CN110713939B - 一种极低pH条件下降解木质纤维素来源抑制物的菌株及应用 - Google Patents

一种极低pH条件下降解木质纤维素来源抑制物的菌株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，一种极低pH条件下降解木质纤维素来源抑制物的菌株及应用。涉及宛氏拟青霉FN89(CGMCC 17665)可以在极低pH环境下有效降解木质纤维素生物质预处理所产生的糠醛、5‑羟甲基糠醛、乙酸、4‑对羟基苯甲醛、香草醛、丁香醛等抑制物，使木质纤维素生物质具备高效酶促水解和发酵的性能；该菌株可在葡萄糖、木糖等可发酵单糖存在的情况下，优先利用糠醛、5‑羟甲基糠醛、乙酸、香草醛、丁香醛等木质纤维素来源抑制物作为碳源供菌体生长和代谢；该菌株在不添加外源营养物质和水的前提下，可对干固颗粒形态的木质纤维素中的抑制物进行降解，无任何废水和固废产生。

Description

一种极低pH条件下降解木质纤维素来源抑制物的菌株及应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种极低pH条件下(1.8≤pH≤2.5)降解木质纤维素来源抑制物的菌株及应用。
背景技术
通过生物炼制技术将木质纤维素原料转变为可发酵糖，并用于微生物发酵，是获得可再生生物能源和高附加值材料的有效手段之一。预处理木质纤维素原料是生物炼制加工链的前提和核心步骤，通过一系列的物理、化学和生物过程打破木质纤维素原料坚固的超分子结构，改变纤维素的晶体结构至可酶促水解的无定形结构，部分降解半纤维素至木糖，并破坏包裹纤维素长纤维的木质素网状聚合结构。木质纤维素生物质经过预处理过程后，再在纤维素酶的酶促水解下可以继续释放出大量的葡萄糖、木糖等可发酵单糖，用于后续的发酵碳源生产液体生物燃料和生物基化学品。
预处理过程不可避免地产生一系列严重抑制后续纤维素酶活性、发酵微生物的细胞生长和代谢活性的抑制物。这些抑制物主要包括糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸、4-对羟基苯甲醛、香草醛、丁香醛等。必须采用有效的手段尽可能彻底的脱除或降解这些抑制物，后续的酶促水解和微生物发酵过程才能够得以顺利进行。目前采用的抑制物脱除手段主要包括水洗、过量石灰处理、离子交换吸附、活性炭吸附等。但是，这些方法中或者由于生物炼制技术进步不再具备实际意义(吸附所依赖的水相已经在先进的预处理过程消失)，或者伴随着大量的有毒废水排放、物料损失和系统高含水等因素不具备实际应用价值(水洗和过量石灰法)。为了解决上述问题，唐传生物科技有限公司的张厚瑞等 (CN 101735958、CN102010833)公开了一种在半纤维素水解液中培养东方伊萨酵母或西方伊萨酵母来进行糠醛和乙酸的部分降解，但降解能力有限，且只能在预处理液(半纤维素水解液)中进行，而先进的预处理技术已经不再有游离的半纤维素水解液存在。华东理工大学鲍杰等(CN102191279) 公开了一种使用树脂枝孢菌AmorphpthecaresinaeZN1对预处理后固态木质纤维素物料中的抑制物进行生物降解的方法，但是该菌株必须在预处理物料调整至接近中性pH下进行，需要使用氢氧化钙或氢氧化钠等碱性化合物中预处理过程所使用的酸催化剂或生物质自身固有的有机酸，从而产生了相当量的钙盐沉淀或可溶性盐，对下游废水处理和固废处理产生了很大压力。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
鉴于上述菌株和生产技术的不足，本发明提供一种可在极低pH条件下(1.8≤pH≤2.5)代谢木质纤维素来源抑制物的宛氏拟青霉FN89(CGMCC No. 17665)。该菌株可对经预处理的各种干固颗粒形态木质纤维素底物进行生物降解，在不调节pH、不添加营养物和水的条件下，通过固态发酵，既能有效代谢各类抑制物，又能避免可发酵糖的消耗，整个过程无任何废水和固废产生。该方法具有工艺简单、成本低廉、污染可控的优点，并保证了生物加工过程的完整性，具有工业生产潜力。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种极低pH条件下(1.8≤pH≤2.5)降解木质纤维素来源抑制物的菌株，其分类命名为宛氏拟青霉FN89(Paecilomyces variotiiFN89)，保藏编号为CGMCC No. 17665，保藏日期为2019年5月8日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明还提供一种使用所述菌株在极低pH条件下代谢不同种类木质纤维素酸解抑制物的方法，将宛氏拟青霉FN89(CGMCC No. 17665)的培养物种于含有不同种类的木质纤维素来源抑制物的真菌合成液体培养基中进行培养，菌株降解其中抑制物的过程。
