CN112111435A - 一种芽孢杆菌nb-1及其培养方法和应用 - Google Patents

一种芽孢杆菌nb-1及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种芽孢杆菌NB‑1及其培养方法和应用，所述芽孢杆菌NB‑1为芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB‑1，于2020年07月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020304；所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB‑1用LB液体培养基在30℃下培养24h；所述芽孢杆菌NB‑1芽孢杆菌NB‑1用于降解养殖水体和养殖尾水中的氨氮和亚硝酸盐浓度。本发明的芽孢杆菌NB‑1能使养殖水体和养殖尾水中的氨氮、亚硝酸盐明显降低，且对人和养殖动物无害，不产生二次污染，可规模化生产应用于改良水产养殖环境和养殖尾水减量排放。

Description

一种芽孢杆菌NB-1及其培养方法和应用
【技术领域】
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种同时具备具有氨氮和亚硝酸盐降解功能的芽孢杆菌NB-1及其培养方法和应用。
【背景技术】
我国是水产养殖大国，养殖产量约占世界养殖产量的68%，其中，池塘养殖产量约占45%。养殖过程中由于大量投喂饲料，导致氮元素在水中的积累，也是养殖水体恶化的主要原因之一，其中氨氮和亚硝酸盐是危害水产养殖水质及养殖动物最严重的水质理化因子，对养殖动物具有很强的毒性。氨氮会影响养殖动物体内的酶反应和细胞膜的稳定，还会影响鳃对氧的传递性，破坏水生动物的排泄系统和渗透平衡。亚硝酸盐是水环境生态系统循环中的一种中间产物，是诱发水产动物爆发性疾病的重要环境因子。而在局部缺氧环境中，硝酸盐会被转化为亚硝酸盐，亚硝酸盐的致癌性使得原本毒性很小的污染物毒性增强，造成水质恶化，伴随着滋生大量的病毒、细菌、浮游生物等微生物。氨氮和亚硝酸盐浓度过高时容易导致鱼虾大批患病甚至死亡，严重影响水质和水产品安全。另一方面，我国的池塘养殖尾水基本未经处理直接排放，由于养殖尾水中一般都含有较高的氮和磷，导致了对周边水域环境不同程度的富营养化污染。为改良养殖水质、减少养殖病害发生、减少养殖动物应激、确保养殖安全和保护周边水域生态环境，很多水产养殖者都通过选择采用微生物制剂来降解水中的氨氮和亚硝酸盐，促进改善水体环境，缓解水质恶化产生的经济损失及环境污染。芽孢杆菌是利用微生物修复养殖环境的常用益生菌。众多研究发现，从养殖废水或养殖污泥中筛选出的土著微生物的脱氮性能更加高效。然而，当前降解氨氮和亚硝酸盐的微生物制剂产品，普遍存在生产应用成本偏高、降解处理效率偏低和处理效果稳定性较差等问题。
现有中国公开专利，专利号为：CN200610011604.1、 CN201810782000.X 、CN201811325758.7以及CN201910309817 .X，均公开了不同类型的芽孢杆菌，但存在以下问题1、接种量高，2、一种类型芽孢杆菌菌株仅能有效降解氨氮和亚硝酸盐氮中的一种，无法达到二者同时有效降解，3、氨氮和亚硝酸盐降解效果均较低。因此，急需开发一种既能高效地降解养殖水体和养殖尾水中的氨氮和亚硝酸盐，又能提高处理效果稳定性和降低使用成本的益生菌。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种芽孢杆菌NB-1及其培养方法和应用，该菌株既能同时高效地降解养殖水体、养殖尾水中的氨氮和亚硝酸盐，又能提高处理效果稳定性和降低使用成本，具有运行成本较低，不产生二次污染等优点。
本发明是这样实现的：
本发明的第一个目是提供一种芽孢杆菌NB-1，所述芽孢杆菌NB-1为芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1，于2020年07月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2020304。
本发明的第二个目是提供一种芽孢杆菌NB-1的培养方法，所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1用LB液体培养基在30℃下培养24h。
本发明的第三个目是提供一种芽孢杆菌NB-1的应用，所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1在改良养殖水体和养殖尾水减量排放中的应用。
优选的，上述应用中，将所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1用于降解养殖水体和养殖尾水中的氨氮和亚硝酸盐浓度。
优选的，上述应用中，所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1在降解养殖水体中氨氮和亚硝酸盐时，芽孢杆菌NB-1的用量为104 cfu/mL；降解养殖尾水中氨氮和亚硝酸盐时，芽孢杆菌NB-1的用量为105 cfu/ mL。
本发明的第四个目是提供一种芽孢杆菌NB-1的应用之二，所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1用于制备养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的降解制剂。
