CN109160861A

CN109160861A - 一种简单的木霉-秸秆菌肥制备方法

Info

Publication number: CN109160861A
Application number: CN201811284716.3A
Authority: CN
Inventors: 张福丽; 杨同文; 李俐俐
Original assignee: Zhoukou Normal University
Current assignee: Zhoukou Normal University
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2019-01-08

Abstract

本发明涉及一种简单的木霉‑秸秆菌肥的制备方法。该木霉‑秸秆菌肥的活性成分为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)菌株T‑A158的菌体，制备步骤为：将棘孢木霉(Trichoderma asperellum)菌株T‑A158的孢子悬液，接入发酵罐的培养基中发酵，完成一级种子的制备；再与秸秆粉进行混合放置发酵，发酵料表面长满孢子，完成二级种子的制备；取二级种子、秸秆粉与腐殖酸混合均匀发酵至表面长满孢子，发酵产物中有效活菌数≥0.21×10⁸~0.37×10⁸个/g、杂菌率≤12~15%、含水量控制在20％～35％。本发明以废弃秸秆（玉米、水稻、小麦、油菜等）为发酵原料，制备木霉‑秸秆高效菌肥，成本低、操作简单，适用工业生产。本发明可预防植物土传病害，提高植物的抗逆性、抗病性，促进植物生长，改良作物品质，并有效改良土壤环境，保护环境。

Description

一种简单的木霉-秸秆菌肥制备方法

技术领域

本发明涉及一种简单的木霉-秸秆菌肥的制备方法，具体为棘孢木霉(Trichoderma asperellum) -秸秆菌肥的制备方法。

背景技术

我国每年因农业生产产生约8亿吨的废弃秸秆，农民为了耕作方便，直接将大量废弃秸秆进行露天焚烧，露天焚烧的秸秆占总可回收秸秆的30%以上。近年来，国家及政府投入大量人力物力解决秸秆焚烧的问题，焚烧现象确实得到了控制，但是仍然无法从根本上解决问题，秸秆无处安放，堆放至田间地头，造成环境污染及严重病虫害现象等。由于科技转化力度不够，秸秆本身蕴藏的巨大经济价值难以发挥。

木霉 (Trichoderm spp.) 为半知菌门、丝孢目、木霉属，是目前国际上应用最为著名的生物防治因子，常见的有棘孢木霉 (T. harzianum)、康氏木霉 (T. koningii)、长枝木霉 (T.longibrachiatum)、拟康氏木霉 (T. pseudokoningii)、粘绿木霉 (T. viren)和绿色木霉 (T. viride) 等，广泛存在于不同的土壤等环境中。已有研究表明，木霉菌在生长代谢过程中会产生多种生物活性物质，如几丁质酶、IAA、葡聚糖苷酶、纤维素酶等，能够促进植物生长，增强植物抵抗生物和非生物胁迫的能力，诱导植物对病原菌产生抗性，进而提高植物的产量和品质，并能有效改良植物生长的土壤环境。因此被广泛应用于有害生物防治、生物肥料及土壤改良剂。

以往生物菌肥发酵技术需要大型发酵设备，对菌肥发酵的环境要求高，发酵过程需要专业人员进行操作，导致成本较高，进而菌肥产品价格较高，推广使用比较困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单的木霉-秸秆菌肥的制备方法，针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出生产木霉-秸秆微生物菌肥的简单、高效的发酵方法，减少化肥农药使用、减轻环境污染、增加作物产量，推动我国绿色农业的健康发展。本发明不需要大型发酵设备，对发酵环境要求低，发酵原料无需在无菌环境下进行发酵，适用于工业生产的同时也适合农民在田间地头发酵，且成本低更符合消费者能接受的价格范围，更适于木霉-秸秆菌肥大规模地推广使用。本发明的产品可预防植物土传病害，提高植物的抗逆性、抗病性，促进植物生长，改良作物品质，并有效改良土壤环境，保护土地资源，保护环境。

