CN104059862B - 一种纤维素降解菌剂和原料菌株及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物菌剂技术领域，尤其是一种纤维素降解菌剂和原料菌株及其制备方法和应用，所述降解纤维素的复合菌剂主要由宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti）MM2菌株、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）MM6菌株、皱落假丝酵母（Candida rugosa）MJ4菌株、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）MX8菌株组成；本发明所述的复合菌剂能够高效降解利用纤维素，可以作为酒渣堆肥的起爆剂和强化剂，加快堆肥过程，提高堆肥腐熟度，制作有机肥，尤其适用于木质纤维素类固体废弃物的资源化处理和利用酒渣生产有机肥。
Description
技术领域
本发明涉及生物菌剂技术领域，尤其是一种纤维素降解菌剂和原料菌株及其制备方法和应用。
背景技术
堆肥技术是在高温、多湿的条件下，通过微生物发酵腐熟有机固体废弃物而制成有机肥料的一种技术手段。木质纤维素类有机固体废弃物的堆肥过程中，纤维素的降解是关键，因为纤维素含量最高而且降解最为缓慢。在好氧堆肥中，如果只依靠堆肥原料中原有土著微生物很难有效的降解堆肥物料中的纤维素，因此需要引入外源特定的微生物，以加快堆肥腐熟过程。对于降解纤维素的菌剂，有的研究者选用单菌株组成的菌剂，如殷中伟等人从黑龙江黑土样品中筛选出一株能够降解羧甲基纤维素的丝状真菌Y5，经鉴定为赭绿青霉，将其制备为菌剂，用于降解小麦秸秆。赵方圆等人从牛羊粪堆肥中筛选出一株纤维素降解菌YN1，经鉴定为曲霉，将其制备为菌剂，可有效降解秸秆。有的研究者选用由两种以上菌种组合的复合菌剂，如李平等人从畜禽养殖场排污口沉积底泥和该养殖场畜禽粪便分离出纤维素降解菌，构建了一组由5株细菌组成的复合微生物，能够有效降解稻草。杨亚珍等人从枯树根、烂菜叶、牛粪和牛胃中分离纤维素降解菌，将其两两组合，用于降解稻草。对于复合菌剂，大多侧重菌种间有无拮抗性，将没有拮抗性菌株组合形成复合菌剂，较少关注菌株间的协同性，尤其碳源利用上的协同性。
目前，纤维素降解菌剂多用于畜禽粪便及秸秆类的木质纤维素堆肥的外源接种剂，如刘佳等人以牛粪和稻草为堆肥原料，研究了接种纤维素降解菌对牛粪堆肥微生物群落的影响，发现接种菌堆肥与自然堆肥相比，微生物数量的变化趋势快于自然堆肥，接种菌在堆肥初期能够激发微生物增殖，快速启动堆肥发酵，缩短堆肥进程。四川农业大学的胡华研究了高效纤维素降解菌株复合系菌剂在秸秆堆肥中的应用，结果表明：接入纤维素降解复合菌剂的处理T，平均C/N比为19.27，比CK1低17.10，平均纤维素含量为21.25％，比CK1低6.35％，平均种子发芽率为101.3％，比CK1高33.7％。酒渣又叫酒糟，是指自谷物中蒸出酒精或酒精饮料后的残渣，即酿酒后产生的渣滓，常用作家畜饲料。利用酒渣堆肥生产有机肥，不仅可以变废为宝，还有利于促进农村经济的发展，减少环境的污染。在现有技术中，对于用于酒渣堆肥中的纤维素降解外源菌剂报道较少。
虽然酒渣中含有大量纤维素，但是如CN1928074A、CN101560488A、CN101974436A和CN1460664A公开的微生物菌剂，应用于酒渣堆肥的效果并不理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可加速纤维素降解和腐熟的复合菌剂以及组成这种复合菌剂的原料菌株，以及这种降解纤维素的复合菌剂在降解纤维素和酒渣堆肥中的应用及其制备方法。
为了实现本发明的目的，本发明的宛氏拟青霉菌株MM2，其分类命名为Paecilomyces varioti，现已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.7903，保藏日期2013年7月8日。
本发明的烟曲霉菌株MM6，其分类命名为Aspergillus fumigatus，现已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.7904，保藏日期2013年7月8日。
本发明的皱落假丝酵母菌株MJ4，其分类命名为Candida rugosa，现已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.7902，保藏日期2013年7月8日。
本发明的地衣芽孢杆菌菌株MX8，其分类命名为Bacillus licheniformis，现已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.7901，保藏日期2013年7月8日。
