CN116836898B - 一种适用于水稻种植的微生物改良剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种适用于水稻种植的微生物改良剂及其应用，属于微生物菌剂技术领域。本发明的一种适用于水稻种植的微生物改良剂，包括枯草芽孢杆菌AM17和节杆菌AM28，枯草芽孢杆菌AM17和节杆菌AM28的活菌数之比为1︰（0.4~5），总活菌数为（1~5）×109cfu/g。本发明制得的微生物改良剂，结合节杆菌AM28对镉的吸附作用以及枯草芽孢杆菌AM17对水稻吸收镉的阻遏作用，协同降低水稻对镉的吸收，降低水稻籽粒中镉的浓度，同时降低土壤中有效态镉的浓度。

Description

一种适用于水稻种植的微生物改良剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种适用于水稻种植的微生物改良剂及其应用，属于微生物菌剂技术领域。
背景技术
工业“三废”的排放、城市生活产生的污水和垃圾的污染以及含有重金属的农药、化肥的不合理使用，导致了土壤污染。因此，研究重金属在水稻生长过程中的吸收富集规律，寻找籽实中重金属减少或消除的方法，为无公害稻米的生产技术创新提供科学依据和工程化基础，具有重要的理论意义和实用价值。
水稻受重金属污染之后，其植株处于重金属胁迫环境中，将产生不同程度的伤害。根据逆境胁迫的有关理论，任何逆境都会使光合速率下降，同化物形成减少，叶绿体受伤，呼吸速率也发生变化，有关光合和呼吸的酶失活或变性，合成酶的作用下降，水解酶的作用增强，从而引起植物体内生理生化指标的变化。而且，重金属还能与植物体内的某些酶进行螯合，破坏酶的活性，从而使得植物体内生理生化的变化尤为复杂。而土壤微生物对土壤重金属环境的改善具有重要作用。
中国专利文献CN108441451A（申请号201810329646.2）公开了一种复合微生物土壤修复剂，包括节杆菌(Arthrobacter sp.)LHM7719菌剂、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌剂和复合酶；复合酶由甘油醛-3-磷酸脱氢酶和β-淀粉酶构成。该发明还公开了上述复合微生物土壤修复剂的制备方法和应用，将节杆菌(Arthrobacter sp.)LHM7719用于土壤修复领域，且节杆菌(Arthrobacter sp.)LHM7719与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶配合能够显著降低土壤中重金属砷、铅和镉的含量；与β-淀粉酶配合能够高效降解土壤中的石油烃，具有良好的应用前景。上述菌剂中需要添加复合酶制剂，导致其施用成本过高，无法大面积推广。如何获得一种既能够改善土壤环境特别是降低土壤重金属污染，又能够实现促进水稻生长、降低土壤重金属对水稻籽粒影响的微生物菌剂，对于改变目前水稻种植现状、确保粮食安全具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种适用于水稻种植的微生物改良剂及其应用，该微生物改良剂既有良好的水稻促生作用，又可以抑制水稻对重金属的吸收，降低水稻籽粒中重金属的含量。
本发明的技术方案如下：
一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) AM17，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为：CGMCC NO. 27031。
一株节杆菌(Arthrobacter sp.) AM28，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为：CGMCC NO. 27035。
一种适用于水稻种植的微生物改良剂，包括枯草芽孢杆菌AM17和节杆菌AM28。
根据本发明优选的，所述微生物改良剂中枯草芽孢杆菌AM17和节杆菌AM28的活菌数之比为1︰（0.4~5），总活菌数为（1~5）×109cfu/g。
进一步优选的，所述微生物改良剂中枯草芽孢杆菌AM17和节杆菌AM28的活菌数之比为1︰（0.4~2），总活菌数为（2~5）×109cfu/g。
根据本发明优选的，所述微生物改良剂的形式为海藻酸钠包埋胶球。
本发明一种优选的技术方案，上述微生物改良剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）分别将枯草芽孢杆菌AM17和节杆菌AM28在LB固体培养基上进行活化培养，制得活化枯草芽孢杆菌AM17和活化节杆菌AM28；
（2）将步骤（1）制得的活化枯草芽孢杆菌AM17和活化节杆菌AM28分别接种于种子培养基中进行种子培养，制得枯草芽孢杆菌AM17种子液和节杆菌AM28种子液；
