CN109837230A - 解淀粉芽孢杆菌y1711、培养方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌Y1711、培养方法及其应用，所述解淀粉芽孢杆菌Y1711为Bacillus amyloliquefaciens Y1711，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2018356，保藏日期为2018年06月11日。本发明公开的解淀粉芽孢杆菌Y1711能使养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐明显降低，使有益绿藻的生长速度有明显提高，从而形成一个良性的循环，且对人畜无害，可规模化生产用于改善水产养殖环境。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌Y1711、培养方法及其应用。
背景技术
随着我国水产养殖面积的不断增加，养殖废水排放及由残饵、粪便、生物残骸形成的有机淤泥堆积，使养殖水体有机污染不断加重，养殖生态环境质量逐年恶化。一些养殖水体水质严重老化，水体中的氨氮、亚硝酸盐等养殖参数持续恶化；有益藻类活动程度大为减少，老化和死水的情况日益严重。芽孢杆菌是利用微生物修复养殖环境的常用益生菌，其中解淀粉芽孢杆菌在繁殖过程中分泌大量的淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶，能迅速降解残饵粪便中的淀粉、脂肪和蛋白，从而起到净化水体的作用。比如中国专利CN106479921A，《高效净化养殖污水的解淀粉芽孢杆菌及其应用》公开了一种保藏号为CGMCC NO.12123的解淀粉芽孢杆菌，其具有强的胞外蛋白酶活性，可以降解养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐，来达到净化水质的目的。
养殖水体中的有益绿藻的光合作用可以产生氧气，能提高水体中溶氧量，为水中动物的生长提供氧气。虽然专利CN106479921A公开的解淀粉芽孢杆菌可以降解养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐，但是无法促进有益绿藻的生长。因此，我们需要开发一种既能降解养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐，又能促进有益绿藻的生长的微生物。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供的一种解淀粉芽孢杆菌Y1711、培养方法及其应用，开发了一种既能降解养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐，又能促进有益绿藻的生长的微生物。
本发明的第一个目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌Y1711，所述解淀粉芽孢杆菌Y1711为Bacillus amyloliquefaciens Y1711，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2018356，保藏日期为2018年06月11日；所述解淀粉芽孢杆菌Y1711既能降解养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐，又能促进有益绿藻的生长。
本发明第二个目的是提供一种所述解淀粉芽孢杆菌Y1711的培养方法，解淀粉芽孢杆菌Y1711用营养琼脂液体培养基在37℃培养24～36h。
本发明的第三个目的是提供一种所述的解淀粉芽孢杆菌Y1711在净化养殖水体中的应用。
优选的，上述应用中，将所述解淀粉芽孢杆菌Y1711用于降解养殖水体中氨氮和亚硝酸盐。
优选的，上述应用中，降解养殖水体中氨氮和亚硝酸盐时，解淀粉芽孢杆菌Y1711的用量为105～106cfu/亩。
优选的，上述应用中，将所述解淀粉芽孢杆菌Y1711用于制备养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的降解制剂。
本发明的第四个目的是提供一种所述的解淀粉芽孢杆菌Y1711在促进有益绿藻生长中的应用。
优选的，上述应用中，将所述解淀粉芽孢杆菌Y1711用于制备绿藻生长促进剂。
优选的，上述应用中，所述有益绿藻为小球藻、栅藻、月牙藻。
与现有技术相比，本发明提供的一种解淀粉芽孢杆菌Y1711、培养方法及其应用，具有以下有益效果：
本发明提供的一种能净化水质的解淀粉芽孢杆菌Y1711，其能使养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐明显降低，使有益绿藻的生长速度有明显提高，从而形成一个良性的循环，且对人畜无害，可规模化生产用于改善水产养殖环境。
生物材料保藏信息说明
Bacillus amyloliquefaciens Y1711，在本申请中也称作解淀粉芽孢杆菌Y1711，已于2018年06月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018356，保藏单位地址是中国武汉武汉大学，邮编430072，分类命名为Bacillusamyloliquefaciens Y1711。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。本发明以下实施例中，若没有特殊说明，所用试剂皆可在市场上购买得到，若没有特殊说明，所涉及的方法皆为常规方法。
本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌Y1711，所述解淀粉芽孢杆菌Y1711为Bacillusamyloliquefaciens Y1711，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M2018356，保藏日期为2018年06月11日。
实施例1解淀粉芽孢杆菌Y1711的分离筛选
取样：在高氨氮的养殖池塘中选取3个不同取样点取底泥，将其装入无菌的自封袋封好后带回。
分离：将底泥用无菌水以1g:10mL的比例稀释，80℃水浴处理10min后，吸取200μl菌液在淀粉培养基平板上涂布，37℃培养。
纯化：平板培养24h后，挑取产生水解圈的菌株在营养琼脂培养基上划线培养，然后挑选菌落边缘不整齐、表面干燥有褶皱的单菌继续划线分纯，直到得到纯培养物。
筛选：将纯化后的菌株再次接种到淀粉培养基平板上，测量菌落直径(C)和水解圈直径(H)。挑选H/C大的菌株命名为解淀粉芽孢杆菌Y1711用于菌种鉴定。
实施例2解淀粉芽孢杆菌Y1711的鉴定
1、形态学鉴定和生理生化特性检测
将解淀粉芽孢杆菌Y1711接种到营养琼脂平板上，37℃培养24h，观察菌落生长情况，挑取菌体进行革兰氏染色，观察菌体形态和芽孢生成情况。根据伯杰细菌手册进行生理生化特性检测。
在营养琼脂平板上，菌株边缘不整齐，表面干燥且有褶皱；革兰氏阳性，菌体杆状，芽孢中生，胞囊膨大。该菌株硝酸盐试验、接触酶试验、淀粉水解、D甘露醇产酸试验均为阳性。
2、分子生物学鉴定
挑取解淀粉芽孢杆菌Y1711单菌落接种于营养肉汤培养基中37℃、200rpm振荡培养6h，采用DNA提取试剂盒(生工生物工程上海有限公司)提取细菌基因组。
利用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物送至生工生物工程上海有限公司完成测序。
获得的基因序列如下所示：
ATGTTAGCGCTGAGACCATGTGAGTACTCTTGGGTAACCAGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATTTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTTTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTTTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAG
该序列(参见SEQ ID NO.1)与解淀粉芽孢杆菌与NCBI上的已有序列进行BLAST，发现与解淀粉芽孢杆菌FJAT-30602、解淀粉芽孢杆菌FJAT-18107的序列相似性为99％。结合菌株的形态学特征和基因序列比对结果，最终将菌株Y1711鉴定为建淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。
实施例3解淀粉芽孢杆菌Y1711的实验室水质净化功能测定
