CN103952355A - 一种复合微生物解磷菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种复合微生物解磷菌剂及其制备方法 Download PDF

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邢素芝
马忠友
汪建飞
赵建荣
李孝良
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Abstract

本发明公开了一种复合微生物解磷菌剂及其制备方法，其有效成分为维罗纳假单胞菌（Pseudomonasveronii）；水生拉恩氏菌（Rahnellaaquatilis）；巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）。三种高效解磷菌株是从皖北高产小麦田土壤样品中筛选得到的，保藏编号分别为：维罗纳假单胞菌（保藏编号CGMCC No.8741）、水生拉恩氏菌（保藏编号CGMCC No.8739）和巨大芽孢杆菌（保藏编号CGMCC No.8737）。将维罗纳假单胞菌和水生拉恩氏菌混和接种到无机磷液体培养基中，培养条件为28-30℃、180r/min、培养48h；巨大芽孢杆菌接种到有机磷液体培养基中，培养条件为28-30℃、180r/min、培养96h。将发酵好的菌剂与添加剂混合均匀，干燥后包装即得成品。该复合微生物解磷菌剂能够显著增加小麦、油菜等作物的产量。

Description

一种复合微生物解磷菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于农业微生物利用技术领域，涉及一种复合微生物解磷菌剂及其制备方法。
背景技术
我国是一个农业大国，肥料在我国粮食生产中占有非常重要的地位，目前市场上的肥料可以归结为两类，一是化肥，另一种是化肥与有机肥相结合的复合肥。化肥长期使用使土壤肥力下降，肥料利用率降低，土壤结构遭到破坏，造成土壤板结。复合肥里面除含有氮、磷、钾以及微量元素外，还含有有机质。这些肥料的中心目的是提供全面的化学元素，但没有考虑改善土壤环境中的微生物与微营养结构。
通过研究发现磷是植物生长的必需元素之一，而我国有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷为无效形式，植物很难直接吸收利用。实际施入的磷肥当季作物利用率为5%～25%，其中大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+ 结合，形成难溶性磷酸盐，因此，大部分磷肥作为无效态（难溶态）在土壤中积累。由于长期施用磷肥，事实上大多数农田土壤潜在的磷库含量很大，而提供作物生长发育的磷却很小，土壤并非真正缺磷而是缺少植物能直接利用的磷。实验证明在土壤中添加微生物菌剂可以提高土壤中磷和其他矿物元素的利用率，促进植物生长，减轻环境污染程度。
发明内容
本发明针对现有肥料的不足，提供一种复合微生物解磷菌剂及其制备方法。它有利于改良土壤，提高土壤中磷元素的利用率。
它包括如下成份：
维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）；水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）；巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。
本发明中涉及到的各个优良细菌菌株于2014年01月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所100101），其保存号分别为：维罗纳假单胞菌（保藏编号CGMCC No. 8741）、水生拉恩氏菌（保藏编号CGMCC No. 8739）和巨大芽孢杆菌（保藏编号CGMCC No. 8737）。
本发明的复合解磷微生物菌剂，其包括如下重量份的组分：
维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）      1份
维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）      2份
巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）         2份
添加剂                                                5-10份
其中，维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）含量达到2×108cfu/g 以上，维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）含量达到4×108cfu/g 以上，巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）含量达到4×108cfu/g 以上所述的添加剂为麦壳粉、硅藻土或二氧化硅(100 目)。
   本发明还提供前述复合微生物解磷菌剂在提高作物产量中的应用，其是将所述复合微生物解磷菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥混合施用。所述作物优选为水稻、大豆、玉米、小麦、棉花、油菜及其它蔬菜或作物。
本发明采用选择性培养的方法利用磷酸钙培养基对皖北高产小麦田来源的土壤样品进行稀释培养，经过多次筛选得到具有分解有机磷和难溶性无机磷的高效菌株维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）、水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。
具体实施方式：
  下面结合实施例，对本发明做进一步阐述，但本发明保护范围不限于此。
实施例1 高效解磷细菌的分离与筛选
  （1）土壤样品：采自安徽省北部优质高产小麦田的根际，去除小麦根际表层土壤，采样深度5～20cm。通过五点采样法，采样后筛选，去除大泥块和其他固体杂质后混匀，用干净的保鲜袋封口，于4℃冰箱中保存备用。
（2）有机磷培养基：NaCl 0.3g，七水硫酸镁 0.3g，一水硫酸锰 0.03g，KCl 0.3g，硫酸铵0.5g，七水硫酸亚铁0.03g，蔗糖10g，蒸馏水1000mL，调pH 7.0～7.5，按每100mL培养液加入碳酸钙0.5g和0.02g大豆卵磷脂，上述培养基若添加琼脂15～20g则为有机磷固体培养基，置于高压蒸汽灭菌锅内灭菌121℃、20min。
  （3）无机磷培养基：NaCl 0.3g，七水硫酸镁0.3g，一水硫酸锰0.03g，KCl 0.3g，硫酸铵0.5g，七水硫酸亚铁0.03g，蔗糖10g，蒸馏水1000mL，调pH7.0～7.5，按每100mL培养液加入磷酸三钙0.5g，上述培养基若添加琼脂15～20g则为无机磷固体培养基，置于高压蒸汽灭菌锅内灭菌121℃、20min。
  （4）解磷细菌的富集：按上述配方配制有机磷液体培养基和无机磷液体培养基，取1g土壤加入已灭菌的装有100mL有机磷液体培养基的500mL锥形瓶中，同样取1g土壤加入到已灭菌的装有100 mL无机磷液体培养基的500mL锥形瓶中，将它们置于摇床中培养48h、180r/min、28-30℃，两天后再次在无菌条件下，把无机磷锥形瓶中的菌液接入新的已灭菌的无机磷液体培养基中，把有机磷锥形瓶中的菌液接入新的已灭菌的有机磷液体培养基中，继续摇床48h、180r/min、28-30℃。
（5）解磷细菌的分离：按上面配方分别配制无机磷固体培养基和有机磷固体培养基平板9个，在超净工作台中点燃酒精灯，在火焰附近，用移液枪从上述已培养好的菌液中吸取0.1mL加入到盛有0.9mL 0.9%无菌生理盐水的1.5mL离心管中，在快速混匀器上充分混匀，然后用移液枪从此管中吸取0.1mL加入到另一盛有0.9mL 0.9%无菌生理盐水的1.5mL离心管中并振荡均匀，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀释度的菌液，分别用移液枪取无机磷和有机磷菌液的10-6、10-7、10-8稀释度各0.1mL，在火焰旁放入到对应培养基平板上，用无菌三角涂棒涂布均匀，每一稀释度各自涂布三个平板并做好标记，置于28-30℃培养箱中培养2d。
（6）两天后用已灭菌的牙签挑取不同的单个菌落接种至新的对应平板上（无机磷固体平板上长的菌落挑至无菌的无机磷固体平板上，有机磷固体平板上长的菌落挑至无菌的有机磷固体平板上）并做好标记，置于28-30℃恒温培养箱中培养1～2天，观察溶磷圈大小，待长出菌落后，用灼烧灭菌并冷却后的接种环挑取上述所标记的解磷菌落在新的固体平板上画线分离、纯化，并倒置于28-30℃恒温培养箱中培养1～2天，使其长出单菌落。
(7)选出解磷能力较强的菌株接种至已灭菌的装有100mL解磷细菌液体培养基的锥形瓶中，置于摇床中培养，无机磷细菌培养条件为28-30℃、180r/min、48h；有机磷细菌培养条件为28-30℃、180r/min、96h,培养结束后将上清液倒入50mL离心管中并做好标记，置于离心机中离心7500r/min、10min，再次将上清液倒入新的离心管中并做好标记以7500r/min、10min离心一次，用钼黄比色法测定上清液中的可溶性磷含量,获得高效解磷细菌维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）、水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。
(8) 复合微生物解磷菌剂的制备：将维罗纳假单胞菌和水生拉恩氏菌混和接种到无机磷液体培养基中，培养条件为28-30℃、180r/min、培养48h；巨大芽孢杆菌接种到有机磷液体培养基中，培养条件为28-30℃、180r/min、培养96h。再将上述发酵好的菌剂与添加剂充分混合均匀，干燥后包装即得成品。
实施例2 复合微生物解磷菌剂的小麦盆栽实验
小麦盆栽实验设4个处理，分别为①施肥（化肥）对照，②灭菌有机肥+解磷菌剂，③灭菌有机肥+灭菌解磷菌，④空白对照，6次重复，随机排列。栽培盆采用上径17cm、下径12cm、高13.5cm下设排水的白色塑料桶。
称取100g种子用水冲洗一次，再用75％酒精浸泡3min，再用无菌水冲洗6次，最后用适量的水浸泡，放于25℃培养箱中催芽，待种子露白即可播种。定时浇水、管理。
  小麦采收后经统计分析施用解磷菌剂的处理比灭菌对照麦粒干重增产11.37%；比施肥（化肥）对照增产15.41%；比空白对照增产51.59%。
  实施例3  复合微生物解磷菌剂的油菜大田栽培实验
  实验设4个处理，分别为①施肥（化肥）对照，②灭菌有机肥+解磷菌剂，③灭菌有机肥+灭菌解磷菌，④空白对照，3次重复，随机排列。栽培小区2m×3m，区组随机排列。定时浇水、管理。
  油菜采收后经统计分析施用解磷菌剂的处理比灭菌对照油菜籽干重增产14.09%；比施肥（化肥）对照增产9.88%；比空白对照增产23.65%。
尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由所附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合和拓展。