本发明的宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)菌株MM2的形态和显微学特征是：菌株加在麦芽汁琼脂培养基上，在25℃黑暗条件下，培养7天，菌落直径扩展为80mm，黄褐色，绒毛状，至近粉状；分生孢子梗自气生菌丝生出，瓶梗单生或轮生(8-20)×(2.5-3)μm。分生孢子呈椭圆形或短柱形，光滑，链状着生于瓶梗上，长径为(3-5)×(2-2.5)μm。
由微检字第052号检测鉴定报告得出，根据送检菌种的培养特征、显微特征和rRNA基因序列的实验数据的综合分析，送检菌种编号为：MM2的菌株，其鉴定结果为一新菌，属于宛氏拟青霉菌株(Paecilomyces varioti MM2)；并且经过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心对该生物材料的存活性检测，结果为存活。
本发明的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)菌株MM6的微生物学特征为：在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，25℃黑暗条件下培养7天，菌落直径扩展为55mm，质地丝绒状或稍带絮状，烟灰绿色，无渗出液。菌落反面灰褐色。分生孢子梗发生于基内和气生菌丝。淡绿色，壁平滑，顶囊烧瓶状或粗棒形，直径10-25μm。产孢结构单层，瓶梗5-10×2-2.5μm。分生孢子球形或近球形，直径2.5-3μm，淡灰绿色，壁稍粗糙。由微检字第053号检测鉴定报告得出，根据送检菌种的细胞形态、生理生化特征、基因序列等综合分析，送检菌种编号为MM6的菌株，其鉴定结果为烟曲霉，属名为Aspergillus fumigatus，并且经过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心对该生物材料的存活性检测，结果为存活。
本发明的皱落假丝酵母(Candida rugosa)菌株MJ4的微生物学特征为：麦芽汁琼脂斜面培养基25℃培养1个月，菌落奶酪状，乳白色，表面平滑，不反光，边缘整齐。玉米粉琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝。细胞椭圆形、腊肠形，大小为(3.6-9.6)×(2.4-4.8)μm。理化特征如下：能够同化纤维二糖、半乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉等碳源。能够同化硝酸盐；在37℃下能够生长。由微检字第050号检测鉴定报告得出，根据送检菌种的细胞形态、生理生化特征、基因序列等综合分析，送检菌种编号为MJ4的菌株，其鉴定结果为皱落假丝酵母，属名为Candida rugosa，并且经过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心对该生物材料的存活性检测，结果为存活。其部分理化结果如下表所示：
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株MX8的微生物学特征为：菌体杆状，革兰氏染色阳性，形成芽孢，50℃下能生长，兼性厌氧，明胶穿刺培养阳性，能利用D-葡萄糖，D-纤维二糖，蔗糖，D-果糖，D-麦芽糖等，水解淀粉和酪素，不能水解果胶。由微检字第055号检测鉴定报告得出，根据送检菌种的细胞形态、生理生化特征、基因序列等综合分析，送检菌种编号为MX8的菌株，其鉴定结果为地衣芽孢杆菌，属名为Bacilluslicheniformis，并且经过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心对该生物材料的存活性检测，结果为存活。其细胞形态和部分理化结果如下表所示：
本发明的原料菌株的培养方法，是将所述的宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株分别置于含有稻草麸皮液体培养基、滤纸液体培养基、PDA液体培养基中的任意一种斜面培养器皿内，通过在28-37℃下，液体培养2-9d，分别获得宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)MX8菌株种子培养液；再将种子培养液分别转接到经121℃灭菌30min后的麸皮上，霉菌在28℃下、细菌在37℃下培养9天，分别获得宛氏拟青霉(Paecilomycesvarioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candidarugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株单菌株株体，再将单菌株株体晾晒，制得固体菌剂。