（3）将步骤（2）制得的枯草芽孢杆菌AM17种子液和节杆菌AM28种子液分别接种于发酵培养基中进行发酵培养，制得枯草芽孢杆菌AM17菌液和节杆菌AM28菌液；
（4）将步骤（3）制得的枯草芽孢杆菌AM17菌液和节杆菌AM28菌液混合，经海藻酸钠包埋后，制得微生物改良剂。
根据本发明优选的，步骤（1）中所述活化培养的条件为：33～37℃活化培养1.5～2.5天；所述LB固体培养基的组份如下：
蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，琼脂 20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。
根据本发明优选的，步骤（2）中所述种子培养的条件为：33～37℃、120～180转/分钟摇床培养20～28h；所述种子培养基的组分如下：
枯草芽孢杆菌AM17的种子培养基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1L，pH 7.0；
节杆菌AM28的种子培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，MgCl20.5 g，K2HPO40.8 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。
根据本发明优选的，步骤（3）中所述发酵培养的接种量为发酵培养基体积的2%～10%。
根据本发明优选的，步骤（3）中所述发酵培养的条件为：33～37℃、溶氧20%～70%的条件下，发酵培养24～48h；所述发酵培养基的组分如下：
枯草芽孢杆菌AM17的发酵培养基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1L，pH 7.0；
节杆菌AM28的发酵培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，MgCl20.5 g，K2HPO40.8 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。
根据本发明优选的，步骤（4）中所述海藻酸钠包埋是将混合后的菌液与质量分数为3~5%海藻酸钠溶液按体积比1:（1～5）混合，搅拌均匀；然后滴入质量分数为2~4%的CaCl2溶液中，制备海藻酸钠包埋胶球。
上述微生物改良剂在水稻种植中的应用。
根据本发明优选的，所述水稻是在重金属污染农田中种植。
根据本发明优选的，所述应用是向种植水稻的重金属污染农田中使用上述微生物改良剂，使用量为1～10kg/亩，农田灌水后均匀撒施在农田中。
有益效果：
1、本发明中从自然界筛选的枯草芽孢杆菌AM17菌株，与目前已知的枯草芽孢杆菌相比，在偏酸性镉污染土壤中对水稻吸收镉的阻遏作用更为显著，降低水稻籽粒对镉的吸收效果更为突出。
2、本发明中筛选的节杆菌AM28在偏酸性镉污染土壤中对镉的吸附作用更为显著，能显著降低土壤中有效态镉的含量，降低水稻对镉的吸收。
3、本发明制得的微生物改良剂，结合节杆菌AM28对镉的吸附作用以及枯草芽孢杆菌AM17对水稻吸收镉的阻遏作用，协同降低水稻对镉的吸收，降低水稻籽粒中镉的浓度，同时降低土壤中有效态镉的浓度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例中涉及的微生物：
一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) AM17，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为：CGMCC NO. 27031。
一株节杆菌(Arthrobacter sp.) AM28，于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为：CGMCC NO. 27035。
实施例1
一种微生物改良剂的制备方法，步骤如下：
（1）分别将枯草芽孢杆菌AM17和节杆菌AM28于35℃条件下在LB固体培养基中活化培养2天，制得活化枯草芽孢杆菌AM17和活化节杆菌AM28；
其中，LB固体培养基的组分如下：
蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；121℃灭菌20min；
（2）将步骤（1）制得的活化枯草芽孢杆菌AM17和活化节杆菌AM28分别接种至种子培养基中于35℃、150转/分钟条件下摇床培养24h，制得枯草芽孢杆菌AM17种子液和节杆菌AM28种子液；
其中，枯草芽孢杆菌AM17的种子培养基组份如下：
蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；
节杆菌AM28的种子培养基组份如下：
葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，MgCl20.5 g，K2HPO40.8 g，蒸馏水1 L，pH7.0；
（3）将步骤（2）制得的枯草芽孢杆菌AM17种子液和节杆菌AM28种子液分别按发酵培养基5%的体积百分比接种至发酵培养基中，35℃、溶氧50%的条件下，发酵培养32h，制得菌体浓度为7.5×109cfu·mL-1的枯草芽孢杆菌AM17菌液和菌体浓度为4.0×109cfu·mL-1的节杆菌AM28菌液；
其中，枯草芽孢杆菌AM17的发酵培养基组份如下：
蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；
节杆菌AM28的发酵培养基组份如下：
葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，MgCl20.5 g，K2HPO40.8 g，蒸馏水1 L，pH7.0；
（4）按质量比例取步骤（3）制得的节杆菌AM28菌液1份和枯草芽孢杆菌AM17菌液1份，充分混匀，得混合菌液；
（5）制备质量分数为4%的海藻酸钠溶液，与步骤（4）制得的混合菌液按1:1的质量比例充分混匀，然后滴入质量分数为2%的CaCl2溶液中，制备直径为2 mm的微生物改良剂的海藻酸钠包埋胶球。
经检测，海藻酸钠包埋胶球中，枯草芽孢杆菌AM17与节杆菌AM28的活菌数之比为2.2:1，总活菌数为3.5×109cfu/g。
实施例2
如实施例1所述的制备方法，不同之处在于，步骤（4）中按质量比例取节杆菌AM28菌液3份和枯草芽孢杆菌AM17菌液1份，充分混匀，得混合菌液。
枯草芽孢杆菌AM17的活化及培养方法同实施例1。
节杆菌AM28的活化及培养方法同实施例1。
如实施例1，取枯草芽孢杆菌AM17菌液1份、节杆菌AM28菌液3份，充分混匀后，经实施例1步骤（5）相同操作后制备得微生物改良剂的海藻酸钠包埋胶球。
经检测，海藻酸钠包埋胶球中，枯草芽孢杆菌AM17与节杆菌AM28的活菌数之比为1:1.5，总活菌数为2.6×109cfu/g。
对比例1
如实施例1所述的微生物改良剂，不同之处在于，枯草芽孢杆菌AM17替换为枯草芽孢杆菌CGMCC No.1950，其中，枯草芽孢杆菌CGMCC No.1950为本实验室早期筛选到的菌株，最早公开于专利CN101050435A（申请号200710013906.7）中：
枯草芽孢杆菌CGMCC No.1950的活化及培养方法与实施例1中枯草芽孢杆菌AM17的一致。
节杆菌AM28的活化及培养方法同实施例1中一致。
本对比例中将制得的枯草芽孢杆菌CGMCC No.1950菌液与节杆菌AM28菌液进行混合，两者质量比例为1:1。然后制备微生物改良剂的海藻酸钠包埋胶球，方法与实施例1中一致。
经检测，上述海藻酸钠包埋胶球中，枯草芽孢杆菌CGMCC No.1950与节杆菌AM28的活菌数之比为2.2:1，总活菌数为3.5×109cfu/g。
对比例2
如实施例1所述的微生物改良剂，不同之处在于，节杆菌AM28替换为节杆菌CGMCC1.1894：
枯草芽孢杆菌AM17的活化及培养方法同实施例1中一致。
节杆菌CGMCC1.1894的活化及培养方法同实施例1中节杆菌AM28的一致。
本对比例中将制得的枯草芽孢杆菌AM17菌液与节杆菌CGMCC1.1894菌液进行混合，两者质量比例为1:1。然后制备微生物改良剂的海藻酸钠包埋胶球，方法与实施例1中一致。
经检测，上述海藻酸钠包埋胶球中，枯草芽孢杆菌AM17与节杆菌CGMCC1.1894的活菌数之比为2.2:1，总活菌数为3.5×109cfu/g。
对比例3
如实施例1所述的微生物改良剂，不同之处在于，微生物改良剂中只含有枯草芽孢杆菌AM17，不含有节杆菌AM28，制备步骤如下：
（1）将枯草芽孢杆菌AM17于35℃条件下在LB固体培养基中活化培养2天，制得活化枯草芽孢杆菌AM17；
其中，LB固体培养基的组分如下：
蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；121℃灭菌20min；
（2）将步骤（1）制得的活化枯草芽孢杆菌AM17接种至种子培养基中于35℃、150转/分钟条件下摇床培养24h，制得枯草芽孢杆菌AM17种子液；
其中，枯草芽孢杆菌AM17的种子培养基组份如下：
蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；
（3）将步骤（2）制得的枯草芽孢杆菌AM17种子液按发酵培养基5%的体积百分比接种至发酵培养基中，35℃、溶氧50%的条件下，发酵培养32h，制得菌体浓度为7.5×109cfu·mL-1的枯草芽孢杆菌AM17菌液；
其中，枯草芽孢杆菌AM17的发酵培养基组份如下：
蛋白胨 10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；
