CN114214206B - 一株高效降解生物质的菌株及其应用 - Google Patents
一株高效降解生物质的菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株高效降解生物质的菌株及其应用，所述菌株的分类命名为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，菌株名为LYS1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211179，保藏日期为2021年9月15日。该菌株能够在发酵1～2天内迅速的生长，并分泌大量纤维素酶、半纤维素酶和β‑葡萄糖苷酶，其中半纤维素降解能力尤为突出，能有效弥补目前商业菌株B‑葡萄糖苷酶分泌不足的问题，能够高效降解微晶纤维素；而且基于较高的半纤维素酶分泌能力，该菌株还能高效降解未处理的玉米芯等木质纤维素类原料，在木质纤维素降解方面有着极高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高效降解生物质的菌株及其应用。
背景技术
木质纤维素生物质被认为是一种丰富的可再生资源，具有生产替代液体燃料的潜力。木质纤维素生物转化为可发酵的单体糖是其进一步转化为有用化学品的关键步骤。但大多数微生物不能直接利用木质纤维素，故需将其进行化学、物理或酶解的预处理后，才能实现到有用化学品的转化。然而，预处理过程中存在着高成本、易产生毒副产物等问题阻碍了木质纤维素类原料的工业化应用。
丝状真菌作为纤维素酶的主要来源，因其在生物质降解中的潜在应用而受到人们的关注。里氏木霉具有强大的纤维素降解能力，已广泛应用于工业纤维素酶的生产，但是该菌缺乏有效的木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，使得其在水解木质纤维素中受到一定的限制，虽然可以在水解前对木质纤维素进行预处理，提高水解效率，但也会增加成本，并且在处理过程中还可能产生一些毒副物质。因此，寻找一种能直接利用木质纤维素并将其高效水解的菌株迫在眉睫。
棘孢木霉广泛存在于土壤、植株根际、树皮、叶面中，该菌能够促进植物生长，并且对某些可致使植物发生病变的真菌具有一定的拮抗作用，在生物防治上有着广泛的应用，但对棘孢木霉降解木质纤维素方面鲜有研究。因此，本发明提供了一株可高效降解生物质的菌株及其应用。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株可高效降解生物质的菌株。
本发明还要解决的技术问题是提供一株能够直接高效降解未处理生物质的菌剂。
本发明还要解决的技术问题是提供上述菌剂的制备方法。
本发明还要解决的技术问题是提供上述菌株和菌剂的应用。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种菌株，其分类命名为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，菌株名为LYS1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20211179，保藏日期为2021年9月15日。
本发明所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)LYS1的筛选方法为：从木梳子中刮取0.5g木屑，用生理盐水稀释，吸取100μL于以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的平板上，与28～35℃下培养3～4天。生长出的菌落划线纯化5代，从而筛选出能够直接利用羧甲基纤维素钠的菌株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)LYS1。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了一种微生物菌剂，其包括上述菌株。
为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了制备上述微生物菌剂的方法，将上述菌株进行培养，即得。
其中，所述培养的培养基为PDA养基，所述PDA培养基配方为土豆200g/L，葡萄糖20g/L。
其中，所述培养的温度为28～35℃，时间为40～56h，优选为48h。
为了解决上述第四个技术问题，本发明公开了上述菌株和上述生物菌剂在降解生物质中的应用。
其中，所述应用为将上述菌株培养所得种子液，或上述微生物菌剂接种到含有生物质的发酵培养基中进行培养降解所述生物质。
其中，所述种子液，或所述微生物菌剂接种到含有生物质的发酵培养基中的接种量为1％～8％v/v，优选为3％～6％，进一步优选为4％～5％，更进一步优选为5％。
其中，所述发酵培养基中，生物质的含量为20～120g/L，优选为20～70g/L，进一步优选为30～60g/L，更进一步优选为60g/L。
其中，所述发酵培养基中，除生物质外，其余各组分的含量为：KH2PO4 1.5～2.5g/L，(NH4)2SO4 0.9～1.9g/L，MgSO4·7H2O 0.1～0.5g/L，CaCl2 0.1～0.5g/L，FeSO4·7H2O0.002～0.008g/L，MnSO4·H2O 0.001～0.003g/L，ZnSO4·7H2O 0.001～0.003g/L，CoCl20.001～0.003g/L，尿素0.1～0.5g/L，优选为KH2PO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 1.4g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，CaCl2 0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.005g/L，MnSO4·H2O 0.00156g/L，ZnSO4·7H2O0.0014g/L，CoCl2 0.002g/L，尿素0.3g/L。
