓度对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图16为模拟废水中初始氨氮浓度对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图17为养殖废水中不同无机盐对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图18为模拟废水中不同无机盐对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图19为养殖废水中无机盐浓度对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图20为模拟废水中无机盐浓度对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图21为养殖废水中转速对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图22为模拟废水中转速对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图23为养殖废水中温度对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图24为模拟废水中温度对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图25为养殖废水中pH对菌株C5氨氮降解特性的影响。
图26为模拟废水中pH对菌株C5氨氮降解特性的影响。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例所采用的Bacillus subtilis subsp.stercoris C5菌株，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：61393的菌株，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2021年1月5日。
菌株的分离、纯化、鉴定，步骤如下：
1)菌株的分离筛选与纯化
上述的B.subtilis subsp.stercoris C5主要通过以下方法筛选得到：
1.1)分离纯化：取1mL养殖废水加入到9mL无菌生理盐水中并对其进行梯度稀释，经梯度稀释后涂布于氨化培养基平板中，挑取长势良好的单菌落，重复纯化3次以上。
1.2)初筛：用格里斯试剂进行硝化活性确认，检测时如出现红色则说明有亚硝酸盐产生，表明菌株具有硝化作用，从而鉴定筛选的菌株具有硝化功能。
1.3)复筛：将分离纯化得到的几株菌株接于LB培养基中培养12h，以2％接种量接种于养殖废水(氨氮浓度为400mg/L)及模拟废水(氨氮浓度为848mg/L)中，在30℃、100rpm摇床震荡培养72h。每隔24h取样测定一次，每株菌做3个重复，选择氨氮降解率相对较高且效果稳定的菌株进行进一步研究。结果如图7、8所示，菌株C5的氨氮降解率相对较高且效果稳定，当模拟废水中氨氮浓度高达848mg/L时，培养72h后C5仍有36％的氨氮降解率，选择C5作为进一步研究。
2)菌种鉴定
上述的B.subtilis subsp.stercoris C5菌种鉴定过程及结果如下：
2.1)形态学鉴定
观察分离的菌株在LB固体平板上的单菌落形态。采用革兰氏染色法和芽孢染色法观察菌体和芽孢形态。
将菌株C5在LB固体培养基平板上倒置培养24h后，在自然光下肉眼可观察(图1)，该菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，乳白色半透明。革兰氏染色鉴定该菌为革兰氏阳性菌(图2)，芽孢染色可以看到芽孢呈椭圆到柱状(图3)。
2.2)生理生化鉴定
参照《常见细菌鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》进行菌种生理生化鉴定，包括脲酶、接触酶、淀粉水解、葡萄糖发酵、硝酸盐还原、V.P实验、柠檬酸实验、甲基红实验等。
对菌株C5进行多种生理生化特性鉴定，结果如表1所示：脲酶、接触酶、淀粉水解、酪蛋白水解、葡萄糖发酵、柠檬酸盐、硝酸盐还原实验、V.P实验、明胶液化、2％NaCl、7％NaCl实验为阳性，淀粉发酵、吲哚实验、甲基红、8％NaCl、10％NaCl实验为阴性。以上结果表明：C5与B.subtilis subsp.stercoris的生理生化特性相似，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐而不产生氮气，最高耐受NaCl浓度为7％，具有脲酶活性。
表1菌株C5生理生化特性
实验名称 实验结果 实验名称 实验结果
服酶 + 吲哚实验 -
接触酶 + V.P实验 +
淀粉水解 + 甲基红 -
