CN108865923A

CN108865923A - 用于重金属污染土壤处理的微生物菌株及其筛选方法与应用

Info

Publication number: CN108865923A
Application number: CN201810511080.5A
Authority: CN
Inventors: 蔡慧; 王佳斌; 贺志刚; 程刚
Original assignee: Suzhou Zhongyishiji Ecological Environment Design Research Co ltd; Suzhou Yifante Environment Restoration Co ltd
Current assignee: Suzhou Zhongyishiji Ecological Environment Design Research Co ltd; Suzhou Yifante Environment Restoration Co ltd
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2038-05-24
Also published as: CN108865923B

Abstract

本发明公开了用于重金属污染土壤处理的微生物菌株及其筛选方法与应用；筛选的微生物菌株为枯草芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC NO:M 2017834。将该微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；通过钝化作用将镉和铬固定在污染土壤中，降低镉和铬的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复土壤的目的。

Description

用于重金属污染土壤处理的微生物菌株及其筛选方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，是一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其筛选方法和应用。

背景技术

重金属是指比重大于5的金属，目前大约有45种，如铜、铅、锌、铁、钴、镍、锰、镉、汞、钨、钼、金、银等。少量的铜、锰、锌等重金属属于生命活动所必需要的元素，但是大部分的重金属如镉、汞、铅、铬等元素不是生物体所必须，且过量的重金属元素对人体均有毒害作用。重金属广泛地分布于大气圈、岩石圈和水圈中，在自然情况下，其浓度一般不会达到危害环境和人类的程度。但是随着工业以及城镇的发展，土壤重金属污染的问题也日益严重其中土壤镉、铬污染范围最广、污染程度最严重。

自然界中原有的镉循环处于生态平衡中，不会造成公害，但由于人类活动，对镉资源的滥用，导致了镉迁移以及流失，使人类生存环境中镉毒含量升高，造成严重的生态污染。由2014年的全国土壤污染状况调查公报可知，我国耕地土壤污染点位超标率为19.4％，且以无机污染物，特别是重金属污染为主。其中重金属镉点位超标率达到 7.0％，是重金属污染物中点位超标率最高的。研究表明，微量的镉进入机体即可通过生物放大和积累，对肺、骨、肾、肝、免疫系统和生殖器官等产生一系列损伤。极微量的镉可对人体造成伤害，它通过食物链富集，具有稳定、积累和不易消除的特点，对人体产生慢性中毒，主要积累在肝、肾、胰腺、甲状腺和骨骼之中，使肾脏等器官发生病变，并引起神经痛和内分泌失调等病症，甚至使人疼痛而死。震惊世界的日本“痛痛病”就是水田镉污染的典型事例，被称为“全球十大环境污染事件”，表现为全身疼痛、骨脆易折而引起身长缩短骨骼变形，最后发生肌萎缩及其他并发症，甚至死亡。

我国是一个铬盐生产大国，排放的铬渣对堆场和周边环境造成严重的污染。由于环境中的Cr(VI)可以通过多种途径进入土壤，铬渣堆场及周边土壤Cr(VI)污染尤为严重。Cr(VI)的毒性比Cr(III) 高110倍左右，因而重金属铬的定主要来源于Cr(VI)。水溶性Cr(VI)被列为对人体危害最大的8种化学物质之一，是国际公认的3 种致癌金属物之一，同时也是美国EPA公认的129种重点污染物之一。

六价铬对人体、农作物、牲畜均有毒害作用，它能降低生化过程中需氧量，从而使生物缺氧，使人窒息，同时它会被肠胃等消化道器官吸收，不仅有刺激作用，而且会诱发病变。

2011年，中国云南曲靖发生了铬渣堆污染事件，调查发现，云南陆良化工实业有限公司厂区东南侧“龙潭”地区地下水或已受极严重污染，该区地下水出水口铬超标242倍，水稻田中存水铬超标 126倍，且附近江段江水被用于农业灌溉，使得附近居民生产生活受到严重威胁。因此，如何有效，快速地修复铬污染成为当前迫在眉睫需要解决的问题。