本发明提供的一种使用所述菌株在极低pH条件下代谢不同木质纤维素来源抑制物的方法包括如下步骤：
(1)菌株活化：将宛氏拟青霉FN89(CGMCC No.17665)划线于真菌合成培养基平板上，28～37℃恒温培养3～4天；
(2)培养物制备：在真菌合成培养基平板上加入5～10mL0.05～0.08％(v/v)的吐温80水溶液，使用涂布棒轻柔刮取孢子并收集；
(3)发酵培养：将培养物按照0.5～1％的接种量接种于装有30～50mL含有不同种类木质纤维素来源抑制物的真菌合成液体培养基三角瓶中，摇床转速100～200rpm，28～37℃恒温震荡培养48～60h。
进一步所述不同种类抑制物主要来源于不同木质纤维素组分的过度降解，主要包括糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸、4-对羟基苯甲醛、香草醛、丁香醛等抑制物。其中糠醛来自木糖过度脱水，5-羟甲基糠醛来自葡萄糖过度脱水，乙酸来源于半纤维素过度降解，4-对羟基苯甲醛、香草酸和丁香醛来源于木质素过度降解。
进一步，含有不同种类木质纤维素酸解抑制物的真菌合成液体培养基，浓度组分如下：葡萄糖 2～5g/L，木糖5～10g/L，(NH4)2SO40.5～2g/L，KH2PO4·2H2O 1～2g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1g/L，CaCl2 0.1～0.5g/L，酵母提取物0.5～1g/L，各种不同抑制物0.5～4g/L，硫酸调节pH至2.0。
本发明还提供一种使用权利要求1所述菌株在极低pH条件下代谢木质纤维素来源抑制物的方法，将生长有宛氏拟青霉FN89(CGMCC No.17665)的培养物接种于经预处理的呈干固颗粒形态的木质纤维素产物中，在不添加外源营养物质和水、不调节底物酸性、不产生任何废水和固废的前提下进行的生物降解过程。
本发明提供的一种使用所述菌株在极低pH条件下代谢木质纤维素来源抑制物的方法，包括如下步骤：
(1)菌株活化：将宛氏拟青霉FN89(CGMCC No. 17665)划线于真菌合成培养基斜面上，28～37℃恒温培养3～4天；
(2)种子培养：称取100～400g经预处理的呈干固颗粒形态的木质纤维素产物，与一个揉碎的生长有宛氏拟青霉FN89(CGMCC No.17665)的真菌合成培养基斜面混匀，28～37℃恒温培养3～4天；
(3)发酵培养：将种子按照10～20％的接种量接种于未调节pH且未添加外源营养物质和水的经预处理的固颗粒形态木质纤维素产物中，混匀后28～37℃恒温通气培养3～4天，即可得到不含有木质纤维素来源抑制物的经预处理的固颗粒形态木质纤维素产物，该产物可直接用于后续的高固含量生物加工过程。
进一步，经预处理的呈干固颗粒形态木质纤维素产物，是对木质纤维素原料进行高温稀酸预处理的产物，经预处理后木质纤维素原料结构被打破，有利于后续糖化发酵。预处理条件为固液比 1:2～2:1，温度150～180℃，压力1.0～2.0MPa，酸溶液浓度5～15％，预处理时间3～10min。预处理后物料完全吸收酸溶液，呈干固颗粒形态。预处理过程中由于过度降解，会产生糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸、4-对羟基苯甲醛、香草醛、丁香醛等微生物生长抑制物。
进一步，经预处理的呈干固颗粒形态木质纤维素产物，原料包括但不限于玉米秸秆、小麦秸秆、稻杆、油菜杆、稻草、软木、硬木等农业废弃物中的一种或几种。
进一步，所述宛氏拟青霉FN89(CGMCC No.17665)在20-25％(v/v)甘油保存。
发明详述：
本发明提供的使用宛氏拟青霉FN89(CGMCC No. 17665)对经预处理的干固颗粒形态木质纤维素底物进行生物降解的方法，包括如下具体步骤：
(1)菌种活化：将在20-25％(v/v)甘油保存的宛氏拟青霉FN89(CGMCC 17665)划线于真菌合成培养基斜面上，28～37℃恒温培养3～4天；