本发明的第五个目是提供一种芽孢杆菌NB-1的应用之三，将所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1用于制备养殖尾水中氨氮和亚硝酸盐的降解制剂。
本发明具有如下优点：
本发明提供的一种能净化水质的芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1，该芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1属于自养菌，具有同时降解氨氮和亚硝酸盐的能力，进行硝化反应时不消耗水中的碳源，并且接种量低且降解氨氮和亚硝酸盐效果好，能使养殖水体和养殖尾水中的氨氮、亚硝酸盐明显降低，且对人和养殖动物无害，不产生二次污染，可规模化生产应用于改良水产养殖环境和养殖尾水减量排放。
【具体实施方式】
本发明涉及一种芽孢杆菌NB-1，所述芽孢杆菌NB-1为芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1，于2020年07月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2020304。
本发明还涉及一种芽孢杆菌NB-1的培养方法，所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1用LB液体培养基在30℃下培养24h。
本发明也涉及一种芽孢杆菌NB-1的应用，所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1在改良养殖水体和养殖尾水减量排放中的应用。具体的，将所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1用于降解养殖水体和养殖尾水中的氨氮和亚硝酸盐浓度。
所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1在降解养殖水体中氨氮和亚硝酸盐时，芽孢杆菌NB-1的用量为104 cfu/mL；降解养殖尾水中氨氮和亚硝酸盐时，芽孢杆菌NB-1的用量为105 cfu/ mL。
本发明涉及一种芽孢杆菌NB-1的应用之二，所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1用于制备养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的降解制剂。
本发明涉及一种芽孢杆菌NB-1的应用之三，将所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1用于制备养殖尾水中氨氮和亚硝酸盐的降解制剂。
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1、芽孢杆菌NB-1的分离筛选
取样：从福建省厦门市集美区集美大学水产试验场鳗鱼养殖车间的鳗鲡养殖池水体中设置的生物膜净水栅上，用无菌剪刀剪下10g生物膜净水栅尼龙丝，装入盛有100mL无菌水的蓝盖瓶中，超声波震荡30min后获得菌悬液。
富集：将菌悬液按10%比例接入无菌的富集培养基中，30℃，180r/min恒温振荡培养，每天加入5%的亚硝酸钠溶液2mL，富集培养1周。
富集培养基(g/L)：葡萄糖5、氯化钠0.1、亚硝酸盐0.2、硫酸镁0.02、磷酸二氢钾4、磷酸氢二钾6，单蒸馏水配制，pH7.4，121℃灭菌30min。
分离纯化：取0.1mL经富集培养后的菌悬液，用无菌水以10倍稀释法分别稀释到10-3，10-4，10-5等。后取0.1mL稀释液涂布于普通肉汤固体培养基上，每个稀释浓度分别涂布3个平板，在恒温培养箱（30℃）中培养24h，待普通肉汤固体培养基上长出菌落。选择菌落数量合适的培养基平板，刮取单菌落接种于新鲜的普通肉汤固体培养基上，重复3次。直到得到纯培养物。
普通肉汤固体培养基：牛肉膏0.5％ ，蛋白胨1％ ，氯化钠 0.5％ ，琼脂1％ ，单蒸馏水配制，pH7.4，121℃灭菌30min。
筛选和保藏：取分离纯化后得到的单菌落菌株置于装有50mL普通肉汤培养基中，80℃水浴加热处理30min，杀死微生物营养体细胞。然后30℃，180r/min恒温振荡培养24h，将增殖培养液置于80℃水浴加热30min，再次杀死不形成芽孢的营养体细胞。取1mL处理液以梯度稀释法分别稀释到10-3，10-4，10-5等。分别取0.1mL菌液涂布于普通肉汤固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养24h后，挑选单菌落，划线接种至普通肉汤固体培养基中培养24h，并分离纯化三次。接种至斜面普通肉汤固体培养基中培养并4℃保藏，备用。
普通肉汤培养基(g/L)：牛肉膏5、蛋白胨10、氯化钠5，单蒸馏水配制，pH7.4，121℃灭菌30min。
实施例2、芽孢杆菌NB-1的鉴定
挑取上述保藏的菌株单菌落，接种在LB 培养基中30℃条件下 170 r/min 振荡培养12h后，离心收集菌体，利用细菌 DNA 提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取菌株的基因组DNA，利用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）（如SEQ ID No:1所示），和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）（如SEQ ID No:2所示），进行16S rRNA基因的PCR扩增，PCR反应条件为：95℃预变性5 min，30个循环（95℃ 1 min、53℃ 1 min、72℃1.5min），延伸72℃10min。用胶回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）纯化大约1.5kb的目的片段，将纯化后的PCR产物送至（上海美吉生物医药科技有限公司）进行测序。
LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠 10，单蒸馏水配制，pH值7.5，121℃灭菌30min。
获得的基因序列如SEQ ID No:3所示。
将所得上述序列经NCBI网站的BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）进行在线比对分析，利用MEGA X软件中的Neighbor-Joining方法构建系统发育树，鉴定菌株NB-1是芽孢杆菌属（Bacillus sp.），因此命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1。
实施例3、芽孢杆菌NB-1的养殖水体氨氮和亚硝酸盐降解率与安全性检测
挑取菌株NB-1单菌落接于灭菌LB培养基中，30℃条件下170 r/min振荡培养24h。以4×104 cfu/mL的接种量添加至含1m3水体的养殖美洲鳗鲡的塑料桶中，对照组不加细菌，设双平行对照试验，处理组和对照组每桶的养殖美洲鳗鲡重量11.2kg，平均规格140g/尾，试验期间，于0h、24h和168h分别采集各桶养殖水样，水样经离心取上清液测定氨氮和亚硝酸盐氮的浓度，计算降解率。处理组和对照组均正常按1.8%投料率投喂饲料和管理，美洲鳗鲡健康生长，无病和死亡。
结果（见表1）表明，24h添加菌液的处理组鳗鲡养殖水体中的氨氮浓度从1.363mg/L降至0.021mg/L（降解率98.5%），亚硝酸盐氮浓度从0.481mg/L降至0.003mg/L（降解率99.4%）；168h处理组鳗鲡养殖水体的氨氮浓度0.245mg/L，显著低于对照组91%，亚硝酸盐氮浓度0.191mg/L，显著低于对照组93%。表明，芽孢杆菌NB-1在养殖水体中能达到91%以上的降解氨氮和亚硝酸盐氮浓度的能力，能良好控制氨氮和亚硝酸盐氮浓度，稳定水质且具有良好的养殖安全性。
表1. 鳗鲡养殖水质因子浓度动态对比
因子（mg/L） 0 0 24h 24h 168h 168h
对照组 处理组 对照组 处理组 对照组 处理组
氨氮 1.348 1.363 1.641 0.021 2.625 0.245
亚硝酸盐氮 0.473 0.481 0.966 0.003 2.779 0.191
实施例4、芽孢杆菌NB-1的养殖尾水氨氮和亚硝酸盐降解率测定和自养性
挑取菌株NB-1单菌落接于灭菌LB培养基中，30℃条件下170 r/min振荡培养24h。以4×105 cfu/mL的接种量添加至1L的鳗鲡养殖尾水中，24h采集水样离心取上清液测定氨氮和亚硝酸盐氮的降解率。
结果表明，24h添加菌液的鳗鲡养殖尾水中的氨氮浓度从2.28mg/L降至0.695mg/L（降解率69.5%），亚硝酸盐氮浓度从2.28mg/L降至0.018mg/L（降解率99.2%）；尾水中的CODMn浓度从5.30mg/L至5.16mg/L，24h浓度基本无变化，表明菌株NB-1没有利用有机物，属于自养菌。
综上所述，本发明芽孢杆菌NB-1属于自养菌，具有降解氨氮和亚硝酸盐的能力，进行硝化反应时不消耗水中的碳源；区别于已报道的筛选菌仅能单一地降解氨氮或亚硝酸盐，区别于已报道的筛选菌为异养菌，在降解时需要消耗碳源；芽孢杆菌NB-1具有所需接种量较少，使用成本较低的优点，应用于降解养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐，仅需要4×104cfu/mL的接种量，应用于降解养殖尾水中的氨氮和亚硝酸盐也仅需要4×105 cfu/mL的接种量，较当前国内已报道的微生物制剂使用量普遍应在106 cfu/mL以上的接种量，明显减少了投入用量；芽孢杆菌NB-1具有高效的氨氮和亚硝酸盐降解率，24h养殖水体中的氨氮浓度降解率达98.5%（从1.36mg/L降至0.021mg/L），亚硝酸盐氮浓度降解率达99.4%（从0.48mg/L降至0.003mg/L）；24h养殖尾水中的氨氮浓度从2.28mg/L降至0.695mg/L（降解率69.5%），亚硝酸盐氮浓度从2.28mg/L降至0.018mg/L（降解率99.2%）。
此外，本发明芽孢杆菌NB-1用于降解养殖尾水中的较高氨氮和亚硝酸盐浓度，仍然具有优势：所需要的接种量较低和能达到较高的降解率。
综上，本发明芽孢杆菌NB-1具有良好的市场应用前景。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
序列表
<110> 集美大学
<120> 一种芽孢杆菌NB-1及其培养方法和应用
<130> P67213
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1412
<212> DNA
<213> （Bacillus sp.）
<400> 3
cagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgaagtcag cggcggacgg gtgagtaaca 60
cgtgggcaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggata 120