酪蛋白水解 + 明胶液化 +
葡萄糖发酵 + 2％NaCl +
淀粉发酵 - 7％NaCl +
柠檬酸盐 + 8％N<sub>a</sub>Cl -
硝酸盐还原 + 10％N<sub>a</sub>Cl -
注：表1中“+”代表阳性，有此项反应，“-”代表阴性，无此项反应；在不同浓度NaCl实验中，“+”表示C5可生长，“-”表示C5不生长。
2.3)分子生物学鉴定
16S rRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16S rDNA就是编码该亚基的基因。细菌rRNA(核糖体RNA)按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。其中16S rDNA由于大小适中，约1.5kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
2.3.1)细菌基因组DNA提取
用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取实验菌株的总基因组DNA，并将其作为PCR扩增模板，利用16S rDNA测序通用引物，上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和下游引物1492R：5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'对16S rDNA进行PCR扩增。
2.3.2)16S rDNA的扩增和测序
PCR扩增反应体系(50μL)：2×EasyTaq PCR SuperMix 25μL；10mmol/L上游引物1μL；10mmol/L下游引物1μL；模板基因组DNA 5μL；ddH2O 18μL。PCR反应程序设定如表2所示：
表2
预变性 94℃ 4min
变性 94℃ 30s
退火 54.5℃ 30s
延伸 68℃ 90s
总共运行30个循环，最后68℃延伸10min。4℃保存。
PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测合格后，胶回收目的片段送交至广州艾基生物技术有限公司完成测序，同源性序列比对用EzBioCloud以及NCBI中的BLAST软件进行分析，系统发育进化树用MEGA7.0软件中Neighbor-Joining法构建。
菌株C5的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳成像结果见图4所示：M：5000bp Marker；1～3：PCR产物。可以看到PCR产物条带较亮，通道无杂质，条带位置在1000bp以上，说明得到了16S rDNA目标条带。PCR产物纯化后进行测序，得到的序列长度为1419bp，经同源性分析，结果如图5所示：菌株C5与B.subtilis subsp.stercoris菌株相似度71％，命名为Bacillussubtilis subsp.stercoris C5。
菌株C5的16S rDNA序列如SEQ NO ID：1所示。
B.subtilis subsp.stercoris C5具有较高的氨氮耐受性，可用于高氨氮废水的降解处理。应用时，先将B.subtilis subsp.stercoris C5制成B.subtilissubsp.stercoris C5种子液，然后再接入养殖废水和模拟废水中摇床培养72h，每隔24h取样一次，测定不同时间段内养殖废水和模拟废水中的氨氮浓度。实验均设置3个重复，实验数据均以平均值±标准误表示。该B.subtilis subsp.stercoris C5种子液采用以下方式制得：
将菌株C5在LB液体培养基中活化，培养至对数期，取菌悬液5000rpm，离心5min，弃上清，用无菌水洗涤，再离心去上清，重复2-3次，用无菌水将菌液OD600调至0.6～0.8，作为种子液。
采用的菌株C5的生长曲线，如图6所示，说明菌株C5在6～12h进入对数生长期。因此，在后续试验中取培养12h的活化菌液作为种子液。
上述用到的培养基配方如下：
氨化培养基(g/L)：C6H12O6 10.0、(NH4)2SO4 5.0、K2HPO4 0.5、NaCl 0.85、MgSO4·7H2O 0.25，pH 7.0。
模拟废水(g/L)：(NH4)2SO4 4.0、NaH2PO4 0.25、MnSO4·4H2O 0.01、MgSO4·7H2O0.03、K2HPO4 0.75、CaCO3 1.0、淀粉10.98，微量元溶液1mL，pH 7.8。根据实验需要，可以调节淀粉的量。
微量元溶液(g/L)：EDTA 50、(NH4)2MoO4 0.05、Fe2(SO4)3 5.0、H3BO3 0.05、CuSO41.6、KI 0.01、ZnSO4 2.2、CoCl2 0.05。