(2)种子培养：称取100～400g经预处理的干固颗粒形态木质纤维素产物，与一个揉碎的生长有宛氏拟青霉FN89(CGMCC No.17665)的真菌合成培养基斜面混匀，28～37℃恒温通气培养3～4天；
(3)发酵培养：将种子按照10～20％的接种量接种于未调节pH，且未添加外源营养物质和水的经预处理的干固颗粒形态木质纤维素产物中，混匀后28～37℃恒温通气培养3～4天，即可得到固颗粒形态的不含有微生物生长抑制物的预处理木质纤维素产物，可直接用于后续的生物加工过程。
作为优选，步骤(2)中的真菌合成培养基的组成成分为：葡萄糖2～5g/L，木糖5～10g/L，(NH4)2SO4 0.5～2g/L，KH2PO4·2H2O 1～2g/L，MgSO4·7H2O0.5～1g/L，CaCl20.1～0.5g/L，酵母提取物0.5～1g/L。
作为优选，步骤(2)、步骤(3)中的经预处理的木质纤维素产物，原料包括但不限于玉米秸秆、小麦秸秆、稻杆、油菜杆、稻草、软木、硬木等农业废弃物中的一种或几种，预处理条件为固液比 1:2～2:1，温度150～180℃，压力1.0～2.0MPa，酸溶液浓度5～15％，预处理时间3～10min。预处理后物料完全吸收酸溶液，呈干固颗粒形态。预处理过程中由于过度降解，会产生糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸、4-对羟基苯甲醛、香草醛、丁香醛等微生物生长抑制物。
本发明涉及到一株可在极低pH条件下降解糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸、4-对羟基苯甲醛、香草醛、丁香醛等木质纤维素生物质来源抑制物的菌株及其应用。宛氏拟青霉FN89(CGMCC No. 17665) 可以在极低pH环境下有效降解木质纤维素生物质预处理所产生的糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸、4- 对羟基苯甲醛、香草醛、丁香醛等抑制物，使木质纤维素生物质具备高效酶促水解和发酵的性能；该菌株可在葡萄糖、木糖等可发酵单糖存在的情况下，优先利用糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸、香草醛、丁香醛等木质纤维素来源抑制物作为碳源供菌体生长和代谢；该菌株在不添加外源营养物质和水的前提下，可对干固颗粒形态的木质纤维素中的抑制物进行降解，无任何废水和固废产生。利用该菌株在极低pH条件下有效降解木质纤维素来源的抑制物，操作简单、工艺简洁、废水和固废零排放、成本低廉。
与现有技术相比，本发明具有如下积极效果：
本发明所提供的宛氏拟青霉FN89(CGMCC 17665)可对经预处理的呈干固颗粒形态的木质纤维素底物直接进行生物降解，无需调节pH、无需添加外源营养物和水，无可发酵糖的损失，操作工艺简化，设备要求降低，废水和固废零排放，加工过程连续，具备显著的经济效益。
具体实施方式
以下实施例以便更好地理解本发明，并不限定本发明。下述实施方法中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1：宛氏拟青霉FN89对木质纤维素来源抑制物的生物降解
宛氏拟青霉FN89(CGMCC No.17665)在液体真菌合成培养中代谢各类木质纤维素来源抑制物的方法，具体步骤为：
(1)菌株活化：将在25％(v/v)甘油保存的宛氏拟青霉FN89(CGMCC No. 17665)划线于真菌合成培养基平板上，28℃恒温培养3天；
(2)培养物制备：在真菌合成培养基平板上加入5mL0.05％(v/v)的吐温80水溶液，使用涂布棒轻柔刮取孢子并收集；
(3)发酵培养：将培养物按照1％的接种量接种于装有50mL分别含有不同种类木质纤维素来源抑制物的真菌合成液体培养基的250mL三角瓶中，摇床转速100rpm，37℃恒温震荡培养60h。不同木质纤维素酸解抑制物的浓度分别如下：糠醛0.1g/L；羟甲基糠醛2g/L；乙酸4g/L；丁香醛1g/L；香草醛1g/L。
(4)糖及抑制物浓度检测：葡萄糖、木糖、糠醛、羟甲基糠醛和乙酸的检测使用高效液相色谱法，使用HPX-87H柱，采用5mM硫酸作为流动相，流速为0.6mL/min，柱温60℃，进样量20ul；香草醛、丁香醛也使用高效液相色谱法检测，使用C18柱，流动相为100％乙腈和0.1％的甲酸梯度洗脱，0～4min，100％乙腈占比从10％升至35％，；5～20min，100％乙腈占比从35％再降到10％，之后保持不变，流速1.0ml/min，柱温36℃，进样量20ul。