其中，所述培养为振荡培养，优选为100～200r·min-1震荡培养，进一步优选为120r·min-1震荡培养。
其中，所述培养过程中保持pH为5.0～6.0，优选为每隔24h调节pH至5.0～6.0。
其中，所述培养的温度为25～30℃，周期为72～168h。
其中，所述生物质为微晶纤维素、玉米芯和秸秆中的任意一种或几种组合，优选为玉米芯。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
本发明从木梳子中的木屑为分离材料，通过一系列筛选分离纯化得到一株能够直接降解生物质的菌株，在以未处理的玉米芯为唯一碳源的条件下能在发酵1～2天内迅速生长，6～7天内基本可以降解60g/L玉米芯。在生长的过程中能分泌大量的纤维素酶(内切型-β-葡聚糖酶)、半纤维素酶(木聚糖酶)和β-葡萄糖苷酶，其中半纤维素降解能力尤为突出，而且能有效弥补目前商业菌株β-葡萄糖苷酶分泌不足的缺陷，能够高效降解微晶纤维素。该菌株将产酶水解为一体，不需要额外添加水解酶，降低成本。基于该菌较高的半纤维素酶分泌能力，该菌株还能高效降解未处理的玉米芯等木质纤维素类原料，该菌强大的降木质纤维素能力为后续利用木质纤维素转化为生物燃料做了很好的铺垫，具有极高的推广和利用价值。与工业上常用的模式菌株相比，该菌株有着很强的半纤维素降解能力，迅速破坏木质纤维素内部致密结构，同时弥补了目前商业菌株β-葡萄糖苷酶分泌不足的缺陷，在木质纤维素降解方面有着极高的应用价值。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为以60g/L微晶纤维素为碳源对棘孢木霉的β-葡萄糖苷酶酶活的测定。
图2为以60g/L微晶纤维素为碳源对棘孢木霉的内切型-β-葡聚糖酶酶活的测定。
图3为以60g/L微晶纤维素为碳源对棘孢木霉的木聚糖酶酶活的测定。
图4为以60g/L玉米芯为碳源对棘孢木霉的β-葡萄糖苷酶酶活的测定。
图5为以60g/L玉米芯为碳源对棘孢木霉的内切型-β-葡聚糖酶酶活的测定。
图6为以60g/L玉米芯为碳源对棘孢木霉的木聚糖酶酶活的测定。
图7为以30、60、90、120g/L玉米芯为碳源对棘孢木霉β-葡萄糖苷酶酶活的测定。
图8为以30、60、90、120g/L玉米芯为碳源对棘孢木霉内切型-β-葡聚糖酶酶活的测定。
图9为以30、60、90、120g/L玉米芯为碳源对棘孢木霉木聚糖酶酶活的测定。
图10为棘孢木霉分别降解微晶纤维素和玉米芯若干天后对降解率的测定。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)的分离筛选及鉴定：
从木梳子中刮取0.5g木屑，用生理盐水稀释，吸取100μL于以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的平板上，于28℃下培养3-4天。生长出的菌落划线纯化5代，从而筛选出能够直接利用羧甲基纤维素钠的菌株，并对该菌株进行18s rDNA测定：利用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’进行PCR扩增，经过NCBI数据库比对，在分子水平上将菌株LYS1鉴定至Trichoderma asperellum菌属，其18s rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述培养过程中所用培养基的配方为CMC 10g，(NH4)2SO4 4g，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，蛋白胨1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。上述PCR反应体系为：真菌基因组DNA 0.5μL，携有Mg2+的10×Buffer 2.5μL，dNTP 1μL，DNA聚合酶0.2μL，10μmol/L的上下游引物各0.5μL，然后加双蒸水至25μL。PCR条件：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，总共30个循环；72℃修复延伸10min，4℃下终止反应。
实施例2：
以微晶纤维素为唯一碳源棘孢木霉(Trichoderma asperellum)内切型-β-葡聚糖酶酶活、木聚糖酶酶活以及β-葡萄糖苷酶酶活的测定
将菌株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)接种到50mL的PDA培养基中，28℃，120r·min-1培养48h，然后以接种量5％v/v接种到50mL发酵培养基中28℃，120r·min-1震荡培养，每隔24h调节pH至5.5并取样测内切型-β-葡聚糖酶酶活、木聚糖酶酶活以及β-葡萄糖苷酶的酶活。酶活结果如图1～3所示。
