CN104450530B - 一株棘孢木霉菌株、菌剂及其在有机垃圾处理中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株高产复合纤维素降解酶的生物防治菌株，即棘孢木霉(Trichoderma asperellum)T‑1，该菌株已于2014年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 9722。本发明还提供了一种由棘孢木霉T‑1菌株制成的垃圾堆肥菌剂及其在有机垃圾降解处理中的应用。本技术发明涉及的棘孢木霉生长快，产孢能力强，pH耐受性强，可以多种纤维素类材料为底物，是生防菌中的一员，应用于农作物种植可防病。本发明提供的棘孢木霉T‑1菌剂添加到有机垃圾中可减少垃圾堆肥产生的渗透液，提高垃圾中纤维素类物质的降解效率，提高垃圾堆肥产品的质量。

Description

一株棘孢木霉菌株、菌剂及其在有机垃圾处理中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一株高产复合纤维素酶的生防菌株棘孢木霉T-1和含有该棘孢木霉的微生物菌剂，及其在有机垃圾处理处置与资源化中的应用。
背景技术
随着城镇化进程的加快和人民生活水平的提高，我国的垃圾产生量在不断增长。但是，与此相对应的，我国的生活垃圾处理水平和污染防治水平还相对滞后。如何实现垃圾资源化和缩减垃圾处理量已成为一个亟待解决的问题。
据统计，我国每年产生的有机废弃物可达到41.3-43.3×108吨，其中包括餐厨垃圾、畜禽粪便、园林剪切物废弃物、秸作物杆、批发市场水果蔬菜废弃物等。目前这类有机废弃物大多作为垃圾处理，这种易腐性有机垃圾组分一般可占到垃圾总量的50％以上。
这种有机垃圾往往含水量高，易腐烂发臭，不便远距离运输，若得不到及时处理将产生恶臭腐败气味，招惹蚊蝇，传播疾病，影响居住环境和人类健康。此外，直接将这类有机垃圾与不可降解垃圾一起进行处理，如卫生填埋，不仅是一种资源浪费，而且在占用填埋土地使用的同时，会加速垃圾填埋污染，例如有机垃圾的高含水量会增加填埋场渗透液析出，加速不可降解垃圾中的重金属、多环芳烃等污染物进入周边土壤和地下水。
垃圾堆肥是有机垃圾处理的一项重要手段。经过堆肥处理后的有机垃圾不仅可以实现无害化和减量化，还可以转变成富含有机质和氮、磷、钾等营养元素的有机肥，实现从农林来又回归农林的良性循环。
但是由于垃圾中的物质成分比较复杂，包括微生物容易利用的营养物质(如碳水化合物、蛋白质和脂肪等)和不容易分解的物质(如纤维素和木质素等)，只依靠垃圾中原有的土著微生物往往不能达到理想的分解效果。因此，向垃圾堆肥体系中引入外源优势微生物，尤其是具有特殊分解功能的菌剂，将可以增强垃圾有机物的降解，提高堆肥处理的垃圾减量化效率。此外，某些外源菌剂引入堆肥体系可以减少堆肥臭气和渗透液的产生，改善堆肥环境。从资源化的角度上看，合适的外源菌剂的接种还改变有机垃圾原有的生物化学代谢过程，从而改变堆肥产物的性质，使得有机垃圾的堆肥产物更适合作为有机肥用于植物栽培。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明第一目的在于提供一株可用于有机垃圾堆肥处理的棘孢木霉菌株T-1及其微生物菌剂。
本发明第二目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。
本发明第三目的在于提供上述棘孢木霉菌株T-1及其微生物菌剂在有机垃圾堆肥处理上的应用。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种棘孢木霉T-1，其分类命名为棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 9722，保藏日期为2014年9月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
作为优选，所述棘孢木霉T-1的ITS基因序列为序列表中SEQ ID NO：1。
作为优选，所述的棘孢木霉菌株T-1是一株高产复合纤维素降解酶的生防菌株，利用多种纤维素材料进行生长繁殖。
