CN111394272B - 一株侧孢短芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一株侧孢短芽孢杆菌及其应用，该菌株命名为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)HY30，其保藏编号为CCTCC No:M20191101。本发明菌株可以降解水体中氨氮和亚硝态氮，还对副溶血性弧菌、水型点状假单胞菌、白皮假单胞菌及大肠杆菌等淡水养殖致病菌均有较强的抑制效果，因此，本发明菌株可开发应用于淡水养殖净水和抑菌的微生物菌剂，有效预防鱼虾养殖病害的发生，并提高鱼虾产品的质量和产量。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株侧孢短芽孢杆菌及其应用。
背景技术
近年来，随着我国不断地发展、人口不断增多，人们对食物的需求也逐渐提高，水产品以其丰富的营养和鲜美的口味赢得了人们的普遍青睐，成为餐桌上必不可少的食物之一。随之带来的是水产养殖业的蓬勃发展，极大地丰富了人们的物质生活。然而人们为了追求经济效益，一方面养殖密度和频率过高，养殖品种单一，导致养殖水体中自然生态体系的平衡被破坏，自身污染严重；另一方面高蛋白饲料的大量投入和残留以及水产动物排泄物的大量积累导致有害微生物大量繁殖，使养殖水体恶化，养殖病害频繁发生；同时，加之各大工厂污染水源的不正当排放，最终导致养殖区域水质、土壤等环境自净能力减弱，使水产养殖压力越来越大，疾病频发，给养殖者造成了严重的经济损失。
侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)，为革兰氏阳性菌，是一类好氧型芽孢杆菌。该菌在自然界中分布广泛，在土壤、海水、昆虫体内等均有分布。其显著特点是可以产生独木舟状的伴孢体，伴孢体与芽孢紧密相连，当孢囊溶解时，伴孢体会被释放出来。侧孢短芽孢杆菌的生物学功能性与该伴孢体密切相关。侧孢短芽孢杆菌具有杀虫活性、抗菌活性以及促生活性等生物学特性，因此常被作为生物防治的菌株而被广泛应用。当侧孢短芽孢杆菌应用于水产养殖中时，该菌对弧菌、假单胞菌和大肠杆菌等常见的有害细菌具有很强的抑制作用；同时还能分解养殖池中的残饵、粪便、有机物等，消除蓝藻，净化水质。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一株侧孢短芽孢杆菌及其应用，所述侧孢短芽孢杆菌筛选自武汉合缘绿色生物公司水体污染较严重、鱼虾发病率较高的养殖池，经试验表明该侧孢短芽孢杆菌具有改善淡水养殖水质以及预防和减少鱼虾病害的发生同时还能促进鱼虾生长等作用。
本发明的技术方案是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一株侧孢短芽孢杆菌，分类命名为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)HY30，已于2019年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，地址为中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏号为CCTCC No:M20191101。
第二方面，本发明提供了侧孢短芽孢杆菌HY30在拮抗淡水养殖致病菌中的应用，包括拮抗副溶血性弧菌、水型点状假单胞菌、白皮假单胞菌或大肠杆菌等致病菌的应用。
第三方面，本发明提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂中包含侧孢短芽孢杆菌HY30。
第四方面，本发明提供了一种所述微生物菌剂的制备方法，包括将侧孢短芽孢杆菌HY30在牛肉膏蛋白胨培养基中30℃、180r/min振荡培养至对数生长中期，获得种子液，然后将种子液接种于发酵培养基中扩大培养，获得微生物菌剂。具体地，种子液的接种量按体积百分量计为3％-5％，发酵条件为发酵温度30℃，转速180r/min，通气量0-0.25cm3/h，发酵时间20-30h。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述发酵培养基成分具体为葡萄糖 20.0g/L、酵母膏10.0g/L、MnSO4 0.2g/L、CaCl2 0.3g/L、KH2PO4 0.1g/L、MgSO4 0.05g/L，pH为7.0。
在以上技术方案的基础上，优选的，侧孢短芽孢杆菌HY30的活菌浓度至少为1.08×109cfu/mL。
第五方面，本发明提供了本发明第三方面所述微生物菌剂在淡水养殖中的应用，包括在淡水养殖中去除水体中氨氮、亚硝态氮的应用以及在减少鱼虾病害、增加鱼虾产量中的应用。