注：固体培养基在以上液体培养基中添加1.5～2％琼脂，所有培养基均在115℃条件下灭菌20min后备用。
用到的实验仪器如表3所示：
表3实验仪器
Figure BDA0002950668020000081
水质检测分析项目及方法如表4所示：
表4水质检测分析的项目及方法
指标 测定方法
氨态氮(NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N) 纳氏试剂分光光度法
pH UB-7精密pH计
菌体生物量吸光度OD<sub>600</sub> 采用紫外可见分光光度计在波长600nm处测定
实施例1：
碳源对菌株氨氮降解特性的影响
许多研究表明，碳源是影响微生物异养硝化能力的重要因素之一，通过控制培养基中的碳源(C源)和初始有机碳浓度，可以有效控制氨氮的产生和积累。本实验选取葡萄糖、淀粉、乙酸钠、甘露醇、丁二酸钠和柠檬酸钠作为碳源，另设不加碳源的养殖废水和模拟废水为对照组。
对上述的C源进行等摩尔质量替换，其他成分不变，配制不同碳源的培养基。以2％的接种量，将种子液分别接入装有100mL不同碳源的养殖废水和模拟废水中，其中初始养殖废水和模拟废水的氨氮浓度分别为470mg/L、488mg/L，C/N为10(C/N是指C与N的质量比)、30℃、100rpm，摇床培养72h，每隔24h取样测定NH4 +-N。
碳源对菌株氨氮降解特性影响结果
不同碳源对菌株氨氮降解特性影响结果如图9、10所示：在养殖废水中，仅以淀粉作为碳源时72h的氨氮降解率高于对照组，为78.1％。其中对照组不外加碳源在72h时仍有较高的降解率，说明养殖废水中存在有一定形式的碳源；在模拟废水中，除以甘露醇为唯一碳源外，添加其余五种碳源在72h时均有30％左右的氨氮降解率，说明C5可以利用多种碳源进行生长代谢。无碳源的培养基几乎没有降解，说明C5的生长需要碳源，没有碳源无法生长。综上所述，选取淀粉为C5氨氮降解特性研究的碳源。
实施例2：
C/N对菌株氨氮降解特性的影响
以淀粉为碳源，以2％的接种量将种子液分别接入C/N为0.5、1、3、5、10、20、30的养殖废水和模拟废水中，其中初始养殖废水和模拟废水的氨氮浓度分别为450mg/L、488mg/L，30℃、100rpm，摇床培养72h，每隔24h取样测定NH4 +-N。
C/N对菌株氨氮降解特性影响结果
不同C/N对菌株氨氮降解特性影响结果如图11、12所示：在养殖废水中，当C/N为0.5～30时，均有较高的氨氮降解率，其中C/N为5～20时的氨氮降解效果更好；在模拟废水中，当C/N为10时，氨氮降解率达到最高，为31.8％。在C/N低于5时，氨氮降解率明显降低，在C/N高于10时，其降解效果略有下降。综上所述，一方面，C/N过低导致碳源不足，没有足够的电子流来为菌株生长提供足够的能量，这导致菌株代谢减慢，影响氨氮降解；另一方面，过高的碳源可以抑制细菌的生长，降低氨氮的降解速率。本研究中，C5的C/N适用范围较大，综合考虑各方面因素，养殖废水和模拟废水中的C/N分别选择5和10。
实施例3：
接种量对菌株氨氮降解特性的影响
分别以1％、3％、5％、8％、10％的接种量将种子液接入养殖废水和模拟废水中，另设不加菌的养殖废水和模拟废水为对照组。以淀粉为碳源，其中养殖废水和模拟废水的C/N分别为5和10，初始氨氮浓度分别为500mg/L、488mg/L，30℃、100rpm，摇床培养72h，每隔24h取样测定NH4 +-N。
接种量对菌株氨氮降解特性影响结果
不同接种量对菌株氨氮降解特性影响结果如图13、14所示：在对照实验中，由于养殖废水中原本就有一些细菌，因此不添加C5时仍然有很好的氨氮降解率，而模拟废水中不存在任何细菌，72h仅有10％左右的氨氮降解率，这可能是由于氨氮挥发所致。实验组中，养殖废水和模拟废水均在3％～8％的接种量区间有较高的氨氮降解率，当接种量高于8％时，氨氮降解率呈下降趋势，这可能是由于当接种量较大时，营养物质相对匮乏。当接种量分别为5％和8％时，养殖废水和模拟废水中氨氮降解率达到最高，因此分别选择5％、8％作为养殖废水和模拟废水的最佳接种量。
实施例4：
初始氨氮浓度对菌株氨氮降解特性的影响
将养殖废水用蒸馏水稀释，使得初始氨氮浓度分别为100、200、300、400、500mg/L。调整模拟废水中(NH4)2SO4的含量，按照0.3、0.8、1.3、1.8、2.3g/L加入，对应的氨氮含量分别为64、170、276、382、488mg/L。以淀粉为碳源，养殖废水和模拟废水的C/N分别为5和10，接种量分别为5％和8％，30℃、100rpm，摇床培养72h，每隔24h取样测定NH4 +-N。
初始氨氮浓度对菌株氨氮降解特性影响结果
不同初始氨氮浓度对菌株氨氮降解特性影响结果如图15、16所示：当养殖废水和模拟废水中初始氨氮浓度分别低于200mg/L、170mg/L时，72h时均有98％以上的降解率，说明菌株C5对中低氨氮浓度降解速率快且基本完全。随着初始氨氮浓度升高，降解率呈下降趋势，但在500mg/L左右的氨氮浓度时，72h的氨氮降解率仍在50％左右。
