CN112522155B - 一种地衣芽孢杆菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种地衣芽孢杆菌的新用途。含氧基团具有吸附重金属的能力。一株产生果胶酶的地衣芽孢杆菌，编号为地衣芽孢杆菌，发酵花生壳，使花生壳上的果胶得以降解，不仅使被包裹的，纤维素和半纤维素上，具有重金属吸附能力的的含氧基团，解除束缚。而且微生物培养过程会产生一些具有含氧基团的代谢物，同时果胶水解使花生壳结构更为疏松，吸附表面积增加，这样多因素提高吸附能力。从而有效提高了花生壳对重金属的吸附量。

Description

一种地衣芽孢杆菌及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及发酵工程和酶工程。

背景技术

随着工业化发展日益加快，对土地的重金属离子污染也日趋严重，目前，重金属污染的治理主要有两种途径：

1、改变重金属的存在状态，降低其活性，使其钝化，脱离食物链，减小其毒性；

2、利用特殊植物吸收土壤中的重金属，然后将该植物除去或用工程技术将重金属变为可溶态、游离态，再经过淋洗，然后收集淋洗液中的重金属，从而达到回收重金属和减少土壤中重金属的双重目的。

两条途径比较，后者成本较高，周期较长，因此通常采用第一条途径。

改变重金属存在状态的方法有，物理法、化学法、生物法。其中物理法和化学法处理工程量大，成本高。生物法包括动物法，植物法和微生物法，其中微生物法资源丰富，周期短，不影响耕种，并具有多种综合治理效果等优势。

纤维素分子结构中含有较多的羟基、羧基等含氧基团，具有吸附重金属的能力。花生壳为可再生生物质，因为其富含纤维素，因此有吸附重金属的功能。但因为花生壳中的纤维素被果胶质包裹，含氧基团受到束缚。因此，未经过加工处理的花生壳的吸附能力很低。通常将其制备成生物活性炭，作为吸附材料推广应用。但用花生壳制备生物活性炭，要求条件苛刻，制作成本高，产品价格昂贵。

发明内容

本发明的目的是提供一种地衣芽孢杆菌的新用途，以解决现有技术中所存在的上述问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.20977，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年10月29日。

该菌株从盐碱土中分离、筛选得到，并送中国科学院微生物研究所，鉴定为地衣芽孢杆菌。现由申请人制成试管斜面种子，置冰箱4℃左右冷藏。

一种如前述的地衣芽孢杆菌在生产碱性果胶酶中的用途。

一种生物制剂，其活性成分包括：

如前述的地衣芽孢杆菌，或/和，

如前述的地衣芽孢杆菌的发酵产物。

一种如前述的生物制剂的制备方法，其包括如下步骤：

将前述地衣芽孢杆菌接种于发酵培养基中发酵；所述发酵培养基包括花生壳。

作为优选方案，所述发酵培养基的制备方法为：

将食用碱、磷酸氢二钾和硫酸镁溶解于水中后，得到营养液；

将花生壳粉碎后，加入所述营养液中，分散均匀，即可。

作为优选方案，所述发酵的温度为30～45℃。

作为优选方案，所述食用碱、磷酸氢二钾和硫酸镁在营养液中的质量分数分别为2％、0.1％和0.02％，所述花生壳与营养液的重量比为1：(1～1.2)。

作为优选方案，所述地衣芽孢杆菌与发酵培养基的用量比例为：每10kg花生壳接入1～3个茄子瓶种子。

作为优选方案，所述固体种子曲的接种量为花生壳重量的10～20％。

一种如前述的生物制剂在土壤中重金属离子处理中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明利用生物技术，部分水解花生壳中的果胶，不仅使更多含氧基团(如羟基、羧基、羰基等等)裸露；而且增加了果胶水解，产生的醛基和羧基；及微生物代谢产生的有机酸，同时使花生壳的结构变得疏松，增加了花生壳的比表面积，也即增加了含氧化学基团与被吸附物料的接触面积，因而从多方面提高了花生壳对重金属的吸附能力；

2、本方法操作简单，设备投资少、原料来源广、价格低廉、废物利用、减少焚烧污染、有利于推广。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的地衣芽孢杆菌的菌种斜面和茄子瓶种子照片；

