CN105195507A - 一种利用苏丹草与高效微生物联合修复铬污染土壤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用苏丹草与高效微生物联合修复铬污染土壤的方法，可有效解决对铬污染土壤的修复问题，方法是，从化工厂附近土壤中筛选并纯化出芽孢杆菌CP-3，分类命名为芽孢杆菌（<i>Bacillus？sp</i>），将芽孢杆菌CP-3制成芽孢杆菌CP-3种子液，接种于发酵培养基中培养发酵，将发酵液与草炭土混匀，风干，得微生物修复菌剂；将微生物修复菌剂均匀撒播于土壤表层，播种苏丹草种子，按植物正常生长要求管理，60天后即可使土壤中的含铬量降低72.9-88.7%，实现对铬污染土壤的修复，本发明高效菌株与苏丹草兼容性好，对污染地的环境适应性强；微生物修复菌剂不仅能改善土壤环境，促进苏丹草对铬的富集，而且增强了微生物施入土壤的可操作性，成本低廉。

Description

一种利用苏丹草与高效微生物联合修复铬污染土壤的方法

技术领域

本发明涉及土壤治理，特别是一种利用苏丹草与高效微生物联合修复铬污染土壤的方法。

背景技术

随着现代化农业和工业的快速发展，不可避免的在现代化农业生产和工业生产中会产生含有重金属的废水、废气和废渣被排入土壤，一旦排入土壤后，由于离子迁移性和动植物的吸附性，这些重金属会进入到生物链系统进行循环，一旦被人食用后，就会对人类健康造成威胁。

铬是毒性极强的重金属之一，被列为是对人体危害最大的八种化学物质之一，是国际公认的三种致癌金属物之一，同时也是美国FPA公认的129种重点污染物之一，严重危害生态环境和人类健康。铬对人类的威胁在于它不能被微生物分解，可通过食物链在生物体内富集。

大多数铬污染修复的方法还处于实验室研究阶段，现场实施较困难，同时，现有的铬污染处理技术工艺相对落后，导致了铬污染修复效率低下、成本高，二次污染及环境风险大。因此，近年来对土壤铬污染修复技术的研究已经逐渐转向投资少、效率高的生物修复手段，尤其是多种技术的组合修复是目前研究的重点和前沿。该修复技术具有无污染、无公害、环境友好、便于操作的显著特征，是解决铬污染土壤修复的很有效的方式，但至今未见有利用植物苏丹草与微生物联合治理铬污染土壤的公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种利用苏丹草与高效微生物联合修复铬污染土壤的方法，可有效解决对铬污染土壤的修复（治理）问题。

本发明解决的技术方案是，由以下步骤实现：

（1）、耐铬微生物的筛选

从化工厂附近土壤中筛选并纯化出芽孢杆菌CP-3，分类命名为芽孢杆菌（Bacillussp），并于2014年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9990，地址：北京市朝阳区北辰西路3号；

（2）、制备微生物修复菌剂

将芽孢杆菌CP-3制成芽孢杆菌CP-3种子液，再以发酵培养基体积的4%接种于发酵培养基中，在温度35℃下，培养得发酵液，将发酵液与草炭土按体积重量1︰2混匀，室温下风干，得微生物修复菌剂；所述的体积重量是指液体以ml计，固体以g计；

（3）、修复铬污染土壤

将微生物修复菌剂均匀撒播于土壤表层，翻耕土壤耙平，均匀撒入苏丹草种子，覆土后，浇水保持土壤湿润，种子发芽后，按植物正常生长要求管理，60天后即可使土壤中的含铬量降低72.9-88.7%，达到土壤环境要求标准，实现对铬污染土壤的修复（治理）。

本发明通过铬污染地区土壤的采集、分离、筛选耐铬微生物芽孢杆菌CP-3，并结合种植苏丹草，实现对铬污染环境的修复；高效菌株与苏丹草兼容性好，对污染地的环境适应性强；微生物修复菌剂不仅能改善土壤环境，促进苏丹草对铬的富集，而且增强了微生物施入土壤的可操作性，成本低廉，经济和社会效益巨大。

具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，是由以下步骤实现的：

一、耐铬微生物的筛选

采集化工厂附近铬污染土样（本实施例中土样是采自河南省三门峡某化工厂附近的土样），采用多点随机采样法采集土壤样品混合均匀，去除动植物残体，过筛后装入无菌袋低温保存带回实验室，进行耐铬微生物的分离；将铬污染土壤与灭菌水以重量比1︰9制成混悬液，然后再用混悬液10倍体积的灭菌水进行稀释，涂布于LB固体培养基平板上，28～32℃培养1～2天，挑取单菌落，平板划线法划线于LB固体培养基平板上，37℃恒温培养箱过夜培养，成纯化的单菌落；

