CN114806932B - 一种异养硝化-好养反硝化复合菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异养硝化‑好养反硝化复合菌剂及其应用，该复合菌剂包括：不动杆菌(Acinetobacter sp.)YZS‑X1‑1、不动杆菌(Acinetobacter sp.)YZN‑1以及假单胞菌(Pseudomonas sp.)YZD‑2，本发明制备的异养硝化‑好氧反硝化复合菌剂，具有高效的氨氮降解能力和亚硝态氮的降解能力，氨氮含量可降至<0.2mg/mL，亚硝酸盐可降至<0.02mg/mL，且生物安全性高，对环境的适应能力强，可应用于高密度水产养殖中，维持健康、绿色、安全的水体环境。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种异养硝化-好养反硝化复合菌剂及其应用。
背景技术
目前，高密度、集约化已成为我国水产养殖的主要模式，然而，养殖密度的不断提高难以维持养殖系统原有的生态平衡，过多的残饵、粪便无法被水体中的微生物分解利用，导致氨氮、亚硝酸盐等有害物质积累，影响养殖动物健康。我国渔业水质标准规定氨氮浓度应小于0.2mg/L，亚硝酸盐浓度应小于0.1mg/L，超过限定范围将对养殖鱼、虾、蟹等造成危害。因此，提高养殖水质的关键在于控制养殖水体中氮的浓度。
现有技术中，生物脱氮是硝化细菌和反硝化细菌将氨最终转化为N2释放至大气中的过程，是目前在水产养殖中控制氮浓度应用最广泛的技术之一。硝化细菌经硝化作用将氨氧化为亚硝酸盐，并继续氧化为硝酸盐，而后硝酸盐经反硝化菌的反硝化作用还原为N2排放至大气中，最终完成生物脱氮过程。传统的生物脱氮是分别由好氧自养硝化菌、厌氧反硝化菌分两步完成，但自养硝化菌生长速度慢、需氧量高，无法在高有机物浓度的养殖水中形成优势菌种，硝化能力难以显现；另一方面，厌氧反硝化菌需在厌氧或缺氧条件下才能表现出较好的反硝化能力，但水产养殖动物必须在良好的爆气条件下才能正常生长，由此决定了反硝化菌在有氧条件下要进行高效的反硝化作用，从而达到降低氮含量的效果。Robertson等1984年在除硫和反硝化处理系统中首次分离出好氧反硝化菌泛养副球菌(Paracoccus pantotropha)，异养硝化-好氧反硝化细菌的出现表明在好氧情况下可实现同时硝化和反硝化。
相对自养硝化菌，异养硝化菌具有生长速率快、需要的溶解氧浓度低、硝化和反硝化在同一反应器中完成，能够代谢各种形态的氮化合物，同时还可以提高COD的去除率等特点，因此，越来越多异养硝化菌被应用于水产养殖水处理中，如专利号CN 111100811 A公开了一种异养硝化复合菌剂及其应用，该复合菌剂耐受C/N范围为0-200，在此范围内其NH4 +-N去除率高于93.0%，可适应较高浓度有机物，且该复合菌剂可耐受NH4 +-N浓度0-500mg•L-1，氨氮降解能力较强，但该复合菌主要功能是异养硝化作用，仅去除水体中的氨氮；专利号CN110656066 A公开了一株短程硝化反硝化变异不动杆菌菌株及其应用，该发明的短程硝化反硝化变异不动杆菌对总氮、氨氮、硝态氮和亚硝氮具有高效去除能力，可在淡水养殖水体除氮处理中应用，但单一菌株对水产养殖复杂环境的适应能力与复合菌群相比稍显薄弱。
发明内容
鉴于此，本发明针对上述技术问题提供一种异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，所述复合菌剂是基于自主分离筛选纯化获得的三株异养硝化菌，通过菌株复配得到的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，利用该复合菌剂可明显降低养殖水体中氨氮、亚硝态氮的含量，对环境适应能力强，对于解决水产养殖水体氨氮、亚硝态氮超标等富营养化问题，具有良好的应用前景。
本发明提供一种异养硝化-好养反硝化复合菌剂，该复合菌剂包括：不动杆菌（Acinetobacter sp.）YZS-X1-1、不动杆菌（Acinetobacter sp.）YZN-1以及假单胞菌（Pseudomonas sp.）YZD-2；
所述不动杆菌（Acinetobacter sp.）YZS-X1-1，于2014 年8 月6 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：CCTCCNO.M 2014369；