上述发酵培养基配方为KH2PO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 1.4g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，CaCl2 0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.005g/L，MnSO4·H2O 0.00156g/L，ZnSO4·7H2O 0.0014g/L，CoCl2 0.002g/L，尿素0.3g/L，微晶纤维素60g/L。上述内切型-β-葡聚糖酶酶活测定方法为取浓度为2wt％的羧甲基纤维素钠溶液(溶剂为0.05mol/L柠檬酸缓冲液)1.0mL作为底物，加入0.5mL适当稀释的待测菌液(稀释至原来体积的2倍)，在50℃下反应30min，用DNS法测定还原糖，并扣除空白试验测定值。木聚糖酶酶活测定方法为取1wt％的木聚糖(溶剂为去离子水)1.0mL作为底物，加入0.5mL适当稀释的待测菌液(稀释至原来体积的20倍)，在50℃下反应30min，用DNS法测定还原糖，并扣除空白试验测定值。β-葡萄糖苷酶酶活测定方法为取1mM的对硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)(溶于0.05mol/L柠檬酸缓冲液)0.1mL作为底物，加入0.9mL适当稀释的待测菌液(稀释至原来体积的2倍)，在50℃下反应30min，加入1MNa2CO3 0.5mL显色，并扣除空白试验测定值。上述所有酶活单位均用IU/mL表示。
从图1～3可以看出，使用微晶纤维素作为碳源有着较好的诱导纤维素酶的能力，棘孢木霉的纤维素酶(内切型-β-葡聚糖酶)的酶活在第四天达到了2.4IU/mL，β-葡萄糖苷酶酶活能保持在0.03IU/mL左右，同时微晶纤维素还能诱导棘孢木霉分泌木聚糖酶，其酶活在第五天达到了最高值(126IU/mL)。说明棘孢木霉在以微晶纤维素为底物时有着较好分泌纤维素酶和木聚糖酶的能力。
实施例3：
以玉米芯为唯一碳源对棘孢木霉(Trichoderma asperellum)的内切型-β-葡聚糖酶酶活、木聚糖酶活以及β-葡萄糖苷酶酶活的测定
将菌株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)LYS1接种到50mL的PDA培养基中，28℃，120r·min-1培养48h，然后以接种量5％v/v接种到50mL发酵培养基中28℃，120r·min-1震荡培养，每隔24h调节pH至5.5并取样测内切型-β-葡聚糖酶酶活、木聚糖酶酶活以及β-葡萄糖苷酶的酶活。酶活结果如图4～6所示。
上述发酵培养基配方为KH2PO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 1.4g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，CaCl2 0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.005g/L，MnSO4·H2O 0.00156g/L，ZnSO4·7H2O 0.0014g/L，CoCl2 0.002g/L，尿素0.3g/L，玉米芯60g/L。上述酶活测定方法同实施列2。
从图4～6可知，棘孢木霉有着较好的降纤维素、半纤维素、纤维二糖的能力，其中木聚糖酶活最为突出，在生长第一天即分泌了大量的木聚糖酶，并且在第五天木聚糖酶酶活达到了473IU/mL，说明棘孢木霉有着极快的生长速率，以及极强的半纤维素降解能力，通过降解玉米芯中大量的半纤维素从而打破内部紧密的结构，使得棘孢木霉能够在底物中迅速的生长，在降解木质纤维素方面有着极高的利用价值。另外，棘孢木霉能分泌较多的β-葡萄糖苷酶(0.99IU/mL)能够弥补目前商业上模式菌β-葡萄糖苷酶分泌不足的缺陷，缓解了底物抑制使得菌株能够更好的生长。
实施例4：
以不同浓度的玉米芯为碳源对棘孢木霉内切型-β-葡聚糖酶酶活、木聚糖酶酶活以及β-葡萄糖苷酶酶活的测定及比较
将菌株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)LYS1接种到50mL的PDA养基中，28℃，120r·min-1培养48h，然后以接种量5％v/v接种到50mL发酵培养基中28℃，120r·min-1震荡培养，每隔24h调节pH至5.5并取样测内切型-β-葡聚糖酶酶活、木聚糖酶酶活以及β-葡萄糖苷酶的酶活。酶活结果如图7～9所示。
上述发酵培养基配方为KH2PO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 1.4g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，CaCl2 0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.005g/L，MnSO4·H2O 0.00156g/L，ZnSO4·7H2O 0.0014g/L，CoCl2 0.002g/L，尿素0.3g/L，玉米芯30、60、90、120g/L。上述酶活测定方法同实施列2。
从图7～9可以看出当玉米芯浓度从30g/L升到60g/L时，棘孢木霉的纤维素、半纤维素、β-葡萄糖苷酶酶活与底物浓度呈正相关，但当玉米芯浓度超过60g/L并上升到90g/L、120g/L时棘孢木霉的酶活与玉米芯浓度呈负相关。说明60g/L玉米芯浓度即是棘孢木霉最佳降解浓度，当浓度继续上升时会产生碳源抑制阻碍了棘孢木霉的生长及酶的分泌。
实施列5：
以微晶纤维素或玉米芯为唯一碳源，棘孢木霉(Trichoderma asperellum)对其降解率进行测定。
将菌株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)接种到50mL的PDA培养基中，28℃，120r·min-1培养48h，然后以接种量5％v/v接种到50mL含微晶纤维素的发酵培养基或含玉米芯的发酵培养基中28℃，120r·min-1震荡培养，每隔24h调节pH至5.5并测微晶纤维素和玉米芯质量。玉米芯及微晶纤维素降解率如图10所示。
上述发酵培养基配方为KH2PO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 1.4g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，CaCl2 0.3g/L，FeSO4·7H2O 0.005g/L，MnSO4·H2O 0.00156g/L，ZnSO4·7H2O 0.0014g/L，CoCl2 0.002g/L，尿素0.3g/L，微晶纤维素或玉米芯60g/L。测降解率方法为每24h将发酵液离心去上清液，将沉淀烘干至恒重。