（4）制备质量分数为4%的海藻酸钠溶液，与步骤（3）制得的枯草芽孢杆菌AM17菌液按1:1的质量比例充分混匀，然后滴入质量分数为2%的CaCl2溶液中，制备直径为2 mm的微生物改良剂的海藻酸钠包埋胶球。
经检测，海藻酸钠包埋胶球中的活菌数为3.8×109cfu/g。
对比例4
如实施例1所述的微生物改良剂，不同之处在于，微生物改良剂中只含有节杆菌AM28，不含有枯草芽孢杆菌AM17，制备步骤如下：
（1）将节杆菌AM28于35℃条件下在LB固体培养基中活化培养2天，制得活化节杆菌AM28；
其中，LB固体培养基的组分如下：
蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；121℃灭菌20min；
（2）将步骤（1）制得的活化节杆菌AM28接种至种子培养基中于35℃、150转/分钟条件下摇床培养24h，制得节杆菌AM28种子液；
其中，节杆菌AM28的种子培养基组份如下：
葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，MgCl20.5 g，K2HPO40.8 g，蒸馏水1 L，pH7.0；
（3）将步骤（2）制得的节杆菌AM28种子液按发酵培养基5%的体积百分比接种至发酵培养基中，35℃、溶氧50%的条件下，发酵培养35h，制得菌体浓度为6.3×109cfu·mL-1的节杆菌AM28菌液；
其中，节杆菌AM28的发酵培养基组份如下：
葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，MgCl20.5 g，K2HPO40.8 g，蒸馏水1 L，pH7.0；
（4）制备质量分数为4%的海藻酸钠溶液，与步骤（3）制得的节杆菌AM28菌液按1:1的质量比例充分混匀，然后滴入质量分数为2%的CaCl2溶液中，制备直径为2 mm的微生物改良剂的海藻酸钠包埋胶球。
经检测，海藻酸钠包埋胶球中的活菌数为3.7×109cfu/g。
实验例
大田实验在湖南衡阳水稻大田中进行，水稻实验品种为湘早籼45号。取实施例1~2以及对比例1~4制得的微生物改良剂，在相同的试验条件下进行改良试验。大田中的镉浓度为1.3~1.4mg/kg，pH 6.08，碱解氮123-127mg/kg，有效磷32-36mg/kg。微生物改良剂在灌田后翻耕前施用，每种实施例和对比例的微生物改良剂的用量一致，为5kg/亩，均匀撒至田中，翻耕至耕作层内。
表1 不同处理水稻收割后土壤指标及产量指标
通过表1中实施例与对比例微生物改良剂施用后的指标数据可以看出，仅含有枯草芽孢杆菌AM17的对比例3微生物改良剂对土壤中有效态Cd含量影响较小，但能显著降低水稻籽粒中的Cd含量；而仅含有节杆菌AM28的对比例4微生物改良剂能显著降低土壤中有效态Cd含量，进而降低了水稻籽粒中的Cd含量；可见，节杆菌AM28通过对Cd的吸附作用可以显著降低土壤中的有效态Cd含量，而枯草芽孢杆菌AM17通过阻遏作用降低了水稻籽粒对Cd的吸收。
通过实施例1与对比例微生物改良剂施用后的指标数据对比可以看出，本发明微生物改良剂中的两株菌在改良Cd污染土壤过程中具有协同作用，两者协同作用降低最终水稻籽粒中的Cd含量，降低土壤中的有效态Cd含量；且通过各处理组的产量数据可以看出，本发明的微生物改良剂可以有效提高水稻的产量。
因此，本发明的微生物改良剂在偏酸性土壤中具有促生提高产量、显著降低水稻籽粒Cd含量、显著降低土壤有效态Cd含量的功能，具有良好的应用前景。

Claims (9)

1. 一种适用于水稻种植的微生物改良剂，其特征在于，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AM17，还包括节杆菌(Arthrobacter sp.)AM28；
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AM17于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为：CGMCC NO. 27031；
所述节杆菌AM28于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为：CGMCC NO. 27035。
2. 如权利要求1所述的一种适用于水稻种植的微生物改良剂，其特征在于，所述微生物改良剂中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AM17和节杆菌AM28的活菌数之比为1︰（0.4~5），总活菌数为（1~5）×109cfu/g。
3. 如权利要求1所述的一种适用于水稻种植的微生物改良剂，其特征在于，所述微生物改良剂中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AM17和节杆菌AM28的活菌数之比为1︰（0.4~2），总活菌数为（2~5）×109cfu/g。