图2为本发明中得到的生物制剂照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1本实施例涉及地衣芽孢杆菌的扩大培养

一、菌种扩大培养

1、菌种保存：试管斜面保存。

2、斜面种子培养

1)制备斜面培养基：将淀粉、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁溶解于水中后，控制淀粉、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁的质量分数分别为：1％、2％、0.1％、0.02％，用氢氧化调节pH值为7左右，按照溶液重量的2.5％加入琼脂，121℃、30min灭菌。另将碳酸钠配制成质量分数20％的水溶液，同样于121℃、30分钟灭菌，灭菌后，按终浓度1％的用量，趁热将碳酸钠与其他培养基成分混合均匀后，分装入已经灭菌的无菌试管中，摆成斜面。斜面凝固后，置培养箱中，于37℃，空白培养2天，检查无菌后，放冰箱4℃左右冷藏备用。

2)斜面种子接种与培养：取空白斜面，在无菌室，按常规方法从原始斜面种子接种，接种后置培养箱于30℃，培养5～7天。作为斜面种子，置冰箱4℃左右冷藏。

3)斜面菌种活化：斜面种子在使用前，按常规转接到空白斜面上，置培养箱于30℃，培养2天进行活化。然后转接液体种子。如图1所示。

3、液体种子培养：

1)液体种子培养基：淀粉1g，玉米浆2g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁0.02g，自来水100mL，加热溶解，用2mol/L氢氧化钠调节pH 7左右，250mL的三角瓶装培养液50mL，121℃、30分钟灭菌。

2)接种：液体种子培养基接种前加入已经灭菌的20％的碳酸钠溶液2.5mL。摇匀。用接种环接入经活化的斜面菌种1环。

3)液体种子培养：液体种子培养基接种后，置摇床，于180rpm，30～35℃培养24小时。

4、茄子瓶种子培养：

1)茄子瓶斜面固体培养基：培养基配方与液体种子培养基相同。每个茄子瓶装除碳酸钠以外其它成分的液体种子培养基80mL，再加入琼脂2g，加棉塞，121℃，30分钟灭菌后，趁热加入经同样灭菌的20％浓度碳酸钠溶液4mL，摇匀，摆成斜面。斜面凝固后，于35℃空白培养2天，确认无菌。置冰箱，4℃左右冷藏备用。

2)茄子瓶接种：用无菌吸管吸取液体种子液0.1mL；加入茄子瓶斜面上，用无菌刮刀将液体种子在斜面上涂布均匀。

3)茄子瓶种子培养：接种后的茄子瓶斜面，置培养箱于30～37℃培养2～3天。作为固体种子曲的种子。

实施例2本实施例涉及一种固体种子曲的制备方法，具体包括如下步骤：

1、固体种子曲的培养：

1)培养基成分：

A.营养液配方：碳酸钠2％，磷酸氢二钾0.1％(化肥)，硫酸镁(化学纯)0.02％，用自来水配制。搅拌溶解。

B.固体种子曲配料：花生壳轧碎，按1:1.2比例加入营养液。在不锈钢盆中翻拌均匀。121℃、30分钟灭菌。即为固体种子曲培养基。

2)种子曲接种：灭菌后的种曲培养基，在种曲培养室，待物料温度冷却至37-40℃按10kg花生壳，用1～3个茄子瓶种子，进行接种。每个茄子瓶种子加50mL无菌水，用无菌刮刀刮下细菌细胞，小心搅散。在物料边缘分出少量物料，加入茄子瓶斜面种子(可以连茄子瓶斜面种子中的培养基一起加入)，翻拌均匀后。再与其余物料翻拌均匀。

3)种子曲培养方法：种子曲可以在不锈钢盆、盘中或种曲培养床上培养，物料接种后先堆积，插上温度计加盖保温培养，待培养料温度上升到35～40℃时，即可耙平；控制料层厚度约10～20cm；加盖保温，继续培养，培养过程中控制温度在30～40℃，根据温度变化，间歇翻拌降温，为了保持培养物料温度，培养室在夏天需降温，冬天需保温。种曲培养3-5天，制成固体种子曲，

