CN104498413A - 一种含枯草芽孢杆菌g10的功能型蔬菜育苗生物基质及其制备方法 - Google Patents

一种含枯草芽孢杆菌g10的功能型蔬菜育苗生物基质及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含枯草芽孢杆菌G10的功能型蔬菜育苗生物基质及其制备方法。一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年11月3日，保藏编号为CGMCC NO.9921。一种功能型蔬菜育苗生物基质，由普通育苗基质中添加本发明所述的枯草芽孢杆菌G10发酵液得到。使用该功能型蔬菜育苗生物基质，对蔬果苗期的促生效果好，能够得到优质的种苗，同时有益微生物能够在种苗根际大量定殖，能够显著增强所育种苗后期田间种植中的生长。

Description

一种含枯草芽孢杆菌G10的功能型蔬菜育苗生物基质及其制备方法
技术领域
本发明属于农业微生物领域，涉及一种含枯草芽孢杆菌G10的功能型蔬菜育苗生物基质及其制备方法。
背景技术
随着我国现代农业的发展,蔬菜工厂化育苗越来越受到人们的重视,穴盘育苗是当前工厂化育苗的主要措施。据不完全统计，我国需要育苗的作物面积非常大，其中水稻种植面积就超过3亿亩/年，经济作物超过5亿亩次/年。目前国内一般以富含有机质的材料(如泥炭、腐熟植物残体等)为主，再配以适当比例的轻质无机材料，如蛭石、膨胀珍珠岩等制成育苗基质。由于材料来源受地区和成本的限制，且泥炭为不可再生资源，限制着基质无土育苗的可持续发展，现已成为草炭匮乏地区蔬菜工厂化育苗发展的瓶颈。国外工厂化育苗发展很快，进口基质保水性明显优于国产泥炭基质，进口基质中有机质和速效磷、钾含量明显高于国产泥炭基质。因此提升国内育苗基质的整体水平变得尤为迫切。将促进作物生长的根际微生物与不同腐熟废弃物料(普通完全或部分替代泥炭物料研制成的基质)相结合，研制成有机活性育苗生物基质，将打破传统育苗基质的配方及工艺，成为提升我国育苗基质整体水平的一个重大突破。目前，国内已有部分专家在尝试此方面工作，主要集中在利用AM菌根接种现有基质进行育苗，虽取得一些成果，但研究均不够系统深入，也没有形成大规模推广并被广大农民认可的产品，因而本专利的研究变得尤为重要。
植物根际促生菌是指定殖于植物根际系统，并能促进植物生长的一类微生物总称。能依靠直接产生信号物质，或者提高植物抗性、加速土壤养素循环等方式促进植物生长、提高防病能力、增加作物的产量。因而成为许多学者研究的热点。
植物根际(rhizosphere)是一个非常特殊的生态环境，是土壤-植物生态系统物质交换的活跃界面，植物进行光合作用，将光合产物运至地下，促进根际微生物的生长和代谢，而根际微生物将有机态养分转化为无机形态，利于植物吸收，同时，很多根际微生物能分泌促进根系生长的促生物质、拮抗土传病原菌的拮抗物质。植物根际形成了根际微生物的生态环境，特定作物根系分泌物造就了特定的土壤细菌和真菌的群落结构。与动物不同，植物生长位点是固定的，植物与其他生物的互作主要依靠分泌的各种化学信号物质。植物通过根系分泌能被土壤微生物识别的信号分子启动微生物与植物根系的对话，这种对话又反过来使微生物产生一些信号来启动微生物在根部的定殖。自然条件下，特定作物的根系分泌物被某些有益微生物所爱好，如果我们在育苗的时候能够将这些特定的针对不同作物根际的功能微生物，保活添加到基质中，研制成具有不同功能的活性微生物育苗基质，从而进一步育出根际带有大量活性功能微生物的优质种苗，必定能够提高该类作物在大田种植中的产量。
发明内容
本发明的目的是提供一株辣椒促生益生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G10。
本发明的另一目的是提供一种含有该菌株的功能型蔬菜育苗生物基质。
本发明的又一目的是提供该功能型蔬菜育苗生物基质的制备方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年11月3日，保藏编号为CGMCC NO.9921。
菌株G10在LB平板上的菌落呈乳白色，皱褶，边缘不整齐，具有一定的黏性，易挑起。在显微镜下所观察到的营养体细胞，革兰氏染色阳性，菌体着色均匀，呈杆状，两端钝平，多数菌体连接成串，呈不规则形状(图1)。淀粉水解反应，V.P反应，接触酶反应，利用柠檬酸盐反应，硝酸盐还原，石蕊牛奶还原胨化，甲基红反应，明胶液化反应均呈阳性，D-果糖，麦芽糖，阿拉伯糖，木糖，乳糖利用均呈阳性，发酵葡萄糖产酸不产气，厌氧条件下不生长，7％NaCl生长。菌株16S rDNA序列构建的系统发育树见附图2。菌株G10位于Bacillus subtilis分支上,与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DSM10相似性在99％以上,结合生理生化试验将G10鉴定为枯草芽孢杆菌。
本发明所述的枯草芽孢杆菌G10在制备蔬菜育苗生物基质中的应用，优选在制备辣椒育苗生物基质中的应用。
一种功能型蔬菜育苗生物基质，由普通育苗基质中添加本发明所述的枯草芽孢杆菌G10发酵液得到。