所述不动杆菌（Acinetobacter sp.）YZN-1，于2021年11月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCC NO.62078；
所述假单胞菌（Pseudomonas sp.）YZD-2，于2021年11月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为：GDMCC NO.62077。
进一步的，该复合菌剂由不动杆菌（Acinetobacter sp.）YZS-X1-1、不动杆菌（Acinetobactersp.）YZN -1以及假单胞菌（Pseudomonas sp.）YZD-2按活菌数1~1.5:1~1.5:1~3.0比例接种混合培养制备成种子液。
进一步的，将所述不动杆菌（Acinetobacter sp.）YZS-X1-1、不动杆菌（Acinetobacter sp.）YZN -1以及假单胞菌（Pseudomonas sp.）YZD-2三种混合菌种子液按体积比2-4%接种于营养肉汤液体培养基NB中，25~32℃、溶氧值2~6 mg/L、转速150~220 r/min培养12~24h，获得复合菌剂培养液。
优选地，所述复合菌剂培养温度为30℃、溶氧值为5mg/L、转速为180r/min，培养时间为16h。
优选地，所述营养肉汤液体培养基NB包括：牛肉膏3.0g、NaCl5.0g、蛋白胨10.0g、蒸馏水1.0 L，所述营养肉汤液体培养基NB的pH值为7.0~7.2。
本发明还提供了一种以上所述异养硝化-好养反硝化复合菌剂的应用，将该复合菌剂应用于降低养殖水体中氨氮、亚硝态氮的含量。
优选地，所述异养硝化-好养反硝化复合菌剂在降低养殖水体中氨氮、亚硝态氮中的应用，其作用方式包括以下步骤：
在好氧条件下，所述复合菌剂在养殖水体中经培养24h后，氨氮含量降至<0.2mg/mL、亚硝酸盐降至<0.02mg/mL。
优选地，所述养殖水体以有机碳为碳源，包括葡萄糖、羧甲基纤维素钠、乙酸钠、柠檬酸钠和/或鱼膨化饲料。
优选地，所述好氧条件指培养过程中养殖水体溶氧量为2.0~6.0mg/L。
优选地，降解前，所述养殖水体的氨氮浓度为0~5.0mg/mL、亚硝酸盐浓度为0~5.0mg/mL；
降解时，所述复合菌剂活菌浓度为109~1012CFU/mL，所述养殖水体pH为7.0~7.8，培养温度为25~32℃，C/N比为6~20；
降解后，所述养殖水体包括：残留氨氮浓度为0~0.02mg/mL、残留亚硝酸盐浓度为0~0.01mg/mL。
本发明的有益技术效果至少如下所述：
1）本发明制备的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，具有高效的氨氮降解能力，氨氮降解率高于94.5%，氨氮含量可降至<0.2mg/mL。
2）本发明制备的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，具有高效的亚硝态氮的降解能力，亚硝酸盐可降至<0.02mg/mL，亚硝酸盐降解率可达86.2%。
3）本发明制备的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，溶血率均低于5%，具有较高的生物安全性，可在水产养殖中应用。
4）本发明制备的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，株菌之间均无拮抗作用，菌株复配可明显提高菌剂对环境的适应能力，对不同性质水体的处理能力更强。
5）本发明制备的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂，在降解氨氮的同时可进行反硝化，对处理高密度养殖废水具有较好的应用前景，可应用于高密度水产养殖中，维持健康、绿色、安全的水体环境。
附图说明
图1为本发明一个实施例的复合菌剂中不动杆菌YZN-1的菌落形态；
图2为本发明一个实施例的复合菌剂中不动杆菌YZN-1的菌体形态；
图3为本发明一个实施例的复合菌剂中假单胞菌YZD-2的菌落形态；
图4为本发明一个实施例的复合菌剂中假单胞菌YZD-2的菌体形态；
图5为本发明一个实施例的复合菌剂中不动杆菌YZN-1的16S rRNA基因构建的系统发育进化树；
图6为本发明一个实施例的复合菌剂中三株单菌间的拮抗实验结果；
图7为本发明一个实施例的复合菌剂中三株单菌和复合菌培养24h后NH4 +与NO2 -的残留情况；
