CN105175162B

CN105175162B - 一种用于防治青枯病的微生物有机肥及其制备和使用方法

Info

Publication number: CN105175162B
Application number: CN201510687192.2A
Authority: CN
Inventors: 肖相政
Original assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Current assignee: GUANGZHOU TU GEN WANG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2015-10-22
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2035-10-22
Also published as: CN105175162A

Abstract

本发明公开了一种用于防治青枯病的微生物有机肥及其制备和使用方法，该肥料由园林废弃物、畜粪、腐熟菌剂、微生物菌剂按一定的重量比混合而成，所述肥料中的有效活菌数为2×10⁷个/g以上，pH值为7.3，水分含量为29.7%，有机质含量为41.2%，全氮含量为1.28%，全钾含量为1.45%，全磷含量为1.60%。本发明还提供了用于制备上述微生物有机肥的制备方法以及使用方法，本发明解决了现有技术中的问题，提出了一种有效解决茄科类作物青枯病的微生物有机肥及其制备方法，其克服了传统方法中效果不稳定、防治效果差等问题，本发明结合了生态调控防治和微生物防治两者的优点，同时可促进废弃物的循环利用。

Description

一种用于防治青枯病的微生物有机肥及其制备和使用方法

技术领域

本发明涉及生物肥料技术领域，特别是指一种用于防治茄科类作物青枯病的微生物有机肥。

背景技术

青枯病是南方地区茄科类作物常见的一种土传病害，由青枯劳尔氏菌引起，在高温高湿地区和连作地块发病更为严重，传统的土壤添加剂防治、农业防治、化学防治等效果不明显、且容易带来诸多负面影响。土壤添加剂不仅杀灭了病原菌，而且对土著微生物破坏严重；农业措施防治工作量大，且对土地的集约度利用不高；化学防治采用喷施农药等方法，不仅效果差，而且导致了病原菌的抗病性。因此研究一种新的防治青枯病方法势在必行。

发明内容

本发明解决了现有技术中的问题，提出了一种有效解决茄科类青枯病的微生物有机肥及其制备方法，其有效克服了传统方法中效果不稳定、效果差等问题，结合了生态调控防治和微生物防治两者的优点，同时可促进废弃物的循环利用。

为实现上述目的，本发明提供一种用于防治青枯病的微生物有机肥，该肥料由园林废弃物、畜粪、腐熟菌剂、功能微生物菌剂按一定的重量比混合而成，所述腐熟菌包括黑曲霉、绿色木霉、地衣芽孢杆菌以及伯顿毕赤酵母，所述功能微生物菌剂包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌。

优选地，所述肥料中的有效活菌数达2.0×10⁷个/g以上，pH值为7.3，水分含量为29.7%，有机质含量为41.2%，全氮含量为1.28%，全钾含量为1.45%，全磷含量为1.60%。

优选地，将黑曲霉、绿色木霉、地衣芽孢杆菌进行分离鉴定后分别进行发酵，发酵完成后与伯顿毕赤酵母发酵液等体积混合。

优选地，所述功能微生物菌剂由枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌经分别发酵后按5:2:3的体积比混合而成。

上述一种用于防治青枯病的微生物有机肥的制备方法，包括：

1）腐熟菌剂的制备：将黑曲霉、绿色木霉、地衣芽孢杆菌进行分离鉴定后分别进行发酵，发酵完成后与伯顿毕赤酵母发酵液等体积混合；

2）腐熟有机肥料的制备：将园林废弃物和鸡粪按照一定比例组合，使混合物料中的C/N比为30:1，然后按重量比为0.3～0.5%添加上述步骤1）制得的腐熟菌剂，将腐熟菌剂与园林废弃物和鸡粪混合均匀，进行高温好氧堆肥，堆肥天数为10～15天左右，待物料基本腐熟，即制得腐熟有机肥料；

3）功能微生物菌剂的制备：将枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌进行分离鉴定，通过正交实验筛选出上述三种菌种的最佳发酵培养基，单独进行发酵，发酵完成后按5:2:3的体积比混合，即制成功能微生物菌剂；

4）混合：将步骤3）所制得的功能微生物菌剂按照重量比为5%添加到步骤2）所制得的腐熟有机肥料中，充分混合，使有机肥料中的有效活菌数达2.0×10⁷个/g以上，即制得防治青枯病的微生物有机肥。

优选地，所述步骤3)中枯草芽孢杆菌的发酵条件为：发酵温度为30℃、发酵时间为30-36小时，发酵液中含菌量为14.5×10⁸个/mL，发酵培养基各组分的重量比为：淀粉0.5%，蔗糖0.3%，豆饼粉0.1%，K₂HPO₄.3H₂O 0.1%，MgSO₄.7H₂O 0.1%，（NH₄）₂SO₄ 0.08%，CaCO₃ 0.2%，酵母膏 0.1%。