本发明还提供一种降解纤维素的复合菌剂，其原料菌剂重量组合份数为：宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株1-2份、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株1-2份、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株1-2份、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)MX8菌株2-3份。
为了较好的实现本发明，使本发明的技术效果得到充分的体现，其原料菌剂的重量组合份数为：宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株1份、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)MM6菌株1份、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株1份、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株2份。
复合菌剂的制备方法为，采用获得的宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株单菌株株体，再将单菌株株体晾晒，制得固体菌剂；再将固体菌剂按照重量组合份数配制即可。
本发明的复合菌剂以及原料菌株的应用方案是通过以下技术方案得以实现的：
当固体菌剂含菌量≥6×108CFU/g时，将固体菌剂以≥8‰的接种量添加到酒渣堆肥中，可有效促进酒渣堆肥升温，并获得保持较高温度的高温期，从而加快堆肥进程，缩短堆肥周期，提高堆肥的腐熟度。
本发明的复合菌剂以及原料菌株在纤维素降解中的应用。
本发明的复合菌剂以及原料菌株在利用酒渣堆肥生产有机肥中的应用。
本发明的复合菌剂以及原料菌株在制备用于酒渣堆肥的微生物菌株中的应用。
本发明通过原位分离方法，在白酒酿造环境中得到四株复合菌剂，该复合菌剂组成有:宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，可加速纤维素降解和腐熟；按一定比例接种添加到酒渣中，能够高效降解利用纤维素。
本发明所述的纤维素降解复合菌剂在酒渣堆肥中的应用通过以下技术方案予以实现：
将所述的宛氏拟青霉MM2菌株、烟曲霉MM6菌株、地衣芽孢杆菌MX8菌株及皱落假丝酵母MJ4菌株的斜面培养物，通过液体培养生产种子培养液，再将种子培养液转接到灭菌麸皮上，分别制备单菌株的固体菌剂。将宛氏拟青霉MM2菌株、烟曲霉MM6菌株、地衣芽孢杆菌MX8菌株及皱落假丝酵母MJ4菌株的固体单菌株菌剂按照1:1:1:2的重量份比例混合制备复合菌剂。当固体复合菌剂含菌量≥6×108CFU/g时，将固体复合菌剂以≥8‰的接种量添加到酒渣堆肥中，可有效促进酒渣堆肥升温，并获得保持较高温度的高温期，从而加快堆肥进程，缩短堆肥周期，提高堆肥的腐熟度。
与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：
①能够高效降解利用纤维素，可以作为酒渣堆肥的起爆剂和强化剂，加快堆肥过程，提高堆肥腐熟度，制作有机肥，尤其适用于木质纤维素类固体废弃物的资源化处理和利用酒渣生产有机肥。本发明采用的纤维素降解复合菌剂均从酒渣堆肥中筛选出，并用于酒渣堆肥中，由于菌种原位施用，避免了菌种对酒渣环境的不适应性和对酒渣生态的干扰性，加之菌株依据碳源协同性组合，不仅有利于菌株间协同性增强，也有利于复合菌剂在酒渣中的定植，能有效促进酒渣堆肥的有机质的转化，加快堆肥腐熟。
②本发明通过稻草粉与麸皮的平板培养试验及滤纸溃烂试验，证明了宛氏拟青霉MM2菌株、烟曲霉MM6菌株以及地衣芽孢杆菌MX8菌株，这三株菌能够高效降解利用纤维素，可以用作木质纤维素类固体废弃物的资源化处理的外接菌种源。
③本发明在研究高效降解纤维素的菌种组成的时候，针对有机物质纤维素，先是选择含有纤维素降解菌宛氏拟青霉MM2菌株，烟曲霉MM6菌株和地衣芽孢杆菌MX8菌株的复合菌剂，来有效降解纤维素。由于纤维素降解产物有纤维二糖和葡萄糖，这两者对纤维素降解存在反馈抑制。经研究发现，加入皱落假丝酵母MJ4菌株能够同化纤维二糖，地衣芽孢杆菌MX8菌株能够利用葡萄糖和纤维二糖，这两株菌可以共同解除纤维二糖和葡萄糖的抑制作用。由于这四种菌在碳源利用上具有很强的协同作用，因此将四种菌组合，可以加快纤维素的降解。同时，由于这四种菌均可从酒渣堆肥中分离出，对酒渣堆肥具有很强的适应性，不存在难以定植的问题，因此添加这四种菌株组合的菌剂，尤其适于对酒渣中的主要有机物纤维素的降解，能有效促进酒渣堆肥进程。