所述的LB固体培养基为：蛋白胨1g、酵母提取物0.5g和氯化钠0.5g，加蒸馏水至100mL，调pH至7.2～7.4，成液体培养基，再加液体培养基重量1.5%～2.0%的琼脂，高压灭菌，成LB固体培养基；所述的灭菌水是蒸馏水经灭菌后的水；

取纯化的单菌落分别接种到Cr(VI)浓度为100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L的LB固体培养基平板上，28～32℃培养1～2天，将耐铬能力最强的菌落选出，对其单菌落采用平板划线分离法进行纯化；该菌株经生理生化和16SrDNA测定为芽孢杆菌CP-3，分类命名为芽孢杆菌（Bacillussp），4℃保存，并于2014年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9990，地址：北京市朝阳区北辰西路3号；

二、制备微生物修复菌剂

（1）种子液的制备

将芽孢杆菌CP-3用无菌牙签挑取于LB液体培养基中，37℃摇床上过夜培养，得芽孢杆菌CP-3种子液；

（2）微生物修复菌剂的制备

将芽孢杆菌CP-3种子液以发酵培养基体积的4%接种于发酵培养基中，35℃，160r/min摇床培养2天，得发酵液；将草炭土高压蒸汽灭菌，冷却后将所得发酵液与草炭土按V:W为1:2混匀，室温风干，装袋封口，制成微生物修复菌剂；

所述的发酵培养基是由重量百分计的：葡萄糖1%，大豆蛋白胨3%，CuSO₄0.1%，KCl0.1%和余量为水，调pH7.0制成；（pH为7的调制，是根据培养基的酸碱情况进行的，通常由氢氧化钠（NaOH）或盐酸（HCl）来实现，属公知技术）

三、苏丹草-微生物联合修复铬污染土壤

将微生物修复菌剂均匀撒播于土壤表层，翻耕土壤，深度为15-25cm，耙平，均匀撒入苏丹草种子，播种量为1.5—2kg/亩，上部覆盖土层，厚度1.5-2cm，均匀浇水，保持土壤湿润状态，种子发芽后，按苏丹草常规栽培管理，60天后即可使土壤中的含铬量降低72.9-88.7%，达到土壤环境要求标准，实现对铬污染土壤的修复（治理）；

所述的土壤为粘土、沙壤土、微酸性土壤或微碱性土壤。

本发明经实验和实地应用表明，苏丹草作为修复植物，其特点是须根发达，生长速度快、再生性好、分叶性强、抗逆性强，适合铬污染土壤的修复。苏丹草具有广泛的适应性，在很多地区都可以栽培，适应土壤范围广，粘土、沙壤土、微酸和微碱性土壤均可栽培，因而具有很好的修复效果。

本发明是申请人经科学研究、实验和对实践总结作出的创造性劳动结晶，有关试验情况如下：

1、耐铬微生物的筛选试验

在试验中，申请人首先对污染土壤采样，采样土壤选自河南省三门峡某化工厂附近，采用多点随机采样法采集土壤样品混合均匀，去除动植物残体，过筛后装入无菌袋低温保存带回实验室，进行耐铬微生物的分离。将铬污染土壤与灭菌水以重量比1︰9制成混悬液，然后再用混悬液10倍体积的灭菌水进行稀释，涂布于LB固体培养基平板上，28～32℃培养1～2天，挑取单菌落，平板划线法划线于LB固体培养基平板上，37℃恒温培养箱过夜培养，得纯化的单菌落；其中LB固体培养基为：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠0.5g，加蒸馏水至100mL，调pH至7.2～7.4，加琼脂1.5%～2.0%，高压灭菌；所说的灭菌水是蒸馏水经灭菌后的水；

取纯化的单菌落分别接种到Cr(VI)浓度为100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L的LB固体培养基平板上，28-32℃恒温培养1～2天，将耐铬能力最强的菌落选出，对其单菌落采用平板划线分离法进行纯化，4℃保存备用；并经反复试验、对比，在经统计学处理后，得出最强的菌株，该菌株经生理生化和16SrDNA测定为芽孢杆菌CP-3，分类命名为芽孢杆菌（Bacillussp），4℃保存，并于2014年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9990。