经检测，各类抑制物在60h时均能被完全代谢，且培养基中木糖、葡萄糖有大量剩余。
实施例2：宛氏拟青霉FN89对纤维素来源抑制物的生物降解
宛氏拟青霉FN89(CGMCC No.17665)对经过预处理的呈干固颗粒形态小麦秸秆进行生物降解的方法，具体步骤为：
(1)菌种活化：将在25％(v/v)甘油保存的宛氏拟青霉FN89(CGMCC No.17665)划线于真菌合成培养基斜面上，30℃恒温培养4天；
(2)种子培养：称取200g经预处理的固颗粒形态小麦秸秆，与一个揉碎的生长有宛氏拟青霉 FN89(CGMCC No.17665)的真菌合成培养基斜面混匀，37℃恒温通气培养4天；
(3)发酵培养：将种子按照20％的接种量接种于未调节pH，且未添加外源营养物质和水的经预处理的呈干固颗粒形态的小麦秸秆产物中，混匀后28℃恒温通气培养3天。定时取样检测小麦秸秆中的各抑制物浓度和可发酵糖浓度。整个发酵培养过程无任何废水和固废产生。
(4)后续高固含量生物加工(以乙醇生产为例)：经过宛氏拟青霉FN89(CGMCC No.17665)生物降解处理的固颗粒形态小麦秸秆被直接用于同步糖化发酵生产乙醇。发酵过程固含量为30％，纤维素酶用量为4mg蛋白/g干物料，酿酒酵母接种量20％，200rpm、30℃恒温发酵96h后，检测最终的乙醇产量。
经检测，经过宛氏拟青霉FN89(CGMCC No.17665)生物降解36h后，预处理小麦秸秆中不含有糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸等木质纤维素来源微生物生长抑制物，无可发酵糖的损失。经生物降解的预处理小麦秸秆直接用于后续高固含量乙醇的同步糖化发酵过程，接种酿酒酵母经过96h培养后，乙醇产量最高达到87.25g/L，满足工业化生产需求。
实施例3：宛氏拟青霉FN89对纤维素来源抑制物的生物降解
宛氏拟青霉FN89(CGMCC No.17665)对预处理的固颗粒形态玉米秸秆进行生物降解的方法，具体步骤为：
(1)菌种活化：将在25％(v/v)甘油保存的宛氏拟青霉FN89(CGMCC 17665)划线于真菌合成培养基斜面上，37℃恒温培养3天；
(2)种子培养：称取100g经预处理的固颗粒形态玉米秸秆，与一个揉碎的生长有宛氏拟青霉 FN89(CGMCC No. 17665)的真菌合成培养基斜面混匀，30℃恒温通气培养3天；
(3)发酵培养：将种子按照20％的接种量接种于未调节pH，且未添加外源营养物质和水的经预处理的呈干固颗粒形态的玉米秸秆产物中，混匀后28℃恒温通气培养4天。定时取样检测小麦秸秆中的各抑制物浓度和可发酵糖浓度。整个发酵培养过程无任何废水和固废产生。
(4)后续高固含量生物加工(以乳酸生产为例)：经过宛氏拟青霉FN89(CGMCCNo.17665)生物降解处理的固颗粒形态玉米秸秆被直接用于同步糖化发酵生产乳酸。发酵过程固含量为30％，纤维素酶用量为4mg蛋白/g干物料，乳酸片球菌接种量5％，200rpm、42℃恒温发酵96h后，检测最终的乳酸产量。
经检测，经过宛氏拟青霉(CGMCC No. 17665)FN89生物降解48h后，预处理玉米秸秆中不含有糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸等木质纤维素来源微生物生长抑制物，无可发酵糖的损失。经生物降解的预处理玉米秸秆直接用于后续高固含量乳酸的同步糖化发酵过程，接种乳酸片球菌经过96h培养后，乳酸产量最高达到121.22g/L，满足工业化生产需求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种极低pH条件下降解木质纤维素来源抑制物的菌株，其特征在于，其分类命名为宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii )FN89，保藏编号为CGMCC No. 17665，保藏日期为2019年5月8日，保藏地址为北京市朝阳区中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种使用权利要求1所述菌株在极低pH条件下代谢不同种类木质纤维素酸解抑制物的方法，其特征在于，将宛氏拟青霉FN89(CGMCC No. 17665)的培养物接种于含有不同种类的木质纤维素来源抑制物的真菌合成液体培养基中进行培养，菌株降解其中抑制物的过程；
