CN106929431B - 一种秸秆腐熟剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种秸秆腐熟剂及其制备方法和应用。本发明的秸秆腐熟剂中的主要有效成分为棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)，命名为Trichoderma asperellum DQ‑T36，保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2016449。本发明的秸秆腐熟剂可制备成两种制剂使用：液体制剂以及固体制剂。本发明通过对小麦秸秆和玉米秸秆还田施用秸秆腐熟剂后，对秸秆的腐熟能力、土壤理化性质、养分影响情况、秸秆中酸性纤维、中性纤维、木质纤维素等因素的研究，确定该产品的效果和优势，为该秸秆腐熟剂应用效果及施用方法提供理论依据，同时也为秸秆的生物降解提供了一种有效途径。

Description

一种秸秆腐熟剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种秸秆腐熟剂，特别涉及一种以棘孢木霉菌(Trichodermaasperellum)作为有效成分的秸秆腐熟剂，属于农业生产技术领域。
背景技术
我国作为农业大国，据有关统计，我国每年可产生7亿多吨秸秆，大量的焚烧秸秆不仅给大气带来了强烈的污染，也让我们在生活的环境里感到非常的不适，焚烧产生的浓烟中含有大量的一氧化碳、二氧化碳和二氧化硫等有毒有害气体，危害我们的身体。大量的秸秆焚烧也加剧了温室效应，使气温持续升高。同时焚烧秸秆属于资源浪费，焚烧秸秆会使土壤中原有的腐殖质含量减少，致使土壤板结，肥力下降，影响生产。中国每年约有1亿吨的秸秆是通过露天焚烧处理的，排放到空气CO和CO2总量平均每年分别为9.19×106t和1.07×108t，如何能缓解秸秆焚烧造成的大气污染，如何能合理利用秸秆使其发挥更大的作用，一直是政府和企业极力寻找的方向。
秸秆腐熟剂是一种通过添加到作物秸秆等农业副产品中，以达到加速和促进秸秆腐化效果的有机物料生物发酵剂，它能通过所含微生物组群等多方面的作用来分解有机物中的半纤维素、纤维素、木质素以及其他有机物，并使之转变成可以被作物吸收和利用的有机肥料，秸秆中所含丰富的有机质和磷、钾等营养元素可以很好的被作物吸收。在腐解过程中产生大量的有益微生物，这些微生物可以刺激农作物的生长和生产并增强植物的抗逆性，减少日常种植过程中化学肥料的使用量从而改善作物品质，更好的实现农业的可持续发展。
秸秆腐熟剂作为一种新型的农业产品为秸秆的综合利用提供了一种新的途径。虽然本公司研发中心对本发明的秸秆腐熟剂秸秆腐熟剂的研究方面取得了一定进展，但是对于施用秸秆腐熟剂过程中提高微生物的种类和数量，最终提高腐解的综合效果和效率，这是一项长期并艰巨的实验过程，需要投入大量的人力和物力来完成，目前秸秆腐熟剂的使用存在着一些问题和局限性。例如：一、受温度湿度等气候条件的局限性较大，特别在东北地区使用，此地进入十月份秸秆还田后，温度和湿度都降低，大多数秸秆腐熟剂在没有适宜温度和湿度下无法发挥促进腐解作用。二、秸秆腐熟剂使用方法操作过于繁琐，在实际应用中农民可能不易接受。三、目前市场上销售秸秆腐熟剂成本较高等。如何解决这些存在的问题，使秸秆腐熟剂产品能更广泛的被应用和更好的被接受是急需解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种新型高效的秸秆腐熟剂，在缓解农田秸秆焚烧给环境带来的巨大压力的同时，通过秸秆腐熟还田加强资源的有效利用，有效提升农田土质，使得土壤有机质效果得以增加，并且加强土壤抗病虫害的能力，更有利于农作物植株的生长。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
一株经分离得到棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)，命名为Trichodermaasperrllum DQ-T36，分类命名为Trichoderma asperrllum DQ-T36，保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2016449，保藏时间为2016年9月1日，保藏地址在中国.武汉.武汉大学。
研究表明，该分离得到的棘孢木霉菌能够分泌纤维素酶，进而有效降解秸秆，因此，进一步，本发明还提出了所述的棘孢木霉菌在制备秸秆腐熟剂中的用途。
其中，优选的，所述的秸秆腐熟剂分为液体制剂以及固体制剂两种剂型：
一种秸秆腐熟剂，其为液体制剂，所述的液体制剂中含有重量百分比为0.001％-50％的山梨酸钾，2-5％的壳聚糖、2.5-7.5％的竹醋以及本发明所述的棘孢木霉菌，所述棘孢木霉菌的活孢子数不低于108CFU/ml。优选的，所述的液体制剂中含有重量百分比为0.2％的山梨酸钾、5％的壳聚糖、3％的竹醋以及所述的棘孢木霉菌。
一种制备所述的秸秆腐熟剂(液体制剂)的方法，包括以下步骤：
(1)一级发酵种子的制备
将本发明所述的棘孢木霉菌接种于摇瓶培养基中，在温度为28℃，转速为220-240r/min的条件下培养20-24小时后，镜检，确认菌丝生长茁壮，无杂菌，作为一级发酵种子；
其中，每1L所述的培养基中含有KH2PO4 1.0～3.0g，(NH4)2SO4 0.5～1.5g，MgSO4·7H2O 0.5～1.5g，葡萄糖18.0～22.0g，酵母浸粉0.5～1.5g，蛋白胨8.0～12.0g，溶剂为去离子水，pН7-7.5；优选的，每1L所述的培养基中含有KH2PO4 2.0g，(NH4)2SO4 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，葡萄糖20.0g，酵母浸粉1.0g，蛋白胨10.0g，溶剂为去离子水，pН7.2；
(2)发酵罐发酵培养
将步骤(1)制备得到的一级发酵种子按照接种量为4～7％(v/v)接种于总体积为5升的全自动发酵罐的培养基中，在初始pH值为7-7.5，温度为28℃，转速为180-210r/min、通气量为3升/min的条件下培养9小时后，然后再将转速调节为280-310r/min、通气量调节为7升/min，温度保持不变，继续发酵，直至菌体浓度达到15-20克/升，棘孢木霉菌的活孢子数不低于1.0×108CFU/ml时放罐，期间若发酵液pH降低到5.5以下，需用灭菌的20％(w/w)氢氧化钠溶液补料，调节发酵液pH到6.0以上；
其中，每1L所述的培养基中含有KH2PO4 1.0～3.0g，(NH4)2SO4 0.5～1.5g，MgSO4·7H2O 0.5～1.5g，葡萄糖18.0～22.0g，酵母浸粉0.5～1.5g，蛋白胨8.0～12.0g，消泡剂2ml，溶剂为去离子水，pН7-7.5；优选的，每1L所述的培养基中含有KH2PO4 2.0g，(NH4)2SO41.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，葡萄糖10.0g，玉米淀粉10.0g，酵母粉1.2g，蛋白胨10.0g，消泡剂2ml，溶剂为去离子水，pН7.2；
(3)向发酵好的培养液中加入发酵液重量0.001％-50％的山梨酸钾，2-5％的壳聚糖，2.5-7.5％的竹醋，将混合物在250-300r/min的速度搅拌10-30分钟，即得权利要求4所述的秸秆腐熟剂。
一种秸秆腐熟剂，其为可湿性粉剂，由以下重量百分比的各原料组成：本发明所述的棘孢木霉菌菌粉6-7％，氮酮1～3％，木质素5～10％，聚羧酸盐1～3％，萘磺酸盐1～3％，其余为高岭土。
在本发明中，优选的，所述的秸秆腐熟剂由以下重量百分比的各原料组成：本发明所述的棘孢木霉菌菌粉6.7％，氮酮2％，木质素7.5％，聚羧酸盐2％，萘磺酸盐2％，其余为高岭土。
其中，氮酮属于一种渗透剂，可以使药剂渗透到秸秆的细胞中，快速生长，降解秸秆。木质素、聚羧酸盐属于分散剂，在稀释药剂时，使原粉更容易扩散，均匀的分散在体系中。萘磺酸盐属于润湿剂，通过降低表面张力，使固体药剂能够在水面上展开，利于均匀混合。添加助剂明显改善了木霉原粉轻飘、不易分散不易润湿的特性，提高腐熟剂的用药效率。
