CN112538445B - 一种生物制剂的制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生物制剂的制备方法及其用途，本发明用可再生，富含纤维素的农作物秸秆、或食品加工及林产加工的废弃物为主要原料，利用我们自己从土壤分离筛选到的，能产生果胶酶的地衣芽孢杆菌，发酵生产环境修复生物制剂，提高物料对重金属的吸附能力，不仅能有效钝化污染土壤中的重金属元素，使其脱离食物链，确保食品安全。又能增加土壤肥效、改良土质、增加粮食产量。

Description

一种生物制剂的制备方法及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域。涉及发酵工程、酶工程和环境修复工程。

背景技术

随着工业化发展日益加快，对土地的重金属离子污染也日趋严重，目前，重金属污染的治理主要有两种途径：

1、改变重金属的存在状态，降低其活性，使其钝化，脱离食物链，减小其毒性；

2、利用特殊植物吸收土壤中的重金属，然后将该植物除去或用工程技术将重金属变为可溶态、游离态，再经过淋洗，然后收集淋洗液中的重金属，从而达到回收重金属和减少土壤中重金属的双重目的。

两条途径比较，后者成本较高，周期较长，因此通常采用的是前者。

改变重金属存在状态的方法分物理法、化学法、生物法。其中物理法和化学法处理工程量大，成本高。生物法包括动物法，植物法和微生物法，其中微生物法资源丰富，周期短，不影响耕种，并具有多种综合治理效果的优势。

纤维素分子结构中含有较多的羟基、羧基等含氧基团，具有吸附重金属的能力。农林产业中富含纤维素的下脚料；如花生壳、稻草、玉米秆、豆类秸秆、树枝、树皮、木屑等，为可再生生物质，因为其富含纤维素，因此有吸附重金属的功能。但因为这些物料中的纤维素被果胶质包裹，含氧基团受到束缚。因此，未经过加工处理的物料，吸附能力很低。通常将其制备成生物活性炭，作为吸附材料推广应用。但利用这些生物质制备生物活性炭，要求条件苛刻，制作成本高，产品价格昂贵。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物制剂的制备方法及其用途，以解决现有技术中所存在的上述问题。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种生物制剂的制备方法，其包括如下步骤：

S1、将碳源掺入营养液中后，得到固体培养基；

S2、将经过扩大培养的地衣芽孢杆菌接种到所述固体培养基中，在30～45℃下进行发酵培养，得到种子曲；

S3、将所述种子曲接种到碳源中，加入营养液，在30～45℃下进行培养，得到所述生物制剂。

作为优选方案，所述营养液的制备方法为：将食用碱、磷酸氢二钾和硫酸镁溶解于水中，混匀即可。

作为优选方案，所述食用碱、磷酸氢二钾和硫酸镁在营养液中的质量分数分别为1～4％、0.1～0.5％和0.02％。

作为优选方案，所述碳源与营养液的重量比为1：(1～3)。

作为优选方案，所述扩大培养的方法为：

将地衣芽孢杆菌菌株利用试管斜面种子培养基培养后，转入三角瓶液体种子培养基培养，然后再转入茄子瓶固体斜面培养基中培养，所述试管斜面种子培养基培养、液体种子培养基培养和茄子瓶种子培养基培养的温度均为30～37℃。

作为优选方案，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.20977，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年10月29日。

作为优选方案，所述试管斜面种子培养基的制备方法为，将淀粉、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钠和琼脂溶解于水中，即可；所述三角瓶液体种子培养基的制备方法为：将淀粉、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钠溶解于水中，即可。

作为优选方案，步骤S2中所述地衣芽孢杆菌接种量按10kg花生壳接2～5个茄子瓶种子；步骤S3中所述的种子曲接种量为碳源重量的20～50％。

作为优选方案，所述碳源为农林产业中富含纤维素的下脚料；所述碳源选自稻草、麦草、麦麸、木屑中的至少一种。

一种如前述的制备方法得到的活菌制剂在土壤中重金属离子吸附中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明利用生物技术，部分水解花生壳中的果胶，不仅使更多含氧基团(如羟基、羧基、羰基等等)裸露；而且增加了果胶水解，产生的醛基和羧基；及微生物代谢产生的有机酸，同时使花生壳的结构变得疏松，增加了花生壳的比表面积，也即增加了含氧化学基团与被吸附物料的接触面积，因而从多方面提高了花生壳对重金属的吸附能力；