菌株生理特征：上述棘孢木霉T-1在PDA培养基上，在28℃培养4天长满整个9cm培养皿，菌落形成同心环，在同心环上产生稠密的分生孢子，分生孢子暗绿色，无黄色色素渗出到琼脂培养基上。
菌株的鉴定：通过提取上述棘孢木霉T-1菌株的基因组，并用ITS4/ITS5通用引物对该菌株进行测定，测定的序列表如SEQ ID NO.1所示，从ITS rDNA基因序列测定结果来看上述菌株可以归为棘孢木霉。
上述棘孢木霉T-1生长快，产孢能力强，pH耐受性强，是重要的生物防治菌株，对植物病原真菌有拮抗作用，且能高产复合纤维素降解酶，可利用多种纤维素材料进行生长繁殖。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种微生物菌剂，所述微生物菌剂为固体菌剂，由棘孢木霉T-1和固体培养基组成；其活性成分为上述的棘孢木霉T-1菌丝、孢子和其胞外酶中的一种或多种。
作为优选，该微生物菌剂内含有的棘孢木霉T-1活菌数大于1.0×108cfu/g。
为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：
上述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)菌株活化培养，将权利要求1所述的棘孢木霉T-1菌株斜面保藏物接种到PDA平板，置于25℃-30℃下培养3-5天，直至形成大量孢子；
2)制备固体培养基，按固体量为3:1的比例，将粉碎粒度为20-40目的秸秆与麸皮进行混合，然后按固液量为1:1的比例，在秸秆和麸皮混合物中加入Mandel培养液，121℃高压灭菌20min，冷却后作为棘孢木霉T-1的固体培养基，其中Mandel培养液含有NaNO3 2g，KH2PO4 1.5g,CaCl2 0.3g,MgSO4·7H2O 0.3g,FeSO4·7H2O 0.005g,MnSO4·H2O 0.0016g,ZnSO4·H2O 0.0014g,CoCl2 0.0005g,水1000ml，pH为6；
3)制备固体微生物菌剂，用无菌水将PDA平板上的棘孢木霉T-1的孢子及菌丝体冲洗出来作为接种液，均匀洒到固体培养基的表面，于25-30℃培养4天后将发酵产物风干或冷冻干燥，即得微生物菌剂。
制备上述棘孢木霉T-1及其微生物菌剂所使用的PDA平板均为常规操作方法制备。
为了实现上述的第四个目的，本发明采用了以下的技术方案：
上述的棘孢木霉T-1及其微生物菌剂应用于有机垃圾减量和资源化生产有机肥。
上述的有机垃圾指的是城市、村镇可堆腐生活垃圾，包括餐厨废弃物、蔬菜废弃物、城市绿化废弃物、农村秸作物杆等富含纤维素和蛋白质的有机废弃物。
本发明的优点在于：
(1)本发明提供的棘孢木霉T-1生长快，产孢能力强，pH耐受性强，在环境pH 4-10之间均能生长且分泌纤维素酶，其可以农用废弃秸秆为主要生长底物和载体形成微生物固体菌剂，制备成本低，过程简单，同时实现农业废弃秸秆的再利用。
(2)本发明提供的棘孢木霉T-1及其微生物菌剂接种到有机垃圾堆肥体系中减少了垃圾渗透压的产生，提高了垃圾中有机物的降解率，降低了堆肥产物中纤维素的含量。
(3)本发明提供的棘孢木霉T-1及其微生物菌剂应用于有机垃圾堆肥体系减少了堆肥前后总磷和总钾的损失，堆肥产物的A/F值(放线菌数量/真菌数量)和B/F比值(细菌数量/真菌数量)高于不接种棘孢木霉T-1及其微生物菌剂的堆肥产物，有利于减少有机肥施用后土传病害的发生。
(4)本发明将棘孢木霉作为直接堆肥菌剂用于有机生活垃圾的降解转化，获得的有机肥由于带有棘孢木霉将具备生物防治的功能。
生物保藏声明
棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 9722，保藏日期为2014年9月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明范围，若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟悉的常规手段。
实施例1：棘孢木霉T-1的获得