本发明的侧孢短芽孢杆菌及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明从水质污染较严重、鱼虾发病率较高的养殖池中筛选到侧孢短芽孢杆菌HY30，其对淡水养殖中的副溶血性弧菌、水型点状假单胞菌、白皮假单胞菌及大肠杆菌等常见致病菌具有较好的抑制效果，克服目前淡水养殖中疫病频发和抗生素滥用的问题；
(2)用本发明筛选到的侧孢短芽孢杆菌HY30制备的微生物菌剂投入淡水养殖池塘里，可以高效降解氨氮、亚硝态氮，改善淡水养殖水质，减少鱼虾病害的发生同时还能促进鱼虾生长。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1、侧孢短芽孢杆菌的筛选及鉴定
S1、实验材料
水样品来自武汉合缘绿色生物公司鱼虾养殖基地，从水质污染较严重、鱼虾发病率较高的养殖池中采集而来。
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3g、蛋白胨8g、氯化钠4g，用蒸馏水定容至1000mL，pH7.5；牛肉膏蛋白胨固体培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入18g/L琼脂。培养基在使用前，用121℃高压蒸汽灭菌20min。
病原菌以副溶血性弧菌、水型点状假单胞菌、白皮假单胞菌及大肠杆菌为代表，均由华中农业大学水产学院惠赠。
S2、菌株初筛
取水样品通过梯度稀释法涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，倒置于 28℃培养箱中培养。培养3天后，挑取不同形态特征的单菌落在牛肉膏蛋白胨固体培养基上三区划线培养，重复分离纯化3次，最后共筛选得到48株不同形态的菌株，分别编号为HY01-HY48。
S3、抑菌实验复筛
采用菌斑抑制法，在牛肉膏蛋白胨固体培养基平板中央的周围对角线打四个直径为10mm小孔，移去培养基，分别接入4种不同的病原菌菌斑。分别在所述平板中央点种48株初筛菌HY01-HY48，放入28℃培养。逐日记录筛选菌与4种病原菌生长情况以及拮抗抑制作用。使用菌斑抑制法，测定抑菌圈直径以后，筛选出4株抑菌圈较大的菌株，编号分别为HY01、HY15、HY23、HY30。然后对这4株菌株继续做抑菌实验，每株菌株设3个重复，将平板放置28℃培养，72h后测定抑菌圈的直径。结果如表1所示，综合来看，对4种病原菌抑制效果皆较好的为菌株HY30，它对4种病原菌的抑菌圈直径皆位于前列，从而可以说明，本发明筛选到的菌株HY30的抑菌效果最佳。
表1筛选菌株对4种病原菌的抑制作用
S4、菌株鉴定
经过初筛和复筛，将得到的菌株HY30送到农业部微生物产品质量监督检验测试中心(武汉)进行生理生化特征测定。菌株HY30革兰氏染色镜检呈阳性，细胞杆状，有独舟状侧孢，椭圆形，孢囊膨大。在营养琼脂培养基上，菌落为圆形，较小，淡黄色，边缘整齐，表面湿润光滑，无褶皱，半透明。生理生化特性鉴定结果如表2。
表2菌株HY30生理生化特征
| 测定项目 | 测定结果 | 测定项目 | 测定结果 |
| 接触酶 | + | 厌氧生长 | + |
| V-P测定 | - | 硝酸盐还原 | + |
| 淀粉水解 | - | 氧化酶 | + |
| 酪元水解 | + | 柠檬酸盐利用 | - |
| 卵黄卵磷脂水解 | - | L-阿拉伯糖产酸 | - |
| D-木糖产酸 | + | 葡萄糖产酸 | + |
| D-甘露醇产酸 | - | 蔗糖产酸 | + |
| 2％氯化钠生长 | + | 7％氯化钠生长 | - |
采用分子生物学的方法对菌株HY30进行鉴定，测得其16S rDNA序列，如序列表中SEQ ID NO.1所示，在GenBank核酸数据库中进行BLAST比对，构建菌株HY30的系统发育进化树，菌株HY30的16S rDNA序列与登录号 CP017705.1(Brevibacillus laterosporus DSM25)序列同源性达100％。通过菌株 HY30的生理生化特征和系统发育进化地位等鉴定结果，最终把菌株HY30鉴定为侧孢短芽孢杆菌HY30(Brevibacillus laterosporus HY30)。
菌株HY30已于2019年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Centerfor Type Culture Collection，简称CCTCC)，地址为中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏号为CCTCC No:M20191101。
实施例2、微生物菌剂的制备