地衣芽孢杆菌菌株经过实施例1和2，扩大培养制成固体种子曲。作为花生壳固体发酵的种子。

实施例3本实施例涉及一种花生壳发酵，制备花生壳制剂

1、发酵配料：称取轧碎的花生壳100kg。

另称取碳酸钠2.4kg，磷酸氢二钾120g，硫酸镁24g，加自来水120kg。搅拌溶解。加入花生壳中，翻拌均匀。即可接种。

2、发酵物料接种：培养料配好，称取固体种子曲10kg，分散加入物料中，翻拌均匀。

3、花生壳发酵培养

发酵物料接种后，先堆积，插上温度计，悬空铺盖塑料薄膜，保温、保湿培养发酵，待物料温度上升到35—40℃时，扒开铺平，控制料层厚度10-20cm，悬空铺盖塑料薄膜，继续培养。培养过程中，根据培养温度需要，间隙翻拌降温，或调整物料层厚度，将物料温度控制在30-45℃。培养5天。制成花生壳制剂1。如图2所示。

实施例4

配料与实施例3相同。按20％接种量，称取种子曲20kg，加入物料中翻拌均匀。培养方法与实施例3相同。培养3天，制成花生壳制剂2。.

实施例5本实施例涉及花生壳制剂对污染土壤重金属吸附效果检测：

污染土壤按1％的比例，分别加入实施例3和4经地衣芽孢杆菌发酵的花生壳制剂。老化处理12天。检测土壤浸出重金属离子的浸出量，以未经培养的花生壳，在同样条件下处理污染土壤做对照，测定结果见表1。如表1所示：花生壳经过地衣芽孢杆菌发酵后，对污染土壤中铬的吸附量由88.4％提高到100％；镉的吸附量由41.34％提高到98％；铅的吸附量由68.14％提高到94％；镍的吸附量由20.14％提高到63％。铜的吸附量由65.6％提高到95.7％。可见花生壳经过地衣芽孢杆菌菌株发酵后，对多种重金属的吸附量均有显著提高。

表1.发酵花生壳处理污染土壤对重金属元素浸出量的影响

在考察地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌发酵花生壳对污染土壤重金属吸附能力的同时，本发明也考察了地衣芽孢杆菌发酵花生壳处理污染土壤中镉和汞有效态含量的变化，结果如表2。如表2所示：花生壳经地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌菌株发酵后，能明显降低土壤中镉、汞的有效态含量。与未经发酵的花生壳相比，对污染土壤中镉的有效态含量的降幅由51.30％提高到96.47％；对汞的有效态含量降幅由52.38％提高到90.47％；

表2.地衣芽孢杆菌发酵花生壳处理污染土壤对土壤中Cd和Hg有效态的影响

以上结果说明：用能产生果胶酶的地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌菌株发酵花生壳，能显著提高花生壳对重金属污染土壤的修复能力。本方法对花生壳的有效利用，对污染环境的修复具有重要的社会意义和经济价值。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明利用生物技术，水解花生壳中的果胶质，不仅使更多含氧基团(如羟基、羧基、羰基等)裸露；而且增加了果胶水解产生的醛基和羧基；及微生物代谢产生的有机酸，同时使花生壳的结构变得疏松，增加了含氧基团与被吸附重金属的接触面积，因而从多方面提高了花生壳对重金属的钝化能力；

2、本方法操作简单，设备投资少、原料来源广、价格低廉、废物利用、减少焚烧污染、值得推广。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (6)

1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.20977。

2.一种生物制剂，其特征在于，由权利要求1所述的地衣芽孢杆菌发酵花生壳制备。

3.一种如权利要求2所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1所述地衣芽孢杆菌接种于发酵培养基中发酵；所述发酵培养基包括花生壳；

所述发酵培养基的制备方法为：

将食用碱、磷酸氢二钾和硫酸镁溶解于水中后，得到营养液；

将花生壳粉碎后，加入所述营养液中，分散均匀，即可；

所述发酵的温度为30~45℃。

4.如权利要求3所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述食用碱、磷酸氢二钾和硫酸镁在营养液中的质量分数分别为2%、0.1%和0.02%，所述花生壳与营养液的重量比为1：（1~1.2）。

5.如权利要求3所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌与发酵培养基的用量比例为：每10kg花生壳接入1~3个茄子瓶种子。

6.一种如权利要求2所述的生物制剂在土壤中重金属离子处理中的用途。

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