本发明所涉及的棘孢木霉菌株是采用羧甲基纤维素平板和稀释涂布法从土壤中分离获得，通过刚果红染色和滤纸条分解试验确定为高效纤维素降解菌，随后经过生理特征分析和ITS rDNA鉴定确定为棘孢木霉菌，具体步骤如下：
1、分离：称取土样10g，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，振荡约20分钟，即为10-1稀释度的土壤溶液，用移液枪从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，试充分混匀，即为10-2稀释度的土壤溶液，然后再从此试管中吸取1ml溶液注入盛有9ml无菌水的试管中，依次类推制成10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9各种稀释度的土壤溶液。分别从上述试管稀释液中吸取200μl溶液，对号放入已写好稀释度的羧甲基纤维素平板中，用无菌刮刀在培养基表面轻轻涂布均匀，倒置于恒温培养箱培养一定时间。用无菌的接种环从上面羧甲基纤维素平板上挑取生长快速的丝状真菌菌落，点接种于羧甲基纤维素双层平板中央，随后进行刚果红染色，以透明圈的形成和大小大致反映该菌的产纤维素酶能力。
本实验挑取了17个真菌，在双层平板上培养3-3.5天，刚果红染色，测量透明圈的直径，分析透明圈直径与菌落直径之比(HC)，挑选出HC>1的菌株，并通过滤纸条分解试验进一步考察菌株的纤维素分解能力。棘孢木霉T-1就是其中一株高效纤维素降解菌，其HC值高于其它真菌。
2、鉴定
该菌株的生物学特征为：菌落在PDA平板上28℃培养，3-4天扩展到9cm，初期白色稀疏，菌丝在表面匍匐生长，后形成深绿色产孢区，反面白色；分生孢子球形，近球形，单个近无色，聚集时呈淡黄绿色，壁光滑。形态学特征符合棘孢木霉菌特征。
该菌株的分子生物学鉴定：用通用引物ITS5/ITS4(White et al.,1990)对真菌ITS-5.8S rDNA区域进行扩增获得一个900bp左右的片段，然后对PCR片段进行序列测定和NCBI数据库Blast分析。菌株T-1测序得到的序列如SEQ ID NO.1所示，经分析确定菌株T-1为棘孢木霉，命名为棘孢木霉T-1。
实施例2：棘孢木霉T-1的平板拮抗实验
采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在棘孢木霉菌和待拮抗菌边缘打取一小块菌饼，接种到新的PDA屏蔽相对的两侧中央，28℃培养，观察棘孢木霉对待拮抗菌的作用。研究结果表明棘孢木霉T-1可以抑制植物病原菌尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌的生长。
实施例3：棘孢木霉T-1微生物菌剂的制备
以农作物秸秆为主要底物，采用固态发酵的方式培养棘孢木霉T-1制备微生物菌剂，具体制备步骤如下：
菌株活化培养，将棘孢木霉T-1菌株斜面保藏物接种到PDA平板，置于25℃-30℃下培养3-5天，直至形成大量孢子；
制备固体培养基，按固体量为3:1的比例，将粉碎粒度为20-40目的秸秆与麸皮进行混合，然后按固液量为1:1的比例，在秸秆和麸皮混合物中加入Mandel培养液，121℃高压灭菌20min，冷却后作为棘孢木霉T-1的固体培养基，其中Mandel培养液含有NaNO3 2g，KH2PO4 1.5g,CaCl2 0.3g,MgSO4·7H2O 0.3g,FeSO4·7H2O 0.005g,MnSO4·H2O 0.0016g,ZnSO4·H2O 0.0014g,CoCl2 0.0005g,水1000ml，pH为6；
制备固体微生物菌剂，用无菌水将PDA平板上的棘孢木霉T-1的孢子及菌丝体冲洗出来作为接种液，均匀洒到固体培养基的表面，于25-30℃培养4天后将发酵产物风干或冷冻干燥，即得微生物菌剂。
实施例4：棘孢木霉T-1微生物菌剂的木质纤维素酶活测定
浸提液(粗酶液)：将4g棘孢木霉T-1微生物菌剂与80ml柠檬酸缓冲液(pH4.8,0.05M)混合，于37℃，180rpm振荡提取2h，离心收集上清。