在本发明中，优选的，每克棘孢木霉菌菌粉中含有棘孢木霉活孢子数不小于108CFU。
一种制备所述的秸秆腐熟剂(可湿性粉剂)的方法，包括以下步骤：
(1)一级发酵种子的制备
将所述的棘孢木霉菌接种于摇瓶培养基中，在温度为28℃，转速为220-240r/min的条件下培养20-24小时后，镜检，确认菌丝生长茁壮，无杂菌，作为一级发酵种子；
其中，每1L所述的培养基中含有KH2PO4 1.0～3.0g，(NH4)2SO4 0.5～1.5g，MgSO4·7H2O 0.5～1.5g，葡萄糖18.0～22.0g，酵母浸粉0.5～1.5g，蛋白胨8.0～12.0g，溶剂为去离子水，pН7-7.5；优选的，每1L所述的培养基中含有KH2PO4 2.0g，(NH4)2SO4 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，葡萄糖20.0g，酵母浸粉1.0g，蛋白胨10.0g，溶剂为去离子水，pН7.2；
(2)发酵罐发酵培养
将步骤(1)制备得到的一级发酵种子按照接种量为4～7％(v/v)接种于总体积5升全自动发酵罐中的培养基中，在初始pH值为7-7.5，温度为28℃，转速为180-210r/min、通气量为3升/min的条件下培养9小时后，然后在将转速调节为280-310r/min、通气量调节为7升/min，温度保持不变，继续发酵，直至菌体浓度达到15-20克/升，棘孢木霉菌的活孢子数不低于1.0×108CFU/ml时放罐，期间若发酵液pH降低到5.5以下，需用灭菌的20％(w/w)氢氧化钠溶液补料，调节发酵液pH到6.0以上；
其中，每1L所述的培养基中含有KH2PO4 1.0～3.0g，(NH4)2SO4 0.5～1.5g，MgSO4·7H2O 0.5～1.5g，葡萄糖18.0～22.0g，酵母浸粉0.5～1.5g，蛋白胨8.0～12.0g，消泡剂2ml，溶剂为去离子水，pН7-7.5；优选的，每1L所述的培养基中含有KH2PO4 2.0g，(NH4)2SO41.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，葡萄糖10.0g，玉米淀粉10.0g，酵母粉1.2g，蛋白胨10.0g，消泡剂2ml，溶剂为去离子水，pН7.2；
(3)将发酵好的培养液喷雾干燥，如果培养液pH低于5.5，用20％(w/w)氢氧化钠溶液将培养液调整pH到6.0以上再进行喷雾干燥，得到棘孢木霉菌菌粉；
(4)按照以下重量百分比称取各原料：棘孢木霉菌菌粉6～7％，氮酮1～3％，木质素5～10％，聚羧酸盐1～3％，萘磺酸盐1～3％，其余为高岭土，混匀后制备得到所述的秸秆腐熟剂。
更进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的秸秆腐熟剂在秸秆降解中的应用，优选的，所述的秸秆包括玉米秸秆和小麦秸秆。
为了说明本发明的秸秆腐熟剂的使用效果，本发明分别通过田间试验以及实验室实验对本发明秸秆腐熟剂在降解纤维素以及改善土样养分中的作用进行了实验，具体结论如下：
一、田间试验结论
每月从小麦和玉米田间取回样品，测定秸秆指标(重量、长度、个数、质量、硬度、颜色等)和对土壤养分影响(pH值、有机质、氮、磷、钾等)，测定结果表明：
1.室外小麦田直观分析秸秆腐熟情况，综合分析秸秆指标结果表明本发明的秸秆腐熟剂(粉剂)的效果好于里氏木霉菌粉以及锦润生物木霉，并且加入尿素效果好于单独加入秸秆腐熟剂。
2.分析本发明的秸秆腐熟剂的添加对小麦田土壤养分影响，本实验测定土壤的指标有pH值、有机质、速效氮、速效磷、速效钾、全氮、全磷、全钾等指标，进而比较不同处理对土壤养分影响情况，可知添加秸秆腐熟剂后土壤的理化性质变化有增加的趋势。
二、实验室实验结论
小麦和玉米实验室实验共设定12个处理，每个处理2个重复，10天取样一次，观察菌体长势、测定失重、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、木质素等指标、5次共取样品120，测定指标600个。
1.本实验测定小麦和玉米秸秆的降解率得知，小麦秸秆整个腐解中，失重率最大为500mg本发明的秸秆腐熟剂处理组，失重率达到39％，大于处理1(空白对照)20％、处理2(里氏木霉菌粉)17％，大于处理3(锦润生物木霉)4％。
2.本实验测定小麦和玉米秸秆中性纤维降解情况，从而分析本发明的秸秆腐熟剂样品对秸秆的腐熟能力，小麦秸秆中性洗涤纤维降解情况中500mg本发明的秸秆腐熟剂降解率效果最明显，其次为锦润生物木霉，再次为里氏木霉菌粉。玉米秸秆中500mg本发明的秸秆腐熟剂对玉米秸秆中性洗涤纤维降解率最强，其次为锦润生物木霉。
3.本实验测定小麦和玉米秸秆酸性纤维、中性纤维、木质素降解情况，从而分析本发明的秸秆腐熟剂样品对秸秆的腐熟能力，综合分析结果表明降解效果最好500mg本发明的秸秆腐熟剂、其次为锦润生物木霉、再次为里氏木霉菌粉。
以上分析可知所含有的大量的纤维素降解菌和木质素降解菌，它们在生长繁殖过程中分泌出大量纤维素酶、半纤维素酶和酷氧化酶，从而能有效促进木质纤维素三组分的降解。
本发明通过对小麦秸秆和玉米秸秆还田施用秸秆腐熟剂后，对秸秆的腐熟能力、土壤理化性质、养分影响情况、秸秆中酸性纤维、中性纤维、木质纤维素等因素的研究，确定该产品的效果和优势，为该秸秆腐熟剂应用效果及施用方法提供了理论依据，同时也为秸秆的生物降解提供了一种有效途径。
附图说明
图1为不同处理组的室外小麦秸秆数量变化值；
图2为不同处理组的室外小麦秸秆长度变化值；
图3为不同处理组的室外小麦秸秆质量变化值；
图4为不同处理组的土壤中有机质变化；
图5为不同处理组的土壤中pH值变化；
图6为不同处理组的土壤中速效氮变化；
图7为不同处理组的土壤中全氮变化；
图8为不同处理组的土壤中速效磷变化；
图9为不同处理组的土壤中全磷变化；
图10为不同处理组的土壤中速效钾变化；
图11为不同处理组的土壤中全钾变化；
图12为小麦秸秆上的秸秆腐熟剂菌体；
其中，A为500mg本发明的秸秆腐熟剂处理组；B为锦润生物木霉处理组；
图13为玉米秸秆上的秸秆腐熟剂菌体；
其中，A为500mg本发明的秸秆腐熟剂处理组；B为锦润生物木霉处理组；
图14为小麦秸秆失重率；
图15为玉米秸秆失重率；
图16为小麦秸秆中性洗涤纤维降解率；
图17为玉米秸秆中性洗涤纤维降解率；
图18为小麦秸秆酸性洗涤纤维降解率；
图19为玉米秸秆酸性洗涤纤维降解率；
图20为小麦秸秆木质素洗涤纤维降解率；
图21为玉米秸秆木质素洗涤纤维降解率。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1棘孢木霉菌发酵菌液的制备
(1)一级发酵种子的制备
将棘孢木霉菌Trichoderma asperellum DQ-T36(CCTCC NO：M 2016449)接种于摇瓶培养基中，在温度为28℃，转速为240r/min的条件下培养24小时后，镜检，确认菌丝生长茁壮，无杂菌，作为一级发酵种子；
其中，每1L所述的培养基中含有KH2PO4 2.0g，(NH4)2SO4 1.0g，MgSO4·7H2O1.0g，葡萄糖20.0g，酵母浸粉1.0g，蛋白胨10.0g，溶剂为去离子水，pН7.2；
(2)发酵罐发酵培养
将步骤(1)制备得到的一级发酵种子按照接种量为5％(v/v)接种于总体积为5升的全自动发酵罐中的培养基中，在初始pH值为7.2，温度为28℃，转速为200r/min、通气量为3升/min的条件下培养9小时后，然后在将转速调节为300r/min、通气量调节为7升/min，温度保持不变，继续发酵，直至菌体浓度达到15-20克/升，棘孢木霉菌的活孢子数不低于1.0×108CFU/ml时出罐，期间若发酵液pH降低到5.5以下，需用灭菌的20％(w/w)氢氧化钠溶液补料，调节发酵液pH到6.0以上，得到棘孢木霉菌的发酵菌液；
其中，每1L所述的培养基中含有KH2PO4 2.0g，(NH4)2SO4 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，葡萄糖10.0g，玉米淀粉10.0g，酵母粉1.2g，蛋白胨10.0g，消泡剂2ml，溶剂为去离子水，pН7.2。