④本发明在长期探索用于酒渣堆肥的菌剂时，经试验偶然发现，宛氏拟青霉MM2菌株，烟曲霉MM6菌株和地衣芽孢杆菌MX8菌株在某白酒生产基地广泛分布，并且具有较强的纤维素降解性能，在酒渣中生长迅速。同时，在白酒酒渣中发现了皱落假丝酵母MJ4菌株。因此，将前述四种微生物菌种组合为复合菌剂应用于酒渣堆肥中，为原位利用，既可避免外来菌源对当地微生态的不适应性及干扰性，又可加快当地酒渣的资源化处理，同时也丰富了菌种资源。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
将所述的宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)MX8菌株分别置于含有K2HPO42g，(NH4)2SO41.4g，MgSO4.7H2O0.3g，CaC120.3g，CoC122mg，FeSO4.7H2O5mg，MnSO4.H2O1.6mg，ZnSO41.7mg，琼脂20g，蒸馏水1000mL。pH7.2-7.3，稻草粉和麸皮3％的稻草麸皮液体培养基的斜面培养器皿内，通过在28℃下，液体培养2d，分别获得宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株种子培养液；再将种子培养液分别转接到经121℃灭菌30min后的麸皮上，霉菌在28℃下、细菌在37℃下培养9天，分别获得宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株单菌株株体，再将单菌株株体晾晒，制得固体菌剂；按重量份比例将宛氏拟青霉MM2菌株1kg、烟曲霉MM6菌株1kg、皱落假丝酵母MX8菌株1kg及地衣芽孢杆菌MJ4菌株2kg混合均匀，得到复合菌剂。
实施例2
将所述的宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)MX8菌株分别置于含有NaNO32.5g；KH2PO41g；CaCl2·2H2O0.1g；MgSO40.3g；NaCl0.1g；FeCl30.01g；滤纸片10g；蒸馏水1000mL自然pH的滤纸液体培养基的斜面培养器皿内，通过在37℃下，液体培养9d，分别获得宛氏拟青霉(Paecilomycesvarioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candidarugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株种子培养液；再将种子培养液分别转接到经121℃灭菌30min后的麸皮上，霉菌在28℃下、细菌在37℃下培养9天，分别获得宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)MX8菌株单菌株株体，再将单菌株株体晾晒，制得固体菌剂；按重量份比例将宛氏拟青霉MM2菌株2kg、烟曲霉MM6菌株2kg、皱落假丝酵母MX8菌株2kg及地衣芽孢杆菌MJ4菌株3kg混合均匀，得到复合菌剂。
实施例3
将所述的宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)MX8菌株分别置于含有马铃薯100g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，PH7.2～7.4，以蒸馏水配制的PDA液体培养基的斜面培养器皿内，通过在30℃下，液体培养6d，分别获得宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)MX8菌株种子培养液；再将种子培养液分别转接到经121℃灭菌30min后的麸皮上，霉菌在28℃下、细菌在37℃下培养9天，分别获得宛氏拟青霉(Paecilomycesvarioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candidarugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株单菌株株体，再将单菌株株体晾晒，制得固体菌剂；按重量份比例将宛氏拟青霉MM2菌株1kg、烟曲霉MM6菌株2kg、皱落假丝酵母MX8菌株1kg及地衣芽孢杆菌MJ4菌株2kg混合均匀，得到复合菌剂。
实施例4
在实施例1-3的基础上，当固体复合菌剂含菌量≥6×108CFU/g时，将固体复合菌剂以≥8‰的接种量添加到酒渣堆肥中。
实施例5