2、最适合芽孢杆菌CP-3生长温度试验

将芽孢杆菌CP-3种子液以LB培养基体积的4%的接种量接种于pH7.5含100mg/LCr(VI)的LB培养基中，同时设不接菌的为空白对照组，分别于25℃、30℃、35℃、40℃，160r/min摇床培养2天后，取样检测其对Cr(VI)的去除效果，最终证明（发现）该菌株去除Cr(VI)的最适生长温度为35℃。

3、最适合芽孢杆菌CP-3生长pH的试验

将CP-3种子液以LB培养基体积的4%的接种量接种于不同pH（5、6、7、8、9）含100mg/LCr(VI)的LB培养基中，同时设不接菌的为空白对照组，35℃，160r/min摇床培养2天后，取样检测其对Cr(VI)的去除效果。最终证明（发现）该菌株去除Cr(VI)的最适pH为7.0。

4、耐铬植物的筛选试验

通过国内外文献的搜集和整理筛选出一批耐重金属污染胁迫的植物作为初筛植物，进行耐铬植物的筛选。初期共搜集16种植物作为初筛植物，将一定数量的初筛植物种子分别均匀平铺于无菌细胞培养皿中，用重铬酸钾配置成的铬溶液浸泡，观察植物长势；初期先用50mg/L的铬溶液处理初筛植物，培养3-5天后，挑选长势较好的植物进行100mg/L铬溶液处理复筛，发现在100mg/L铬溶液中长势较好的植物有4种，分别为：狼尾草、杂交高粱、苏丹草、田旋花。将这四种植物分别用150mg/L和200mg/L铬溶液处理，最终获得两种耐铬能力较强的植物，分别为苏丹草和杂交高粱；将这两种植物分别再用300、400mg/L和500mg/L铬溶液处理，依然能生长，生长较好的为苏丹草，最终确定（证明）苏丹草为强耐铬植物。

实验表明，苏丹草作为修复植物，其特点是须根发达，生长速度快、再生性好、分叶性强、抗逆性强，适合铬污染土壤的修复。苏丹草具有广泛的适应性，在很多地区都可以栽培，适应土壤范围广，粘土、沙壤土、微酸和微碱性土壤均可栽培，因而具有很好的修复效果，成本低，易开发推广。

由上述资料可以清楚的看出，本申请是申请人创造性劳动的结晶，并经实地应用取得了非常满意的有益技术效果，有关资料如下：

资料一：

将苏丹草种子和杂交高粱种子分别均匀平铺于无菌细胞培养皿中，浇入一定量的用重铬酸钾配置成的150mg/L铬溶液，以加入等量清水处理的苏丹草种子和杂交高粱种子为对照（CK），待皿中溶液近干时补浇等量清水，每个处理设3次重复，分别在处理后5天、10天、15天取样，测定植物中的铬含量。结果发现随着处理时间的延长，植物中的铬富集量逐渐增加，苏丹草的效果优于杂交高粱。

表1铬溶液处理下苏丹草和杂交高粱植株中的铬含量变化

资料2：

将采自河南省三门峡市某化工厂附近的铬污染土壤（铬含量为447.8mg/kg）与一部分无污染的普通土混合成低、高两组浓度的铬污染土壤后，粉碎过筛，进行盆栽修复试验：试验均设A、B、C三个处理，A为无铬污染的正常土壤对照组；B为铬污染土壤对照组；C为铬污染土壤的微生物修复菌剂处理组（将微生物修复菌剂与土壤充分混匀）；播种苏丹草种子，覆土1.5-2cm后喷洒自来水使土壤充分湿润但没有多余水分从花盆底部流出，定期浇水保持土壤湿润，30天和65天后分别测定各处理土壤中和植物中的铬含量。

在两组浓度的铬污染土壤中，苏丹草在施加微生物修复菌剂的土壤中的生长状况均较未施加微生物修复菌剂的土壤有明显改善，微生物修复菌剂与苏丹草处理组植株中铬的富集量是苏丹草处理组的1.3~4.2倍，植株中铬的富集量差异达显著水平（p<0.05），说明微生物修复菌剂的使用有利于苏丹草的生长，并且促进了苏丹草对铬的富集；经检测发现，30天后，对于低浓度铬污染土壤组，微生物修复菌剂与苏丹草处理组土壤中的铬含量降低了72.9%~88.7%，可达到国家环境标准要求；对于较高浓度铬污染土壤组，微生物修复菌剂与苏丹草处理组中的铬含量降低了21.3%~43.9%，65天后，微生物修复菌剂与苏丹草处理组植株中铬的富集量与苏丹草处理组相比显著增加（p<0.05），也就是说土壤中的铬被吸收到苏丹草上，土壤质量可达到国家环境标准要求。苏丹草吸收的铬含量未达到国家规定的标准情况下，苏丹草可以作为饲料使用，以节约资源（国标规定化工污水中铬含量的排放标准为≤1mg/L，饲料中铬的允许量为≤10mg/kg）。