实施例2秸秆腐熟剂(液体制剂)的制备
向实施例1发酵好的发酵液中加入发酵液重量0.2％的山梨酸钾，5％的壳聚糖，3％的竹醋，将混合物在250r/min的速度搅拌20分钟，即得所述的秸秆腐熟剂，其中棘孢木霉菌的活孢子数不低于108CFU/ml。
实施例3秸秆腐熟剂(液体制剂)的制备
向实施例1发酵好的发酵液中加入发酵液重量5％的山梨酸钾，2％的壳聚糖，5.0％的竹醋，将混合物在300r/min的速度搅拌10分钟，即得所述的秸秆腐熟剂，其中棘孢木霉菌的活孢子数不低于108CFU/ml。
实施例4秸秆腐熟剂(液体制剂)的制备
向实施例1发酵好的发酵液中加入发酵液重量35％的山梨酸钾，4％的壳聚糖，7.0％的竹醋将混合物在280r/min的速度搅拌30分钟，即得所述的秸秆腐熟剂，其中棘孢木霉菌的活孢子数不低于108CFU/ml。
实施例5秸秆腐熟剂(可湿性粉剂)的制备
(1)将实施例1发酵好的培养液喷雾干燥，如果培养液pH低于5.5，用20％(w/w)氢氧化钠溶液调整pH到6.0以上再进行喷雾干燥，得到棘孢木霉菌菌粉；
(2)按照以下重量百分比称取各原料：棘孢木霉菌菌粉6.7％，氮酮2％，木质素7.5％，聚羧酸盐2％，萘磺酸盐2％，其余为高岭土，混匀后制备得到所述的秸秆腐熟剂。
实施例6秸秆腐熟剂(可湿性粉剂)的制备
(1)将实施例1发酵好的培养液喷雾干燥，如果培养液pH低于5.5，用20％(w/w)氢氧化钠溶液调整pH到6.0以上再进行喷雾干燥，得到棘孢木霉菌菌粉；
(3)按照以下重量百分比称取各原料：棘孢木霉菌菌粉6.5％，氮酮2.5％，木质素5％，聚羧酸盐1.5％，萘磺酸盐1.5％，其余为高岭土，混匀后制备得到所述的秸秆腐熟剂。
实施例7秸秆腐熟剂(可湿性粉剂)的制备
(1)将实施例1发酵好的培养液喷雾干燥，如果培养液pH低于5.5，用20％(w/w)氢氧化钠溶液调整pH到6.0以上再进行喷雾干燥，得到棘孢木霉菌菌粉；
(2)按照以下重量百分比称取各原料：棘孢木霉菌菌粉7％，氮酮3％，木质素10％，聚羧酸盐1％，萘磺酸盐1.5％，其余为高岭土，混匀后制备得到所述的秸秆腐熟剂。
实验例1秸秆腐熟剂的田间试验
1实验材料和方法
1.1实验材料
试验地点：试验于2015年7月27日～10月27日在位于黑龙江省哈尔滨市东风镇黑龙江省农业科学院试验田，供试面积为40m2，前茬作物为小麦。小麦收获后全部秸秆进行还田。试验前取耕层混合样进行分析化验，试验后每个处理分小区进行取样分析，试验前土壤养分状况见表1。土壤类型：黑钙土、质地：壤、肥力等级：中。
表1试验前供试土壤理化性状分析结果
pH 9.19
碱解氮mg/kg 40.56
有效磷mg/kg 28.16
速效钾mg/kg 240.2
有机质g/kg 26.03
全磷g/kg 0.91
全钾g/kg 23.11
含水量％ 25.21
供试秸秆及腐熟剂品种：供试秸秆为小麦秸秆。
供试秸秆腐熟剂种类：I秸秆腐熟剂(液体制剂)实施例2制备、II秸秆腐熟剂(可湿性粉剂)实施例5制备、III阳性对照(锦润生物木霉菌粉以及里氏木霉菌粉)
2.1.2试验方法
2.1.2.1实验设计
小麦田间实验共设置12个处理，每个处理3个重复，每个小区面积为2m2，小区布置随机排列，具体实验设计见表2：
表2小麦田间用药
种类 用量
处理1 水(ck) 适量
处理2 硝酸铵 1.5g/m<sup>2</sup>
处理3 尿素 1.5g/m<sup>2</sup>
处理4 锦润生物木霉菌粉 0.75g/m<sup>2</sup>
处理5 锦润生物木霉菌粉+尿素 0.75g/m<sup>2</sup>+1.5g/m<sup>2</sup>
处理6 本发明的秸秆腐熟剂(液体) 0.5mL/m<sup>2</sup>
处理7 本发明的秸秆腐熟剂(液体)+尿素 0.5mL/m<sup>2</sup>+1.5g/m<sup>2</sup>
处理8 本发明的秸秆腐熟剂(粉剂) 200mg/m<sup>2</sup>
处理9 本发明的秸秆腐熟剂(粉剂)+尿素 200mg/m<sup>2</sup>+1.5g/m<sup>2</sup>
处理10 本发明的秸秆腐熟剂(粉剂) 500mg/m<sup>2</sup>
处理11 本发明的秸秆腐熟剂(粉剂)+尿素 500mg/m<sup>2</sup>+1.5g/m<sup>2</sup>
处理12 里氏木霉菌粉 0.75g/m<sup>2</sup>
2.1.2.2实验过程：
1.将药物按照设计方案利用喷壶均匀喷洒到整理好的田地里；
2.喷洒药后，干燥10分钟后，利用耙子铺平；
3.按照5点取样法，取样回来放到罐内；
4.取原始小麦地未经过处理土样测定氮、磷、钾、有机质等指标作为空白样；
5.每个月取室外小麦田的小麦秸秆样品测定指标；
5.1样本原始重量(土+残茬)
5.2从土壤中挑出秸秆
5.3秸秆称重
5.4记录秸秆的数量
5.5测量秸秆片段的长度
5.6描述秸秆的状态和颜色(黄色，坚硬的，紧实的，有弹性的，用力折断)
2.2实验结果与分析
2.2.1腐熟过程中小麦秸秆形态变化
2.2.1.1直观分析腐熟剂的作用：
秸秆腐熟剂施加到小麦田后，室外小麦田秸秆的状态和颜色都逐渐发生着变化，如表3，30天后只有处理2(尿素)和处理5(锦润生物木霉菌粉+尿素)不完整、处理11(本发明的秸秆腐熟剂+尿素)变得柔软，其他的处理形状并无变化，60天后观察处理5(锦润生物木霉菌粉+尿素)、处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)、处理12(里氏木霉菌粉)变化较大，达到90天后处理6(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂)和处理9(200mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)颜色硬度、弹性、折断、完整性也发生变化。说明处理5(锦润生物木霉+尿素)、处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)、处理12(里氏木霉菌粉)对田间小麦秸秆腐熟效果比较明显。处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)要比处理1(空白对照)使秸秆状态发生变化提前60天，比处理5(锦润生物木霉菌粉+尿素)速度慢30天，并且与处理12(里氏木霉菌粉)基本相同。
表3室外小麦田秸秆状态情况
Figure GDA0001304886580000111
Figure GDA0001304886580000121
注：上表3中，黄色“+”灰色“—”、坚硬“+”柔软“—”、有弹性“+”无弹性“—”、用力折断“+”轻松易断“—”、完整“+”不完整“—”
2.2.1.2腐解过程中秸秆数量变化：
在腐解过程中，秸秆的数量会随着时间的推移逐渐发生变化。本试验设每个月取小麦田内的小麦秸秆，测定秸秆数量，并比较几个处理秸秆数量变化情况，从而推测腐熟能力，结果以下表4和图1。
表4腐解过程中秸秆数量
Figure GDA0001304886580000122
Figure GDA0001304886580000131
从表4和图1结合分析可知室外小麦田中小麦秸秆60天后秸秆数量变化情况，其中处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)变化最明显，数量减少21个，其次是处理12(里氏木霉菌粉)减少18个，再次处理7(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂(液体)+尿素)减少14个，其它处理变化均小于14个。当达到90天后处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)＞处理12(里氏木霉菌粉)＞处理10(500mg本发明的秸秆腐熟剂)，其它处理变化均小于18个。同时通过图1比较可知秸秆数量变化处理5＞处理4、处理7＞处理6、处理9＞处理8、处理11＞处理10，说明在腐熟剂中添加尿素有利于秸秆腐熟。同时对小麦田秸秆数量影响最大的是处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)减少28个，其次是处理12(里氏木霉菌粉)22个，再次处理10(500mg本发明的秸秆腐熟剂)18个。处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)对秸秆数量变化大于处理1(空白)26个，大于处理12(里氏木霉菌粉)和处理5(锦润生物木霉+尿素)，分别大于6个和12个。