由图10可知，以微晶纤维素为底物7天之后降解率能达到33％左右，而以玉米芯为底物降解率能达到43％左右。从上述实施列中可以发现，玉米芯诱导相关木质纤维素酶的能力比微晶纤维素强，并且结合本实施列玉米芯降解率比微晶纤维素高10-20％。说明该菌株虽然降解纤维素的能力稍弱，但在降解木质纤维素这种由纤维素、半纤维素、木质素等组成的聚合物时，该菌株能够分泌较为完整的木质纤维素降解酶体系，具有较强降解木质纤维素的能力。
以上实施例的只是用于分析理解本发明的制备方法及应用范围，但本发明不限于以上实例。如果本领域的普通技术人员受其启示，对本发明直接进行改变、替代、修饰等，均应属于本专利的保护范围。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一株高效降解生物质的菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 620
<212> DNA
<213> 棘孢木霉(Trichoderma asperellum)
<400> 1
atccctccgg tagggggacc tgcggaggga tcattaccga gtttacaact cccaaaccca 60
atgtgaacgt taccaaactg ttgcctcggc ggggtcacgc cccgggtgcg tcgcagcccc 120
ggaaccaggc gcccgccgga ggaaccaacc aaactctttc tgtagtcccc tcgcggacgt 180
atttcttaca gctctgagca aaaattcaaa atgaatcaaa actttcaaca acggatctct 240
tggttctggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt 300
cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgcccgcc agtattctgg cgggcatgcc 360
tgtccgagcg tcatttcaac cctcgaaccc ctccggggga tcggcgttgg ggatcgggac 420
ccctcacacg ggtgccggcc ccgaaataca gtggcggtct cgccgcagcc tctcctgcgc 480
agtagtttgc acaactcgca ccgggagcgc ggcgcgtcca cgtccgtaaa acacccaact 540
ttctgaaatg ttgacctcgg atcaggtagg aatacccgct gaacttaagc atatcaaaag 600
gcgggaggaa attttgcctt 620
Claims (10)
1.一种菌株，其分类命名为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，菌株名为LYS1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211179，保藏日期为2021年9月15日。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的菌株。
3.制备权利要求2所述的微生物菌剂的方法，其特征在于，将权利要求1所述的菌株进行培养，即得。
4.权利要求1所述菌株或权利要求2所述生物菌剂在降解生物质中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，将权利要求1所述菌株的种子液，或权利要求2所述微生物菌剂接种到含有生物质的发酵培养基中进行培养降解所述生物质；所述发酵培养基中，生物质的含量为20～120g/L。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，权利要求1所述菌株的种子液，或权利要求2所述微生物菌剂接种到含有生物质的发酵培养基中的接种量为1％～8％v/v。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述发酵培养基中，除生物质外，其余各组分的含量为：KH2PO4 1.5～2.5g/L，(NH4)2SO4 0.9～1.9g/L，MgSO4·7H2O 0.1～0.5g/L，CaCl20.1～0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.002～0.008g/L，MnSO4·H2O 0.001～0.003g/L，ZnSO4·7H2O0.001～0.003g/L，CoCl2 0.001～0.003g/L，尿素0.1～0.5g/L。
8.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述培养的温度为25～30℃，周期为72～168h。
9.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述生物质为微晶纤维素、玉米芯和秸秆中的任意一种或几种组合。
10.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述生物质为玉米芯。
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|---|
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