本发明提供的一种简单的木霉-秸秆菌肥，其活性成分是棘孢木霉(Trichoderma asperellum) 菌株T-A158，保藏号为：CCTCC NO: M2018620。菌种保藏日：2018年9月14日，保藏单位是中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编 430072。为生物源制备的木霉-秸秆菌肥料。

本发明提供的一种简单的木霉-秸秆菌肥的活性成分为棘孢木霉(Trichoderma asperellum) 菌株T-A158的菌体，制备步骤为：

1）将活化好的棘孢木霉(Trichoderma asperellum) 菌株T-A158的孢子悬液，接入发酵罐中发酵，发酵罐中的培养基配方为：每100L中：玉米粉 300~350g，七水硫酸镁30~50g，七水硫酸亚铁 0.4~0.6g，硫酸锰 0.1~0.3g，硫酸锌 0.1~0.2g，硫酸二氢钾 245~260g，硝酸钠 90~95g，硫酸铵 70~75g，氯化钠/氯化钙 65~70g；完成一级种子的制备，孢子浓度为1×10⁷～9×10⁷个/mL。

2）取一级种子与秸秆粉进行混合成发酵料，放置发酵，发酵料表面长满孢子，完成二级种子的制备，表面孢子个数在3×10⁶~7×10⁶个/ g。

3）取二级种子、秸秆粉与腐殖酸混合均匀成发酵料，发酵至发酵料表面长满孢子，发酵产物中有效活菌数≥0.21×10⁸~0.37×10⁸个/g、杂菌率≤12~15%、含水量控制在20％～35％。

本发明提供的简单的木霉-秸秆菌肥的具体制备方法包括的步骤：

1）将植物秸秆（小麦、玉米、稻草以及稻壳等）原材料粉碎至10～60目，备用。

2）将平板上活化好的木霉孢子刮下与无菌水混合制备成孢子悬液，孢子浓度为1×10⁷～9×10⁷个/mL，4℃保存，接种备用。将制备好孢子悬液接入容量为120L的液态菌种发酵罐中发酵20d，控制通气量为0.12~1vvm，完成一级种子的制备，接种量为300ml。

发酵罐中的培养基配方为（每100L的量）：玉米粉 300~350g，七水硫酸镁 30~50g，七水硫酸亚铁 0.4~0.6g，硫酸锰 0.1~0.3g，硫酸锌 0.1~0.2g，硫酸二氢钾 245~260g，硝酸钠 90~95g，硫酸铵 70~75g，氯化钠/氯化钙 65~70g。

3）将步骤2）中制备好的一级种子与秸秆粉进行混合，接种量为40～60% （V/m），将待发酵二级种子原料放置发酵车间进行发酵，铺置约厚度5～10cm，铺置完毕后将发酵原料罩上塑料布密闭培养，塑料布与发酵料的上表面之间的距离为30～50cm。待发酵原料表面长满孢子，表面孢子个数在3×10⁶~7×10⁶个/ g 时，即为二级种子。

4）将秸秆粉，腐殖酸，二级种子混合均匀，质量比=13:5:2，含水量为50%~60%，放置发酵车间进行发酵，铺置约厚度15～25cm，铺置完毕后将发酵原料罩上塑料布密闭培养，塑料布表面每平方米预留6～8个直径为1～2cm的通气孔。发酵环境温度25℃～35℃，第4～5天待发酵原料表面长满孢子后，将发酵原料翻料一次，继续发酵，继续发酵4d～6d，整个发酵周期为8d～11d。发酵产物中有效活菌数≥0.21×10⁸~0.37×10⁸个/g、杂菌率≤12~15%、含水量控制在20％～35％。

5）对木霉-秸秆菌肥进行温室与田间肥效分析

本发明具有以下优点：

（1）本发明利用农作物废弃秸秆与高效木霉菌株结合，通过固体发酵生成高效木霉-秸秆菌肥，而固体发酵是目前公认的获得真菌孢子的最好方法之一，它不仅产量高，而且质量好。