2.2.1.3腐解过程中秸秆长度变化：
在腐解过程中，秸秆的长度会随着时间的推移逐渐发生变化。本试验设每个月取小麦田内的小麦秸秆，并比较几个处理秸秆长度变化，从而推测腐熟能力，结果见表5和图2。
表5腐解过程中秸秆长度
Figure GDA0001304886580000132
Figure GDA0001304886580000141
结合表5和图2可知在腐熟的过程中室外小麦田中小麦秸秆的长度随着时间的推移逐渐呈现减少的趋势，经过60天、90天分别记录结果，可知比较不同秸秆腐熟剂的效果不同，其中效果由强变弱依次为处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)＞处理9(200mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)＞处理7(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂(液体)+尿素)，长度减少值为1.37cm、0.88cm、0.85cm。处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)对秸秆长度变化大于处理1(空白对照)0.83cm、大于处理12(里氏木霉菌粉)0.55cm，大于处理5(锦润生物木霉+尿素)0.62cm。
2.2.1.4腐解过程中秸秆质量变化：
小麦田间内取回小麦秸秆秸通过风干至恒重后称量质量，结果见表6，通过质量变化来衡量秸秆被腐熟的情况，进而评价腐熟剂腐熟效果。
表6腐解过程中秸秆质量
Figure GDA0001304886580000142
Figure GDA0001304886580000151
分析表7和图3可知：在室外小麦田秸秆在腐熟的过程中质量在逐渐减少，90天观察结果发现减少质量最多的是处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)减少0.27g，其次处理8(200mg本发明的秸秆腐熟剂)减少0.23g，再次处理10(500mg本发明的秸秆腐熟剂)减少0.22g，均比处理1(清水对照)减少大约2倍左右。其他处理效果不明显。处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)使秸秆质量变化大于处理1(空白)200.00％、大于处理5(锦润生物木霉+尿素)125.00％、大于处理12(里氏木霉菌粉)68.75％。
2.2.2腐熟过程中对土壤养分影响
2.2.2.1腐熟剂对土壤有机质的影响：
由图4可知，土壤中有机质的含量呈逐渐增加趋势，比原来有所增加，说明秸秆或者其他有机物质转化为有机质。不同秸秆腐熟剂处理后土壤中有机质增加量不同，其中处理7(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂+尿素)＞处理9(200mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)＞处理6(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂)＞处理5(锦润生物木霉+尿素)。处理7(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂)处理土样中有机质变化大于处理1(空白对照)11.01％、处理5(锦润生物木霉+尿素)9.19％。
2.2.2.2腐熟剂对土壤pH值的影响：
从图5可以看出，土壤pH值随腐熟剂增加呈明显的下降趋势。处理间差异不明显，秸秆在分解过程中会对土壤pH值有一定的影响。秸秆在转化过程中产生小分子量有机物被微生物利用，说明在代谢过程中会产生酸性气体对土壤pH值产生一定的影响。处理12(里氏木霉菌粉)、处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)、处理9(200mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)pH值变化较大。
2.2.2.3腐熟剂对土壤速效氮和全氮的影响：
由图6可知小麦秸秆还田后的90天内土壤中的速效氮的含量在迅速增长到不变到缓慢增加，不同秸秆腐熟剂在不同时间对土壤中速效氮含量产生不同影响，如在30天时处理7(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂+尿素)、处理4(锦润生物木霉)、处理2(硝酸铵)中土壤氮含量均大于处理1(清水对照)，到60天各处理间几乎无差距。处理7(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂(液体)+尿素)使土样中速效氮增加最多，大于处理1(空白对照)11.1％、处理5(锦润生物木霉+尿素)5.56％、处理12(里氏木霉菌粉)7.87％。
由图7可知小麦田秸秆还田后，腐熟的过程中总氮的含量在不断的增加，特别施加处理7(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂+尿素)、处理2(尿素)、处理5(锦润生物木霉+尿素)、处理3(硝酸铵)的土样中总氮的含量从0-90天一直大于处理1(清水对照)。分析可能原因处理2、处理3添加氮源、同时处理7也添加氮源，在秸秆腐熟过程，秸秆中氮含量不断释放，所以总氮含量最高，说明ck(锦润生物木霉)和加入本发明的秸秆腐熟剂0.5ml能显著提高土壤总氮含量。土样中总氮变化中处理7(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂+尿素)最大，大于处理1(空白对照)15.56％、处理5(锦润生物木霉+尿素)11.83％、处理12(里氏木霉菌粉)17.32％。
2.2.2.4腐熟剂对土壤速效磷和全磷的影响：
从图8和图9分析可知，小麦田秸秆在腐熟的过程中，土壤中速效磷和总磷的含量呈现总体降低的趋势，分析可能原因小麦收割后并未施加任何磷肥，并且小麦收割后频繁下雨，温度也适宜，因此实验小区内大量杂草生长，吸收土壤中的磷元素，使得在0-60天土壤中速效磷和全磷含量降低，当60-90天东北地区气温下降杂草停止生长，土壤中速效磷和全磷都有了增加的趋势。从图8可知处理6(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂(液体))土壤中速效磷的含量有所提高，说明添加本发明的秸秆腐熟剂有利于加快秸秆腐熟释放磷元素。处理6(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂(液体))土壤中速效磷增加最多，大于处理1(空白对照)7.04％、处理5(锦润生物木霉+尿素)14.07％、处理12(里氏木霉菌粉)26.65％。而全磷变化中处理6(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂)大于处理1(空白对照)3.85％、处理5(锦润生物木霉+尿素)9.62％、处理12(里氏木霉菌粉)20.93％。
2.2.2.5腐熟剂对土壤速效钾和全钾的影响：