实验和实践证明，本发明与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：

1.微生物芽孢杆菌CP-3与植物苏丹草联合可以起到协同作用，微生物修复菌剂的加入可以促进植物生长，改善土壤的结构快，并能促进植物对铬的富集（吸收），清除土壤中的铬，达到对铬污染土壤的修复治理。

2.苏丹草除具有铬污染土壤修复的作用外，特别是与微生物相结合，吸铬效果尤为突出，易推广应用，当铬在苏丹草中的含量不超标时，还可将苏丹草作为饲料使用，节约资源，有很好的经济价值。

3.利用微生物芽孢杆菌CP-3-植物苏丹草联合修复，可以提高铬污染修复的效果，土壤中除铬速度快，经苏丹草两个多月的生长，土壤中铬含量可降低72.9-88.7%，土壤质量可达到国家环境标准要求，且成本低，可节约资金50%以上，既节约，又实现环保，效果之好是未曾料到的，经济和社会效益巨大。

Claims (4)

1.一种利用苏丹草与高效微生物联合修复铬污染土壤的方法，其特征在于，由以下步骤实现：

一、耐铬微生物的筛选

采集化工厂附近铬污染土样，采用多点随机采样法采集土壤样品混合均匀，去除动植物残体，过筛后装入无菌袋低温保存带回实验室，进行耐铬微生物的分离；将铬污染土壤与灭菌水以重量比1︰9制成混悬液，然后再用混悬液10倍体积的灭菌水进行稀释，涂布于LB固体培养基平板上，28～32℃培养1～2天，挑取单菌落，平板划线法划线于LB固体培养基平板上，37℃恒温培养箱过夜培养，成纯化的单菌落；

取纯化的单菌落分别接种到Cr(VI)浓度为100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L的LB固体培养基平板上，28～32℃培养1～2天，筛选出最强的耐铬菌落，对其单菌落采用平板划线分离法进行纯化，得纯化菌株，经生理生化和16SrDNA测定为芽孢杆菌CP-3，分类命名为芽孢杆菌（Bacillussp），并于2014年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9990，地址：北京市朝阳区北辰西路3号；

二、制备微生物修复菌剂

（1）种子液的制备

将芽孢杆菌CP-3用无菌牙签挑取于LB液体培养基中，37℃摇床上过夜培养，得芽孢杆菌CP-3种子液；

（2）微生物修复菌剂的制备

将芽孢杆菌CP-3种子液以发酵培养基体积的4%接种于发酵培养基中，35℃，160r/min摇床培养2天，得发酵液；将草炭土高压蒸汽灭菌，冷却后将所得发酵液与草炭土按V:W为1:2混匀，室温风干，成微生物修复菌剂；

所述的发酵培养基是由重量百分计的：葡萄糖1%，大豆蛋白胨3%，CuSO₄0.1%，KCl0.1%和余量为水，调pH7.0制成；

三、苏丹草-微生物联合修复铬污染土壤

将微生物修复菌剂均匀撒播于土壤表层，翻耕土壤，深度为15-25cm，耙平，均匀撒入苏丹草种子，播种量为1.5—2kg/亩，上部覆盖土层，厚度1.5-2cm，均匀浇水，保持土壤湿润状态，种子发芽后，按苏丹草常规栽培管理，60天后即可使土壤中的含铬量降低72.9-88.7%，达到土壤环境要求标准，实现对铬污染土壤的修复。

2.根据权利要求1所述的利用苏丹草与高效微生物联合修复铬污染土壤的方法，其特征在于，步骤一所述的LB固体培养基为：蛋白胨1g、酵母提取物0.5g和氯化钠0.5g，加蒸馏水至100mL，调pH至7.2～7.4，成液体培养基，再加液体培养基重量1.5%～2.0%的琼脂，高压灭菌，成LB固体培养基。

3.根据权利要求1所述的利用苏丹草与高效微生物联合修复铬污染土壤的方法，其特征在于，步骤一所述的灭菌水是蒸馏水经灭菌后的水。

4.根据权利要求1所述的利用苏丹草与高效微生物联合修复铬污染土壤的方法，其特征在于，步骤三所述的土壤为粘土、沙壤土、微酸性土壤或微碱性土壤。