一种用于防治青枯病的微生物有机肥在防治茄科类作物青枯病中的应用。

使用上述一种用于防治青枯病的微生物有机肥的方法，所述微生物有机肥在防治青枯病的过程中分两次使用，第一次用作基肥，微生物有机肥用量为100kg/亩，第二次为在第一次施肥15～20天后用作追肥，微生物有机肥用量为50kg/亩。

本发明以园林废弃物、鸡粪等为基础，通过添加由黑曲霉、绿色木霉、酵母菌、地衣芽孢杆菌组成的腐熟菌剂混合堆肥，堆肥结束后添加由具有拮抗青枯菌的枯草芽孢杆菌和促生作用的短小芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌组成的功能微生物菌剂制成有效解决茄科类作物青枯病的微生物有机肥，本发明为针对现有防治青枯病技术效果差而提出的一种环境友好型生态调控技术措施，研制的微生物有机肥对常见茄科作物番茄、辣椒、茄子的青枯病具有明显的防治效果，番茄青枯病防治效果达69.0%以上，辣椒青枯病的防治效果达56.6%以上，茄子青枯病的防治效果达33.4～100%。同时，施用本发明微生物有机肥对作物促生作用效果明显，能显著提高作物的产量。

具体实施方式

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一：

(一)菌种的分离与鉴定

黑曲霉、绿色木霉、地衣芽孢杆菌的分离：此三种菌自园林废弃物、秸秆堆置地取样分离，采用以园林废弃物作为培养基唯一碳源的平板划线分离；

伯顿毕赤酵母从广东省微生物研究所购买。

枯草芽孢杆菌的分离：该菌从青枯病发生地作物根际土壤中取样，采用稀释平板法和抑菌法分离。

胶质芽孢杆菌、短小芽孢杆菌的筛选与分离：自作物根际土壤中取样，采用促生对比法和稀释平板法进行筛选分离。

黑曲霉、绿色木霉、地衣芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、短小芽孢杆菌的鉴定：采用传统的菌落菌体形态观察和基因测序比对鉴定。

注：上述菌种的分离与鉴定均属于现有技术的范畴内，在此不再累述。

（二）微生物有机肥的制备

1）腐熟菌剂的制备：将黑曲霉、绿色木霉、地衣芽孢杆菌进行分离鉴定后分别进行发酵，发酵完成后与伯顿毕赤酵母发酵液等体积混合，即制得腐熟菌剂；

2）腐熟有机肥料的制备：将园林废弃物和鸡粪按照一定比例组合，使混合物料中的C/N比为30:1，然后按重量比为0.3～0.5%添加上述步骤1）制得的腐熟菌剂，将腐熟菌剂与园林废弃物和鸡粪混合均匀，进行高温好氧堆肥，堆肥天数为10～15天左右，物料基本腐熟，即制得腐熟有机肥料；

4）混合：将步骤3）所制得的微生物菌剂按照重量比为5%添加到步骤2）所制得的腐熟有机肥料中，充分混合，使微生物有机肥中的有效活菌数达2.0×10⁷个/g以上，pH值为7.3，水分含量为29.7%，有机质含量为41.2%，全氮含量为1.28%，全钾含量为1.45%，全磷含量为1.60%，即制得防治青枯病的微生物有机肥。

枯草芽孢杆菌的发酵条件为：发酵温度为30℃、发酵时间为30-36小时，发酵液中含菌量为14.5×10⁸个/mL，利用装液量为200mL/1000mL的三角瓶进行发酵，其中培养基的pH为7.5，培养基各组分的重量比为：淀粉0.5%，蔗糖0.3%，豆饼粉0.1%，K₂HPO₄.3H₂O 0.1%，MgSO₄.7H₂O 0.1%，（NH₄）₂SO₄ 0.08%，CaCO₃ 0.2%，酵母膏 0.1%。

短小芽孢杆菌的发酵条件为：利用装液量为200mL/1000mL三角瓶进行发酵培养，培养温度为32℃，培养时间为24-28小时，其中培养基的pH为7.5，培养基组分的重量比为：淀粉0.4%，蔗糖0.2%，豆饼粉0.1%，K₂HPO₄.3H₂O 0.1%，KH₂PO₄.12H₂O 0.1%，CaCO₃ 0.1%，酵母膏 0.04%，硫酸亚铁 0.002%，硫酸锰 0.002%，发酵液含菌量≥20.0×10⁸个/mL。