结合图10和图11可知，小麦田土壤中速效钾和全钾都出现先降低后增加趋势，分析可能原因小麦收割后，试验田生长杂草吸收土壤中钾元素，造成前期土壤中速效钾和全钾降低，后期杂草停止生长，同时还田秸秆腐熟过程中释放钾元素，使得速效钾和全钾含量有所提高。从图10可知处理4(锦润生物木霉)中速效钾含量大于对照，说明处理4对秸秆腐熟有良好效果。从图11可知处理2(硝酸铵)、处理5(锦润生物木霉+尿素)、处理6(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂)、处理8(200mg本发明的秸秆腐熟剂)、处理9(200mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)、处理10(500mg本发明的秸秆腐熟剂)土壤中全钾含量大于处理1(清水对照)。处理10(500mg本发明的秸秆腐熟剂)土样速效磷的含量最高大于处理1(空白对照)15.44％、处理5(锦润生物木霉+尿素)4.1％、处理12(里氏木霉菌粉)16.14％。在土壤中总磷的变化中处理10(500mg本发明的秸秆腐熟剂)全磷的含量大于处理1(空白对照)6.85％、处理5(锦润生物木霉+尿素)15.43％、处理12(里氏木霉菌粉)9.7％。
小结：
1.对室外小麦田直观分析秸秆腐熟情况可知，处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)要比处理1(空白对照)使秸秆状态发生变化提前60天，比处理5(锦润生物木霉+尿素)速度慢30天，并且与处理12(里氏木霉菌粉)相同。对小麦秸秆数量变化情况为，处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)变化最明显，数量减少21个，其次是处理12(里氏木霉菌粉)减少18个，再次处理7(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂(液体)+尿素)减少14个，其它处理变化均小于14个。腐解过程中影响秸秆长度变化，处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)对秸秆长度变化大于处理1(空白对照)0.83cm、大于处理12(里氏木霉菌粉)0.55cm，大于处理5(锦润生物木霉+尿素)0.62cm。腐解过程中也影响秸秆质量变化，处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)使秸秆质量变化大于处理1(空白)200.00％、大于处理5(锦润生物木霉+尿素)125.00％、大于处理12(里氏木霉菌粉)68.75％。
2.分析本发明的秸秆腐熟剂秸秆腐熟剂的添加对小麦田土壤养分影响，本实验测定土壤的指标有pH值、有机质、速效氮、速效磷、速效钾、全氮、全磷、全钾等指标，进而比较不同处理对土壤养分影响情况，可知添加秸秆腐熟剂后土壤中有机质和全氮和速效氮呈现增加趋势，对土壤中速效氮源影响可知，处理7(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂+尿素)使土样中速效氮增加最多，高于处理1(空白对照)11.1％、处理5(锦润生物木霉)5.56％、处理12(里氏木霉菌粉)7.87％。土壤中总氮变化为处理7(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂+尿素)最大，大于处理1(空白对照)15.56％、处理5(锦润生物木霉+尿素)11.83％、处理12(里氏木霉菌粉)17.32％
pH值出现下降趋势、秸秆在转化过程中产生小分子量有机物被微生物利用，说明在代谢过程中会产生酸性气体对土壤pH值产生一定的影响。pH值变化由强变弱分别为处理12(里氏木霉菌粉)、处理11(500mg本发明的秸秆腐熟剂+尿素)、处理9(200mg本发明的秸秆腐熟剂)pH值变化较大。
速效钾和速效磷及全磷全钾出现先下降后平稳升高趋势，其中土壤速效磷和全磷的变化中，处理6(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂)土壤中速效磷增加最多，大于处理1(空白对照)7.04％、处理5(锦润生物木霉+尿素)14.07％、处理12(里氏木霉菌粉)26.65％。而全磷变化中处理6(0.5ml本发明的秸秆腐熟剂)大于处理1(空白对照)3.85％、处理5(锦润生物木霉+尿素)9.62％、处理12(里氏木霉菌粉)20.93％。土壤中钾元素变化为处理10(500mg本发明的秸秆腐熟剂)土壤中速效钾的含量最高，大于处理1(空白对照)15.44％、处理5(锦润生物木霉+尿素)4.1％、处理12(里氏木霉菌粉)16.14％。在土壤中总钾的变化中处理10(500mg本发明的秸秆腐熟剂)全钾的含量大于处理1(空白对照)6.85％、处理5(锦润生物木霉+尿素)15.43％、处理12(里氏木霉菌粉)9.7％。分析可能原因为小麦收割后并未施加任何磷、钾肥，并且小麦收割后频繁下雨，温度也适宜，因此实验小区内大量杂草生长，吸收土壤中的磷元素，使得在0-60天土壤中速效磷、钾和全磷、钾含量降低，当60-90天东北地区气温下降杂草停止生长，土壤中速效磷、钾和全磷、钾都有了增加的趋势。
实验例2实验室实验
1实验目的
稻秆速腐剂在农作物稻杆中的应用得到了人们越来越多的认可，它的使用不仅能使农作物稻秆问题得到很好的解决，同时还能起到肥田和改善土质等积极影响。前文已设计田间试验，本实验目的设计实验室内小麦秸秆以及玉米秸秆实验，通过小麦、玉米秸秆外观、失重、纤维素、半纤维素和木质素的变化来判断本发明的秸秆腐熟剂、锦润生物木霉样品、里氏木霉菌粉样品对秸秆腐熟情况，同时确定本发明的秸秆腐熟剂最佳使用量。
2实验材料和方法
2.1实验材料：
玉米秸秆来自黑龙江，小麦秸秆来自无锡，本发明的秸秆腐熟剂(按照实施例5方法制备)。
锦润生物木霉药剂，里氏木霉菌粉购自市场。
实验仪器药品：滤纸、玻璃平皿、移液管、三角瓶、剪刀、电子秤
(a)消化装置—ANKOM A200i纤维分析仪。
(b)滤袋—ANKOM F57滤袋。如果样品非常细，可选用F58滤袋
(c)封口机
(d)干燥器
(e)分析天平-精确至0.1mg
(f)电热干燥箱
(g)耐溶剂记号笔
2.2实验方法：
2.2.1实验设计
表7室内实验设计表
Figure GDA0001304886580000191
2.2.2实验操作
1.秸秆预处理
预估实验需要玉米秸秆和小麦秸秆数量，利用清水浸泡24h后，利用清水冲洗2-3遍后，放入烘箱培养过夜直到完全烘干。(目的洗掉杂质和水溶性纤维素)
2.菌悬液制备
分别称取本发明的秸秆腐熟剂100mg、200mg、500mg，锦润生物木霉药剂750mg及里氏木霉菌粉750mg，放入含有100ml蒸馏水的三角瓶内摇匀后备用。
3.取玻璃平板放入滤纸，用蒸馏水使滤纸湿润，放入小麦秸秆(大小一致长度5-7cm)3g，玉米秸秆3g(大小一致长度5-7cm)备用。
4.利用移液管分别吸取含有100mg、200mg、500mg的本发明的秸秆腐熟剂的菌悬液以及含有750mg的锦润生物木霉菌粉、里氏木霉菌粉的菌悬液分别加入到准备好的盛有玉米秸秆和小麦秸秆平板内。同时以加入清水为对照，每个处理10个重复。
5.放置在室温下培养。观察记录结果并照片记录。
6.放置在室温下培养，每隔一段时间测定四个指标：秸秆失重、纤维素、半纤维素、木质素具体方法同下：
6.1秸秆失重
利用清水洗涤秸秆，目的洗掉菌体及杂物，放到滤纸上风干处理，风干到恒重后记录描述秸秆的状态和颜色(黄色，坚硬的，紧实的，有弹性的，用力折断)，称重将其与总的秸秆的量比较，计算降解量与降解率。
6.2测定中性洗涤纤维(NDF)
(a)滤袋和样品的准备
1)用耐溶剂的记号笔给滤袋编号，称重(m1)。
2)直接准确称取0.5g(±0.05g制备好的样品(m)于滤袋中。样品需要粉碎过1mm筛。
3)在距离滤袋上边缘大约5mm用封口机封口。然后将样品在滤袋中展平，均匀分布。
4)至少取一个空白滤袋(C1)，同时做空白测定。
5)一次最多可以在滤袋架上放24个滤袋。无论放置滤袋数量多少，9层滤袋架上托盘要全部使用，每层放三个滤袋。层与层之间错开120度。然后将装有滤袋的支架放入纤维分析仪消煮器中，然后在顶部将金属压锤放上，以确保消煮过程中不浮起。
(b)当处理24个滤袋时，向2000mL中性洗涤剂溶液中加无水亚硫酸钠20g(0.5g/50mL ND溶液)和4.0mL热稳定α-淀粉酶。让无水亚硫酸钠在溶液中充分溶解。向容器中加入该溶液。如果处理样品少于20个滤袋，按照每个滤袋加100mL酸溶液，但不能少于1500mL，确保滤袋托盘完全浸没。