2、本方法操作简单，设备投资少、原料来源广、价格低廉、废物利用、减少焚烧污染、有利于推广。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例，将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1：本实施例涉及地衣芽孢杆菌经过扩大培养，制备固体种子曲的方法。

1、通过试验，对微生物培养基的成分和配比进行优化，确定最佳培养基配方如下：

营养液配方：纯碱、磷酸氢二钾、硫酸镁的质量分数分别为：1～4％、0.1～0.5％、0.02％，生物质与营养液的重量配比为1：(1～3)。

2、通过实验，对微生物的培养条件和培养方法进行优化，最终确定最佳培养方法和培养条件为：在自然环境下，采用固体培养方法；培养温度控制在30～45℃，培养时间为2～5天；固体曲对生产物料的接种量为20～50％。

二、菌种扩大培养

1、菌种保存：试管斜面保存。

2、斜面种子培养

1)制备斜面培养基：将淀粉、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁溶解于水中后，控制淀粉、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁的质量分数分别为：1％、2％、0.1％、0.02％，用自来水溶解，再用2mol/L的氢氧化钠调节pH值7左右，按照溶液重量的2.5％加入琼脂，121℃、30min灭菌。另将碳酸钠配制成质量分数20％的水溶液，同样灭菌后，按终浓度1％的用量，趁热加入碳酸钠，与其他培养基成分混合均匀，分装入已经灭菌的无菌试管中，摆成斜面。待斜面凝固后，置培养箱中，于30—37℃空白培养2天，检查无菌后，放冰箱4℃左右冷藏备用。

2)斜面种子接种与培养：取空白斜面，按常规方法从原始斜面种子接转到新鲜斜面上，置培养箱于30—37℃，培养5～7天。作为斜面种子，置冰箱4℃左右冷藏备用。

3)斜面菌种活化：斜面种子在使用前，按常规转接到空白斜面上，置培养箱于30—37℃，培养2天进行活化。然后转接液体种子。

3、液体种子培养：

1)液体种子培养基：淀粉1g，玉米浆2g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁0.02g，加自来水100mL，溶解后，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH 7左右，250mL的三角瓶装培养液50mL，121℃、30分钟灭菌。

2)接种：液体种子培养基接种前加入已经灭菌的20％的碳酸钠溶液2.5mL。摇匀。用接种环接入经活化的斜面菌种1环。

3)液体种子培养：液体种子培养基接种后，置摇床，于160—180rpm，30～37℃培养24-48小时。

4、茄子瓶种子扩大培养：

1)茄子瓶斜面固体培养基配方与液体种子培养基相同。每个茄子瓶装除碳酸钠以外的液体种子培养基80mL，再加入琼脂2g，加棉塞，121℃，30分钟灭菌后，趁热加入经同样灭菌的20％浓度碳酸钠溶液4mL，小心摇匀，摆成斜面。37℃空白培养2天，确认无菌。置冰箱4℃左右冷藏备用。

2)茄子瓶接种：用无菌吸管吸取液体种子液0.1mL；加入茄子瓶斜面上，用无菌刮刀将液体种子在斜面上涂布均匀。

3)茄子瓶种子培养：接种后的茄子瓶斜面，置培养箱于30～37℃培养2～3天。作为固体种子曲的种子。

5、固体种子曲的培养：

1)培养基成分：

A.营养液配方：纯碱2—4％，磷酸氢二钾0.1％(化肥)，硫酸镁(化学纯)0.02％，用自来水配制。搅拌溶解。

B.固体种子曲配料：花生壳轧碎，按1:1.2比例加入营养液。在种子培养室在不锈钢盆中翻拌均匀。121℃、30分钟灭菌。

2)种子曲接种：灭菌后的种子曲培养料，放种曲培养室，待物料温度下降至40℃左右，接种量按10kg花生壳，接入2～5个茄子瓶种子。每个茄子瓶种子加50mL无菌水，用无菌刮刀刮下细菌细胞，小心搅散。在物料边缘分出少量物料，加入茄子瓶种子(可以连茄子瓶种子中的培养基一起加入)，翻拌均匀后。再与其余物料翻拌均匀。

3)种子曲培养方法：在种子培养室用不锈钢盆、盘或种曲培养床培养，物料接种后堆积，插上温度计加盖或悬空铺盖塑料薄膜，保温、保湿培养，待培养料温度上升到 35～40℃时，即可耙平；控制料层厚度约10～20cm，继续培养3天，培养过程中控制温度在30～40℃；温度过高，可以翻拌降温，根据温度变化，间歇翻拌降温，或降低物料厚度利于散热。为了保持培养物料温度，培养室在夏天需降温，冬天需保温。