所述含有不同种类的木质纤维素来源抑制物为糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸、4-对羟基苯甲醛、香草醛或丁香醛。
3.一种使用权利要求1所述菌株在极低pH条件下代谢木质纤维素来源抑制物的方法，其特征在于，将生长有宛氏拟青霉FN89(CGMCC No. 17665)的培养物接种于经预处理的呈干固颗粒形态的木质纤维素产物中，在不添加外源营养物质和水、不调节底物酸性、不产生任何废水和固废的前提下进行的生物降解过程。
4.根据权利要求2所述的一种使用所述菌株在极低pH条件下代谢不同木质纤维素来源抑制物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌株活化：将宛氏拟青霉FN89(CGMCC No. 17665)划线于真菌合成培养基平板上，28～37℃恒温培养3～4天；
(2)培养物制备：在真菌合成培养基平板上加入5～10mL 0.05～0.08％(v/v)的吐温80水溶液，使用涂布棒轻柔刮取孢子并收集；
(3)发酵培养：将培养物按照0.5～1％的接种量接种于装有30～50mL含有不同种类木质纤维素来源抑制物的真菌合成液体培养基三角瓶中，摇床转速100～200rpm，28～37℃恒温震荡培养48～60h。
5.根据权利要求3所述的一种使用所述菌株在极低pH条件下代谢木质纤维素来源抑制物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌株活化：将宛氏拟青霉FN89(CGMCC No. 17665)划线于真菌合成培养基斜面上，28～37℃恒温培养3～4天；
(2)种子培养：称取100～400g经预处理的呈干固颗粒形态的木质纤维素产物，与一个揉碎的生长有宛氏拟青霉FN89(CGMCC No. 17665)的真菌合成培养基斜面混匀，28～37℃恒温培养3～4天；
(3)发酵培养：将种子按照10～20％的接种量接种于未调节pH且未添加外源营养物质和水的经预处理的固颗粒形态木质纤维素产物中，混匀后28～37℃恒温通气培养3～4天，即可得到不含有木质纤维素来源抑制物的经预处理的固颗粒形态木质纤维素产物，该产物可直接用于后续的高固含量生物加工过程。
6.根据权利要求2所述的一种使用该菌株在极低pH条件下代谢不同种类木质纤维素种类抑制物的方法，其特征在于，不同种类抑制物主要来源于不同木质纤维素组分的过度降解，主要包括糠醛、5-羟甲基糠醛、乙酸、4-对羟基苯甲醛、香草醛、丁香醛等抑制物；其中糠醛来自木糖过度脱水，5-羟甲基糠醛来自葡萄糖过度脱水，乙酸来源于半纤维素过度降解，4-对羟基苯甲醛、香草酸和丁香醛来源于木质素过度降解。
7.根据权利要求2所述的一种使用该菌株在极低pH条件下代谢不同木质纤维素种类抑制物的方法，其特征在于，含有不同种类木质纤维素酸解抑制物的真菌合成液体培养基，浓度组分如下：葡萄糖2～5g/L，木糖5～10g/L，(NH4)2SO40.5～2g/L，KH2PO4·2H2O 1～2g/L，MgSO4·7H2O0.5～1g/L，CaCl20.1～0.5g/L，酵母提取物0.5～1g/L，各种不同抑制物0.5～4g/L，硫酸调节pH至2.0。
8.根据权利要求3的所述的一种使用该菌株在极低pH条件下代谢木质纤维素来源抑制物的方法，其特征在于，经预处理的呈干固颗粒形态木质纤维素产物，预处理条件为固液比1:2～2:1，温度150～180℃，压力1.0～2.0MPa，酸溶液浓度5～15％，预处理时间3～10min。
9.根据权利要求3所述的一种使用该菌株在极低pH条件下代谢木质纤维素来源抑制物的方法，其特征在于，经预处理的呈干固颗粒形态木质纤维素产物，原料包括但不限于玉米秸秆、小麦秸秆、稻杆、油菜杆、稻草、软木、硬木等农业废弃物中的一种或几种。
10.根据权利要求4所述一种使用所述菌株在极低pH条件下代谢不同木质纤维素来源抑制物的方法，所述宛氏拟青霉FN89(CGMCC No. 17665)在20-25％(v/v)甘油保存。
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