(c)打开搅拌和加热开关，确保滤袋支架搅拌正常。盖上盖子并完全密封好。仪器将加热并维持溶液温度100℃。设置处理时间75min，包括加热升温时间。
(d)消煮结束，关上加热和搅拌开关，打开排液阀(开始要慢一点)，在打开盖子之前确保废液排放管与废液容器安全连接，一定将热的溶液排完。
(e)溶液排完后，打开盖子，关闭排液阀，加2000mL(70℃～90℃)蒸馏水，并且第1和第2次淋洗时同时加4.0mLα-淀粉酶，放下盖子，但不旋紧。打开搅拌开关(不打开加热开关)搅拌3～5min。排掉废液，重复2次，共淋洗3次。
(f)最后一次淋洗后，加冷的自来水以操作和使冷却容器，为下轮测定做好准备。排干水，从容器中取出带滤袋的支架。将滤袋从滤袋支架上取下来，轻轻挤压去掉多余的水。然后将滤袋放入250mL烧杯中，加丙酮至覆没滤袋，浸泡3～5min，然后取出并轻轻挤压去掉多余的丙酮。
(g)在通风橱中展开滤袋，让其自然干燥。完全干燥后放入102℃±2℃烘箱烘干4小时。
(q)从烘箱中取出滤袋，直接放入干燥器中冷却至室温，然后称重(m2)。
E.计算
试样中中性洗涤纤维质量分数按以下公式计算。
NDF(％)＝(m2-(m1×C1))×100/m
其中：m1为空袋质量，g；m为样品质量，g；m2为提取处理后样品残渣+滤袋质量，g；C1为空白袋子校正系数(烘干后质量/原来质量)。
6.3测定酸性洗涤纤维(ADF)
(a)滤袋和样品的准备
1)用耐溶剂的记号笔给滤袋编号，称重(m1)。
2)直接准确称取0.5g(±0.05g制备好的样品(m)于滤袋中。样品需要粉碎过1mm筛。
3)在距离滤袋上边缘大约4mm用封口机封口。然后将样品在滤袋中展平，均匀分布。
4)至少取一个空白滤袋(C1)，同时做空白测定。
5)一次最多可以在滤袋架上放24个滤袋，每层放三个滤袋。层与层之间错开120度。然后将装有滤袋的支架放入纤维分析仪消煮器中，然后在顶部将金属压锤放上，以确保消煮过程中不浮起。
(b)当处理24个滤袋时，向容器中加入2000mL酸性洗涤剂溶液。如果处理样品少于20个滤袋，按照每个滤袋加100mL酸溶液，但不能少于1500mL，确保滤袋托盘能完全浸没。
(c)打开搅拌和加热开关，确保滤袋支架搅拌正常。盖上盖子并完全密封好。仪器将加热并维持溶液温度100℃。设定处理时间60min，包括加热升温时间。
(d)消煮结束，关上加热和搅拌开关，打开排液阀(开始要慢一点)，在打开盖子之前确保废液排放管与废液容器安全连接，一定将热的溶液排完。
(e)溶液排完后，打开盖子，关闭排液阀，加2000mL(70℃～90℃)蒸馏水，关闭盖子并打开加热开关，或打开盖子并关闭加热开关。搅拌5min。排掉废液，重复2次，共淋洗3次或洗涤至中性。
(f)将滤袋从滤袋支架上取下来，轻轻挤压去掉多余的水。然后将滤袋放入250mL烧杯中，加丙酮至覆没滤袋，浸泡3～5min，然后取出并轻轻挤压去掉多余的丙酮。
(g)在通风橱中展开滤袋，让其自然干燥。完全干燥后放入102℃±2℃烘箱
(q)从烘箱中取出滤袋，直接放入干燥器中冷却至室温，然后称重(m2)。
E.计算
试样中酸性洗涤纤维质量分数按以下公式计算。
ADF(％)＝(m2-(m1×C1))×100/m
其中：m1为空袋质量，g；m为样品质量，g；m2为提取处理后样品残渣+滤袋质量，g；C1为空白袋子校正系数(烘干后质量/原来质量)
6.4测定酸性洗涤木质素(ADL)
(a)滤袋和样品的准备
1)用耐溶剂的记号笔给滤袋编号，称重(m1)。
2)直接准确称取0.5g(±0.05g制备好的样品(m)于滤袋中。样品需要粉碎过1mm筛。
3)在距离滤袋上边缘大约5mm用封口机封口。然后将样品在滤袋中展平，均匀分布。
4)至少取一个空白滤袋(C1)，同时做空白测定。
5)先按照ADF测定方法进行处理。
(b)ADF测定之后，将干燥后的滤袋/样品放入3L烧杯中，加足量72％硫酸将滤袋浸没(大约250mL)。
(c)将2L烧杯放到3L beaker中使滤袋浸没。开始时搅拌滤袋，并在30分钟内将2L烧杯上、下提起大约30次。
(d)3小时后将硫酸倒掉，然后用水淋洗除掉酸。重复淋洗至pH为中性。然后用250mL丙酮淋洗3min除掉水。
(e)在102℃烘箱中干燥4h，然后放入干燥器中冷却至室温，称重(m2)。
(f)将滤袋放入已知重量(m3)30或50mL坩埚中，在600℃±15℃条件下灰化2小时，冷却，称重(m4)
E.计算
试样中酸性洗涤木质素质量分数按以下公式计算。
ADL(％)＝[(m2-m1×C1)-((m4-m3)]×100/m
其中：m1为空袋质量，g；m2为提取烘干后滤袋+样品质量，g；m3为坩埚质量，g；m4为坩埚+灰分质量；C1为空白袋子校正系数(烘干后质量/原来质量)；m为样品质量，g
3.3实验结果和分析
3.3.1腐解过程中小麦和玉米秸秆上菌体变化
结合表8和图12分析可知当2个月时所有处理秸秆上都存在绿色木霉菌，在3个月500mg本发明的秸秆腐熟剂菌体和ck(锦润生物木霉)仍然在小麦秸秆上存在，说明随着本发明的秸秆腐熟剂样品添加量增大，菌体存在时间也在延长。
表8小麦秸秆本发明的秸秆腐熟剂菌体情况表
Figure GDA0001304886580000231
注：“+”代表有绿色木霉菌，“-”代表代表无绿色木霉菌
表9玉米秸秆本发明的秸秆腐熟剂菌体情况表
Figure GDA0001304886580000232
Figure GDA0001304886580000241
注：“+”代表有绿色木霉菌，“-”代表代表无绿色木霉菌
结合表9和图13分析可知，在一个月内秸秆上的绿色木霉菌大量存在，当2个月时所有处理部分秸秆上存在绿色木霉菌，在3个月500mg本发明的秸秆腐熟剂菌体和ck(锦润生物木霉)仍然在小麦秸秆上存在，说明随着本发明的秸秆腐熟剂样品添加量增大，菌体存在时间也在延长。
3.3.2腐解过程中小麦和玉米失重率测定结果
如图14可知，实验室内小麦秸秆失重情况随着时间变化失重率也在逐渐变化，在实验开始一个月时，各个处理的秸秆失重率并没有明显的差异，当60天时失重率发生差异，其中处理6(500m本发明的秸秆腐熟剂)和处理3(ck锦润生物木霉)失重率大于其他处理组，当100天时失重率差异明显，因此失重率最大为处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)39％、再次处理3(ck锦润生物木霉)35％。处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)失重率最大，大于处理1(空白对照)20％、处理2(里氏木霉菌粉)17％，大于处理3(锦润生物木霉)4％。
如图15可知，实验室内玉米秸秆失重情况随着时间变化失重率也在逐渐变化，在实验开始一个月时，各个处理的秸秆失重率并没有明显的差异，当60天时失重率发生差异，各处理组失重率均大于CK(水)，当100天时失重率差异明显，处理6(500m本发明的秸秆腐熟剂)失重率最大为28％，其次处理3(ck锦润生物木霉)失重率最大为27％。处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)失重率最大，大于处理1(空白对照)13％、处理2(里氏木霉菌粉)5％，与处理3(锦润生物木霉)基本相同。
3.3.3腐解过程对小麦玉米秸秆木质纤维素三组分的降解率变化
3.3.3.1测定中性洗涤纤维(NDF)：
通过图16可知秸秆腐熟的过程小麦秸秆降解率呈现出先迅速增高后缓慢的趋势，并且相同的时间不同处理秸秆中性洗涤纤维降解率存在着差异，在20天内降解率不断增加。当20-60天活性变化较小。说明此时0-20天菌体不断繁殖，活性不断增大，到40-90天秸秆上几乎无绿色木霉菌菌体慢慢减少，但有其他菌体产生，因此导致60-90天降解率又增加了。在90天内处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)、处理3(ck锦润生物木霉)、处理2(ck里氏木霉菌粉)的降解率一直大于ck水，并且处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)降解率出现最大值11.9％。因此小麦秸秆中性洗涤纤维降解率最大处理组为处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)，其次为处理3(ck锦润生物木霉)，再次为处理2(ck里氏木霉菌粉)。