（2）本发明具有成本低廉、操作简单等优点，便于传授给农民，同时也可完成废弃秸秆在田间地头的直接发酵处理，更加贴近农民、更好的服务于农民。

（3）本发明具有在无大型菌肥发酵罐的情况下，能较大批量生产，规模不限、投资少等显著优势。

（4）本发明通过生产高效木霉-秸秆菌肥既能实现秸秆变废为宝、高效利用，发酵腐熟后，水稻秸秆、小麦秸秆、油菜秸秆的累积腐解率分别为38.15%～45.17%、49.02%～52.17%和32.18%～48.83%。本发明利用农作物废弃秸秆（玉米、水稻、小麦、油菜等）及废弃农作物材料为主要发酵原料，再加入腐殖酸、木霉液态孢子悬液，将其按照一定比例混合搅拌均匀，置于发酵室中发酵，可分别提高水稻秸秆、小麦秸秆、油菜秸秆的降解率为15.01%~19.86%、23.22%~26.77%、12.56%~15.32%（实验结果也见申请人的同日发明申请：名称为：一种秸秆菌肥化的快速还田方法）。而且使用该发明生产的木霉-秸秆菌肥(木霉微生物肥料)成本低于传统生物有机肥发酵成本，使用方便，促生和抗病效果好的优点，适合田间大面积使用。

（5）本发明对于减少环境污染，减少化肥农药大量使用，改良土壤环境，提高农产品的产量和质量具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明二级种子发酵图；a. 二级种子；b. 二级种子局部放大（10×）。

图2为本发明发酵的木霉-秸秆菌肥图（第 6天的发酵产品）；a. 发酵第六天的木霉-秸秆菌肥；b. 发酵第六天的木霉-秸秆菌肥发酵。

图3 木霉菌肥肥效分析 (种植小麦)； CF₁：化肥60%+木霉微生物肥料40%；CF₂：化肥；CK：空白对照。

图4 木霉菌肥肥效分析 (种植玉米)； CF₁：木霉微生物肥料；CF₂：化肥；CK：空白对照。

图5 不浇水7天后小麦植株生长状况；CK：对照；CF：木霉菌肥。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

木霉菌为棘孢木霉 (Trichoderma asperellum)。棘孢木霉(Trichoderma asperellum) 菌株T-A158，该菌株已于2018年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC NO: M2018620。

实施例1：木霉菌株的分离、筛选、形态学及分子鉴定

（1）木霉菌的分离与筛选

木霉菌株的分离所取土样来自福建省福州森林公园。具体分离方法为：称取3g土样，加入27ml无菌水中，摇床150r/min震荡20min后，静置5min，取上清液为1×10^-1稀释液，用梯度浓度法稀至1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4。各梯度稀释液取100μl 涂布于孟加拉红分离培养基上。28℃恒温培养4-5d, 根据菌落形态、菌丝丰富程度和产孢量等特征挑取有代表性的单菌落纯化（纯化所用培养基为PDA培养基），纯化后，-70℃，30%甘油保存备用。

（2）木霉菌的形态学鉴定

将纯化后的木霉菌株接种到PDA培养基，28℃培养2-4天后，观察菌落形态，并采用显微镜观察菌株有无分隔、分枝等形态。木霉菌株在PDA培养基中菌落生长迅速，呈放射状向四周扩散生长，菌落致密，菌落周围有白色菌丝的生长带，逐渐产生分生孢子，外观由白色逐渐变为草绿色或深绿色。分生孢子单生或簇生，分生孢子圆形或卵圆形，绿色。

（3）木霉菌的分子鉴定

将木霉菌株接种于PDA液体培养基中，28℃，180 rpm ，摇瓶培养7d，收集菌丝，利用CTAB法提取菌丝的DNA，采用通过PCR（Polymerase Chain Reaction，多聚酶链式反应）技术对ITS区和TEF-1α区分别进行扩增。扩增序列插入T载体后，转化大肠杆菌DH5α，涂布平板后，28℃进行培养，各选取16个转化子分别用ITS TEF-1α引物进行扩增，扩增出条带的样品各选12个交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。ITS区序列如SEQ ID NO.1所示。

