CN109266575A - 一株耐镉肠菌株及吸附镉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株从矿山土壤分离、纯化、驯化得到的肠杆菌（Enterobactersp.）FM‑1，于2017年12月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M2017825。包括取土、培养土壤，获得初提液，再用LB液体培养基富集培养、用LB固体培养基纯化培养，最后将单菌落接种于含镉的LB平板培养基进一步驯化培养等步骤，获得对镉具有高耐受性的肠杆菌FM‑1。肠杆菌FM‑1对镉具有较好的耐受性和吸附特性，在含4 mmol L‑1镉，30℃，pH 7优化培养条件下，最大吸附率为80.36%；无菌操作下加入装有无此时镉吸附量190.45 mg g‑1。该菌株可应用于与植物联合修复镉污染的水体和土壤，应用前景广泛。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种肠杆菌及其吸附镉的方法。
背景技术
我国土壤重金属污染严重，其中以镉为主要污染物的土地大约占一半左右。镉污染土壤修复的方法主要有物理法，如土壤淋洗法、换土法、电动处理法、玻璃化等。这些方法往往技术要求高、成本大，不适合大面积的污染土壤修复。化学法，如添加沸石、石灰、粉煤灰、生活垃圾等；这些方法往往对环境影响大、去除效果差，系统稳定性差等特点。而生物法因其具有对环境友好，不产生二次污染，且可持续等特点而备受关注。其中，利用微生物改变土壤中镉的形态，改善根际环境，从而促进植物修复土壤中的镉，成为目前研究的热点。如公开号为CN106967657A的专利公开了一种用于强化萎篙修复镉污染土壤的混合促生菌及其制备方法与应用的方法；公开号为CN107603893A的专利公开了一种对镉具有高抗性的紫胞菌及提取方法和应用，其对镉的耐受性只有16mmol L-1。微生物和植物的联合作用往往具有选择性，耐镉微生物种质资源的获得是微生物- 植物联合修复中亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种对镉有较好耐受性和吸附特性的肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1，并提供该肠杆菌筛选的方法，以及用该肠杆菌吸附镉的方法。
本发明所提供的肠杆菌(Enterobacter sp)，名称为肠杆菌FM-1(Enterobactersp. FM-1)，已于2017年12月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国湖北省武汉市2武昌区八一路珞珈山)，保藏号为CCTCC M 2017825。
本发明所述肠杆菌FM-1是一株筛选自矿山土壤的菌株，从广西壮族自治区贺州宁贺锰矿采矿区表层土壤筛选出来的。筛选方法步骤如下：
1、菌株的获得
(1)取土：取矿区表层土，自然风干，过1-2mm筛，用于微生物的筛选。
(2)菌株初提夜制备：取上述风干、过筛土少量，在无菌操作下加入装有一定量的无菌水的三角瓶中，制得土壤初提液。
(3)菌株富集：取适量土壤初提夜，接种于LB液体培养基，在恒温摇床上振荡，然后稀释到不同浓度梯度。富集培养基配制方法为，每升培养基含牛肉膏4-6g、蛋白胨8-12g、NaCl 4-6g，灭菌，自然pH。
(4)菌株纯化：将富集培养物稀释后，取少量样品均匀涂布于LB平板培养基上。然后，将培养皿倒放于20-40℃恒温箱培养3-5d，观察菌株生长情况及统计菌落数；用划线法挑取长势较好的菌株划线分离，在20-40℃下倒置培养，获得纯培养。纯化培养的培养基配制方法为每升培养基含牛肉膏4-6g、蛋白胨8-12g、NaCl 4-6g，琼脂18-20 gL，灭菌，自然pH。培养温度15-45℃，
(5)菌株驯化：将上述获得的纯培养，活化6-12h后，接种于含镉(5-30mmol L-1) LB固体培养上，再在20-40℃的培养箱中倒置培养2-3d，获得耐镉菌株。驯化培养基配制方法为每升培养基含牛肉膏4-6g、蛋白胨8-12g、NaCl 4-6g，琼脂18-20g，镉5-30 mmol，灭菌，自然pH。培养温度15-45℃。
(6)菌株保存：将驯化后的菌用LB斜面培选择养基保存于冰箱。LB斜面选择培养基的配制方法为每升培养基含牛肉膏4-6g、蛋白胨8-12g、NaCl 4-6g，琼脂18-20g，镉2.5-25mmol，灭菌，自然pH，琼脂18-22g，灭菌，自然pH。
2、菌株的鉴定
(1)形态特征鉴定
用显微镜进行菌株的形态观察，发现菌落呈圆形，乳白色，不透明，粘稠，表面湿润，边缘光滑整齐。用扫描电镜观察，发现该菌体呈细杆状，长度在0.70-1.26μm之间。
(2)分子鉴定
对所获得的菌株进行16S rRNA基因序列进行分析。该工作委托中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国湖北省武汉市2武昌区八一路珞珈山)完成。测定的序列结果在https://www.ezbiocloud.net上进行比较分析，用MEGA5.0软件构建系统发育树，菌株与肠杆菌(Enterobacter sp.)相似性达98.6％，在系统发育树上比较亲缘关系相近，最终将该菌归属于肠杆菌属，并命名为肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1。
3、菌株的耐受特性
本发明所述肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1对镉具有较好的耐受性。将上述1(6)保存的菌株，活化6-12h后，接种于含镉(2.5-60mmol L-1)培养基上，再在20-40℃的培养箱中倒置培养2-3d，测定其耐镉特性。耐镉测试培养基的配制为每升培养基含牛肉膏4-6g、蛋白胨8-12g、NaCl 4-6g，琼脂18-20g，镉0-60mmol，高压蒸汽灭菌，自然pH，培养温度15-45℃。该菌可耐受40mmol L-1镉。
