CN102911875A

CN102911875A - 一种多功能土壤修复菌剂的制备方法

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Publication number: CN102911875A
Application number: CN2012101262888A
Authority: CN
Inventors: 谢宝恩; 王继雯; 甄静; 杨文玲; 刘莹莹; 李冠杰; 周伏忠; 陈国参
Original assignee: HENAN ACADEMY OF SCIENCES BIOLOGICAL RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: HENAN ACADEMY OF SCIENCES BIOLOGICAL RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2013-02-06

Abstract

本发明提供一种多功能土壤修复菌剂的制备方法，包括：A、将斜面菌种黑曲霉菌株J6经PDA培养基培养至孢子成熟后，接种于种子培养基中，孢子萌发得孢子种子液；B、将所述孢子种子液，按5-10％(质量百分比)接种于固体发酵培养基中，在25-35℃浅盘培养4-7d，其间翻曲2～3次，得到多功能土壤修复菌剂。该方法制得的多功能土壤修复菌剂既能高效降解土壤中的有机磷农药，又能高效吸附土壤中的重金属如铬、铅等，达到了多重修复土壤的目的。

Description

一种多功能土壤修复菌剂的制备方法

技术领域

本发明涉及生物肥料技术领域，特别涉及一种多功能土壤修复菌剂的制备方法。

背景技术

目前，随着工农业的迅猛发展，土壤污染问题已经成为我国乃至世界各国共同关注和研究的热点。各种各样的农药和化肥的过度使用，对土壤造成的多重污染；还有各种化工厂和矿区附近的土壤也被重金属造成严重污染。我国是农药生产和使用大国，每年农药使用量约80万吨，居世界第一位，农药生产总量从1990年起一直名列世界第二位，仅次于美国。目前，我国农药产品结构仍以杀虫剂为主，杀虫剂的生产量占农药总产量70％左右，其中有机磷杀虫剂占杀虫剂总产量的70％，在年产量万吨以上的6个杀虫剂品种中，有5个是有机磷杀虫剂。有机磷杀虫剂的主要特点是杀虫谱广、杀虫迅速、见效快且价格便宜，因此，在相当长的时期内，有机磷杀虫剂的使用不可避免。据统计，我国耕地面积为18亿亩，约有13％受农药污染，面积约为2.4亿亩。以上述两个70％计，有机磷农药残留显然是造成土壤农药污染的主要种类，这其中有机磷杀虫剂的总量最大，故在农药和各种化学药品污染中，有机磷农药对土壤的污染问题也不容忽视。另外，据统计，我国受重金属污染的农田面积多达2000万公顷以上，受矿区污染土壤达200多万公顷，受农药和各种化学药品污染的耕地面积达6000多万公顷。大面积的土壤污染直接或间接地影响农作物的品质和产量，造成粮食减产和农残超标，在我国生产的农产品中，农药残留超标高达20％左右，严重影响我国农产品的进出口贸易；另外，在土壤污染严重的地区，癌症等疾病的发病率和死亡率明显高于没有污染的地区。因此，土壤污染问题，已成为制约我国农产品的国际贸易和我国农业经济可持续发展以及人类健康的瓶颈。土壤污染的治理和修复工作已经成为当务之急且刻不容缓的工作，对污染土壤修复技术的研究直接关系到我国土壤的生态平衡和安全。

在各种土壤污染修复技术中，微生物修复技术是最环保、最行之有效的方法，而现有的微生物土壤修复剂大多是针对某一种污染的修复，而实际上土壤污染类型往往是多重污染，既有农药和化学物质污染，还有重金属污染，只不过是在某一地区的污染程度不同。因此，针对目前我国土壤污染的状况，研发一种多功能土壤修复剂来处理污染土壤，已经成为当务之急！

发明内容

本发明提供一种多功能土壤修复菌剂的制备方法，该方法制得的多功能土壤修复菌剂既能高效降解土壤中的有机磷农药，又能高效吸附土壤中的重金属如铬、铅等，达到了多重修复土壤的目的。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种多功能土壤修复菌剂的制备方法，其包括：