图8为本发明一个实施例的复合菌剂对养殖水体中亚硝酸盐和氨氮的降解效率图。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：主要培养基的配制
1）制备微量元素母液：
EDTA•2Na•2H2O 5.39g，ZnSO4 0.3g，MnCl2•4H2O 0.5g，FeSO4•7H2O 0.5g，CuSO4•5H2O 0.2g，CoCl2•6H2O 0.3g，超纯水1L，pH值为7.0~7.4。
2）制备氨氧化培养基①（记作M1，下同）：
NH4Cl 0.020g (NH4 +-N 5.2mg/L) 、乙酸钠0.4g、MgSO4·7H2O 0.01g、KH2PO40.03g、Na2HPO4 0.04g、CaCl2 0.01g，微量元素母液2mL，加超纯水至1L，pH值为7.0~7.4。
3）亚硝酸盐还原培养基②（记作M2，下同）：
NaNO2 0.025g(NO2 --N5.1mg/L) 、乙酸钠0.4g、MgSO4·7H2O 0.01g、KH2PO40.03g、Na2HPO4 0.04g、CaCl2 0.01g，微量元素母液2mL，加超纯水至1L，pH值为7.0~7.4。
4）营养肉汤培养基（NB）：
牛肉膏3.0g、NaCl 5.0g、蛋白胨10.0g、蒸馏水1.0L、pH值为7.0~7.2；
配置以上M1、M2或NB固体培养基，需添加1.5%的琼脂。
实施例2：菌株YZN-1、YZD-2的形态特征与分子生物学鉴定
1）YZN-1的形态特征：菌落形态（如图1）为圆形，呈乳白色，外周边缘平滑，中间隆起，表面光滑；光学显微镜下细胞呈短杆状（如图2）。
2）YZD-2的形态特征：菌落形态（如图3）为圆形，呈白色，外周边缘平滑，表面光滑；光学显微镜下细胞呈杆状（如图4）。
3）利用天根细菌基因组提取试剂盒提取菌株YZN-1和YZD-2的基因组DNA，利用细菌通用引物27F，1492R 扩增菌株YZN-1和YZD-2的16S rDNA 片段，PCR产物送测序公司测序，分析测序结果，将所得序列提交至NCBI数据库进行BLAST检索分析。
4）如上所述的引物对序列为：
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
1492R：TACCTTGTTACGACTT。
5）菌株YZN-1的16S rRNA序列结果如SEQ ID No.1，经序列同源性分析，发现其与Acinetobacterbaylyi OsEnb ALM D22 (MN889365.1)相似度达100%。
如上所述的16S rRNA序列采用软件CLUSTAL_X program (version1.83) 进行比对，使用软件MEGA version 6.0.software绘制进化关系树。采用neighbor-joining计算，并以maximum-parsimony和maximum-likelihood进行验证计算，bootstrap 设置为1000个循环，构建系统发育树，如图5所示。
通过系统发育树分析，可将菌株YZN-1归入Acinetobacterbaylyi簇，且其与YZS-X1-1分属两个不同的不动杆菌簇群。
6）菌株YZD-2的16S rRNA序列结果如SEQ ID No.2，经序列同源性分析其为Pseudomonas sp.。
实施例3：复合菌剂中各单一菌株安全性考察
在菌株应用前需对其进行安全性考察，溶血实验是一种简便、快捷的考察方法，溶血是待测样品对血细胞进行破坏的一种表现，如果菌株发酵液引起水产动物血细胞破裂（溶血率＞5%），表面该菌易导致动物死亡，不可应用于水产养殖中，反之表明该菌的安全性，可在养殖水处理中进行应用。
1.实验流程：
制备红细胞悬液→孵育→观察红细胞的溶血情况→测定吸光度→计算溶血率。
1）制备红细胞悬液：取无菌罗非鱼血1 mL，用生理盐水洗涤后离心(1000rpm离心15min，共3~5次)，至上清液不显示红色为止，将血细胞用50mL生理盐水重悬，制备成2%红细胞悬液。
2）孵育：如表1所示，YZS-X1-1、YZN-1、YZD-2培养液上清作为实验组，以1%Trion100为阳性对照，NB培养基为阴性对照。按表1溶血实验设计添加红细胞量，混匀后，于37℃放置30分钟。
3）观察红细胞的溶血情况：将孵育后的溶液高速离心(10000 rpm，3 min)，取上清液观察。
4）测定吸光度：在570 nm处测定吸光度。
5）计算溶血率：
表1 溶血实验设计
2.实验结果
实验结果如下表2所示。
表2 溶血率统计
| 样品/菌株名称 | 溶血率 |
| YZS-X1-1 | 0.48% |