将本发明侧孢短芽孢杆菌HY30在牛肉膏蛋白胨固体培养基上活化后的单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、180r/min条件下振荡培养至对数生长中期，得到种子液。
本发明选取了葡萄糖、蔗糖、淀粉和玉米淀粉作为碳源备选；选取尿素、牛肉膏、工业蛋白胨及酵母膏作为氮源备选，通过单因子优化和正交试验证实，此侧孢短芽孢杆菌HY30最适发酵培养基为：葡萄糖20.0g/L，酵母膏10.0g/L， MnSO4 0.2g/L，CaCl2 0.3g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4 0.05g/L。
在5L的发酵罐中使用相同配方的发酵培养基，发酵条件为：灭菌的发酵培养基投入量3L，初始pH值7.0，按体积百分量接入种子液3％-5％，培养温度 30℃，转速180r/min，通气量为0-0.25cm3/h，发酵时间为20-30h。最终培养液中活菌数为≥1.08×109cfu/mL，制得微生物菌剂。
实施例3、微生物菌剂在淡水养殖中的应用
S1、水质改良效果检测
取有机质含量较高的鱼虾养殖池废水，混匀后分装于8L塑料桶中，每桶4L，试验组加入实施例2所述微生物菌剂稀释108倍的剂量40mL，对照组加40mL 灭菌水，静置，分别在0h、4h、8h、12h、25h、30h、35h、45h测定对照组与试验组水样的pH值、亚硝酸盐以及氨氮含量值，每组试验重复3次，结果如表 3所示，表3中数据为三次重复试验的平均值。
表3水质改良效果检测结果表
如表3所示，对照组水样pH值较高且数值较为稳定，试验组水样pH先持续下降，尤其是8h后，pH急剧下降，25h后又逐渐有回升趋势，但相对对照组来说，pH值偏低。对照组的氨氮质量浓度维持在11mg/L左右，而试验组的氨氮质量浓度在8h后急剧下降，之后随着时间的延长，含量有所上升。对照组的亚硝酸盐浓度基本稳定在38μmoL/L，而试验组的亚硝酸浓度4h之后急剧下降，至12h时，亚硝酸盐移除率达到约98％。以上结果表明，侧孢短芽孢杆菌HY30 在水质改良应用上具有良好的效果。
S2、预防鱼、虾病害及促生长效果检测
表4微生物菌剂应用于小龙虾养殖的试验结果
| 处理 | 小龙虾存活率(％) | 小龙虾产量(kg/亩) | 小龙虾重量(尾/kg) |
| 对照组 | 76.8 | 28.72 | 56.5 |
| 试验组1 | 95.6 | 75.28 | 29.2 |
| 试验组2 | 96.2 | 74.36 | 30.1 |
| 试验组3 | 96.7 | 76.93 | 28.5 |
表5微生物菌剂应用于草鱼养殖的试验结果
| 处理 | 草鱼存活率(％) | 草鱼产量(kg/亩) | 草鱼均重(kg/尾) |
| 对照组 | 75.3 | 568.62 | 1.35 |
| 试验组1 | 85.6 | 758.25 | 3.24 |
| 试验组2 | 86.2 | 755.83 | 3.32 |
| 试验组3 | 85.8 | 757.45 | 3.28 |
表4和表5中，对照组为不添加本发明微生物菌剂的正常养殖池，试验组1、 2、3为添加本发明实施例2微生物菌剂的养殖池，每亩养殖池投入1kg菌剂。表4为小龙虾养殖1个月后测量结果，表5为草鱼养殖5个月后测量结果，由此看出，利用本发明微生物菌剂培育后，从成活率高的数据可以推断出鱼、虾的免疫力提高从而发病率减少了，且小龙虾亩产超过150斤，草鱼亩产也超过 1500斤。这些说明本发明的微生物菌剂的添加有效提高了鱼、虾养殖效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉合缘绿色生物股份有限公司
<120> 一株侧孢短芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 1
cctaatacat gcaagtcgag cgagggtctt cggaccctag cggcggacgg gtgagtaaca 60
cgtaggcaac ctgcctgtga gactgggata acatagggaa acttatgcta ataccggata 120
gggttttgct tcgcctgaag cgaaacggaa agatggcgca agctatcact tacagatggg 180
cctgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg 240
acctgagagg gtgaccggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 300
agcagtaggg aattttccac aatggacgaa agtctgatgg agcaacgccg cgtgaacgat 360