将所述的宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)MX8菌株分别置于含有稻草麸皮液体培养基、滤纸液体培养基、PDA液体培养基中的任意一种斜面培养器皿内，通过在35℃下，液体培养5d，分别获得宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株种子培养液；再将种子培养液分别转接到经121℃灭菌30min后的麸皮上，霉菌在28℃下、细菌在37℃下培养9天，分别获得宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株单菌株株体，再将单菌株株体晾晒，制得固体菌剂；按重量份比例将宛氏拟青霉MM2菌株1.5kg、烟曲霉MM6菌株1.5kg、皱落假丝酵母MX8菌株1.5kg及地衣芽孢杆菌MJ4菌株2.5kg混合均匀，得到复合菌剂。
实施例6
在实施例1-5的基础上，将所述的宛氏拟青霉MM2菌株、烟曲霉MM6菌株、皱落假丝酵母MX8菌株及地衣芽孢杆菌MJ4菌株的斜面培养物，通过液体培养生产种子培养液，再将种子培养液转接到灭菌麸皮上，分别制备单菌株的固体菌剂；再将各固体单菌株菌剂按照以下重量份比例混合制备复合菌剂：
宛氏拟青霉MM2菌株 1g；
烟曲霉MM6菌株 1g；
皱落假丝酵母MJ4菌株 1g；
地衣芽孢杆菌MX8菌株 2g。
实施例7-12
在实施例1-5的基础上，将所述的宛氏拟青霉MM2菌株、烟曲霉MM6菌株、皱落假丝酵母MX8菌株及地衣芽孢杆菌MJ4菌株的斜面培养物，通过液体培养生产种子培养液，再将种子培养液转接到灭菌麸皮上，分别制备单菌株的固体菌剂；再按每重量份为10g，将各固体单菌株菌剂按照如下表所示的重量份比例混合，制备实施例7～12的复合菌剂：
表：实施例7～12中的菌种比例
试验例：
试验例1高效降解纤维素菌株的筛选
1.1试验用培养基配方
稻草麸皮培养基：K2HPO42g，(NH4)2SO41.4g，MgSO4.7H2O0.3g，CaC120.3g，CoC122mg，FeSO4.7H2O5mg，MnSO4.H2O1.6mg，ZnSO41.7mg，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH＝7.2～7.3，稻草粉和麸皮3％；
滤纸培养基：NaNO32.5g；KH2PO41g；CaCl2·2H2O0.1g；MgSO40.3g；NaCl0.1g；FeCl30.01g；滤纸片10g；蒸馏水1000mL，自然pH。
1.2菌种的分离纯化
首先进行酒渣堆肥，将鲜酒渣与发霉的干酒渣以2：1混合，进行堆置。堆置12天后，即堆体高温期已达10天后，开始堆置第2堆：即以堆置12天的堆1为接种剂，将鲜酒渣与堆1以2:1混合。在堆2升温期间，即堆置48小时后取样，采用孟加拉红培养基，以十倍系列稀释涂布法，分离中温霉菌，采用牛肉膏蛋白胨培养基分离细菌。将粉碎的稻草与麸皮分别以2:1和1:1混合，制备两种平板培养基，分别转接上述分离出的霉菌和细菌，培养48h后，发现两种霉菌(宛氏拟青霉MM2菌株和烟曲霉MM6菌株)在两种培养基上均有生长且生长速度较快，地衣芽孢杆菌MX8菌株也有生长。将宛氏拟青霉MM2菌株和烟曲霉MM6菌株用PDA培养基平板划线，地衣芽孢杆菌MX8菌株用牛肉膏蛋白胨平板划线，进行纯化。将孟加拉红培养基上生长速度快数量多的酵母菌(皱落假丝酵母MJ4菌株)也用PDA培养基平板划线纯化。通过菌种的分离纯化，获得纯菌株。
1.3纤维降解性能检测
将一定量的滤纸片加入无机盐培养液中，经121℃灭菌30min后，分别接种宛氏拟青霉MM2菌株，烟曲霉MM6菌株和地衣芽孢杆菌MX8菌株。霉菌在28℃培养，细菌在37℃培养，培养第9天，滤纸明显溃烂，滤纸失重率分别为15.85％，15.99％，19.43％。结果如下表所示：
表：不同培养时间各菌株的滤纸失重率
由表2可以看出，宛氏拟青霉MM2菌株，烟曲霉MM6菌株和地衣芽孢杆菌MX8菌株具有高效的纤维素降解能力。
试验例2高效降解纤维素的微生物菌剂的制备
2.1试验方法
将宛氏拟青霉MM2菌株，烟曲霉MM6菌株，皱落假丝酵母MJ4菌株和地衣芽孢杆菌MX8菌株分别划线接种于PDA和牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃～32℃培养48h，然后分别接入500mL三角瓶，在30℃，135r/min下，培养24h。将上述各菌株的液体菌种以10％(v/w)接种量分别接入灭菌后的麸皮上，混匀，置于竹篓中，覆盖4层纱布，室温培养，每天搅拌一次，培养6天。
2.2试验结果
按照试验方法培养6天后，微生物数量达6×108CFU/g以上。
将培养所得宛氏拟青霉MM2菌株，烟曲霉MM6菌株，皱落假丝酵母MJ4菌株及地衣芽孢杆菌MX8菌株分别晾晒后按照1:1:1:2的重量份比例混匀，得到复合菌剂，装袋封口，常温保藏，备用。
试验例3酒渣堆肥试验
3.1试验材料
试验例2中所得复合菌剂；
酒渣6堆，每堆200kg，分别编号。
3.2试验方法
堆1中不添加复合菌剂，作为空白对照例；
堆2、堆3、堆4、堆5和堆6，分别以2‰，4‰，6‰，8‰和10‰的接种量添加上述制备的固体菌剂，混合搅拌均匀；
堆置21天，进行酒渣堆肥处理。