Claims (5)

1.一种复合微生物解磷菌剂，其有效成分包括：维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii），保藏编号CGMCC No. 8741；水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis），保藏编号CGMCC No. 8739；巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），保藏编号CGMCC No. 8737。
2.根据权利要求1 所述的复合微生物解磷菌剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成： 
维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）      1份
水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）           2份
巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）         2份
添加剂                                                5-10份
     其中，维罗纳假单胞菌（Pseudomonas veronii）含量达到2×108cfu/g 以上，水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）含量达到4×108cfu/g 以上，巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）含量达到4×108cfu/g。
3.根据权利要求2 所述的复合微生物解磷菌剂中的添加剂为麦壳粉、硅藻土或二氧化硅(100 目)。
4.一种复合微生物解磷菌剂制备方法，其特征在于：包括使用如权利要求1所述的解磷菌剂，其步骤为：
（1）将维罗纳假单胞菌和水生拉恩氏菌混和接种到无机磷液体培养基中，培养条件为28-30℃、180r/min、培养48h；
（2）巨大芽孢杆菌接种到有机磷液体培养基中，培养条件为28-30℃、180r/min、培养96h；
（3）将发酵好的菌剂与添加剂混合均匀，干燥后包装即得成品。
5.权利要求1-4任一项所述的复合微生物解磷菌剂在提高作物产量中的应用，其是将所述复合微生物解磷菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复混肥混合使用。
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