CN106493167B - 地衣芽孢杆菌和菌剂及它们的应用和钝化重金属的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物环境修复领域，具体公开了一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)及其应用，该地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNo.10852。还公开了一种含有该地衣芽孢杆菌的菌剂和钝化重金属的方法。本发明的地衣芽孢杆菌能够同时对水体和土壤中的多种重金属(镉、砷、铅、汞和铬)起到钝化作用。在水相中，本发明提供的地衣芽孢杆菌对镉、砷、铅、汞和铬的去除率分别高达73.49％、68.26％、81.07％、58.44％和70.21％。在重金属污染的土壤中，也能够对以上五种重金属进行有效地钝化。并且，采用本发明的地衣芽孢杆菌能够同时对5种重金属钝化，操作简便，能耗小，不会造成二次污染，并且周期较短，具有较高的经济效益和社会效益。

Description

地衣芽孢杆菌和菌剂及它们的应用和钝化重金属的方法

技术领域

本发明涉及微生物环境修复领域，具体地，涉及一株具有钝化重金属功能的地衣芽孢杆菌，含有该地衣芽孢杆菌的菌剂，以及它们的应用和一种钝化重金属的方法。

背景技术

随着工业、城市污染的加剧和农用化学物质种类、数量的增加，土壤重金属污染日益严重，且污染面积也在逐年扩大。重金属污染物在土壤中滞留时间长，不能被微生物降解，并可经水、植物等介质最终影响人类健康。我国土壤受镉、砷、铅、汞、铬等重金属污染严重，据我国农业部进行的全国污灌区调查，在约140万平方千米的污灌区中，遭受重金属污染的土地面积占污水灌区总面积的64.8％，其中轻度污染的占46.7％，中度污染的占9.7％，严重污染的占8％。我国每年因重金属污染而减产的粮食约1000多万吨，被重金属污染的粮食每年多达1200万吨，合计经济损失至少200亿元。

重金属污染土壤和地下水的典型特征是持续时间长，污染控制难度大，修复费用高。目前理论上和技术上可行的修复技术主要有植物修复、微生物修复、化学修复、物理修复和联合修复等几大类。其中，物理方法往往工程量大，能耗大；化学方法大多花费高，易造成二次污染；生物法中的植物修复受到较多研究人员的青睐，但植物生长缓慢，修复周期长，而微生物修复处理费用低，对环境影响小，效率高，是一种环境友好，经济可行的修复技术。

但目前的微生物菌株或者是对重金属的修复效果不佳，或者是只能够单一修复某特定的重金属。因此，筛选出能够高效并且同时钝化多种重金属的微生物菌株势在必行。

发明内容

本发明的目的为了克服现有技术存在的以上缺陷，提供一株能够在简单操作的条件下，无污染的且修复周期短的同时对多种重金属进行钝化的地衣芽孢杆菌。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，其中，所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.10852。

第二方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有如上所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

第三方面，本发明提供了如上所述的地衣芽孢杆菌和/或如上所述的菌剂在重金属钝化中的应用。

第四方面，本发明提供了一种钝化重金属的方法，该方法包括：将如上所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，和/或如上所述的菌剂与含有重金属污染的环境接触，以对环境中的重金属进行钝化。

优选的，该方法还包括向所述含有重金属污染的环境中加入无机盐。

优选的，所述无机盐选自KH₂PO₄、K₂HPO₄、NH₄NO₃、MgSO₄、CaCl₂和FeSO₄中的至少一种。

本发明的地衣芽孢杆菌能够同时对水体和土壤中的多种重金属(镉、砷、铅、汞和铬)起到钝化作用。在水相中，本发明提供的地衣芽孢杆菌对镉、砷、铅、汞和铬的钝化率分别高达73.49％、68.26％、81.07％、58.44％和70.21％。在重金属污染的土壤中，也能够对以上五种重金属进行有效地钝化。并且，采用本发明的地衣芽孢杆菌至少能够同时对5种重金属钝化，操作简便，能耗小，不会造成二次污染，并且周期较短，具有较高的经济效益和社会效益。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明的菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，并于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.10852。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

一方面，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，其中，所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.10852。

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)分离自安徽宣城的烟植土壤。

所述分离的方法可以为本领域常规的筛选新菌株的方法，例如，液相富集法或土壤环流法。

液相富集法具体可以包括：称取适量镉污染土壤样品加入到装有LB液体培养基的三角瓶中，加入适量玻璃珠。将三角瓶在28-30℃，150-170rpm下振荡；将土壤混合液转入离心管，取离心后的上清液作为镉钝化微生物的来源。将所述上清液接种到含有镉的LB液体培养基中，在28-30℃，150-170rpm下振荡培养。用无菌吸管吸取1-2mL，移入另一个富集培养三角瓶中。如此转移三次后，在LB固体培养基上进行平板划线，分离单菌落。

土壤环流法具体可以包括：称取镉污染土壤与适量粒径约为3mm的砂粒混合均匀，置于环流装置的上层。下层装入LB培养基作为环流液。启动空气压缩机，开始驯化过程，期间根据环流液的蒸发情况定期补加环流液。驯化结束后，取上层土壤和下层环流液，将驯化后的微生物在LB固体培养基上进行平板划线，分离单菌落。