胶质芽孢杆菌的发酵条件为：利用装液量为100mL/1000mL的三角瓶。培养温度为30℃，培养时间为30-32小时，其中培养基的pH为8.5，培养基组分的重量比为：淀粉0.7%，葡萄糖0.25%，豆饼粉0.1%，硫酸铵0.05%，K₂HPO₄.3H₂O 0.2%，MgSO₄.7H₂O 0.2%，CaCO₃ 0.1%，酵母膏 0.08%，三氯化铁 0.02%，发酵液含菌量≥19.2×10⁸个/mL。

本发明通过设置正交试验研究各功能菌株的最适培养基及发酵条件，分别以碳源、氮源、培养基起始pH、培养温度、通气量（即装液量）为基础，设计5因素4水平正交试验L₁₆（4⁵）。

以胶质芽孢杆菌为例，设计如下表：

注：A1：0.2%蔗糖+0.7%淀粉 A2：0.2%蔗糖+0.5%淀粉

A3：0.25%葡萄糖+0.7%淀粉 A4：0.25%葡萄糖+0.5%淀粉

B1：0.05%硫酸铵+0.1%豆饼粉 B2：0.05%硫酸铵+0.2%豆饼粉

B3：0.1%硫酸铵+0.1%豆饼粉 B4：0.1%硫酸铵+0.2%豆饼粉

C1：7.0 C2：7.5 C3： 8.0 C4：8.5

D1：28℃ D2：30℃ D3：32℃ D4：34℃

E1：50mL E2：75mL E3：100mL E4：150mL

根据上述实验得出胶质芽孢杆菌的最佳培养基以及培养条件。

所述的一种微生物有机肥可应用在防治茄科类农作物青枯病上，使用方法为：在防治青枯病的过程中分两次使用，第一次用作基肥，微生物有机肥用量为100kg/亩，第二次为在第一次施肥15～20天后用作追肥，微生物有机肥用量为50kg/亩。相比一次性应用，其防治青枯病的效果大大提高，对番茄青枯病防治效果达69.0%以上（一次性应用30%左右），对辣椒青枯病的防治效果达56.6%以上（一次性施用25%左右），对茄子青枯病的防治效果达33.4～100%（一次性施用30%左右）。

（三）盆栽实验

1、微生物有机肥对番茄青枯病的防治效果及促生作用

供试番茄品种为市购，育苗4-5片真叶后移栽到有5kg土壤的盆钵中，盆钵设置以下3种处理：健康土壤+番茄青枯病病原菌（CK）;健康土壤+番茄青枯病病原菌+市购微生物有机肥（CK+OF）；健康土壤+番茄青枯病病原菌+微生物有机肥（CK+BOF）。其中有机肥（OF）和微生物有机肥（BOF）施用量约为10g/盆（亩用量为300kg，按亩耕层土15万公斤折算成盆用量），分两次施用，空白对照组（CK）、处理组用化学氮、磷、钾肥补齐养分。

在番茄生长40天和60天时调查青枯病发生情况，计算病情指数和防治效果（病情指数=∑（各级病株数×相应级数）/调查总植株数×100；防治效果=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100；病害严重度分级标准：0级：无病状；Ⅰ级：1/4叶片发病；Ⅱ级：1/2叶片发病；Ⅲ级：整株死亡），结果显示如下：

表1 微生物有机肥对番茄青枯病的防治效果

注：同一栏中不同字母代表Duncan’s多重比较差异显著（n=6, p≤0.05）。

在番茄收获时测量番茄的各项生长指数，测量结果如下表显示：

表2 微生物有机肥对番茄生物量的影响

试验表明：在防治病情方面：施用微生物有机肥60天后，对番茄青枯病防治效果达69.0%以上，而市购有机肥一般为41.4%，其可以起到防治番茄青枯病，大大减少作物土壤中青枯病病原菌数量的作用；在促生方面：与市购有机肥相比，本发明微生物有机肥在对番茄的株高、鲜重、干重及结果数方面都有很好的促生效果。

（四）小区试验

1、微生物有机肥对辣椒青枯病的防治效果及增产作用

试验条件：试验选择在仲恺农业工程学院农场内进行。试验蔬菜为辣椒，品种为湘研五号，播种日期为3月6日，土壤为沙壤土，整个试验小区除处理设置外其它水肥管理一致。

试验设计：试验设3个处理组，本发明微生物有机肥（BOF）、参比组有机肥(OF)（为市购其它企业生产的微生物有机肥）以及一空白对照组(CK)。微生物有机肥亩用量为150kg，分两次施用（第一次做基肥100kg/亩，第二次在20天后用作追肥50kg/亩）。

在辣椒生长60天和80天时进行发病率和防病效果调查。试验结果如下表所示：

表3 微生物有机肥对辣椒青枯病的防治效果

注：同一栏中不同字母代表Duncan’s多重比较差异显著（n=3, p≤0.05）。

表4 微生物有机肥对辣椒产量的影响

处理	产量（克/小区）	增产量（克）	增产率（%）	单个辣椒重（克）
					CK	4465.0±66.5b			26.2±1.2a
BOF	5137.7±196.2a	672.7	15.1	27.8±1.3a
					OF	4780.3±106.0ab	315.3	7.1	27.9±0.9a