滤纸酶酶活测定(FPAase)：反应体系为柠檬酸缓冲液(0.05M,pH 4.8)650μl，Waterman No.1滤纸0.5mg(直径为0.5cm的圆纸片2个),50℃预热10min后，加入100μl粗酶液，50℃保温50min。加入含750μl DNS液的反应管中，沸水浴5min，冰水终止反应。测定540nm处的吸光度。酶活定义：在测定条件下，每分钟催化底物水解生成1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位IU。
羧甲基纤维素酶酶活测定(CMCase)：在650μl的2％CMC-Na溶液(CMC-Na溶于0.05M,pH 4.8的柠檬酸缓冲液)中加入100μl粗酶液，50℃保温30min。在反应液中加入750μl DNS，沸水浴5min，冰水冷却。测定540nm处的吸光度。酶活定义：在测定条件下，每分钟催化底物水解生成1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位IU。
--葡萄糖苷酶酶活测定：在450μl的0.4M Na2HPO4-0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5)中加入50μl粗酶液，50℃保温10min，再加入0.5ml已在50℃预热了10min以上的5mM对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，在50℃反应10min后，加入500μl Na2CO3(1M)终止反应。室温放置5min后，测定400nm处的吸光度。酶活定义：在测定条件下，每小时催化底物水解生成1μmol产物的酶量为一个酶活力单位IU。
木聚糖酶酶活测定：将500μl的1.0％燕麦木聚糖溶液(燕麦木聚糖溶于0.05M,pH4.8的柠檬酸缓冲液)与250μl稀释的粗酶混合，50℃保温30min。加入含750μl DNS液的反应管中，沸水浴5min，冰水终止反应。测定540nm处的吸光度。酶活定义：在测定条件下，每分钟催化底物水解生成1μmol木糖的酶量为一个酶活力单位IU。
我们将棘孢木霉T-1微生物菌剂与其他纤维素降解真菌微生物菌剂进行对比，酶活测定结果见表1。由表1可知，棘孢木霉T-1具有高效的木质纤维素酶分泌能力。
表1棘孢木霉T-1微生物菌剂和部分纤维素降解真菌微生物菌剂的纤维素酶测定结果
实施例5：棘孢木霉T-1菌剂应用于有机垃圾好氧堆肥
棘孢木霉T-1菌剂的制作同实施例1。有机垃圾由餐厨垃圾和作物秸秆组成，比例为4:1。餐厨垃圾取自浙大学生食堂，先将骨头、塑料袋、纸杯等杂物拣出，再沥去泔水，充分混匀。稻草秸秆取自浙江省农业科学院环土所试验田，用植物粉碎机粉碎，粒径≤3cm。在堆肥桶装入混合均匀的有机垃圾物料，堆料体积占反应器体积的4/5左右，通风供氧，每7天翻堆1次，堆制27天。实验组按照质粒比为0.5％的比例添加棘孢木霉微生物菌剂T-1。对堆肥过程中的理化参数和微生物学指标进行测定。
研究结果表明：(1)添加棘孢木霉菌剂T-1可以减少堆肥产物中磷和钾的损失，实验组堆肥27天后磷和钾的损失量比对照组低64％；(2)棘孢木霉菌剂T-1实验组堆肥产品中的纤维素含量(22％)低于对照组(24％)；(3)接种棘孢木霉菌剂T-1可控制堆肥过程中渗透液的产生，实验组的渗透液产生量仅是对照组的一半；(4)对堆肥产物中细菌、真菌和放线菌数量的测定分析结果显示，实验组堆肥产品的A/F比值(放线菌数量/真菌数量)和B/F比值(细菌数量/真菌数量)分别为0.23和60.74，而对照组堆肥产品A/F比值和B/F比值分别为0.05和23.31，而A/F比值和B/F比值较低的有机肥进入土壤容易诱导土壤从细菌主导型转变为真菌主导型，因而更容易引发土传病害；(5)萝卜种子发芽试验指出，实验组堆肥产物的发芽率略高于对照组。
序列表
<110>浙江省农业科学院
<120>一株生产复合纤维素酶的棘孢木霉及其在有机垃圾减量和资源化中的应用
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>595
<212>DNA
<213> Trichoderma asperellum
<400>1
atgcttaagt tcagcgggta ttcctacctg atccgaggtc aacatttcag aaagttgggt 60