为了有效利用现有的土地资源、减少镉和铬等重金属对人体造成的危害，需要采取有效的治理措施和恢复受污染的土壤。当前针对镉污染土壤的治理方法主要有物理方法、化学方法和生物方法等。物理方法需要耗费大量资金、人力物力，且移除的污染土壤又易引起二次污染。化学方法则易再度活化重金属，生物方法也具有局限性，如修复周期长，在实地修复中并没有很好的成功案例。目前多数受关注的修复技术均处于实验室试验阶段，实际修复效果并不理想。因此，寻找一种节能高效，经济环保的修复措施至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一微生物菌株及其筛选方法与在处理重金属污染土壤中的应用，所获得的微生物菌株对土壤中的重金属镉和铬具有较强的钝化作用以及耐受作用，通过钝化作用将镉和铬固定在污染土壤中，降低镉和铬的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复土壤的目的。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种用于重金属污染土壤处理的微生物菌株，为强固芽孢杆菌，已于2017 年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017834；保藏地址为中国武汉武汉大学，命名为强固芽孢杆菌NiuC(Bacillus firmus NiuC)。

本发明还公开了上述用于重金属污染土壤处理的微生物菌株的筛选方法，包括以下步骤：

(1)将镉和铬污染土壤与牛肉膏蛋白胨液体培养基振荡混合，获得土壤混合液；然后将土壤混合液离心，得到上清液；

(2)将步骤(1)得到的上清液采用稀释涂布法均匀涂布在含有 Cd²⁺和Cr⁶⁺的固体培养基上，置于37℃恒温培养箱中倒置培养48h，挑选菌落形态不同的优势单菌落划线分离获得单菌；

(3)取步骤(3)获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液，将上清液梯度稀释后分别涂布于含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在28～30℃培养3～4天，比较菌株的生长状况，从中筛选出目标微生物菌株。

上述技术方案中，步骤(1)中，所述振荡混合在玻璃珠存在下进行，振荡混合的温度为28～30℃，速度为160～170rpm；步骤(2) 中，所述含有Cd²⁺和Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，Cd²⁺的含量为25mg/L，Cr⁶⁺的含量为50mg/L。

上述技术方案中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为7.4～7.6，包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.3～0.6％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的pH为 7.4～7.6，包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.3～0.6％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、1.5～2.5％琼脂、其余为去离子水。优选的，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、1.5％琼脂、其余为去离子水。

上述技术方案中，步骤(3)中，将上清液分别稀释为10^-1、10^-2、 10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，然后将不同浓度梯度的上清液分别涂布于含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在28～30℃培养 3～4d；选取在稀释10^-5倍数时易于菌株单独分离，在含有60mg/L Cd²⁺和100mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基上能正常生长的菌株划线分离，得到目标微生物菌株；所述含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨固体培养基为含有25mg/L Cd²⁺以及50mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有50mg/L Cd²⁺以及75mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有60mg/L Cd²⁺以及100mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有70mg/LCd²⁺以及150mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基和含有80mg/L Cd²⁺以及200mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基。

不同类型土壤具有不同的物理、化学等条件，如孔隙度、含水率、 pH等，不同条件适宜不同微生物生长，因此，不同类型土壤中，微生物种类有所不同。

通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，根据Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定；在比对匹配度最高的结果中，菌种所测得到的16s rDNA序列部分 (SEQ ID NO:1所示)与Bacillus(芽孢杆菌属)的16s rDNA序列有100％的同源性，可确定菌属为Bacillus(芽孢杆菌属)，与已知菌种的匹配中，与Bacillusfirmus(强固芽孢杆菌)的16s rDNA有100％同源性；与Bacillus firmus(强固芽孢杆菌)在RDP-II数据库中，序列相似性最高；可确定菌种为Bacillus firmus(强固芽孢杆菌)，命名为强固芽孢杆菌NiuC。