| YZN-1 | 1.43% |
| YZD-2 | 3.6% |
由表2可知，三株菌发酵液上清溶血率均低于5%，说明该三株菌具有较高的安全性，可在水产养殖中应用。
实施例4：拮抗实验
复合菌剂的菌株之间不应产生拮抗作用，否则不能进行混合培养，利用滤纸片扩散法进行菌株间的相互拮抗测试，对菌株间的拮抗作用予以考察。
将YZS-X1-1、YZN-1、YZD-2三株菌分别培养至对数期，分别取200μL菌液与NB营养琼脂培养基混匀后倒入培养皿中，待培养基冷却凝固后，铺上已灭菌的滤纸片(直径6.0mm)，然后分别滴加20μL另两株菌的菌液，以NB培养基做空白对照，30℃培养24h后观察是否有抑菌圈出现。
结果如图6显示，在分别混有菌液 YZS-X1-1、YZN-1、YZD-2的固体培养基的滤纸片上滴加另两株菌的菌液后，滤纸片周围均有菌生长，NB空白对照（control）周围菌正常生长，均无透明抑菌圈产生，说明此三株菌间均无拮抗作用，可进行混合培养，菌株复配可明显提高菌剂对环境的适应能力。
实施例5：异养硝化复合菌对氨氮、亚硝态氮降解性能的考察
1.实验方法：
1）于NB固体培养基平板上分别挑取YZS-X1-1、YZN-1、YZD-2三株菌株单菌落，于NB液体培养基中活化培养后，分别转接至新鲜培养基培养至对数中期；
2）分别取三种菌液于4℃、4000 rpm条件下离心15min，弃上清，以无菌的生理盐水重悬菌体，并再次在相同条件下离心弃上清，重复该步骤2次，最后以无菌的生理盐水重悬菌体，使OD600均调至约0.8，将YZS-X1-1、YZN-1、YZD-2三株菌悬液按体积比1:1:2混合，得混合菌剂种子液；
3）将混合菌株种子液按3%的体积接入氨氧化培养基M①中，其中C/N比为20，氨氮浓度为5.0 mg/L，pH值约7.2；
4）将混合菌株种子液按3%(v/v)的比例接入亚硝酸盐还原培养基M②，其中C/N比为20，亚硝酸盐浓度为5.0 mg/L，pH值约7.2；
5）以单一菌株做对照，30℃，200 r/min摇床培养，使用市售的氨氮和亚硝酸盐检测试剂盒每12h测定氨氮、亚硝态氮的残留量：取菌液4mL，12000rpm离心2min，上清过滤除菌，分别取3mL单菌培养液上清、复合菌培养液上清和空白培养基按氨氮或亚硝态氮检测试剂盒说明书滴加测定试剂，混匀静置5min后观察颜色变化，颜色越深，代表液体中的氨氮或亚硝态氮浓度越高（亚硝态氮检测限为0.01~0.30mg/L，氨氮检测限为0.20~1.50mg/L）。
2.实验结果：
结果如附图7所示，为复合菌剂及单菌组YZS-X1-1、YZN-1、YZD-2培养24h后培养液上清中亚硝酸盐和氨氮的残余浓度检测结果，其中空白培养基（即空白对照）由于亚硝酸盐或氨氮浓度较高，均为5.0mg/L，因而颜色较深；而复合菌剂和单菌组YZS-X1-1、YZN-1、YZD-2均呈无色透明澄清状，说明均降至检测限以下（亚硝酸盐<0.01mg/mL，氨氮<0.2mg/mL）。
且于M①培养基中生长所得细菌培养液中无亚硝酸盐积累，表明该复合菌剂具有较好的亚硝态氮、氨氮的降解能力，且在降解氨氮的同时可进行反硝化，对处理高密度养殖废水具有较好的应用前景。
实施例6：异养硝化复合菌在水产养殖废水处理中的应用
将YZS-X1-1、YZN-1、YZD-2三株菌种子液按活菌数1:1:2比例混合，后取混合菌液按3%(v/v)的比例接种于3L的NB液体培养基中培养16h，培养温度为30℃，转速180rpm，溶氧量为5mg/L。
分别取80L鱼塘养殖水于三个100L的水桶（作为三个重复），该养殖塘中80%为草鱼，另有部分黄颡鱼、鲫鱼，其中氨氮含量为3.5mg/L，亚硝酸盐含量为0.3mg/L，C/N为8，pH为7.8，盐度18‰。
每桶养殖水中分别加入1L上述混合发酵菌液，持续曝气，每24h监测亚硝酸盐和氨氮的残余量。
结果如图8所示，作用24h后亚硝酸盐及氨氮降解率超过50%，经96h后，亚硝酸盐降解率达86.2%，亚硝酸盐残余量为0.04mg/L；氨氮降解率高于94.5%，残余氨氮低于0.20mg/L，亚硝酸盐与氨氮均降至安全范围内。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州先进技术研究所
<120> 一种异养硝化-好养反硝化复合菌剂及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1401
<212> DNA
<213> 不动杆菌(Acinetobacter sp.)