A、将斜面菌种黑曲霉菌株J6经PDA培养基培养至孢子成熟后，接种于种子培养基中，孢子萌发得孢子种子液；

B、将所述孢子种子液，按5-10％(质量百分比)接种于固体发酵培养基中，在25-35℃浅盘培养4-7d，其间翻曲2～3次，得到多功能土壤修复菌剂。

优选地，所述步骤A，具体为：将斜面菌种黑曲霉菌株J6接种于PDA培养基平板上，于25-32℃培养3-5天，孢子成熟后用灭菌的种子培养基冲洗平板，配制成密度约3×10⁸个/mL的菌悬液，加入种子培养基中，25-35℃，150-200r/min摇床培养6-24h后孢子萌发得孢子种子液。

优选地，所述步骤B，具体为：将所述孢子种子液按5-10％(质量百分比)接种于固体发酵培养基中，其固体发酵培养基组分为(按质量分数)：麸皮与米糠的比例4∶1，得到物料与固体发酵营养液的比例为1∶2，硫酸铵3-6％；初始pH6.0-7.5，25-35℃浅盘培养4-7d，其间翻曲2～3次，待孢子长成后即得多功能土壤修复菌剂。

优选地，所述种子培养基组分为：NaCl 1g、KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄ 1.5g、(NH₄)₂SO4 1g、MgSO₄·7H₂O 0.1g和葡萄糖2g定容至1000mL，pH7.0。

优选地，所述固体发酵营养液组分为：MgSO₄·7H₂O 0.5g、KH₂PO₄ 1.0g、 Na₂HPO₄ 0.2g、MnSO₄ 0.035g、CuSO₄·5H₂O 0.007g和FeSO₄·7H₂O 0.007g，加蒸馏水至1000mL，pH自然，121℃灭菌20min，冷却后备用。

通过实施以上技术方案，具有以下技术效果：本发明提供的多功能土壤修复菌剂具有以下技术效果：

1、该修复剂的生物量大、抗逆性强、耐高温、遗传性状稳定，且降解酶系丰富，降解底物范围广，它不仅能降解以甲拌磷、辛硫磷为代表的硫代磷酸酯类(P＝S键)有机磷农药，还能降解以氧化乐果为代表的磷酸酯类(P＝O键)有机磷农药。

2、该修复剂对有机磷农药和重金属污染的土壤修复效果良好，环保效果明显，并且起到了活化土壤，改善土壤菌群结构，进而增加土壤肥力的作用，达到了多重修复土壤的目的。

3、用该法制备的多功能土壤修复剂的有效活菌数(孢子数)高达2.4×10⁸cfu/g，远高于农用微生物菌剂国家标准GB20287-2006(有效活菌数≥0.5×10⁸cfu/g)，其它技术指标也均符合国家标准GB20287-2006规定。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的技术方案，下面详细描述本发明提供的实施例。

本发明实施例提供一种多功能土壤修复菌剂的制备方法，其包括：

A、将斜面菌种黑曲霉(Aspergillus niger)菌株J6(在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCC NO.4220，保藏日期2010年10月12日)经PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)(组分为：去皮马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15-20g，pH自然，下同)培养至孢子成熟后，接种于种子培养基中，孢子萌发得孢子种子液；

在上述实施例中，所述步骤A，具体为：将斜面菌种黑曲霉(Aspergillusniger)菌株J6接种于PDA培养基平板上，于25-32℃培养3-5天，孢子成熟后用灭菌的种子培养基冲洗平板，配制成密度约3×10⁸个/mL的菌悬液，加入种子培养基中，25-35℃，150-200r/min摇床培养6-24h后孢子萌发得孢子种子液。

在上述实施例中，所述步骤B，具体为：将所述孢子种子液按5-10％(质量百分比)接种于固体发酵培养基中，其固体发酵培养基组分为(按质量分数)：麸皮与米糠的比例4∶1，得到物料与固体发酵营养液的比例为1∶2，硫酸铵3-6％；初始pH 6.0-7.5，25-35℃浅盘培养4-7d，其间翻曲2～3次，待孢子长成后即得多功能土壤修复菌剂。