本发明还公开了一种重金属污染土壤处理试剂的制备方法，包括以下步骤，将上述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液为重金属污染土壤处理试剂；或将菌液真空冷冻干燥后制备重金属污染土壤处理试剂。优选重金属为镉和铬，培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基；所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为7.4～7.6，包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.3～0.6％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的pH为7.4～7.6，包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、 0.3～0.6％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、1.5～2.5％琼脂、其余为去离子水。优选的，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分： 1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、1.5％琼脂、其余为去离子水。本发明筛选微生物菌株时的培养基与培养微生物菌株时的培养基可以一样，也可以不一样。

本发明还公开了上述微生物菌株在重金属污染土壤处理或制备重金属污染土壤处理试剂中的应用，优选的，所述重金属为镉和铬。加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态镉在10d内由 17.93mg/kg降到0.68mg/kg，土壤可交换态铬由29.78mg/kg降到1.52mg/kg；用水洗脱土壤，未检出Cd²⁺和Cr⁶⁺，这说明本发明菌株对土壤中的镉和铬具有较强的钝化能力。此外，本发明所述菌株在水相中对镉和铬具有较强的耐受性以及较强的钝化能力；土壤中可交换态镉和铬的含量越低，则土壤中镉和铬的钝化效果越好，植物可利用度越低。

本发明还公开了一种重金属污染土壤的处理方法，将上述微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理。

作为优选，所述微生物菌株接种于培养基时，接种量为2％。

国内外虽然已经开展了镉污染土壤的修复研究，但是物理化学方法成本高工艺复杂，已筛选的降解菌耐受性差，实际应用受限；本发明针对现有治理重金属污染土壤的方法具有一定局限性、实施成本高、对土壤破坏严重、易带来其他污染等问题，通过筛选出功能性微生物菌株的生物钝化作用来实现对污染土壤的原位修复。本发明从受重金属镉污染的土壤中筛选出的苏云金芽孢杆菌能够将土壤中的可交换态镉钝化显著降低其含量，同时对镉和铬具有较强的耐受性，对土壤扰动小，具有较强的生物修复功能，能够应用于修复重金属污染土壤和制备重金属污染修复材料中，且具有成本低、效果好、操作方便、对土壤扰动小等特点。

附图说明

图1为本发明筛选的微生物菌株的生长曲线。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的微生物菌株及其筛选方法与在重金属污染土壤处理中的应用进行详细说明。

实施例1

本发明用于重金属污染土壤处理的微生物菌株的筛选采用液相富集法，包括以下步骤：

(1)称取5g污染土壤样品(土壤取自苏州市上方山，最终含有 Cd²⁺25mg/kg，Cr⁶⁺50mg/kg)，加入到装有牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，然后在30℃、160rpm下振荡，获得土壤混合液；

(2)将土壤混合液转入离心管，取离心后的上清液作为镉和铬钝化微生物的来源；

(3)取5mL驯化后的悬浊液，采用稀释涂布法均匀涂布在Cd²⁺和Cr⁶⁺浓度分别为25mg/L和50mg/L的固体培养基平板上，置于37℃ 恒温培养箱中倒置培养48h，挑选菌落形态不同的优势单菌落划线分离，纯化后制作斜面保存；

(4)取步骤(3)获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液将上清液分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，然后将不同浓度梯度的上清液分别涂布于含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨固体培养基(五种)上，在30℃培养4d，比较菌株的生长状况，选取在稀释10^-5倍数时易于菌株单独分离，在含有60mg/L Cd²⁺和100 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基上能正常生长的菌株划线分离，得到目标微生物菌株；所述含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨固体培养基为含有25mg/L Cd²⁺以及50mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有50mg/L Cd²⁺以及75mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有60mg/L Cd²⁺以及100mg/LCr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有70 mg/L Cd²⁺以及150mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基和含有80 mg/L Cd²⁺以及200mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基。