根据测序结果，利用国际真菌分类委员会木霉菌和肉座菌分会在http://www.isth.info/上提供的TrichOKEY和TrichoBLAST两个在线软件分别进行分类鉴定，若12个测序结果均为同种木霉，则可初步将此菌株鉴定为此木霉种类。

其中，ITS序列扩增引物：ITS1 (5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)，ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)

TEF-1α序列扩增引物：EF1-728F (5-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG)，TEF1LLErev (5-AACTTGCAGGCAATGTGG-3)。

实施例2：木霉-秸秆菌肥的制备

木霉孢子悬液的制备

将上述实施例1步骤（2）中平板上活化好(活化步骤：在培养2天的木霉菌平板上用直径为30mm的打孔器在菌落的外缘打取一个菌饼，接种于PDA平板的中央，于28℃的恒温培养箱内培养至绿色孢子布满整个平板，4℃保存备用。) 的木霉孢子刮下与无菌水混合制备成孢子悬液，孢子浓度为5×10⁷个/mL，4℃保存，接种备用。将制备好孢子悬液接入容量为120L的液态菌种发酵罐中发酵20d，控制通气量为1vvm，完成一级种子的制备，接种量为300ml。

发酵罐中的培养基配方为（此配方为每100L的量，水）：玉米粉 325g，七水硫酸镁40g，七水硫酸亚铁 0.5g，硫酸锰 0.2g，硫酸锌 0.1g，硫酸二氢钾 250g，硝酸钠 93g，硫酸铵 73g，氯化钠/氯化钙 68g。

二级种子的制备

将制备好的一级种子与秸秆粉进行混合，接种量为50%，将待发酵二级种子原料放置发酵车间进行发酵，铺置约厚度8cm，铺置完毕后将发酵原料罩上塑料布密闭培养，塑料布与发酵料的上表面之间的距离为40cm。待发酵原料表面长满孢子，表面孢子个数在6×10⁶个/g时，即为二级种子，备用。

木霉秸秆菌肥发酵

将制备好的二级种子与秸秆粉（小麦、玉米、稻草等以及稻壳均可）、腐殖酸按一定比例混合均匀,（秸秆粉：腐殖酸：二级种子（质量比）=13：5：2），含水量为55%，放置发酵车间进行发酵，铺置约厚度20cm，铺置完毕后将发酵原料罩上塑料布密闭培养，塑料布表面每平方米预留7个直径为1.5cm的通气孔。发酵环境温度29℃，第5天待发酵原料表面长满孢子后，将发酵原料翻料一次，继续发酵，继续发酵5d，整个发酵周期为10d。发酵产物中有效活菌数为0.29×10⁸个/g、杂菌率为13%、含水量控制在25％，制得木霉微生物肥料。

发酵完毕后，通过对发酵产品进行多处取样数孢子处理，发酵产物中有效活菌数为0.31×10⁷个/g、杂菌率为13%、含水量控制在25％，总氮磷钾养分达到15％、有机质含量达到52%。

实施例3：温室肥效实验

将发酵的菌肥在温室内应用于小麦、黄瓜、苦瓜在促生长方面效果明显（如表1、表2、表3）具体方法如下：

木霉-秸秆菌肥对小麦、黄瓜、苦瓜的促生分析实验在周口师范学院生命科学与农学学院温室中进行，供试作物为小麦，种为敦玉8号；黄瓜，种为露地王黄瓜；苦瓜，种为美冠绿剑王。设置处理组的对照组，处理组为本发明研制的高效木霉-秸秆菌肥，对照组为不加菌肥（CK），处理组为加入木霉-秸秆菌肥（CF），其余的因素都控制相同。对照组（CK）直接将实验材料小麦、黄瓜、苦瓜种入托盘中，处理组（CF）将菌肥与普通土混合，在将小麦、黄瓜、苦瓜种入土中，菌肥使用量为20%。观察并记录。