本发明从筛选出的菌株中获得了一株对多种重金属(至少包括镉、砷、铅、汞和铬)耐抗性最强的细菌进行了DNA提取与鉴定，鉴定结果显示，该菌株的16S rDNA序列(如SEQID No：1所示)与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)有100％的同源性，可确定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，并于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10852，命名为LH-R。

本发明提供的地衣芽孢杆菌经过培养能够产生大量地衣芽孢杆菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述地衣芽孢杆菌增殖即可，例如，可以按照10⁷CFU/mL的接种量将地衣芽孢杆菌的活菌体接种于LB培养基中，并且在好氧条件下，在25-38℃的温度下培养8-72小时后，得到培养液。

本发明可以进一步分离上述培养液中的地衣芽孢杆菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。

第二方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有如上所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

本发明的发明人在研究的过程中意外的发现，本发明的地衣芽孢杆菌的死菌体和活菌体均能够有效对多种重金属进行钝化。因此，如上所述的地衣芽孢杆菌可以为活菌体，也可以为死菌体，还可以为活菌体和死菌体的混合菌体。但本发明的发明人还发现，当选用本发明的地衣芽孢杆菌的活菌体对重金属进行钝化时，钝化效果更好。因此，优选的，所述菌剂含有如上所述的地衣芽孢杆菌的活菌体。

根据本发明，所述菌剂中所述地衣芽孢杆菌的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。

另外，根据预定的用途不同，本发明提供的菌剂可以制备为不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种赋形剂均为本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。

第三方面，本发明还提供了如上所述的地衣芽孢杆菌和/或如上所述的菌剂在重金属钝化中的应用。

本发明提供的地衣芽孢杆菌对多种重金属，例如，镉、砷、铅、汞和铬等均有一定的钝化作用。

本申请中，术语“钝化”是指使重金属固定在污染土壤的表面，降低重金属的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复重金属污染的环境的目的。在本文中，对重金属进行“钝化”和对重金属进行“去除”是可替换使用的。

第四方面，本发明提供了一种钝化重金属的方法，该方法包括：将如上所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，和/或如上所述的菌剂与含有重金属污染的环境接触，以对环境中的重金属进行钝化。

如上所述的，本发明提供的地衣芽孢杆菌的活菌体对重金属具有更好的钝化效果，因此，本发明优选在所述地衣芽孢杆菌能够存活的条件下对重金属进行钝化。其中，术语“地衣芽孢杆菌能够存活”是指在含有重金属的环境中，至少大于20％，优选至少大于40％，更优选至少大于60％的菌体能够存活。术语“地衣芽孢杆菌能够存活的条件”是指至少包括地衣芽孢杆菌能够存活最基本的条件，例如，温度、营养源等，此为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

另外，当加入到环境中的为本发明的简单芽孢杆菌的活菌体时，还可以向环境中添加适量的适于所述简单芽孢杆菌生长的营养物质，例如，LB培养液，或者是无机盐培养液。所述无机盐培养液例如可以为含有KH₂PO₄、K₂HPO₄、NH₄NO₃、MgSO₄、CaCl₂和FeSO₄中的至少一种的无机盐培养液，优选为含有KH₂PO₄、K₂HPO₄、NH₄NO₃、MgSO₄、CaCl₂和FeSO₄的无机盐培养液，更优选为含有0.1-0.2％的KH₂PO₄，0.1-0.2％的K₂HPO₄，0.05-0.1％的NH₄NO₃，0.05-0.1％的MgSO₄，0.001-0.002％的CaCl₂，0.01-0.02％的FeSO₄·7H2O；pH＝6.8-7.0的无机盐培养液，其中，各成分含量以重量份计。

根据本发明的钝化重金属的方法，所述重金属的具体选择可以为如上所述的，此处不再重复。

根据本发明，所述含有重金属污染的环境可以包括任何含有重金属的环境，例如，所述含有重金属污染的环境可以包括含有重金属的土壤或水体。

根据本发明，加入至所述含有重金属污染的环境中的地衣芽孢杆菌的形式并没有特别的限定，只要保证加入后所述地衣芽孢杆菌能够在所述含有重金属污染的环境中起作用并且对所述重金属有效钝化即可，加入的所述地衣芽孢杆菌的形式，例如，可以为培养至对数期的菌体，也可以为冷冻干燥后的菌体干粉。

本发明对加入的地衣芽孢杆菌的数量也没有特别的限制，这可以根据所述含有重金属污染的环境中的重金属的含量以及钝化难易程度来决定，例如，当所述环境中的重金属含量较高或较难钝化或所述环境对于所述地衣芽孢杆菌的生存较不利时，可以提高所述地衣芽孢杆菌的接种量；当所述环境中的重金属含量较低或较易钝化或所述环境对所述地衣芽孢杆菌的生存的影响较小时，可以减少所述地衣芽孢杆菌的接种量。