4.如权利要求1所述的一种适用于水稻种植的微生物改良剂，其特征在于，所述微生物改良剂的形式为海藻酸钠包埋胶球。
5.权利要求1所述的一种适用于水稻种植的微生物改良剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）分别将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AM17和节杆菌AM28在LB固体培养基上进行活化培养，制得活化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AM17和活化节杆菌AM28；
（2）将步骤（1）制得的活化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AM17和活化节杆菌AM28分别接种于种子培养基中进行种子培养，制得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AM17种子液和节杆菌AM28种子液；
（3）将步骤（2）制得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AM17种子液和节杆菌AM28种子液分别接种于发酵培养基中进行发酵培养，制得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AM17菌液和节杆菌AM28菌液；
（4）将步骤（3）制得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AM17菌液和节杆菌AM28菌液混合，经海藻酸钠包埋后，制得微生物改良剂。
6.如权利要求5所述的一种适用于水稻种植的微生物改良剂的制备方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：
i. 步骤（1）中所述活化培养的条件为：33～37℃活化培养1.5～2.5天；所述LB固体培养基的组份如下：
蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，琼脂 20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；
ii. 步骤（2）中所述种子培养的条件为：33～37℃、120～180转/分钟摇床培养20～28h；所述种子培养基的组分如下：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AM17的种子培养基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；
节杆菌AM28的种子培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，MgCl2 0.5 g，K2HPO40.8 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；
iii. 步骤（3）中所述发酵培养的接种量为发酵培养基体积的2%～10%；
iv. 步骤（3）中所述发酵培养的条件为：33～37℃、溶氧20%～70%的条件下，发酵培养24～48h；所述发酵培养基的组分如下：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AM17的发酵培养基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；
节杆菌AM28的发酵培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，MgCl2 0.5 g，K2HPO40.8 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；
v. 步骤（4）中所述海藻酸钠包埋是将混合后的菌液与质量分数为3~5%海藻酸钠溶液按体积比1:（1～5）混合，搅拌均匀；然后滴入质量分数为2~4%的CaCl2溶液中，制备海藻酸钠包埋胶球。
7.权利要求1所述的一种适用于水稻种植的微生物改良剂的应用，其特征在于，应用于水稻种植中。
8.如权利要求7所述的一种适用于水稻种植的微生物改良剂的应用，其特征在于，所述水稻是在重金属污染农田中种植。
9.如权利要求8所述的一种适用于水稻种植的微生物改良剂的应用，其特征在于，所述应用是向种植水稻的重金属污染农田中使用权利要求2所述的微生物改良剂，使用量为1～10kg/亩，农田灌水后均匀撒施在农田中。
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