实施例5：
无机盐对菌株氨氮降解特性的影响
养殖废水和模拟废水中分别加入CuCl2、FeCl3、MgCl2、KCl、CoCl2、ZnCl2、MnCl2七种无机盐，以不加无机盐作为对照，确定有助于提高氨氮降解率的无机盐种类。其中，CuCl2、FeCl3、MgCl2、KCl四种无机盐按照1g/L的量添加，CoCl2、ZnCl2、MnCl2三种无机盐按照0.1mg/L添加。以淀粉为碳源，养殖废水和模拟废水的C/N分别为5和10，接种量分别为5％和8％，初始氨氮浓度分别为500mg/L、488mg/L，30℃、100rpm，摇床培养72h，每隔24h取样测定NH4 +-N。
无机盐对菌株氨氮降解特性影响结果
不同无机盐对菌株氨氮降解特性影响结果如图17、18所示：在养殖废水中，与对照组相比，仅添加1g/L FeCl3对氨氮降解有明显的提升作用，1g/L CuCl2对氨氮降解有明显的抑制作用；在模拟废水中，仅添加0.1mg/L MnCl2对氨氮降解有一定提升作用，添加1g/LCuCl2的模拟废水几乎没有氨氮降解。因此，在养殖废水和模拟废水中需添加的无机盐分别为FeCl3和MnCl2。
实施例6：
无机盐浓度对菌株氨氮降解特性的影响
在养殖废水中分别加入0.1、0.5、1、3、5g/L的FeCl3，模拟废水中分别加入0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/L的MnCl2。以淀粉为碳源，养殖废水和模拟废水的C/N分别为5和10，接种量分别为5％和8％，初始氨氮浓度分别为500mg/L、488mg/L，30℃、100rpm，摇床培养72h，每隔24h取样测定NH4 +-N。
无机盐浓度对菌株氨氮降解特性影响结果
无机盐浓度对菌株氨氮降解特性影响结果如图19、20所示：在养殖废水中，少量添加FeCl3可提高氨氮降解率，当加入的FeCl3浓度超过3g/L时，对废水中氨氮降解有明显的抑制作用；在模拟废水中，仅需稍微增加MnCl2的量即可。因此，可在养殖废水和模拟废水中分别添加0.5g/L FeCl3和0.01mg/L MnCl2。
实施例7：
转速对菌株氨氮降解特性的影响
将摇床转速设置为80rpm、120rpm、160rpm、200rpm。以淀粉为碳源，养殖废水和模拟废水的C/N分别为5和10，接种量分别为5％和8％，分别添加0.5g/L FeCl3和0.01mg/LMnCl2，初始氨氮浓度分别为450mg/L、4 88mg/L，30℃摇床培养72h，每隔24h取样测定NH4 +-N。
转速对菌株氨氮降解特性影响结果
转速是细菌在生长过程中获得氧气的能力的反映，细菌会以高速获得更多的氧气，以低速获得较低的氧气。转速对菌株氨氮降解特性影响结果如图21、22所示：转速在160～200rpm时，养殖废水和模拟废水中的氨氮降解率较高，因此选取160rpm转速为后续实验条件。
实施例8：
温度对菌株氨氮降解特性的影响
将摇床温度设置为24℃、28℃、32℃、36℃。以淀粉为碳源，养殖废水和模拟废水的C/N分别为5和10，接种量分别为5％和8％，分别添加0.5g/L FeCl3和0.01mg/L MnCl2，初始氨氮浓度分别为310mg/L、488mg/L，160rpm摇床培养72h，每隔24h取样测定NH4 +-N。
温度对菌株氨氮降解特性影响结果
温度是影响微生物生长的重要因素之一，它主要通过改变酶的活性来影响细胞合成，进而影响微生物的生长和生长物质的吸收利用。温度对菌株氨氮降解特性影响结果如图23、24所示：菌株C5降解氨氮的适宜温度范围较广，其中在养殖废水中，当温度为24℃时氨氮降解率最高，72h时为57.4％，28～36℃时相差不大；在模拟废水中，当温度分别为24℃、28℃时，对应的72h氨氮降解率为77.2％、78.1％。因此，选择24℃作为C5培养温度。
实施例9：
pH对菌株氨氮降解特性的影响
养殖废水和模拟废水中的初始pH分别为7.6、7.8，加入酸或碱将pH调整为5、6、7、8、9。以淀粉为碳源，养殖废水和模拟废水的C/N分别为5和10，接种量分别为5％和8％，分别添加0.5g/L FeCl3和0.01mg/L MnCl2，初始氨氮浓度分别为310mg/L、488mg/L，24℃，160rpm摇床培养72h，每隔24h取样测定NH4 +-N。
pH对菌株氨氮降解特性影响结果
微生物的生长有一定的pH耐受范围。pH对菌株氨氮降解特性影响结果如图25、26所示：pH为5和6时，72h的氨氮降解率较低，说明C5不适合在酸性条件下生长。当pH为9时，养殖废水和模拟废水中的氨氮降解率均达到最高，72h时分别为73.4％、80.8％，说明偏碱性条件更有利于菌株C5降解氨氮。
实施例10：
正交试验