通过图17可知秸秆腐熟的过程中玉米秸秆降解率呈现出先增高后平缓的趋势，并且相同的时间内，不同处理秸秆中的中性洗涤纤维降解率存在着差异，在20天内降解率不断增加。40-90天降解率几乎不变。最终处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)对玉米秸秆中性洗涤纤维降解率最强，降解率6.97％，其次处理3(ck锦润生物木霉)降解率出现最大值6.48％。
3.3.3.2测定酸性洗涤纤维(ADF)
小麦秸秆酸性洗涤纤维(ADF)降解率的变化曲线如图18所示。从图中可以看出，经过10天的腐解，秸秆腐熟剂的处理样纤维素降解率迅速增加，且都高于处理1(清水)、经过90天的腐解处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)降解率出现最大值11.59％，处理3(ck里氏木霉菌粉)降解率10.91％、处理2(ck锦润生物木霉)降解率10.37％、明显高于处理1(清水)降解率7.73％。说明处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)降解小麦秸秆酸性洗涤纤维能力最强，其次处理3(锦润生物木霉)，再次是处理2(ck里氏木霉菌粉)。
玉米秸秆酸性洗涤纤维(NDF)降解率的变化曲线如图19所示。从图中可以看出，玉米秸秆在腐解过程中，利用腐熟剂处理的玉米秸秆酸性洗涤纤维(ADF)降解率一直大于清水对照。并且处理2(ck里氏木霉菌粉)＞处理6(500mg)，处理3(锦润生物木霉)＞处理5(200mg)≥处理4(100mg)，说明ck(里氏木霉菌粉)降解玉米秸秆酸性洗涤纤维能力最强降解率为7.63％，其次处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)降解率为6.8％，再次是ck(锦润生物木霉)降解率5.61％。
3.3.3.3测定木质素洗涤纤维(ADL)
小麦木质素洗涤纤维(ADL)降解率的变化曲线如图20所示。小麦秸秆腐解20天内，所有处理的木质素降解率都在不断增加，小麦秸秆腐解90天内，所有处理的木质素降解率都在不断增加并大于ck(清水处理)，并且处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)降解率为14.83％，达到最大值，处理2(里氏木霉菌粉)降解率分别为10.79％、处理3(ck锦润生物木霉)降解率为10.58％，因此说明小麦木质素洗涤纤维(ADL)降解率由强到弱分别是处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)、处理5(200mg本发明的秸秆腐熟剂)、处理2(里氏木霉菌粉)。
玉米木质素洗涤纤维(ADL)降解率的变化曲线如图21所示。小麦秸秆腐解90天内，所有处理的木质素降解率都在不断增加并大于ck(清水处理)，并且处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)降解率为11.21％，达到最大值、处理3(ck锦润生物木霉)降解率达到最大值为9.66％，都大于ck(清水处理)的降解率，因此说明玉米木质素洗涤纤维(ADL)降解率由强到弱分别是处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)、处理3(锦润生物木霉)、处理4(200mg本发明的秸秆腐熟剂)、处理2(里氏木霉菌粉)。
小结：
1.本次试样中小麦和玉米秸秆上绿色棘孢木霉菌在实验室适宜的条件下，20天内大量繁殖，在20-40天几乎不变，在40天后菌体逐渐减小，60天几乎后只有处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)和处理3(锦润生物木霉)还存在绿色菌体，说明随着本发明的秸秆腐熟剂浓度的提高，菌体在秸秆上存在时间也增加。
2.本实验测定小麦和玉米秸秆的降解率得知，小麦秸秆整个腐解中，失重率最大处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)为39％、其次处理3(ck锦润生物木霉)35％。其中处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)失重率高于处理1(空白对照)20％、处理2(里氏木霉菌粉)17％、低于处理3(锦润生物木霉)4％。
玉米秸秆在整个腐解过程中失重率最大为处理6(500mg)为28％，其次处理3(ck锦润生物木霉)失重率最大为27％。处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)失重率最大，大于处理1(空白对照)13％、处理2(里氏木霉菌粉)5％，与处理3(锦润生物木霉)基本相同。
3.本实验测定小麦和玉米秸秆中性纤维降解情况，从而分析本发明的秸秆腐熟剂样品对秸秆的腐熟能力，小麦秸秆中性洗涤纤维降解情况中处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)降解率效果最明显，最大值11.9％。其次是处理3(ck锦润生物木霉)再次是处理2(ck里氏木霉菌粉)。
玉米秸秆中性洗涤纤维降解情况分析可知，处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)对玉米秸秆中性洗涤纤维降解率最强，降解率6.97％、其次是处理3(ck锦润生物木霉)降解率为6.48％。
本实验测定小麦和玉米秸秆酸性纤维降解情况，从而分析本发明的秸秆腐熟剂样品对秸秆的腐熟能力，小麦秸秆酸性纤维素降解分析可知处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)降解率出现最大值11.59％，处理3(ck里氏木霉菌粉)降解率10.91％、处理2(ck锦润生物木霉)降解率10.37％、明显高于处理1(清水)降解率7.73％。说明处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)降解小麦秸秆酸性洗涤纤维能力最强。玉米秸秆酸性洗涤纤维能力为处理2(ck里氏木霉菌粉)＞处理6(500mg)，处理3(锦润生物木霉)＞处理5(200mg)≥处理4(100mg)，说明ck(里氏木霉菌粉)降解玉米秸秆酸性洗涤纤维能力最强，降解率为7.63％，其次是处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)降解率为6.8％，再次是ck(锦润生物木霉)降解率5.61％。。
本实验测定小麦和玉米秸秆木质降解情况，其中小麦秸秆中木质素洗涤纤维(ADL)降解率由强到弱分别是处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)、处理5(200mg本发明的秸秆腐熟剂)、处理2(里氏木霉菌粉)，其中处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)降解率为14.83％，达到最大值，处理2(里氏木霉菌粉)降解率分别为10.79％、处理3(ck锦润生物木霉)降解率为10.58％。
玉米秸秆中木质纤维素降解情况分析可知处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)降解率分别为11.21％达到最大值、处理3(ck锦润生物木霉)降解率9.66％，都大于ck(清水处理)的降解率，因此说明玉米木质素洗涤纤维(ADL)降解率由强到弱分别是处理6(500mg本发明的秸秆腐熟剂)、处理3(锦润生物木霉)、处理4(200mg本发明的秸秆腐熟剂)、处理2(里氏木霉菌粉)。