一：木霉-秸秆菌肥对黄瓜的促生长实验

设置木霉-秸秆菌肥添加组（CF）和实验对照组，实验对照组不加木霉-秸秆菌肥(CK)、加木霉-秸秆菌肥（CF）组，其余因素都控制相同。木霉-秸秆菌肥添加量为20％，木霉-秸秆菌肥与土充分混合均匀装入盒子中，将已发芽的黄瓜种子直接栽入，每一盆（盒）一株苗，每组4盘，一盘12个栽培盒。放入温室，常规管理，并记录生长情况，温室温度为26℃，后期管理处理和对照相同，测定生长指数。结果如表1。

从表中数据可以看出，木霉-秸秆菌肥对黄瓜的促生长效果明显，各项指标显著性增加。

二：木霉-秸秆菌肥对小麦促生长实验，时间2016年9月29日—2016年10月26日

木霉-秸秆菌肥对小麦促生分析实验在周口师范学院生命科学与农学学院温室中进行，供试作物为小麦，种为敦玉8号。设置处理组的对照组，处理组为本发明研制的高效木霉-秸秆菌肥，对照组为不加菌肥（CK），处理组为加入木霉-秸秆菌肥（CF），其余因素都控制相同。对照组（CK）直接将实验材料小麦种入托盘中，处理组（CF）将菌肥与土混合，在将小麦种入土中，菌肥使用量为20%。同时，在小麦生长7天后，停止浇水，使小麦处于干旱条件下，观察现象。温室温度为19℃，后期管理处理和对照相同。停止浇水7天后，测定其生长指标，如表2，小麦植株生长状况，如图5。

从表中数据可以看出，木霉-秸秆菌肥对小麦的促生长效果明显，各项指标显著性增加。

同时，在7天不浇水的情况下，本发明的CF处理能够提高小麦植株抗干旱的能力，表现出显著性差异。

三：木霉-秸秆菌肥对苦瓜促生实验 2016年9月26日—2016年12月26日

木霉-秸秆菌肥对苦瓜促生分析实验在周口师范学院生命科学与农学学院温室中进行，供试作物为苦瓜，种为美冠绿剑王，购于周口市农科院的种子市场。苦瓜促生实验，设置处理组的对照组，处理组为本发明研制的高效木霉-秸秆菌肥，对照组分别为不加菌肥(CK)、处理组为木霉-秸秆菌肥（CF），其余因素都控制相同。菌肥添加量为20％，菌肥与土充分混合均匀装入盒子中，将已发芽的苦瓜种子直接栽入，每一盆一株苗，每组四盘，每盘12盆。放入温室，常规管理。温室温度为26℃，后期管理处理和对照相同，测定生长指数，结果如表3。

可见：1)根数：与对照相比，本发明研制的CF处理组能够增加植株的根数，表现出显著性差异。2)茎基粗：与对照相比，本发明研制的CF处理组能够增加植株的茎基粗，表现出显著性差异。3)株高：与对照相比，本发明研制的CF处理组能够增加植株的株高，表现出显著性差异。4)根长：与对照相比，本发明研制的CF处理组能够增加植株的根长，表现出显著性差异。5)干重：与对照相比，本发明研制的CF处理组能够增加植株的干重，表现出显著性差异。6)：鲜重：与对照相比，本发明研制的CF处理组能够增加植株的鲜重，表现出显著性差异。