选用5个因素(碳源、C/N、转速、接种量、pH)，每个因素设4个水平，以72h氨氮降解率为依据，检验菌株C5的最适条件及影响因素。利用SPSS软件按照所选的因素和水平设计正交表(表5)。养殖废水和模拟废水的初始氨氮浓度分别为320mg/L、488mg/L，摇床温度设为30℃。
表5正交试验因素水平表
水平 碳源 C/N 转速/rpm 接种量/％ pH
1 淀粉 5 80 3 6
2 乙酸钠 10 120 5 7
3 丁二酸钠 20 160 8 8
4 柠檬酸钠 30 200 10 9
正交试验结果
养殖废水和模拟废水的正交试验结果如表6、7所示：采用极差分析法对试验结果进行分析，养殖废水中，C/N的极差最大，pH次之，接种量的极差最小，因此所考察的5个因素对氨氮降解率影响程度由大到小依次为：C/N＞pH＞转速＞碳源＞接种量，且最优实验条件为：C/N为20，pH为7，转速120rpm，碳源为柠檬酸钠，接种量3％；在模拟废水中，碳源的极差最大，pH次之，C/N的极差最小，因此所考察的5个因素对氨氮降解率影响程度由大到小依次为：碳源＞pH＞转速＞接种量＞C/N。且最优实验条件为：碳源为淀粉，C/N为20，pH为9，转速160rpm，接种量10％。
表6养殖废水的正交试验结果
试验编号 碳源 C/N 转速/rpm 接种量/％ pH 氨氮降解率/％
1 淀粉 5 80 3 6 16.9
2 淀粉 10 120 5 7 95.6
3 淀粉 20 160 8 8 58.3
4 淀粉 30 200 10 9 41.3
5 乙酸钠 5 120 8 9 45.5
6 乙酸钠 10 80 10 8 67.5
7 乙酸钠 20 200 3 7 93.8
8 乙酸钠 30 160 5 6 -1.9
9 丁二酸钠 5 160 10 7 42.2
10 丁二酸钠 10 80 8 6 37.4
11 丁二酸钠 20 200 5 9 68.9
12 丁二酸钠 30 120 3 8 65.5
13 柠檬酸钠 5 200 5 8 41.8
14 柠檬酸钠 10 160 3 9 94.7
15 柠檬酸钠 20 120 10 6 92.8
16 柠檬酸钠 30 80 8 7 64.5
K1 53.0 36.6 46.6 67.7 36.3
K2 51.2 73.8 74.9 51.1 74.0
K3 53.5 78.5 48.3 51.4 58.3
K4 73.5 42.4 61.5 61.0 62.6
极差 22.3 41.9 28.3 16.6 37.7
表7模拟废水的正交试验结果
Figure BDA0002950668020000141
Figure BDA0002950668020000151
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种利用芽孢杆菌处理高氨氮废水的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Bacillus subtilis subsp. stercoris C5的16S rDNA序列
<400> 1
acatgcagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag 60
taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc 120
ggatggttgt ttgaaccgca tggttcaaac ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag 180
atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc aacgatgcgt 240
agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 300
gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga 360
gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt accgttcgaa 420
tagggcggta ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc 480
gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc 540
ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg 600
ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga 660
tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga 720
aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc 780
taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg 840
gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 900
agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac 960
aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020
cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt 1080
tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140
gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacag 1200
aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga 1260
tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320
cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1380
cacccgaagt cggtgaggta accttttagg agccagccg 1419
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 上游引物27F
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 下游引物1492R
<400> 3
tacggttacc ttgttacgac tt 22

Claims (10)

1.一种芽孢杆菌，其特征在于：名称为Bacillus subtilis subsp.stercoris C5，于2021年1月5日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No：61393。
2.一种生物制剂，其特征在于：基于权利要求1所述的芽孢杆菌制备得到。
3.权利要求1所述的芽孢杆菌或权利要求2所述的生物制剂在处理高氨氮废水中的应用。
4.一种利用权利要求1所述的芽孢杆菌处理高氨氮废水的方法，其特征在于：包括以下步骤：
将权利要求1所述的芽孢杆菌种子液接种于高氨氮废水中，震荡反应，完成对高氨氮废水的处理。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述的震荡反应的条件为在温度为24℃～36℃，转速为80rpm～200rpm的条件下震荡反应72～75h；
所述高氨氮废水中的碳源为葡萄糖、淀粉、乙酸钠、甘露醇、丁二酸钠和柠檬酸钠中的至少一种；
所述高氨氮废水的C/N比值为0.5～30，所述高氨氮废水中氨氮的浓度为310mg/L～500mg/L；
所述的芽孢杆菌种子液的接种量为1％～10％v/v。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述的震荡反应的条件为在温度为24℃～32℃，转速为120rpm～200rpm的条件下震荡反应72h；
所述高氨氮废水的C/N比值为0.5～20；
所述的芽孢杆菌种子液的接种量为3％～10％v/v。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述的高氨氮废水包括养殖废水或模拟废水中至少一种；
养殖废水中氨氮的浓度为100mg/L～500mg/L，模拟废水中所述氨氮的浓度为50mg/L～500mg/L；
所述高氨氮废水的pH值为5～9。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述高氨氮废水中的无机盐为FeCl3、MgCl2、KCl、CoCl2、ZnCl2、MnCl2中的至少一种；
所述无机盐浓度为大量元素0.1～5g/L，微量元素0.01～1mg/L。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述芽孢杆菌种子液通过以下方法制得：
将权利要求1所述的芽孢杆菌接种到LB液体培养基中培养至对数期，所得菌悬液离心去除上清液，洗涤后加无菌水，得到芽孢杆菌种子液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述培养的过程为：在温度为30±2℃、转速为80～150rpm下震荡培养68～75h；
加无菌水至菌液OD600为0.6～0.8。
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