<400> 1
tgcagtcgag cggagtgatg gtgcttgcac tatcacttag cggcggacgg gtgagtaatg 60
cttaggaatc tgcctattag tgggggacaa catctcgaaa gggatgctaa taccgcatac 120
gtcctacggg agaaagcagg ggatcacttg tgaccttgcg ctaatagatg agcctaagtc 180
ggattagcta gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac gatctgtagc gggtctgaga 240
ggatgatccg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300
ggaatattgg acaatggggg gaaccctgat ccagccatgc cgcgtgtgtg aagaaggcct 360
tatggttgta aagcacttta agcgaggagg aggctctttt ggttaatacc caagatgagt 420
ggacgttact cgcagaataa gcaccggcta actctgtgcc agcagccgcg gtaatacaga 480
gggtgcaagc gttaatcgga tttactgggc gtaaagcgcg cgtaggcggc caattaagtc 540
aaatgtgaaa tccccgagct taacttggga attgcattcg atactggttg gctagagtgt 600
gggagaggat ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc gtagagatct ggaggaatac 660
cgatggcgaa ggcagccatc tggcctaaca ctgacgctga ggtgcgaaag catggggagc 720
aaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgtctactag ccgttggggc 780
ctttgaggct ttagtggcgc agctaacgcg ataagtagac cgcctgggga gtacggtcgc 840
aagactaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 900
ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggc cttgacatag tagaaacttt ccagagatgg 960
attggtgcct tcgggaatct acatacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1020
agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttttc cttacttgcc agcatttcgg 1080
atgggaactt taaggatact gccagtgaca aactggagga aggcggggac gacgtcaagt 1140
catcatggcc cttacggcca gggctacaca cgtgctacaa tggtcggtac aaagggttgc 1200
tacctagcga taggatgcta atctcaaaaa gccgatcgta gtccggattg gagtctgcaa 1260
ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agaatgccgc ggtgaatacg 1320
ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tttgttgcac cagaagtagc 1380
tagcctaact gcaaagaggg c 1401
<210> 2
<211> 1384
<212> DNA
<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp.)