以上分析可知所含有大量的纤维素降解菌和木质素降解菌，它们在生长繁殖过程中分泌出大量纤维素酶、半纤维素酶和酷氧化酶，从而能有效促进木质纤维素三组分的降解。

Claims (13)

1.一种秸秆腐熟剂，其为液体制剂，其特征在于所述的液体制剂中含有重量百分比为0.001%-50%的山梨酸钾、2-5%的壳聚糖、2.5-7.5%的竹醋以及棘孢木霉菌，所述棘孢木霉菌的活孢子数不低于108 CFU /ml，所述的棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum），命名为Trichoderma asperellum DQ-T36，保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2016449，保藏时间为2016年9月1日，保藏地址在武汉大学。
2.如权利要求1所述的秸秆腐熟剂，其特征在于所述的液体制剂中含有重量百分比为0.2%的山梨酸钾、5%的壳聚糖、3%的竹醋。
3.一种制备权利要求1所述的秸秆腐熟剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）一级发酵种子的制备
将权利要求1中所述的棘孢木霉菌接种于摇瓶培养基中，在温度为28℃，转速为220-240r/min的条件下培养20-24小时后，镜检，确认菌丝生长茁壮，无杂菌，作为一级发酵种子；
其中，每1L所述的培养基中含有KH2PO41.0～3.0g，(NH4)2SO40.5～1.5g，MgSO4·7H2O0.5～1.5g，葡萄糖18.0～22.0 g，酵母浸粉 0.5～1.5g，蛋白胨 8.0～12.0g，溶剂为去离子水，pН7-7.5；
（2）发酵罐发酵培养
将步骤（1）制备得到的一级发酵种子按照接种量为4~7%（v/v）接种于总体积为5升的全自动发酵罐的培养基中，在初始pH值为7-7.5，温度为28℃，转速为180-210r/min、通气量为3升/min的条件下培养9小时后，然后再将转速调节为280-310r /min、通气量调节为7升/min，温度保持不变，继续发酵，直至菌体浓度达到15-20克/升，棘孢木霉菌的活孢子数不低于1.0×108 CFU /ml时放罐，期间若发酵液pH降低到5.5以下，需用灭菌的20%（w/w）氢氧化钠溶液补料，调节发酵液pH到6.0以上；
其中，每1L所述的培养基中含有KH2PO41.0～3.0g，(NH4)2SO40.5～1.5g，MgSO4·7H2O0.5～1.5g，葡萄糖18.0～22.0 g，酵母浸粉 0.5～1.5g，蛋白胨 8.0～12.0g，消泡剂1-3ml，溶剂为去离子水，pН 7-7.5；
（3）向发酵好的培养液中加入发酵液重量0.001%-50%的山梨酸钾，2-5%的壳聚糖，2.5-7.5%的竹醋，将混合物在250-300 r /min的速度搅拌10-30分钟，即得权利要求1所述的秸秆腐熟剂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中每1L所述的培养基中含有KH2PO42.0 g，(NH4)2SO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 1.0g，葡萄糖20.0 g，酵母浸粉1.0 g，蛋白胨10.0g，溶剂为去离子水，pН7.2。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中每1L所述的培养基中含有KH2PO42.0 g，(NH4)2SO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 1.0g，葡萄糖 10.0 g，玉米淀粉10.0g，酵母粉1.2g，蛋白胨10.0g，消泡剂2ml，溶剂为去离子水，pН7.2。
6.一种秸秆腐熟剂，其为可湿性粉剂，其特征在于由以下重量百分比的各原料组成：棘孢木霉菌菌粉6～7%，氮酮1～3%，木质素5～10%，聚羧酸盐1～3%，萘磺酸盐1～3%，其余为高岭土，所述的棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum），命名为Trichoderma asperellumDQ-T36，保藏在中国典型培养物保藏中心，其菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2016449，保藏时间为2016年9月1日，保藏地址在武汉大学。
7.如权利要求6所述的秸秆腐熟剂，其特征在于由以下重量百分比的各原料组成：棘孢木霉菌菌粉6.7%，氮酮2%，木质素7.5%，聚羧酸盐2%，萘磺酸盐2%，其余为高岭土。
8.如权利要求6或7所述的秸秆腐熟剂，其特征在于，每克棘孢木霉菌菌粉中含有棘孢木霉活孢子数不小于108 CFU。
9.一种制备权利要求6所述的秸秆腐熟剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）一级发酵种子的制备
将所述的棘孢木霉菌接种于摇瓶培养基中，在温度为28℃，转速为220-240r/min的条件下培养20-24小时后，镜检，确认菌丝生长茁壮，无杂菌，作为一级发酵种子；
其中，每1L所述的培养基中含有KH2PO41.0～3.0g，(NH4)2SO40.5～1.5g，MgSO4·7H2O0.5～1.5g，葡萄糖18.0～22.0 g，酵母浸粉 0.5～1.5g，蛋白胨 8.0～12.0g，溶剂为去离子水，pН7-7.5；
（2）发酵罐发酵培养
将步骤（1）制备得到的一级发酵种子按照接种量为4~7%接种于总体积为5升的全自动发酵罐的培养基中，在初始pH值为7-7.5，温度为28℃，转速为180-210r/min、通气量为3升/min的条件下培养9小时后，然后在将转速调节为280-310r /min、通气量调节为7升/min，温度保持不变，继续发酵，直至菌体浓度达到15-20克/升，棘孢木霉菌的活孢子数不低于1.0×108 CFU /ml时放罐，期间若发酵液pH降低到5.5以下，需用灭菌的20%（w/w）氢氧化钠溶液补料，调节发酵液pH到6.0以上；
其中，每1L所述的培养基中含有KH2PO41.0～3.0g，(NH4)2SO40.5～1.5g，MgSO4·7H2O0.5～1.5g，葡萄糖18.0～22.0 g，酵母浸粉 0.5～1.5g，蛋白胨 8.0～12.0g，消泡剂1-3ml，溶剂为去离子水，pН 7-7.5；
（3）将发酵好的培养液喷雾干燥，如果培养液pH低于5.5，用20%（w/w）氢氧化钠溶液将培养液调整pH到6.0以上再进行喷雾干燥，得到棘孢木霉菌菌粉；
（4）按照以下重量百分比称取各原料：棘孢木霉菌菌粉6～7%，氮酮1～3%，木质素5～10%，聚羧酸盐1～3%，萘磺酸盐1～3%，其余为高岭土，混匀后制备得到权利要求6所述的秸秆腐熟剂。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（1）中每1L所述的培养基中含有KH2PO42.0 g，(NH4)2SO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 1.0g，葡萄糖20.0 g，酵母浸粉1.0 g，蛋白胨10.0g，溶剂为去离子水，pН7.2。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤（2）中每1L所述的培养基中含有KH2PO42.0 g，(NH4)2SO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 1.0g，葡萄糖 10.0 g，玉米淀粉10.0g，酵母粉1.2g，蛋白胨10.0g，消泡剂2ml，溶剂为去离子水，pН7.2。
12.权利要求1或2或权利要求6-8任一项所述的秸秆腐熟剂在秸秆降解中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的秸秆包括玉米秸秆和小麦秸秆。
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