其中，所述的普通育苗基质中含有机质(基质干重，下同)≥20％，总养分(N+P2O5+K2O)1.5％～7％，水分≤55％，pH值5.5～7.5，Ec≤2.5ms/cm。
所述的功能型蔬菜育苗生物基质中枯草芽孢杆菌G10活菌数优选≥2.0×107CFU/g基质干重。
所述的枯草芽孢杆菌G10发酵液通过以下方法制备：将保藏号为CGMCC NO.9921的枯草芽孢杆菌G10接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH6.0～7.0，发酵温度范围30℃，搅拌速度为170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵时间为48h，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×1010个/ml；其中所用PDA培养基配制方法为，以配制1L培养基为例：200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min后过滤，滤液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃灭菌20min。
本发明所述的功能型蔬菜育苗生物基质的制备方法，包含以下步骤：
(1)制备枯草芽孢杆菌G10发酵液，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×1010个/ml；
(2)将步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌G10发酵液加入普通育苗基质中，发酵液的接入量为3～5％(v/w)。
所述的普通育苗基质中含有机质(基质干重，下同)≥20％，总养分(N+P2O5+K2O)1.5％～7％，水分≤55％，pH值5.5～7.5，Ec≤2.5ms/cm。
所得产品中有益活菌数≥2.0×107CFU/g(基质干重，下同)。有机质≥20％，总养分(N+P2O5+K2O)1.5％～7％，水分≤55％，pH值5.5～7.5，Ec≤2.5ms/cm。
有益效果：
本发明通过大量实验从南京市蔬菜花卉研究所辣椒大棚所种辣椒根际分离筛选到一株优异促生菌株——枯草芽孢杆菌G10，其能够产生大量促生物质IAA，同时能够有效在根际定殖。
由于基质的良好通透性和优质保水性，普通基质与枯草芽孢杆菌G10结合后，能够大幅度促进G10的存活能力，从而确保所育种苗根际带有大量活性功能菌。
使用该产品，对蔬果苗期的促生效果好，能够得到优质的种苗，同时有益微生物能够在种苗根际大量定殖，能够显著增强所育种苗后期田间种植中的生长。本产品中包含的活性微生物，具有高效的促生能力，技术优势和功能优势明显。
附图说明
图1G10在LB平板上的菌落形态
图2基于菌株G10的16S rRNA基因序列采用邻接法建立的系统发育树
图3不同接菌量生物基质育辣椒苗功能菌根际定殖情况
图45％功能菌接入量生物基质育辣椒苗的促生效果图
其中，A为CK1：未接菌的空白培养基对照，B为G10处理组；C为CK2为水对照。
图5生物基质育苗的辣椒盆栽促生效果图
生物材料保藏信息
G10，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年11月3日，保藏编号为CGMCC NO.9921。
具体实施方案
实施例1、菌株的分离及鉴定
取辣椒根部，切成长约3cm小段，取10g植物根于盛有90ml无菌水的三角瓶内，在30℃，170r/min条件下的摇床中振荡20min，制成土壤悬浮液，80度水浴20min后，稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等不同梯度稀释液后涂平板，培养箱中黑暗培养1d～2d，后挑取单菌落，经平板纯化后，共挑选150株，分别测定各菌株产植物生长素吲哚乙酸(IAA)(方法参考文献：Glickmann E,Dessaux Y.A critical examination of the specificity of the salkowski reagent forindolic compounds produced by phytopathogenic bacteria.[J].Applied and environmentalmicrobiology,1995,612)及产ACC脱氨酶的能力(方法参考文献：Glick BR.Modulation of plantethylene levels by the bacterial enzyme ACC deaminase[J].FEMS Microbiology Letter,2005,251:1-7)。采用同样的方法，结果初筛和复筛，获得一株同时产IAA和具ACC脱氨酶能力优异的菌株G10，保存留待进一步研究。
菌株G10在LB平板上的菌落呈乳白色，皱褶，边缘不整齐，具有一定的黏性，易挑起。在显微镜下所观察到的营养体细胞，革兰氏染色阳性，菌体着色均匀，呈杆状，两端钝平，多数菌体连接成串，呈不规则形状(图1)。生理生化测定结果表明：淀粉水解反应，V.P反应，接触酶反应，利用柠檬酸盐反应，硝酸盐还原，石蕊牛奶还原胨化，甲基红反应，明胶液化反应均呈阳性，D-果糖，麦芽糖，阿拉伯糖，木糖，乳糖利用均呈阳性，发酵葡萄糖产酸不产气，厌氧条件下不生长，7％NaCl生长。