gttttacgga cgtggacgcg ccgcgctccc ggtgcgagtt gtgcaaacta ctgcgcagga 120
gaggctgcgg cgagaccgcc actgtattta ggggccggca cccgtgtgag gggtcccgat 180
ccccaacgcc gatcccccgg aggggttcga gggttgaaat gacgctcgga caggcatgcc 240
cgccagaata ctggcgggcg caatgtgcgt tcaaagattc gatgattcac tgaattctgc 300
aattcacatt acttatcgca tttcgctgcg ttcttcatcg atgccagaac caagagatcc 360
gttgttgaaa gttttgattc attttgaatt tttgctcaga gctgtaaaga aatacgtccg 420
cgaggggact acagaaagag tttggttggt tcctccggcg ggcgcctggt tccggggctg 480
cgacgcaccc ggggcgtgac cccgccgagg caacagtttg gtaacgttca cattgggttt 541
gggagttgta aactcggtaa tgatccctcc gctggttcac caacggagac cttgt 595

Claims (6)

1.一种棘孢木霉T-1，其分类命名为棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.9722，保藏日期为2014年9月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.一种微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂为固体菌剂，由棘孢木霉T-1和固体培养基组成；其活性成分为权利要求1所述的棘孢木霉T-1的菌丝和孢子二者中的一种或两种。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于：其内含有的棘孢木霉T-1活菌数大于1.0×108cfu/g。
4.根据权利要求2或3所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
1)菌株活化培养，将权利要求1所述的棘孢木霉T-1菌株斜面保藏物接种到PDA平板，置于25℃-30℃下培养3-5天，直至形成大量孢子；
2)制备固体培养基，按固体量为3:1的比例，将粉碎粒度为20-40目的秸秆与麸皮进行混合，然后按固液量为1:1的比例，在秸秆和麸皮混合物中加入Mandel培养液，121℃高压灭菌20min，冷却后作为棘孢木霉T-1的固体培养基，其中Mandel培养液含有NaNO32g，KH2PO41.5g,CaCl20.3g,MgSO4·7H2O 0.3g,FeSO4·7H2O 0.005g,MnSO4·H2O 0.0016g,ZnSO4·H2O0.0014g,CoCl20.0005g,水1000ml，pH为6；
3)制备固体微生物菌剂，用无菌水将PDA平板上的棘孢木霉T-1的孢子及菌丝体冲洗出来作为接种液，均匀洒到固体培养基的表面，于25-30℃培养4天后将发酵产物风干或冷冻干燥，即得微生物菌剂。
5.权利要求1所述的棘孢木霉T-1在有机垃圾减量和资源化生产有机肥中的应用。
6.权利要求2或3所述的微生物菌剂在有机垃圾减量和资源化处理中的应用。
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Denomination of invention: A strain of Trichoderma aculeatus, bacterial agent and its application in organic waste treatment

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