gaaggctttc gggtcgtaaa gttctgttgt tagggaagaa acagtgctat ttaaataagg 420
tagcaccttg acggtaccta acgagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480
aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggtggcta 540
tgtaagtctg atgttaaagc ccgaggctca acctcggttc gcattggaaa ctgtgtagct 600
tgagtgcagg agaggaaagt ggtattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga 660
ggaacaccag tggcgaaggc gactttctgg cctgtaactg acactgaggc gcgaaagcgt 720
ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaggtg 780
ttaggggttt caataccctt agtgccgcag ctaacgcaat aagcactccg cctggggagt 840
acgctcgcaa gagtgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900
tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatccca ctgaccgctc 960
tagagataga gcttcccttc ggggcagtgg tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc 1020
gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatctt tagttgccag 1080
cattcagttg ggcactctag agagactgcc gtcgacaaga cggaggaagg cggggatgac 1140
gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg ttggtacaac 1200
gggatgctac ttcgcgagaa gatgctaatc tcttaaaacc aatctcagtt cggattgtag 1260
gctgcaactc gcctacatga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1320
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgggagttt gcaacacccg 1380
aagtcggtga ggtaaccgta aggagccagc cgccgaaggt gg 1422
Claims (7)
1.一株侧孢短芽孢杆菌，其特征在于：所述侧孢短芽孢杆菌为侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）HY30，其保藏号为CCTCC No:M20191101。
2.权利要求1所述的侧孢短芽孢杆菌在拮抗淡水养殖致病菌中的应用，所述淡水养殖致病菌为副溶血性弧菌、水型点状假单胞菌、白皮假单胞菌或大肠杆菌。
3.一种微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂包含权利要求1所述侧孢短芽孢杆菌。
4.一种权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：将所述侧孢短芽孢杆菌在活化培养基中振荡培养至对数生长中期，获得种子液，然后将种子液接种于发酵培养基中扩大培养，获得微生物菌剂。
5.如权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基成分具体为葡萄糖20.0g/L、酵母膏10.0g/L、MnSO4 0.2g/L、CaCl2 0.3g/L、KH2PO4 0.1g/L、MgSO40.05g/L，pH为7.0。
6.如权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述侧孢短芽孢杆菌的活菌浓度至少为1.08×109cfu/mL。
7.权利要求3所述的微生物菌剂在淡水养殖中的应用，所述淡水养殖中的应用为淡水水质改良或者鱼、虾促生长。
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