菌株16S rDNA序列构建的系统发育树见附图2。菌株G10位于Bacillus subtilis分支上,与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DSM10相似性在99％以上,结合生理生化试验将G10鉴定为枯草芽孢杆菌。将G10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年11月3日，保藏编号为CGMCC NO.9921。
实施例2功能菌菌液的生产
将菌株G10(CGMCC NO.9921)接种至PDA培养液中液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH7.0，发酵温度30℃，搅拌速度为170rpm/min，发酵中后期形成芽孢，发酵时间为48h，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×1010个/ml；
其中所用PDA培养基配制方法为，以配制1L培养基为例：200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min后过滤，滤液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃灭菌20min。
实施例3、功能型生物基质研发
3.1以菌株G10为功能菌的生物基质育苗效果
基质的研发：菌株G10接至普通育苗基质中，混合均匀。基质中功能菌株G10采用选择性培养基：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂2.0％，去离子水1000mL，pH 7.2‐7.4，121℃高压灭菌20min；1％多粘菌素2mL，1％放线菌酮4mL(抗生素在培养基倒前冷却后加入)。功能菌G10菌落数以每克基质干重计算。经计数，生物基质中含功能菌数约为6.73×107CFU/g。
育苗试验处理如下：1)普通育苗基质(CK2)；2)添加未接菌空白培养基的育苗基质(CK1)；3)添加菌株G10发酵液的育苗生物基质(G10)。将辣椒种子消毒浸种催芽，露白后，埋入三个处理的基质中，每个处理50个重复。40天左右分别测定相关生长指标：株高、茎粗、SPAD、叶面积、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重、地下部干重(表1)。并稀释涂布计数各处理中功能菌G10在根际的定殖数量。
同样的处理，重复做第二季(表2)。
表1 第一季生物基质育苗40天对辣椒苗期生长的影响
表2 第二季生物基质育苗40天对辣椒苗期生长的影响
综上所述，两季苗盘育苗试验中：相比于普通育苗基质(CK2)及添加未接菌空白培养基的育苗基质(CK1)，添加功能菌研制成的育苗生物基质(G10)均对辣椒苗生长具有显著的促生效果，除SPAD值外，其他生长指标均有显著性差异(表1，表2)。同时，普通育苗基质(CK2)与添加未接菌空白培养基的育苗基质(CK1)之间并无多次重复的显著差异，可得出培养基对本实验并无显著影响。在功能菌方面，两季苗盘育苗实验中，添加菌株G10发酵液的育苗生物基质所育辣椒种苗40天左右根际含有功能菌的数量分别为4.32×107CFU/g、6.65×107CFU/g(根际基质干重)。
3.2不同接菌量生物基质的育苗效果
菌株G10分别以3％、5％的接菌量接至普通育苗基质中，混合拌匀。基质中功能菌株G10计数方法同上。功能菌G10菌落数以每克基质干重计算，经计数分别含有3.78×107CFU/g、8.23×107CFU/g。
育苗试验处理如下：1)CK，普通育苗基质；2)添加3％菌株G10发酵液的育苗生物基质(3％G10)；3)添加5％菌株G10发酵液的育苗生物基质(5％G10)。将辣椒种子消毒浸种催芽，露白后，埋入三个处理的基质中，每个处理50个重复。40天后分别测定相关指标：株高、茎粗、SPAD、叶面积、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重、地下部干重(表3)，并稀释涂布计数各处理中功能菌G10在根际的定殖数量。
结果表明，相比于普通育苗基质，添加不同浓度功能菌研制成的育苗生物基质均能不同程度的增加植株的株高等(表3),尤以5％添加量效果最优，株高、地上部干鲜重显著优于3％添加量处理及对照；3％添加量处理在地下部干鲜重、株高、茎粗显著优于对照。在功能菌方面，添加3％和5％菌株G10发酵液的育苗生物基质所育辣椒种苗根际含有功能菌的数量分别为3.43×106和6.78×106CFU/g(图4)。综上结论，最终以5％的接入量为最终产品的加入量。
表3 不同接菌量生物基质育苗对辣椒生长的影响
3.3功能型育苗基质所育辣椒苗的盆栽试验
3.3.1功能型育苗基质所育辣椒苗的第一季盆栽试验
将功能型基质以及普通基质所育的辣椒种苗进行两季盆栽试验，第一季共设两个处理：1)普通基质所育种苗(CK)；2)5％接菌量生物基质所育种苗(5％G10)。每个处理6盆，每盆2.5公斤土，每盆施入1.5％的普通有机肥与土拌匀作为基肥，40d测定各处理株高、茎粗、SPAD值地上部鲜重、干重，并取样涂布计数辣椒根际的功能菌G10数量。