本发明选取在稀释10^-5倍数时易于菌株单独分离、在60mg/L Cd²⁺和100mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基上能正常生长的菌株，划线分离，为目标微生物菌株。通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，命名为强固芽孢杆菌 NiuC(Bacillus firmusNiuC)，已于2017年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017834；保藏地址为中国武汉，武汉大学。

本发明筛选的微生物菌株的鉴定根据Ezup柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定；在比对匹配度最高的结果中，菌种所测得到的16s rDNA序列部分(SEQ ID NO:1所示)与Bacillus(芽孢杆菌属)的16s rDNA序列有100％的同源性，可确定菌属为Bacillus(芽孢杆菌属)；与已知菌种的匹配中，与Bacillus firmus(强固芽孢杆菌)的16s rDNA有100％同源性；与Bacillus firmus (强固芽孢杆菌)在RDP-II数据库中，序列相似性最高；可确定菌种为Bacillus firmus(强固芽孢杆菌)。

本发明筛选的微生物菌株的序列(SEQ ID NO:1)如下：

GCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGAAGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATTCTTTCCCTCACATGAGGGAAAGCTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGGAGTAACTGCCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTCCTGACAACCCTAGAGATAGGGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGGATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCGAGACCGCGAGGTTAAGCGAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTG

将上述菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种量为2wt％， 30℃、170rpm下振荡培养，间歇取样。如图1所示，为菌株的生长曲线，进入对数生长期，到达稳定期，后生长有下降趋势，进入衰亡期，浓度最高能达到OD600为1.77。

本实施例中，牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、其余为去离子水；牛肉膏蛋白胨固体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、1.5％琼脂、其余为去离子水。

实施例2

将本发明筛选的微生物菌株接种于经121℃灭菌30min的牛肉膏蛋白胨液体培养基中(接种量为2wt％)，培养(160rpm，30℃下培养 12h)至对数生长期，得到菌液。

可以将菌液加入含有重金属镉和铬的污染土壤中，混合均匀，培养15d左右，用BCR连续提取法，提取土壤中各种形态的镉；并用清水洗脱土壤，测定可被植物吸收利用的可交换态镉，用ICP-AES 检测。

或将菌液用真空冷冻干燥机冻干后加入含有重金属镉的污染土壤中，混合均匀，培养15d左右，用BCR连续提取法，提取土壤中各种形态的镉；并用清水洗脱土壤，测定可被植物吸收利用的可交换态镉，用ICP-AES检测。

本实施例中，牛肉膏蛋白胨液体培养基包括以下质量百分数的组分：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.5％氯化钠、其余为去离子水。

实施例3

向牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入不同浓度的Cd²⁺和Cr⁶⁺(10、 20、40、60mg/L的Cd²⁺，同时对应含有20、40、60、100mg/L的Cr⁶⁺)，121℃ 灭菌30min；然后接种本发明筛选的微生物菌株，30℃、160rpm下培养，不同时间取样测OD值；在同时含有浓度分别为10、20、40、60mg/L 与20、40、60、100mg/L的Cd²⁺和Cr⁶⁺时，该菌株分别在0.5、4、8、12h 时进入对数生长期，能达到的最高OD值分别为6.1、5.5、3.2和2.1，从数据表明，该菌株对Cd²⁺和Cr⁶⁺具有较强的耐受能力。

上述接种本发明筛选的微生物菌株为取2wt％的新鲜菌液，或在牛肉膏蛋白胨固体培养基上挑取单菌落接入培养基中，两者效果近似，本实施例为取含菌质量分数为2％的新鲜菌液。

实施例4

本发明筛选的微生物菌株接种经121℃灭菌30min的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，160rpm，30℃下培养10h，然后加入浓度分别为10、 20、40、60mg/L的Cd²⁺和浓度分别为20、40、60、100mg/L的Cr⁶⁺，继续振荡培养12h后，取10ml菌液，8000rpm离心10min，用ICP-AES 检测上清液中残余Cd²⁺和Cr⁶⁺的浓度。

公式如下:

本发明筛选的微生物菌株对10、20、40、60mg/L Cd²⁺的去除率分别为 71.01％、83.53％、59.39％、36.24％，对20、40、60、100mg/L Cr⁶⁺的去除率分别为88.41％、75.63％、48.98％、13.26％。

上述接种本发明筛选的微生物菌株为取2％的新鲜菌液，或在牛肉膏蛋白胨固体培养基上挑取单菌落接入培养基中，两者效果近似；本实施例为取2％的新鲜菌液。

实施例5

取实施例2制备的菌液加入到含有重金属Cd²⁺和Cr⁶⁺的污染土壤中，搅拌均匀，培养10d，保证含水量为25％，10天后，将土壤在 60℃下烘干，准确称取1g，用BCR连续提取法，提取土壤中各种形态的镉。具体做法如下：

a.可交换态：准确称取通过100目筛的风干土壤样品1g，加 40mL 0.1mol/L的HAc，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后5000r/min下离心16min；取上清液，用ICPAES测定Cd²⁺含量；加入无菌水清洗残余物，振荡22min，离心，弃去清洗液；

b.可还原态：向a离心分离出的残渣中加入40mL0.5mol/L的盐酸羟胺，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后5000r/min 下离心18min；其余步骤同步骤a；

c.可氧化态：向b离心分离出的残渣中加入10mL H₂O₂，搅拌均匀，室温下静置1h左右后用水浴加热保持85℃±2℃1h左右，再加入10mLH₂O₂，在恒温水浴箱中加热保持85℃±2℃1h左右；冷却后，加入50mL 1mol/L的NH₄Ac，放在恒温振动器中24±1℃下连续震荡16h，然后5000r/min下离心19min；其余步骤同步骤a；

d.残余态：向c离心分离出的残渣中加入10mL HNO₃，使酸和样品充分混合均匀；进行微波消解(参考EPA3052中的微波消解法)；

e.测总量：准确称取过100目筛的风干土壤样品0.5g，加入10mL HNO₃，微波消解方法同上；

f.水洗脱：将处理前后的土壤样品烘干或自然风干后过100目筛，准确称取5g土壤，加入20ml无菌水，置于恒温振荡器中振荡洗脱16h，然后离心测定上清液中被洗脱下来镉的量。表1为各种形态的镉检测结果，由表1可知，加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态镉在10d内由17.93mg/kg降到0.68mg/kg；用水洗脱土壤，未检出Cd²⁺，这说明本发明菌株对土壤中的镉具有极强的钝化能力。通过总量的检测，处理前后的镉总量基本一致，检测方法未造成镉的增加或减少，各种状态下的镉含量检测准确。由表2可知，加入本发明微生物菌株的菌液后土壤可交换态铬在10d内由29.78mg/kg降到 1.52mg/kg；用水洗脱土壤，未检出Cr⁶⁺，这说明本发明菌株对土壤中的铬具有较强的钝化能力；通过总量的检测，处理前后的铬总量基本一致，检测方法未造成铬的增加或减少，各种状态下的铬含量检测准确。也可以取真空干燥后冻干的菌体；效果近似。

表1 土壤中各形态镉检测结果(mg/kg)

表2 土壤中各形态铬检测结果(mg/kg)

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 苏州逸凡特环境修复有限公司

苏州中益世纪生态环境设计研究有限公司

<120> 用于重金属污染土壤处理的微生物菌株及其筛选方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1448

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctaatacat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgaagtc agcggcggac 60

gggtgagtaa cacgtgggca acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc 120

taataccgga taattctttc cctcacatga gggaaagctg aaagatggtt tcggctatca 180

cttacagatg ggcccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac 240

gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300

cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc 360

cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aaactctgtt gttagggaag aacaagtacc 420

ggagtaactg ccggtacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 480

gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc 540

gcaggcggtt ccttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga 600

aactggggaa cttgagtgca gaagagaaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg 660

tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactcttt ggtctgtaac tgacgctgag 720

gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780

gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctgc agcaaacgca ttaagcactc 840

cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900

cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatct 960

cctgacaacc ctagagatag ggcgttcccc ttcgggggac aggatgacag gtggtgcatg 1020

gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080

atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg 1140

aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1200

atggatggta caaagggctg cgagaccgcg aggttaagcg aatcccataa aaccattctc 1260

agttcggatt gcaggctgca actcgcctgc atgaagccgg aatcgctagt aatcgcggat 1320

cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1380

gtttgtaaca cccgaagtcg gtggggtaac cttttggagc cagccgccta aggtgggaca 1440

gatgattg 1448

Claims

1.一种用于重金属污染土壤处理的微生物菌株，其特征在于：所述用于重金属污染土壤处理的微生物菌株为芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC NO:M 2017834。

2.权利要求1所述用于重金属污染土壤处理的微生物菌株在重金属污染土壤处理或制备重金属污染土壤处理试剂中的应用。

3.一种重金属污染土壤处理试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，将权利要求1所述用于重金属污染土壤处理的微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液为重金属污染土壤处理试剂；或将权利要求1所述用于重金属污染土壤处理的微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液，将菌液真空冷冻干燥后制备重金属污染土壤处理试剂。

4.一种重金属污染土壤的处理方法，其特征在于：将权利要求1所述用于重金属污染土壤处理的微生物菌株接种于培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液加入重金属污染土壤中，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理；或将菌液真空冷冻干燥后加入土壤，混合均匀，完成重金属污染土壤的处理。

5.根据权利要求3或者4所述的方法，其特征在于：所述培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基或者牛肉膏蛋白胨液体培养基；所述重金属为镉和铬。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.3~0.6%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.3~0.6%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、1.5~2.5%琼脂、其余为去离子水。

7.权利要求1所述用于重金属污染土壤处理的微生物菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将镉和铬污染土壤与牛肉膏蛋白胨液体培养基振荡混合，获得土壤混合液；然后将土壤混合液离心，得到上清液；

（2）将步骤（1）得到的上清液采用稀释涂布法均匀涂布在含有Cd²⁺和Cr⁶⁺的固体培养基上，置于37℃恒温培养箱中倒置培养48 h，挑选菌落形态不同的优势单菌落划线分离获得单菌；

（3）取步骤（3）获得的单菌落制成菌悬液，离心后取上清液，将上清液梯度稀释后分别涂布于含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在28~30℃培养3~4天，比较菌株的生长状况，从中筛选出目标微生物菌株。

8.根据权利要求7所述处理重金属污染土壤的微生物菌株的筛选方法，其特征在于：步骤（1）中，所述振荡混合的温度为28~30℃，速度为160~170rpm；步骤（2）中，所述含有Cd²⁺和Cr⁶⁺的固体培养基中，Cd²⁺的含量为25mg/L，Cr⁶⁺的含量为50mg/L。

9.根据权利要求7所述用于重金属污染土壤处理的微生物菌株的筛选方法，其特征在于：所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.3~0.6%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、其余为去离子水；所述牛肉膏蛋白胨固体培养基的pH为7.4~7.6，包括以下质量百分数的组分：1%蛋白胨、0.3~0.6%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、1.5~2.5%琼脂、其余为去离子水。

10.根据权利要求7所述处理重金属污染土壤的微生物菌株的筛选方法，其特征在于，步骤（3）中，将上清液分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，然后将不同浓度梯度的上清液分别涂布于含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，在28~30℃培养3~4d；选取在稀释10^-5倍数时易于菌株单独分离，在含有60 mg/L Cd²⁺和100 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基上能正常生长的菌株划线分离，得到目标微生物菌株；所述含有镉和铬的牛肉膏蛋白胨固体培养基为含有25 mg/L Cd²⁺以及50 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有50 mg/L Cd²⁺以及75 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有60 mg/L Cd²⁺以及100 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有70 mg/L Cd²⁺以及150 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基、含有80 mg/L Cd²⁺以及200 mg/L Cr⁶⁺的牛肉膏蛋白胨固体培养基。