实施例4：大田肥效实验

将本发明发酵的菌肥在大田内应用于小麦、玉米在肥效分析方面效果明显（如图3、4）具体方法如下：木霉-秸秆菌肥对小麦、玉米在肥效分析实验在周口师范学院生命科学与农学学院试验田中进行，供试作物为小麦，种为敦玉8号；玉米，种为周糯1号。设置处理组的对照组，处理组为本发明研制的高效木霉-秸秆菌肥与化肥混合施用（CF1），菌肥：化肥（质量比）=2:3，对照组1为化肥（CF2），对照组2为不加菌肥（CK），其余因素控制相同。对照组（CK）直接将实验材料小麦、玉米种入实验田中，处理组（CF1）将菌肥与化肥和土混合，再将小麦、玉米分别种入土中，菌肥使用量为50kg/亩，化肥使用量为50kg/亩。对照组1（CF2）将化肥与土混合，再将小麦分别种入土中，化肥使用量为50kg/亩。正常管理，观察并记录后期结果。小麦四个半月后拍照如图3，玉米两个月后拍照如图4。

一：木霉-秸秆菌肥作用于小麦田间肥效分析时间：2016年9月25日—2017年5月26日

将本发明发酵的菌肥与化肥混合使用，在大田内应用于小麦，种为敦玉8号，与化肥相比，有效促进小麦的生长，与化肥相比，可使小麦增产15%~23%，且小麦叶片较化肥处理组色泽更绿，植株更壮。

具体使用方法如下：设置处理组的对照组，处理组为本发明研制的高效木霉-秸秆菌肥与化肥混合施用（CF₁），菌肥：化肥（质量比）=2:3，对照组1为化肥（CF₂），对照组2为不加菌肥（CK），其余因素控制相同。对照组（CK）直接将实验材料小麦种入实验田中，处理组（CF₁）将菌肥与化肥和土混合，再将小麦分别种入土中，菌肥使用量为50kg/亩，化肥使用量为50kg/亩。对照组1（CF₂）将化肥与土混合，再将小麦分别种入土中，化肥使用量为50kg/亩。正常管理，观察并记录后期结果。小麦四个半月后拍照如图3。

二：木霉-秸秆菌肥作用于玉米田间肥效分析时间：2017年5月7日-2017年9月8日

将本发明发酵的菌肥在大田内应用于玉米，种为周糯1号，玉米茎秆粗壮，颗粒饱满，且玉米叶片较化肥处理组色泽更绿，植株更壮。具体使用方法如下：设置处理组的对照组，处理组为本发明研制的高效木霉-秸秆菌肥（CF₁），对照组1为化肥（CF₂），对照组2为不加菌肥（CK），其余因素都控制相同。对照组（CK）直接将实验材料小麦、玉米分别种入实验田中，处理组（CF₁）将菌肥与土混合，再将玉米分别种入土中，菌肥使用量为50kg/亩。对照组1（CF₂）将化肥与土混合，再将玉米分别种入土中，化肥使用量为50kg/亩。正常管理，观察并记录后期结果。玉米两个月后拍照如图4。，

上述实施例是本发明中发酵配方的多个实施例的优选实施例。上述实施例并非对本发明限制，本领域的普通技术人员基于上述事实所做的显而易见性修改都不脱离本发明精神。本发明精神以权利要求书为准。

序列表

<110> 周口师范学院

<120> 一种简单的木霉-秸秆菌肥制备方法

<130> 20181028

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 632

<212> DNA

<213> 人工序列()

<220>

<221> gene

<222> (1)..(632)