结果表明，移苗后40天，5％添加量生物基质所育种苗生长过程中的指标除SPAD值外，其余指标均显著高于对照(表5)。5％添加量生物基质所育辣椒苗盆栽结束后，根际功能菌的定殖数量分别为1.3×107CFU/g干土。
在本季盆栽试验结果中，活性基质所育种苗，由于根际已经定殖有大量的功能菌G10，在盆栽试验中功能菌G10能够更好的发挥其功能。功能菌5％添加量研制成的活性生物基质所育种苗的后期盆栽效果最佳。
表5 第一季不同接菌量生物基质育苗对辣椒生长的影响40天盆栽效果
3.3.2功能型育苗基质所育辣椒苗的第二季盆栽试验
第二季共设两个处理：1)普通基质所育种苗(CK)；2)5％接菌量生物基质所育种苗(5％G10)。每个处理6盆，每盆2.5公斤土，每盆施入1.5％的普通有机肥与土拌匀作为基肥，40d测定各处理株高、茎粗、SPAD值地上部鲜重、干重，并取样涂布计数辣椒根际的功能菌G10数量。
结果表明，移苗后40天，5％添加量生物基质所育种苗生长过程中的指标除SPAD值外，其余指标均显著高于对照，与第一季结果一致(表6)。5％添加量生物基质所育辣椒苗盆栽结束后，根际功能菌的定殖数量分别为3.1×107CFU/g干土。
与第一季结果一致，在本季盆栽试验中，活性基质所育种苗，由于根际已经定殖有大量的功能菌G10，且能够更好的发挥其功能，无论是功能菌定殖情况以及盆栽效果均显著优于普通育苗基质所育种苗的效果。
表6 第二季不同接菌量生物基质育苗对辣椒生长的影响40天盆栽效果
综上两季盆栽结果表明，功能菌5％添加量研制成的活性生物基质，在育苗效果、功能菌定殖情况以及后期盆栽效果方面均显著优于功能菌3％添加量研制成的活性生物基质和普通育苗基质的效果，且达到显著性差异，因此，最终以5％的接入量为最终活性生物基质产品的加入量。
以上实施例中使用的普通的育苗基质均为江苏淮安柴米河基质肥料有限公司生产的育苗基质，其中含有机质≥20％，总养分(N+P2O5+K2O)1.5％～7％，水分≤55％，pH值5.5～7.5，Ec≤2.5ms/cm。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年11月3日，保藏编号为CGMCC NO.9921。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌G10在制备蔬菜育苗生物基质中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)G10在制备辣椒育苗生物基质中的应用。
4.一种功能型蔬菜育苗生物基质，其特征在于由普通育苗基质中添加权利要求1所述的枯草芽孢杆菌G10发酵液得到。
5.根据权利要求4所述的功能型蔬菜育苗生物基质，其特征在于所述的普通育苗基质中含有机质(基质干重，下同)≥20％，总养分(N+P2O5+K2O)1.5％～7％，水分≤55％，pH值5.5～7.5，Ec≤2.5ms/cm。
6.根据权利要求4所述的功能型蔬菜育苗生物基质，其特征在于所述的功能型蔬菜育苗生物基质中枯草芽孢杆菌G10活菌数≥2.0×107CFU/g基质干重。
7.根据权利要求1所述的功能型蔬菜育苗生物基质，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌G10发酵液通过以下方法制备：将保藏号为CGMCC NO.9921的枯草芽孢杆菌G10接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH6.0～7.0，发酵温度范围30～35℃，搅拌速度为170～200转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵时间为48h，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×1010个/ml。
8.权利要求4所述的功能型蔬菜育苗生物基质的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)制备枯草芽孢杆菌G10发酵液，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×1010个/ml；
(2)将步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌G10发酵液加入普通育苗基质中，发酵液的接入量为3～5％(v/w)。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述的普通育苗基质中含有机质(基质干重，下同)≥20％，总养分(N+P2O5+K2O)1.5％～7％，水分≤55％，pH值5.5～7.5，Ec≤2.5ms/cm。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述的功能型蔬菜育苗生物基质中枯草芽孢杆菌G10活菌数≥2.0×107CFU/g基质干重。
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