三、生物制剂制备：在碱性培养基下，于自然环境中，采用固体培养方法制备，可以在洁净的水泥地面，或瓷砖地面上操作。

1)固体发酵培养基配料：

a.营养液配方：按重量百分比，碳酸钠2～4％，磷酸氢二钾0.1～0.5％(化肥)，硫酸镁(化学纯)0.02％，称取物料，用自来水配制。搅拌溶解。

生物质按1:1～3的比例加入营养液。翻拌均匀即可以接种。

2)固体种子曲接种：接种量为生物质重量的20～50％。按接种量称取固体种子曲，加入物料中，翻拌均匀。

3)生物质发酵培养：培养方法与种子曲相同。先堆积，后铺平，料层厚度在10～50cm。料层上悬空铺盖塑料薄膜，间歇翻拌，或调整物料厚度，控制发酵温度30～45℃，培养3～5天。制备成生物制剂。用于重金属污染土壤的修复。

实施例2：本实施例涉及一种花生壳发酵，制备花生壳生物制剂的方法

1、发酵配料：

称取碳酸钠2.4kg，磷酸氢二钾120g，硫酸镁24g，加自来水120kg。搅拌溶解。配制成营养液。

称取轧碎的花生壳100kg，加入已经溶解好的营养液，翻拌均匀。即可接种。

2、发酵物料接种：培养料配好，称取固体种子曲10kg，分散加入物料中，翻拌均匀。

3、生物制剂发酵培养：物料接种后，先堆积插上温度计，悬空铺盖塑料薄膜保温、保湿培养发酵，待物料温度上升至35℃左右，扒开铺平，控制料层厚度10-30cm，培养过程中，根据培养温度需要，间隙翻拌降温，或调整物料层厚度控制散热，控制物料温度30-45℃。培养4天。制成花生壳生物制剂1。

实施例3

本实施例的配料与实施例2相同。按20％接种量，称取种子曲20kg，加入物料中翻拌均匀。培养方法与实施例2相同。培养3天，制成花生壳生物制剂2。

实施例4本实施例涉及一种稻草发酵，用稻草代替花生壳，制备稻草生物制剂。

1、发酵配料：营养液配制与实施例2相同

称取粉碎稻草100kg，加入营养液120kg，因稻草吸水量大，加营养液后，再加水100kg.翻拌均匀，称取种子曲30kg，加入物料中翻拌均匀。

2、稻草生物制剂发酵培养：培养方法与实施例2相同。制成稻草生物制剂。

实施例5本实施例涉及利用实施例1～4得到的生物制剂治理重金属污染土壤的使用效果的检验

1、污染土壤按1％的比例，分别加入实施例1和2发酵条件优化后，经地衣芽孢杆菌发酵的花生壳生物制剂。老化处理12天。检测土壤浸出重金属离子的浸出量，以原污染土壤和在同样条件下用未经优化的发酵的花生壳处理污染土壤做对照，进行比较，测定结果见表1。表1结果显示：生物制剂对污染土壤中Cr、Cd、Pb、Ni、Cu、Zn的浸出量降幅均在95％以上。且比发酵条件优化前，污染土壤重金属元素Pb、Ni、Cu、 Zn的浸出量降幅有明显提高。上述结果显示发酵条件优化后，生物制剂对各种重金属几乎没有选择性，因此对各种重金属污染综合修复效果更好。

表1.生物制剂处理污染土壤对重金属元素浸出量的影响，与发酵条件优化前的比较

2、考察生物制剂对污染土壤中Hg有效态含量的影响。结果显示2个生物制剂对污染土壤中Hg有效态含量降幅分别是84.84％和81.17％。

3、用优化后的发酵条件，发酵花生壳、稻草。豆杆、玉米秆，检测制成的生物制剂对重铬酸钾的吸附量。测定结果见表2。

表2地衣芽孢杆菌发酵制备的生物制剂对重铬酸钾吸附量

注1.玉米秸秆因原料水分大，检测时，原料已经自然发霉，因此没有原料对照。

注2.FBA是枯草芽孢杆菌发酵的树皮生物制剂。

表2数据显示，多种生物质经过地衣芽孢杆菌培养发酵制成的生物制剂对重铬酸钾的吸附量均较发酵前有显著提高，且多种生物质制备的生物制剂，对重铬酸钾的吸附量均相近。这一结果说明：多种生物质都可以作为生物制剂的原料。