attctttccc tcacatgagg gaaagctgaa agatggtttc ggctatcact tacagatggg 180
cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcaacga tgcgtagccg 240
acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 300
agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat 360
gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt tagggaagaa caagtaccgg agtaactgcc 420
ggtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480
atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagcgcgcgc aggcggttcc 540
ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact 600
tgagtgcaga agagaagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga 660
ggaacaccag tggcgaaggc gactctttgg tctgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt 720
ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 780
ttagagggtt tccgcccttt agtgctgcag caaacgcatt aagcactccg cctggggagt 840
acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900
tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatctcc tgacaaccct 960
agagataggg cgttcccctt cgggggacag gatgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc 1080
agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca 1200
aagggctgcg agaccgcgag gttaagcgaa tcccataaaa ccattctcag ttcggattgc 1260
aggctgcaac tcgcctgcat gaagccggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1320
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1380
cgaagtcggt ggggtaacct ttggagccag cc 1412

Claims (7)

1.一种芽孢杆菌NB-1，其特征在于：所述芽孢杆菌NB-1为芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1，于2020年07月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2020304。
2.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌NB-1的培养方法，其特征在于：所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1用LB液体培养基在30℃下培养24h。
3.根据权利要1所述的一种芽孢杆菌NB-1的应用，其特征在于：所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1在改良养殖水体和养殖尾水减量排放中的应用。
4.根据权利要求3所述一种芽孢杆菌NB-1的应用，其特征在于：将所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1用于降解养殖水体和养殖尾水中的氨氮和亚硝酸盐浓度。
5.根据权利要求4所述一种芽孢杆菌NB-1的应用，其特征在于：所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1在降解养殖水体中氨氮和亚硝酸盐时，芽孢杆菌NB-1的用量为104cfu/mL；降解养殖尾水中氨氮和亚硝酸盐时，芽孢杆菌NB-1的用量为105 cfu/ mL。
6.根据权利要1所述的一种芽孢杆菌NB-1的应用，其特征在于：所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1用于制备养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的降解制剂。
7.根据权利要1所述的一种芽孢杆菌NB-1的应用，其特征在于：将所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）NB-1用于制备养殖尾水中氨氮和亚硝酸盐的降解制剂。
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