根据本发明，当所述含有重金属的环境为土壤时，为了进一步促进本发明提供的地衣芽孢杆菌对重金属的钝化效率，优选的，将土壤中的水含量控制在至少15重量％，更优选为18-30重量％。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中：

LB液体培养基：0.8-1％蛋白胨，0.5-0.8％酵母粉，1-1.5％氯化钠，pH＝6.8-7.0。

本发明的菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，以下简称菌株LH-R，于2015年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.10852。

参比菌株为简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)，以下简称菌株D，筛选自安徽宣城土壤。

可交换态镉含量用ICP-AES的方法进行测定；可交换态砷含量用ICP-AES的方法进行测定；可交换态铅含量用ICP-AES的方法进行测定；可交换态汞含量用ICP-AES的方法进行测定；可交换态铬含量用ICP-AES的方法进行测定。

镉去除率＝(处理前可交换态镉含量-处理后可交换态镉含量)/处理前可交换态镉含量×100％；

砷去除率＝(处理前可交换态砷含量-处理后可交换态砷含量)/处理前可交换态砷含量×100％；

铅去除率＝(处理前可交换态铅含量-处理后可交换态铅含量)/处理前可交换态铅含量×100％；

汞去除率＝(处理前可交换态汞含量-处理后可交换态汞含量)/处理前可交换态汞含量×100％；

铬去除率＝(处理前可交换态铬含量-处理后可交换态铬含量)/处理前可交换态铬含量×100％。

制备例

将本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)以及参比的简单芽孢杆菌在LB液体培养基中活化2次，所述活化在28-30℃下进行10-12小时，菌体浓度达到10⁹CFU/mL，分别得到活化的本发明的地衣芽孢杆菌(菌株LH-R)和活化的参比的简单芽孢杆菌(菌株D)，分别于4℃保存备用。

实施例1

本实施例用于说明本发明的地衣芽孢杆菌对重金属的钝化性能

(1)在水相中对重金属的钝化能力

向去离子水中加入重金属镉、砷、铅、汞和铬，加入量使各重金属的浓度均为100mg/L，121℃灭菌15min，冷却至室温备用。

将以上活化的本发明的菌株LH-R按照1-2％的接菌量接入LB液体培养基中，28-30℃，170rpm下振荡培养18h，取100mL培养好的菌液4℃，4000rpm下离心20min，收集所有菌体，将菌体加入到如上配制的含有重金属镉、砷、铅、汞、铬的水溶液中，170rpm，30±1℃下培养8h。然后离心取样，检测上清中交换态的镉、砷、铅、汞和铬的含量，并计算本发明的菌株LH-R对镉、砷、铅、汞和铬的去除率，结果见表1。

(2)对土壤中重金属的钝化效果

相对于1kg含有重金属的污染土壤，加入100mL的菌液，搅拌均匀，24±1℃下培养8d，保证含水量为20％左右。8天后，将钝化前和钝化后的土壤在70℃下烘干，准确称取1g，加入40ml 0.1mol/L的HAc，放在恒温振荡器中24℃下连续震荡16h，然后4000r/min下离心20min。取上清液，分别测定上清液中游离态的镉、砷、铅、汞和铬的含量，并计算去除率。结果见表2。

对比例1

本对比例用于说明参比的菌株D对重金属的钝化性能

按照实施例1中的方法对水相和土相中的重金属进行钝化，不同的是，所使用的菌株为参比菌株D。结果见表1和表2。

对比例2

本对比例用于说明自然状态下重金属的钝化性能(空白对照)

按照实施例1中的方法对水相和土相进行处理，不同的是，不加入任何菌株。结果见表1和2。

表1

由表1可以看出，本发明的地衣芽孢杆菌能够同时对水体和土壤中的多种重金属(镉、砷、铅、汞和铬)起到钝化作用。在水相中，在不额外加入营养源的情况下，本发明提供的地衣芽孢杆菌对镉、砷、铅、汞和铬的去除率分别高达73.49％、68.26％、81.07％、58.44％和70.21％。在重金属污染的土壤中，也能够对以上五种重金属进行有效地钝化。并且，采用本发明的地衣芽孢杆菌至少能够同时对5种重金属钝化，操作简便，能耗小，不会造成二次污染，并且周期较短，具有较高的经济效益和社会效益。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (8)

1.一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.10852。

2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其中，该菌剂含有所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的活菌体。

4.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌、权利要求2或3所述的菌剂在重金属钝化中的应用，所述重金属为镉、砷、铅、汞和铬中的至少一种。

5.一种钝化重金属的方法，该方法包括：将权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，和/或权利要求2或3所述的菌剂与含有重金属污染的环境接触，以对环境中的重金属进行钝化，所述重金属为镉、砷、铅、汞和铬中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述含有重金属污染的环境包括土壤或水体。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，该方法还包括向所述含有重金属污染的环境中加入无机盐。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述无机盐选自KH₂PO₄、K₂HPO₄、NH₄NO₃、MgSO₄、CaCl₂和FeSO₄中的至少一种。