4、菌株对镉的吸附特性及吸附条件优化
本发明所述肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1对镉具有较好的吸附特性。将上述1(6) 保存的菌株，活化6-12h后，接种于LB液体悬浮培养基。培养基配制方法为每升培养基含牛肉膏4-6g、蛋白胨8-12g、NaCl 4-6g，琼脂18-20g，灭菌，自然pH。控制吸附条件为：培养基pH2-9，镉初始浓度为0-16mmol L-1，培养温度15-45℃。
肠杆菌的优化培养条件为：镉初始浓度为4mmol L-1，培养基pH为7，培养温度为 30℃。镉的最高吸附率(去除率)达到80.36％，此时吸附量为190.45mg g-1。
附图说明
图1肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1单菌落形态；
图2肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1电镜扫描图片；
图3肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1镉耐受性测试生长图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置3次重复实验，结果取平均值。
实施例1
第一部分：肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1获得
一、肠菌株的获得
(1)取土：土壤采自广西壮族自治区贺州宁贺锰矿采矿区表层土。具体步骤如下，采用随机采样法，用土钻采取0-10cm土壤样品20个，带回实验室，风干，混合均匀后过1mm筛，备用。
(2)初提夜制备：取上述(1)土壤10g，在无菌操作下加入装有90ml的无菌水的三角瓶中，30℃恒温箱震荡培养箱，震荡培养10min，制得土壤初提液。
(3)菌株富集：取上述(2)土壤初提夜1.0ml，接种于50ml LB液体培养基，在 30℃，150r min-1下振荡培养5d获得富集培养物。富集培养基的配制为每升培养基含牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g，121℃高压蒸汽灭菌20min，自然pH。
(4)菌株纯化：将富集培养物稀释10-4、10-5、10-6、10-7浓度梯度。取稀释富集培养物0.1ml均匀涂布于LB平板培养基上。将培养皿倒放于30℃恒温箱培养4d，观察菌株生长情况及统计菌落数；用划线法挑取长势较好的菌株划线分离，在30℃下倒置培养，获得纯培养。纯化培养的培养基配制方法为每升培养基含牛肉膏5g、蛋白胨10g、 NaCl 5g，琼脂20g，121℃高压蒸汽灭菌20min，自然pH。
(5)菌株驯化：将上述获得的纯培养，活化8h后，接种于含镉10mmol L-1LB固体培养基上，在30℃的培养箱中倒置培养4d，获得耐镉菌株。驯化培养基配制方法为每升培养基含牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g，琼脂20g，镉10mmol，121℃高压蒸汽灭菌20min，自然pH。
(6)菌株保存：将生长良好的驯化后的菌株接种于LB斜面选择培养基，至于4℃冰箱保存。斜面保存培养基的配制为每升培养基含牛肉膏4-6g、蛋白胨8-12g、NaCl 4-6g，琼脂18-20g，镉10mmol，灭菌，自然pH，琼脂18-22g，灭菌，自然pH。经过筛选、驯化得到一株具有耐镉特性的菌株。
二、菌株鉴定
1、形态特征鉴定
菌株在LB培养基上生长良好，本菌落特征如下：菌落呈圆形，乳白色，不透明，粘稠，表面湿润，边缘光滑整齐，见图1。用扫描电镜观察，该菌体呈细杆状，长度在 0.70-1.26μm之间，见图2。
2、分子鉴定
菌株的鉴定是委托中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国湖北省武汉市2武昌区八一路珞珈山)完成。
(1)细菌提取DNA
①选择新鲜的细菌斜面培养物，用巴氏管向其中加入约1mlddH2O，刮取少量菌体至1.5ml的EP管中，12000rpm离心2min，去上清；
②加入100ulddH2O重悬，12000rpm离心2min，去上清；
③重复步骤2；
④向1.5ml EP管中加入适量ddH2O，加入玻璃珠，震荡破碎1min，然后将EP管放入沸水中煮沸10min；
⑤将EP管置于冷水中冷却，
⑥取出EP管，12000rpm离心2min，取上清作PCR模板备用。
(2)PCR反应
以上述DNA作为PCR模板，采用引物27F(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 和1492R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对其进行扩增。反应条件：94℃， 10min；94℃，1min，55℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃ 10min，10℃∞。将扩增产物送测序。
扩增产物的测序结果见序列表中的序列1。对测定的序列在https://www.ezbiocloud.net 上进行比较分析，用MEGA5.0软件构建系统发育树，菌株FM-1与肠杆菌(Enterobacter sp.)相似性达98.6％，在系统发育树上比较亲缘关系相近，最终将该菌归属于肠杆菌属。扩增产物的测序结果见序列表中的序列1。
根据形态特征鉴定和分子鉴定的结果，将所筛选的菌株命名为肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1。
肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1已于2017年12月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国湖北省武汉市2武昌区八一路珞珈山)，保藏号为 CCTCC M2017825。
第二部分：肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1耐镉特性测试
将保存于LB斜面选择培养基的菌株活化8h后，用划线法接种到10，15，20，40，60mmol L-1的LB固体培养基，然后倒置于恒温培养箱中30℃培养4d，观察菌落生长情况，测定菌株对镉的耐受性。每组样品重复3次。由表1和图3可知，肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1在镉浓度为10-20mmol L-1的固体培养基中生长良好，最大可耐受40mmol L-1的镉。
表1肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1耐镉特性测试
注：+++表示：生长好；++表示：生长良好；+表示：可以生长；-表示：几乎不生长
第三部分：肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1镉吸附特性测试
1、不同镉初始浓度下肠杆菌(Enterobacter sp.FM-1)镉吸附特性
将保存于LB斜面选择培养基的菌株活化8h后，以5％的菌液量(OD600＝1.0-1.2)接种接到装有95ml含镉液体培养基。镉的初始浓度为0.25、0.5、1、2、4、8、16mmol L-1，pH为7的LB液体培养基中。在30℃，150r min-1下振荡培养，24h后取样(低温离心8000rpm，10min)，收集上清液，加入一滴浓硝酸。利用原子吸收光谱仪测定上清液中的镉含量，采用下面公式①计算肠杆菌对镉的吸附率。每组设3个平行样，以不含重金属离子的培养基中接种菌株作为对照。LB液体培养基的配制为每升培养基含牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g，121℃高压蒸汽灭菌20min，自然pH。
镉的吸附率计算公式：
其中，Q表示镉的吸附率，q表示镉的吸收量
C0、C表示培养基中镉的起始浓度和终浓度，(mg L-1)
V表示溶液的体积，ml
M表示菌体的质量，g。
镉初始浓度对肠杆菌镉吸附效率和吸附量见表2。在镉初始浓度为4mmol L-1时，肠杆菌FM-1对镉的吸附量最大，为74.77％；此时吸附量为174.60mg g-1。
表2不同镉初始浓度下肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1镉吸附特性
2、不同pH条件下肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1镉吸附特性
配制pH梯度为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，含镉初始浓度为4mmol L-1的LB液体培养基，其配制方法同上述1。以5％接种量接入1中活化的菌液，在30℃，150r min-1下振荡培养，24h后取样(低温离心8000rpm，10min)，收集上清液，加入一滴浓硝酸。利用原子吸收光谱仪测定上清液中的镉含量。采用上述1中的方法计算肠杆菌对镉的吸附率。每组设3个平行样。不同pH条件下肠杆菌镉吸附效率和吸附量见表3。在培养基pH为7.0时，肠杆菌FM-1对镉的吸附量最大，为78.01％；此时吸附量为184.88mg g-1。
表3不同pH条件下肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1镉吸附特性
3、不同温度条件下肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1镉吸附特性
配制含镉初始浓度为4mmolL-1，pH为7的LB液体培养基，配制方法同上述1。以5％接种量接入1中活化的菌液，分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，150 r min-1下振荡培养24h后，取样(低温离心8000rpm，10min)，收集上清液，加入一滴浓硝酸。利用原子吸收光谱仪测定上清液中的镉含量，采用上述1中的方法计算肠杆菌对镉的吸附率。每组设3个平行样。在培养温度为30℃时，肠杆菌FM-1对镉的吸附量最大，为80.36％；此时吸附量为190.45mg g-1。
表4不同温度条件下肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1镉吸附特性
肠杆菌的优化培养条件：镉初始浓度为4mmol L-1，培养基pH为7，培养温度为 30℃。
序列表
<110> 广西师范大学
<120> 一株耐镉肠菌株及吸附镉的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1432
<212> DNA
<213> 肠杆菌(Enterobacter sp.FM-1)
<400> 1
gagatgcgca gctaccatgc agtcgagcgg tagcacagag agcttgctct cgggtgacga 60
gcggcggacg ggtgagtaat gtctgggaaa ctgcctgatg gagggggata actactggaa 120
acggtagcta ataccgcata atgtcgcaag accaaagagg gggaccttcg ggcctcttgc 180
catcagatgt gcccagatgg gattagctag taggtggggt aacggctcac ctaggcgacg 240
atccctagct ggtctgagag gatgaccagc cacactggaa ctgagacacg gtccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagccatgcc 360