室内配制模拟养殖水，所述模拟养殖水采用虾饵料浸泡液、硝酸铵、磷酸氢二钾、亚硝酸钠配制而成，再用海水晶调节盐度为15，pH7.8±0.5,。模拟养殖水中氨氮的总含量为7.79mg/L，亚硝酸盐的总含量为1.03mg/L。
向模拟养殖水中加入解淀粉芽孢杆菌Y1711菌液，使其中的含菌量为106cfu/亩，加菌液前及加菌液后的第1、2、3、5、7天取水测量水中氨氮、亚硝酸盐含量，数据如下表1所示。
解淀粉芽孢杆菌Y1711菌液培养方法如下：营养琼脂液体培养基，37℃培养24～36h。
表1实施例3菌液添加施用效果
| 天数 | 氨氮(mg/L) | 亚硝酸盐(mg/L) |
| 加菌前 | 7.79 | 1.03 |
| 第1天 | 6.25 | 0.56 |
| 第2天 | 4.94 | 0.14 |
| 第3天 | 1.10 | 0.01 |
| 第5天 | 0.44 | 0.01 |
| 第7天 | 0.15 | 0.01 |
从上表1中可以看出该解淀粉芽孢杆菌Y1711菌在试验第7天基本能将水中氨氮和亚硝酸盐完全降解。
实施例4解淀粉芽孢杆菌Y1711的试验鱼塘水质净化功能测定
1、试验鱼塘：江苏省淮安市涟水县涟城镇，试验养殖水面2亩，水深1.5米，施用前，水体氨氮、亚硝酸盐偏高。
2、养殖品种：草鱼。
3、试验方法：向鱼塘中加入解淀粉芽孢杆菌Y1711菌液，使其中的含菌量为106cfu/亩，当天夜间开启增氧机配合。加菌液前及加菌液后的第1、2、3、5、7天取水测量水中氨氮、亚硝酸盐含量数据如下表2所示。
表2实施例4菌液施用效果
从上表2可以看出，施用该解淀粉芽孢杆菌Y1711菌液后2天氨氮和亚硝酸盐即有明显下降，3天后基本完全降解。
实施例5解淀粉芽孢杆菌Y1711的促进藻类生长作用
实验室内培养小球藻、栅藻、月牙藻，分别向其中加入菌液，使其中的含菌量为105cfu/亩，加菌液前及加菌液后的第1、2、3、5天取藻液于OD680检测藻浓度，同时分别以不添加解淀粉芽孢杆菌Y1711菌液的小球藻、栅藻、月牙藻为空白对比，数据如下表3所示。
表3实施例5菌液施用效果
从上表3可以看出，施用该解淀粉芽孢杆菌Y1711菌液后，三种绿藻生长速度明显提高。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 中国科学院水生生物研究所
<120> 解淀粉芽孢杆菌Y1711、培养方法及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1380
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<400> 1
atgttagcgc tgagaccatg tgagtactct tgggtaacca gcctgtaaga ctgggataac 60
tccgggaaac cggggctaat accggatggt tgtttgaacc gcatggttca gacataaaag 120
gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac 180
ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg 240
agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag 300
tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta 360
gggaagaaca agtgccgttc aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca 420
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta 480
ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac 540
cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg 600
tgtagcggtg aaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaagc gactctctgg 660
tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta 720
gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag 780
ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt 840
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct 900
taccaggtct tgacatcctt tgacaatcct agagatagga cgtccccttc gggggcagag 960
tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1020
acgagcgcaa cccttgattt tagttgccag cattcagttg ggcactttaa ggtgactgcc 1080
ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1140
ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc 1200
ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tttgcaactc gactgcgtga agctggaatc 1260
gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1320
ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt taggagccag 1380
Claims (9)
1.一种解淀粉芽孢杆菌Y1711，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌Y1711为Bacillusamyloliquefaciens Y1711，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M2018356，保藏日期为2018年06月11日；所述解淀粉芽孢杆菌Y1711既能降解养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐，又能促进有益绿藻的生长。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌Y1711的培养方法，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌Y1711用营养琼脂液体培养基在37℃培养24～36h。
3.一种权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌Y1711在净化养殖水体中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述解淀粉芽孢杆菌Y1711用于降解养殖水体中氨氮和亚硝酸盐。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，降解养殖水体中氨氮和亚硝酸盐时，解淀粉芽孢杆菌Y1711的用量为105～106cfu/亩。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述解淀粉芽孢杆菌Y1711用于制备养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的降解制剂。
7.一种权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌Y1711在促进有益绿藻生长中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述解淀粉芽孢杆菌Y1711用于制备绿藻生长促进剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述有益绿藻为小球藻、栅藻、月牙藻。
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