4、地衣芽孢杆菌生物制剂有机肥肥效测定：

1)污染土壤添加未发酵花生壳和添加发酵花生壳制剂后的肥效测定见表3。

表3.污染土壤添加地衣芽孢杆菌发酵花生壳后的肥效测定结果

样品名称	pH	有效磷(mg/kg)	有机质(g/kg)	速效钾(mg/kg)	碱解氮(mg/kg)
						土壤对照1	6.26	6.2	31.4	181	166
花生壳对照	6.13	2.0	34.7	310	184
						花生壳制剂1	6.47	24.8	33.1	344	220
花生壳制剂2	6.72	21.6	36.3	365	258
						花生壳制剂3	6.66	17.1	36.5	309	241

表3结果显示，污染土壤添加本发明的生物制剂后各项肥效均有所提高。

2)生物制剂的肥效测定

生物制剂的肥效测定结果见表4。

表4.生物制剂的肥效测定结果

表4数据说明：生物制剂的肥效测定结果达到我国制定的有机肥国家标准。

多次测定生物制剂的活菌数，均在1亿个/g以上。其数值超过生物有机肥国家标准。

由以上结果可见：

生物质富含纤维素，能吸附重金属。但吸附量很低。而且未经腐熟，用于农田会有烧苗现象。本发明用可再生的生物质原料，经过能产生果胶酶的地衣芽孢杆菌培养发酵，所研制的生物制剂，除具有修复重金属污染土壤，钝化重金属，阻止重金属进入食物链，保障食品完全的功能外。还兼具有机肥的多重功能、生物质经发酵后，能促使有机质腐熟，避免引起烧苗现象。

本发明所用原料为多种植物秸秆、食品加工的下脚料。来源丰富，价格低廉。且废物利用、减少环境污染。

利用地衣芽孢杆菌在碱性条件下培养，杂菌污染少。可以在自然环境中培养。操作简单、投资少、成本低。

我们研究的碱性条件、自然环境下，固体培养发酵技术，多种可再生生物质都可以作为原料，因此，只需要在专业环境下，保存、扩大培养菌种、制备固体种曲，大规模生产可以就地取材，就地培养发酵。利于推广应用。

该技术也适合于林业加工，或园林绿化产生的枯枝落叶、树皮木屑等富含纤维素的原料发酵制备类似的生物制剂。包括环境修复剂，生物有机肥等。

本发酵技术也适合园林绿化产生的枯枝，剪切树枝、落叶等就地发酵、腐熟转化为有机肥，就地使用。

本技术还可适用于有机垃圾堆积填埋发酵。

目前申请人正在研究，将本发酵技术，应用于盐碱土和酸性土壤的改良。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容和权利要求。

Claims (6)

1.一种生物制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将碳源掺入营养液中后，得到固体培养基；

S2、将经过扩大培养的地衣芽孢杆菌接种到所述固体培养基中，在30~45℃下进行发酵培养，得到种子曲；

S3、将所述种子曲接种到碳源中，加入营养液，在30~45℃下进行培养，得到所述生物制剂；

所述营养液的制备方法为：将食用碱、磷酸氢二钾和硫酸镁溶解于水中，混匀即可；

所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.20977；

所述碳源为农林产业中富含纤维素的下脚料；所述碳源选自稻草、麦草、麦麸、木屑中的至少一种。

2.如权利要求1所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述食用碱、磷酸氢二钾和硫酸镁在营养液中的质量分数分别为1~4%、0.1~0.5%和0.02%。

3.如权利要求1所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述碳源与营养液的重量比为1：（1~3 ）。

4.如权利要求1所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述扩大培养的方法为：

将地衣芽孢杆菌菌株利用试管斜面种子培养基培养后，转入三角瓶液体种子培养基培养，然后再转入茄子瓶固体斜面培养基中培养，所述试管斜面种子培养基培养、液体种子培养基培养和茄子瓶固体斜面培养基培养的温度均为30~37℃。

5.如权利要求4所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述试管斜面种子培养基的制备方法为，将淀粉、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钠和琼脂溶解于水中，即可；所述三角瓶液体种子培养基的制备方法为：将淀粉、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钠溶解于水中，即可。

6.一种如权利要求1所述的制备方法得到的活菌制剂在土壤中重金属离子吸附中的用途。