在上述实施例中，所述种子培养基组分为：NaCl 1g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄1.5g、(NH₄)₂SO₄1g、MgSO₄·7H₂O 0.1g和葡萄糖2g定容至1000mL，pH7.0，在另外的实施例中，也可以按照该实施例的比例进行配比成为其他总质量的种子培养基。在其他的实施例中，进一步的，还可以再加入1g左右的麸皮(有利于孢子分散，防止黑曲霉菌丝形成球状)，得到该种子培养基的pH 5.5-7.5。

在上述实施例中，所述固体发酵营养液组分为：MgSO₄·7H₂O 0.5g、KH₂PO₄1.0g、Na₂HPO₄0.2g、MnSO₄0.035g、CuSO₄·5H₂O 0.007g和FeSO₄·7H₂O 0.007g，加蒸馏水至1000mL，pH自然，121℃灭菌20min，冷却后备用。在另外的实施例中，也可以按照该实施例的比例进行配比成为其他总质量的固体发酵营养液。

实施例1：

将100mg/L甲拌磷水溶液均匀喷洒在200g灭菌试验土壤上，取20g所述菌剂接种于该试验土壤中混匀，加无菌水调节含水量至60％(重量百分比)的土壤湿度，将试验土壤置于30℃条件下培养，培养过程中加入无菌水保持60％(重量百分比)的土壤湿度，同时以不接菌的为空白对照，每隔1天取样用气相色谱测定甲拌磷残留量。施用后第5天甲拌磷降解率为80％。

实施例2：

选取交通便利、易于观察及管理、有代表性的田块，要求田块方正、田面平整、肥力均匀、排灌方便、种植水平与当地生产水平相当的河南省有机磷农药应用较多的济源市郊区小麦田。本试验共分两组：

(1)对照组：常规施肥+多次喷施有机磷农药氧化乐果(其浓度为5000mg/L)的田地。

(2)处理组：河南省科学院生物所有限公司生产的多功能土壤修复菌剂处理组(常规施肥+多次喷施有机磷农药氧化乐果，其浓度为5000mg/L，+多功能土壤修复菌剂的田地)试验设3次重复，处理随机排列，小区面积不小于60平方米。

该项试验与小麦播种同时进行，使用多功能土壤修复菌剂菌剂前，应对土壤进行平整，划线犁5cm～10cm的浅沟，把所述菌剂均匀地撒在沟中，所述菌剂使用量约为100g/m²，然后，把沟搂平，基本上使菌掩埋在土壤中即可。分别在使用菌剂0、3、5、7d后取样，并观察记录小麦生长情况，每小区按“S”形方法采集土样，取样深度为4～5cm的土壤，送河南省农业科学院进行检测土样有机磷农药氧化乐果残留量，并用0.5mol/L NaHCO₃提取，钼锑抗比色法测土样中有效磷的含量。

有机磷农药氧化乐果残留量结果如表1所示，施用3d与对照组相比降解率为87.2％，在使用复合菌剂5d后土壤中的氧化乐果已经降解完全。同时由2可知，在施用菌剂后3d内处理组与对照组(即自然降解组)相比土壤中有效磷含量均有显著增加(P＜0.05)，并且在第3d后土壤中有效磷含量没有明显增加(P＞0.05))。从表3可以看出，施用多功能土壤修复菌剂能够增加小麦产量，施用多功能土壤修复菌剂的处理组，比对照组平均亩增产54.1kg，增产率8.9％，增产效果显著(P＜0.05)。

表1施用多功能土壤修复菌剂处理后土壤中氧化乐果残留量(mg/kg)

表2用多功能土壤修复菌剂处理后与对照相比土壤中有效磷的变化(mg/kg)

表3产量结果统计表

上述实验在三年内连续在不同的地方，不同面积的田间，如60平方米，80平方米，120平方米等实验18次均取得了相同和相近似的结果，在实验中，未发现不良效果，清楚的表明本发明的菌剂具有很好的降解农药残留的显著作用，使用安全，性能稳定可靠，有效降低了农药的副作用，大大有利于农业的丰产丰收和人们的身体健康，经济和社会效益巨大。