<400> 2
gacgggagct tgctccttga ttcagcggcg gacgggtgag taatgcctag gaatctgcct 60
ggtagtgggg gacaacgttt cgaaaggaac gctaataccg catacgtcct acgggagaaa 120
gcaggggacc ttcgggcctt gcgctatcag atgagcctag gtcggattag ctagttggtg 180
gggtaatggc tcaccaaggc gacgatccgt aactggtctg agaggatgat cagtcacact 240
ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg 300
gcgaaagcct gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatt gtaaagcact 360
ttaagttggg aggaagggca gtaagttaat accttgctgt tttgacgtta ccgacagaat 420
aagcaccggc taactctgtg ccagcagccg cggtaataca gagggtgcaa gcgttaatcg 480
gaattactgg gcgtaaagcg cgcgtaggtg gtttgttaag ttggatgtga aagccccggg 540
ctcaacctgg gaactgcatc caaaactggc aagctagagt acggtagagg gtggtggaat 600
ttcctgtgta gcggtgaaat gcgtagatat aggaaggaac accagtggcg aaggcgacca 660
cctggactga tactgacact gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 720
tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcaact agccgttgga atccttgaga ttttagtggc 780
gcagctaacg cattaagttg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg 840
aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga 900
accttaccag gccttgacat gcagagaact ttccagagat ggattggtgc cttcgggaac 960
tctgacacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1020
cgtaacgagc gcaacccttg tccttagtta ccagcacgta atggtgggca ctctaaggag 1080
actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacgg 1140
cctgggctac acacgtgcta caatggtcgg tacagagggt tgccaagccg cgaggtggag 1200
ctaatctcac aaaaccgatc gtagtccgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagtc 1260
ggaatcgcta gtaatcgcga atcagaatgt cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1320
caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg caccagaagt agctagtcta accttcggga 1380
ggac 1384
Claims (8)
1.一种异养硝化-好养反硝化复合菌剂，其特征在于：由不动杆菌(Acinetobactersp.)YZS-X1-1、不动杆菌(Acinetobacter sp.)YZN-1以及假单胞菌(Pseudomonas sp.)YZD-2组成；
不动杆菌(Acinetobacter sp.)YZS-X1-1、不动杆菌(Acinetobacter sp.)YZN-1以及假单胞菌(Pseudomonas sp.)YZD-2按活菌数1～1.5:1～1.5:1～3.0比例混合制备成种子液；
三种混合菌种子液按体积比2-4％接种于营养肉汤液体培养基NB中，25～32℃、溶氧值2～6mg/L、转速150～220r/min培养12～24h，获得复合菌剂培养液；
所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)YZS-X1-1，于2014年8月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO.M 2014369；
所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)YZN-1，于2021年11月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC NO.62078；
所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)YZD-2，于2021年11月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC NO.62077。
2.根据权利要求1所述的异养硝化-好养反硝化复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂培养温度为30℃、溶氧值为5mg/L、转速为180r/min，培养时间为16h。
3.根据权利要求1所述的异养硝化-好养反硝化复合菌剂，其特征在于：所述营养肉汤液体培养基NB包括：牛肉膏3.0g、NaCl 5.0g、蛋白胨10.0g、蒸馏水1.0L，所述营养肉汤液体培养基NB的pH值为7.0～7.2。
4.一种如权利要求1-3任一项所述异养硝化-好养反硝化复合菌剂的应用，其特征在于：将该复合菌剂应用于降低养殖水体中氨氮、亚硝态氮的含量。
5.根据权利要求4所述的异养硝化-好养反硝化复合菌剂的应用，其特征在于：所述异养硝化-好养反硝化复合菌剂在降低养殖水体中氨氮、亚硝态氮中的应用，其作用方式包括以下步骤：
在好氧条件下，所述复合菌剂在养殖水体中经培养24h后，氨氮含量降至<0.2mg/mL、亚硝酸盐降至<0.02mg/mL。
6.根据权利要求5所述的异养硝化-好养反硝化复合菌剂的应用，其特征在于：所述养殖水体以有机碳为碳源，包括葡萄糖、羧甲基纤维素钠、乙酸钠、柠檬酸钠和/或鱼膨化饲料。
7.根据权利要求5所述的异养硝化-好养反硝化复合菌剂的应用，其特征在于：所述好氧条件指培养过程中养殖水体溶氧量为2.0～6.0mg/L。
8.根据权利要求5所述的异养硝化-好养反硝化复合菌剂的应用，其特征在于：降解前，所述养殖水体的氨氮浓度为0～5.0mg/mL、亚硝酸盐浓度为0～5.0mg/mL；
降解时，所述复合菌剂活菌浓度为109～1012CFU/mL，所述养殖水体pH为7.0～7.8，培养温度为25～32℃，C/N比为6～20；
降解后，所述养殖水体包括：残留氨氮浓度为0～0.02mg/mL、残留亚硝酸盐浓度为0～0.01mg/mL。
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| CN110846254A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-02-28 | 深圳大学 | 用于脱氮的复合微生物菌剂及其制备方法和应用 |
| CN110982732A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-04-10 | 重庆理工大学 | 耐盐耐高氨氮的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂及制备和应用 |
-
2022
- 2022-04-01 CN CN202210348490.9A patent/CN114806932B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Zhang Q等.Performance and microbial ecology of a novel moving bed biofilm reactor process inoculated with heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacteria for high ammonia nitrogen wastewater treatment. .《Bioresour Technol.》.2020,123813. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114806932A (zh) | 2022-07-29 |
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