<400> 1

ttcctccggc ttattgatat gcttaagttc agcgggtatt cctacctgat ccgaggtcac 60

atttcagaaa gttgggtgtt ttacggacgt ggacgcgccg cgctcccggt gcgagttgtg 120

caaactactg cgcaggagag gctgcggcga gaccgccact gtatttaggg gccggcaccc 180

gtgtgagggg tcccgatccc caacgccgat cccccggagg ggttcgaggg ttgaaatgac 240

gctcggacag gcatgcccgc cagaatactg gcgggcgcaa tgtgcgttca aagattcgat 300

gattcactga attctgcaat tcacattact tatcgcattt cgctgcgttc ttcatcgatg 360

ccagaaccaa gagatccgtt gttgaaagtt ttgattcatt ttgaattttt gctcagagct 420

gtaaagaaat acgtccgcga ggggactaca gaaagagttt ggttggttcc tccggcgggc 480

gcctggttcc ggggctgcga cgcacccggg gcgtgacccc gccgaggcaa cagtttggta 540

acgttcacat tgggtttggg agttgtaaac tcggtaatga tccctccgct ggttcaccaa 600

cggagacctt gttacgactt ttacttcctc ta 632

Claims

1.一种棘孢木霉-秸秆菌肥，其特征在于该木霉-秸秆菌肥的活性成分为棘孢木霉(Trichoderma asperellum) 菌株T-A158的菌体，制备步骤为：

1）将活化好的棘孢木霉(Trichoderma asperellum) 菌株T-A158的孢子悬液，接入发酵罐中发酵，发酵罐中的培养基配方为：每100L中：玉米粉 300~350g，七水硫酸镁 30~50g，七水硫酸亚铁 0.4~0.6g,硫酸锰 0.1~0.3g，硫酸锌 0.1~0.2g，硫酸二氢钾 245~260g，硝酸钠 90~95g，硫酸铵 70~75g，氯化钠/氯化钙 65~70g；完成一级种子的制备，孢子浓度为1×10⁷～9×10⁷个/mL；

2）取一级种子与秸秆粉进行混合成发酵料，放置发酵，发酵料表面长满孢子，完成二级种子的制备，表面孢子个数在3×10⁶~7×10⁶个/g；

2.权利要求1所述的棘孢木霉-秸秆菌肥的制备方法，其特征在于包括的步骤：

1）将植物秸秆粉碎至10～60目，备用；

2）将平板上活化好的棘孢木霉孢子刮下与无菌水混合制备成孢子悬液，孢子浓度为1×10⁷～9×10⁷个/mL，4℃保存，接种备用；将制备好孢子悬液接入容量为120L的液态菌种发酵罐中发酵20d，控制通气量为0.12~1vvm，完成一级种子的制备，接种量为300ml；

发酵罐中的培养基配方为，每100L的量：玉米粉 300~350g，七水硫酸镁 30~50g，七水硫酸亚铁 0.4~0.6g，硫酸锰 0.1~0.3g，硫酸锌 0.1~0.2g，硫酸二氢钾 245~260g，硝酸钠90~95g，硫酸铵 70~75g，氯化钠/氯化钙 65~70g；

3）将步骤2）中制备好的一级种子与秸秆粉进行混合，接种量为40～60% （V/V），将待发酵二级种子原料放置发酵车间进行发酵，铺置约厚度5～10cm，铺置完毕后将发酵原料罩上塑料布密闭培养，塑料布与发酵料的上表面之间的距离为30～50cm，待发酵原料表面长满孢子，表面孢子个数在3×10⁶~7×10⁶个/g时，即为二级种子；

4）将秸秆粉，腐殖酸，二级种子混合均匀，质量比=13:5:2，含水量为50%~60%，放置发酵车间进行发酵，铺置约厚度15～25cm，铺置完毕后将发酵原料罩上塑料布密闭培养，塑料布表面每平方米预留6～8个直径为1～2cm的通气孔；发酵环境温度25℃～35℃，第4～5天待发酵原料表面长满孢子后，将发酵原料翻料一次，继续发酵，继续发酵4d～6d，整个发酵周期为8d～11d；发酵产物中有效活菌数≥0.21×10⁸~0.37×10⁸个/g、杂菌率≤12~15%、含水量控制在20％～35％;

5）对棘孢木霉-秸秆菌肥进行温室与田间肥效分析。

3.根据权利要求2所述的棘孢木霉-秸秆菌肥的制备方法，其特征在于所述的植物秸秆为：小麦秸秆、玉米秸秆、油菜秸秆或稻壳、稻草。

4.一种棘孢木霉(Trichoderma asperellum) 菌株T-A158，保藏号为：CCTCC NO:M2018620。菌种保藏日：2018年9月14，保藏单位是中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址是湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编 430072。