实施例3：

称取10g过100目筛的严重铬污染的土壤(采自河南省三门峡义马市千秋乡，其中铬含量为447.8mg/kg土壤)于100mL灭菌水中，然后称取0.01g所述菌剂接种于其中，30℃，180r/min摇床培养5-7d后，结果可明显观察到有大量的黑曲霉孢子生长，同时用二苯碳酰二肼分光光度法测定六价铬浓度，测得上述土壤中铬含量为145mg/kg，故其对铬的吸附率为67.62％。

实施例4：

同实施例2，称取10g过100目筛的严重铅污染的土壤(采自河南省济源市郊)，其中铅含量为395mg/kg土壤)于100mL灭菌水中，然后称取0.01g所述菌剂接种于其中，30℃，180r/min摇床培养5-7d后，结果可明显观察到有大量的黑曲霉孢子生长，同时用火焰原子吸收法测定上述土壤中铅含量为94.5mg/kg，故其对铅的吸附率为76.08％。

实施例5：

铬污染土壤(采自河南省三门峡义马市千秋乡某化工厂附近，其中铬含量为447.8mg/kg土壤)的盆栽修复试验：本试验共分A、B、C、D四组，每组设三个重复，其中A、C、D分别为无铬污染的正常土壤对照组、(用无铬污染的正常土壤)1∶1稀释的铬污染土壤对照组、铬污染土壤对照组，B为(用无铬污染的正常土壤)1∶1稀释铬污染土壤的菌剂处理组(按5％接种量施用多功能土壤修复菌剂)，处理40天后播种小麦，同时测各组土样的六价铬浓度(mg/kg)，结果如表4所示，B组与其余各组相比差异极显著(P＜0.01)，与C、D两组相比六价铬浓度明显降低，但与A组的正常土壤相比，六价铬浓度还明显偏高。

另外，连续观察一个月，小麦的出芽情况及生长情况及土壤中六价铬浓度，其结果如表5所示，B组小麦的出芽情况和株高及六价铬浓度与其余各组相比差异均极显著(P＜0.01)，与C组相比六价铬浓度明显降低，小麦的生长情况明显好于C、D两组，但与A组的正常土壤相比，六价铬浓度依然明显偏高，小麦的生长也比较缓慢。而未使用菌剂的C、D两组与一个月前相比，六价铬浓度没有明显改变，小麦的生长情况较差或不生长。

因此，由上试验结果可以得出以下结论：使用本发明提供的多功能土壤修复菌剂处理铬污染土壤后可以明显降低土壤中六价铬含量，使污染土壤的毒性减小。

表4盆栽修复试验各组土壤中六价铬浓度(mg/kg)

表5播种小麦一月后各组小麦的出芽情况和生长情况及土壤中六价铬浓度(mg/kg)

以上对本发明实施例所提供的一种多功能土壤修复菌剂的制备方法进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1.一种多功能土壤修复菌剂的制备方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤A，具体为：将斜面菌种黑曲霉菌株J6接种于PDA培养基平板上，于25-32℃培养3-5天，孢子成熟后用灭菌的种子培养基冲洗平板，配制成密度约3×10⁸个/ml的菌悬液，加入种子培养基中，25-35℃，150-200r/min摇床培养6-24h后孢子萌发得孢子种子液。

3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤B，具体为：将所述孢子种子液按5-10％(质量百分比)接种于固体发酵培养基中，其固体发酵培养基组分为(按质量分数)：麸皮与米糠的比例4∶1，得到物料与固体发酵营养液的比例为1∶2，硫酸铵3-6％；初始pH 6.0-7.5，25-35℃浅盘培养4-7d，其间翻曲2～3次，待孢子长成后即得多功能土壤修复菌剂。

4.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述种子培养基组分为：NaCl 1.0g、KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄1.5g、(NH₄)₂SO₄1.0g、MgSO₄·7H₂O 0.1g和葡萄糖2.0g定容至1000mL，pH7.0。

5.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述固体发酵营养液组分为：MgSO₄·7H₂O 0.5g、KH₂PO₄1.0g、Na₂HPO₄0.2g、MnSO₄0.035g、CuSO₄·5H₂O0.007g和FeSO4·7H2O 0.007g，加蒸馏水至1000mL，pH自然，121℃灭菌20min，冷却后备用。