gcgtgtatga agaaggcctt cgggttgtaa agtactttca gcggggagga aggtgttaag 420
gttaataacc ttgtcaattg acgttacccg cagaagaagc accggctaac tccgtgccag 480
cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcacg 540
caggcggtct gtcaagtcgg atgtgaaatc cccgggctca acctgggaac tgcattcgaa 600
actggcaggc tagagtcttg tagagggggg tagaattcca ggtgtagcgg tgaaatgcgt 660
agagatctgg aggaataccg gtggcgaagg cggccccctg gacaaagact gacgctcagg 720
tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780
tcgacttgga ggttgtgccc ttgaggcgtg gcttccggag ctaacgcgtt aagtcgaccg 840
cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg 900
gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctactct tgacatccag 960
agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggaactctg agacaggtgc tgcatggctg 1020
tcgtcagctc gtgttgtgaa atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcct 1080
ttgttgccag cggtccggcc gggaactcaa aggagactgc cagtgataaa ctggaggaag 1140
gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacgagtagg gctacacacg tgctacaatg 1200
gcgcatacaa agagaagcga cctcgcgaga gcaagcggac ctcataaagt gcgtcgtagt 1260
ccggattgga gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat cgctagtaat cgtagatcag 1320
aatgctacgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg 1380
ggttgcaaaa gaagtaggta gcttaacctt cgggagggcg cttaccactt tg 1432
Claims (9)
1.一种耐受镉的肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1，保藏号CCTCC M2017825。
2.一种如权利要求1所述肠菌株的获得方法，其特征在于：包括取土、初提、富集、纯化、驯化和保存。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述取土的土壤为矿山表层土壤；所述初提是取少量土壤，无菌操作下加入装有无菌水的容器中，制得土壤初提夜；所述富集是取土壤初提夜，接种到LB液体培养基进行富集培养，得富集物；所述富集培养方法为，每升培养基含牛肉膏4-6g、蛋白胨8-12g、NaCl 4-6g，灭菌，自然pH，培养温度15-45℃。
4.根据权利要求2所述的方法，所述纯化，取富集物稀释后用LB固体培养基进行纯化培养；所述纯化培养方法为每升培养基含牛肉膏4-6g、蛋白胨8-12g、NaCl 4-6g，琼脂18-20g，灭菌，自然pH，培养温度15-45℃。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述驯化培养方法为每升培养基含牛肉膏4-6g、蛋白胨8-12g、NaCl 4-6g，琼脂18-20g，镉5-30mmol，灭菌，自然pH，培养温度15-45℃。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述保存时将驯化所获得的菌株接入LB斜面选择培养基后，放入冰箱进行保存；所述LB斜面选择培养基的配制方法为每升培养基含牛肉膏4-6g、蛋白胨8-12g、NaCl 4-6g，琼脂18-20g，镉2.5-25mmol，灭菌，自然pH，琼脂18-22g，灭菌，自然pH。
7.一种如权利要求1所述肠杆菌FM-1，其特征在于：以LB固体培养基为培养基质，控制pH为2-9，培养温度15-45℃；所述LB固体培养基每升培养基含牛肉膏4-6g、蛋白胨8-12g、NaCl 4-6g，琼脂18-20g，镉10-60mmol，灭菌，自然pH；所述肠杆菌可耐受0-40mmol L-1镉。
8.一种用权利要求1所述肠杆菌FM-1吸附镉的方法，其特征在于，吸附条件为：以LB固体培养基为培养基质，控制pH为2-9，培养温度15-45℃，镉初始浓度0-16mmol L-1。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：肠杆菌(Enterobacter sp.)FM-1吸附条件为，pH 7，温度30℃，镉初始浓度为4mmol L-1，镉的最大吸附率为80.36％，相应的镉吸附量为190.45mg g-1。
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