注：1. 表中所计产量为前五次采摘总产；

2. 同一栏中不同字母代表Duncan’s多重比较差异显著（n=3, p≤0.05）。

试验表明：在防治青枯病方面：施用微生物有机肥80天后对辣椒青枯病的防治效果达56.6%，而市购的普通微生物有机肥的防治效果为23.3%，使用本发明微生物有机肥对辣椒的增产作用明显，施用80天后，辣椒的增产率达到15.1%，而一般有机肥仅为7.1%。

本发明以园林废弃物、鸡粪等为基础，通过添加由黑曲霉、绿色木霉、酵母菌、地衣芽孢杆菌组成的腐熟菌剂混合堆肥，堆肥结束后添加由具有拮抗青枯菌的枯草芽孢杆菌和促生作用的短小芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌组成的功能微生物菌剂制成有效解决茄科类青枯病的微生物有机肥，本发明为针对现有防治青枯病技术效果差而提出的一种环境友好型生态调控技术措施，研制的微生物有机肥对常见茄科作物番茄、辣椒、茄子的青枯病具有明显的防治效果。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种用于防治青枯病的微生物有机肥的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

1)腐熟菌剂的制备：将黑曲霉、绿色木霉、地衣芽孢杆菌进行分离鉴定后分别进行发酵，发酵完成后与伯顿毕赤酵母发酵液等体积混合；

2)腐熟有机肥料的制备：将园林废弃物和鸡粪按照一定比例组合，使混合物料中的C/N比为30:1，然后按重量百分比为0.3～0.5％添加上述步骤1)制得的腐熟菌剂，将腐熟菌剂与园林废弃物和鸡粪混合均匀，进行高温好氧堆肥，堆肥天数为10～15天，待物料腐熟，即制得腐熟有机肥料；

3)功能微生物菌剂的制备：将枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌进行分离鉴定，通过正交实验筛选出上述三种菌的最佳发酵培养基，单独进行发酵，发酵完成后按5:2:3的体积比混合，即制成功能微生物菌剂；

4)混合：将步骤3)所制得的功能微生物菌剂按照重量比为5％添加到步骤2)所制得的腐熟有机肥料中，充分混合，使有机肥料中的有效活菌数达2.0×10⁷个/g以上，pH值为7.3，水分含量为29.7％，有机质含量为41.2％，全氮含量为1.28％，全钾含量为1.45％，全磷含量为1.60％，即制得防治青枯病的微生物有机肥。

2.根据权利要求1所述的一种用于防治青枯病的微生物有机肥的制备方法，其特征在于：

所述步骤3)中枯草芽孢杆菌的发酵条件为：发酵温度为30℃、发酵时间为30-36小时，发酵液中含菌量为14.5×10⁸个/mL，发酵培养基各组分的重量比为：淀粉0.5％，蔗糖0.3％，豆饼粉0.1％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.1％，(NH₄)₂SO₄0.08％，CaCO₃0.2％，酵母膏0.1％；

短小芽孢杆菌的发酵条件为：培养温度为32℃，培养时间为24-28小时，其中培养基的pH为7.5，培养基组分的重量比为：淀粉0.4％，蔗糖0.2％，豆饼粉0.1％，K₂HPO₄·3H₂O0.1％，KH₂PO₄·12H₂O 0.1％，CaCO₃0.1％，酵母膏0.04％，硫酸亚铁0.002％，硫酸锰0.002％，发酵液含菌量≥20.0×10⁸个/mL；

胶质芽孢杆菌的发酵条件为：培养温度为30℃，培养时间为30-32小时，其中培养基的pH为8.5，培养基组分的重量比为：淀粉0.7％，葡萄糖0.25％，豆饼粉0.1％，硫酸铵0.05％，K₂HPO₄·3H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.2％，CaCO₃0.1％，酵母膏0.08％，三氯化铁0.02％，发酵液含菌量≥19.2×10⁸个/mL。

3.一种根据权利要求1或2所述的用于防治青枯病的微生物有机肥的制备方法所制备的用于防治青枯病的微生物有机肥，在防治茄科类作物青枯病中的应用。

4.根据权利要求3所述的用于防治青枯病的微生物有机肥在防治茄科类作物青枯病的应用，其特征在于：该微生物有机肥在防治青枯病的过程中分两次使用，第一次用作基肥，微生物有机肥用量为100kg/亩，第二次为在第一次施肥15～20天后用作追肥，微生物有机肥用量为50kg/亩。