3.3试验结果
在堆置的21天内，接种量为8‰的堆5及接种量为10‰的堆6明显比其他堆处理的升温快，堆温升至50℃所用时间相对于其他堆大致提前了48h，而且在堆肥前10天内，温度值始终高于其他堆。
3.4试验结论
试验结果表明菌剂添加量≥8‰时，对堆肥有明显的促进作用。
在此有必要指出的是：以上实施例和试验例的所述不构成对本发明要求保护的范围限制；如果在不偏离本发明精神的基础上，作出了一些对本领域技术人员而言是显而易见的修改或改进，即没有作出实质性的改进和显著的进步的发明时，仍属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种降解纤维素的复合菌剂，其特征在于，其由宛氏拟青霉(Paecilomycesvarioti)MM2菌株，于2013年7月8日保藏于中国微生物保藏管理委员会，保藏号是CGMCCNO.7903；烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株，于2013年7月8日保藏于中国微生物保藏管理委员会，保藏号是CGMCC NO.7904；皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株，于2013年7月8日保藏于中国微生物保藏管理委员会，保藏号是CGMCC NO.7902；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株，于2013年7月8日保藏于中国微生物保藏管理委员会，保藏号是CGMCC NO.7901作为菌种组成，其重量组成份为：宛氏拟青霉(Paecilomycesvarioti)MM2菌株1-2份、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株1-2份、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株1-2份、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株2-3份。
2.如权利要求1所述的降解纤维素的复合菌剂，其特征在于，所述的菌种组成的重量组成份为：宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株1份、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)MM6菌株1份、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株1份、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株2份。
3.如权利要求1或2所述的降解纤维素的复合菌剂的培养方法，其特征在于，将所述的宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株分别置于含有稻草麸皮液体培养基、滤纸液体培养基、PDA液体培养基中的任意一种斜面培养器皿内，通过在28-37℃下，液体培养2-9d，分别获得宛氏拟青霉(Paecilomycesvarioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candidarugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)MX8菌株种子培养液；再将种子培养液分别转接到经121℃灭菌30min后的麸皮上，霉菌在28℃下、细菌在37℃下培养9天，分别获得宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)MM2菌株、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)MM6菌株、皱落假丝酵母(Candida rugosa)MJ4菌株及地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)MX8菌株单菌株株体，再将单菌株株体晾晒，制得固体菌剂；再将各固体单菌株菌剂按照重量份比例混合制备复合菌剂。
4.如权利要求1或2所述的降解纤维素的复合菌剂的应用方法，其特征在于，当固体复合菌剂含菌量≥6×108CFU/g时，将固体复合菌剂以≥8‰的接种量添加到酒渣堆肥中。
5.如权利要求1或2所述的降解纤维素的复合菌剂在降解纤维素中的应用。
6.如权利要求1或2所述的降解纤维素的复合菌剂在利用酒渣堆肥生产有机肥中的应用。
7.如权利要求1或2所述的降解纤维素的复合菌剂在制备用于酒渣堆肥的微生物菌剂中的应用。
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