CN106190929B - 一种地衣芽孢杆菌新菌株及其应用 - Google Patents

一种地衣芽孢杆菌新菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)新菌株CLIMAX‑VBL，其保藏号为CGMCC No.12499。本发明还提供含有地衣芽孢杆菌CLIMAX‑VBL的菌剂及其应用。该菌能够显著提高农作物产量和抗逆能力，显著降低作物病害。菌株CLIMAX‑VBL经过工业化生产，具有广阔应用前景，可以用于配置多种肥料产品，并可用于苗床、灌根、配肥(制作生物有机肥)等用途。

Description

一种地衣芽孢杆菌新菌株及其应用
技术领域
本发明涉及农用微生物制剂及土壤肥料领域，具体地说，涉及一种地衣芽孢杆菌新菌株及其应用。
背景技术
白色农业是指微生物资源产业化的工业型新农业，通常指微生物发酵工程在农业上的应用。农业生产需要土壤提供作物生长的营养物质和生存环境。多年来，化学肥料的施用对农业增收起到了关键作用。然而，由于长期施用化学肥料，土壤有益微生物菌群受到破坏、有机肥供应不足，各类养分比例失调，致使农田生态环境、土壤理化性状和土壤微生物区系受到了不同程度的破坏，在一定程度上影响了农产品的品质，我国目前土壤资源现状迫切需要通过人为措施解决土壤被逐渐破坏的问题，确保农业种植水平和农作物产品品质。一些有益微生物可固定空气中的氮素、活化土壤中难以利用的磷、钾及其他营养元素，提高土壤养分供应能力和保水、保肥能力，提高土地资源的持续生产能力，还能增强农作物抗病性，减少农药用量。
在我国生态环境保护的十大对策中明确提倡要推广“生态农业”，保护生态环境和农田土壤，推动无公害健康食品的生产，促进生态系统中生物循环，达到保持和增强土壤肥力及生物活性目的。以有益微生物为核心的微生物制剂或肥料产品能起到改良土壤、提高地力、促进生长等作用，是优质无公害农产品生产的优选生产资料。随着我国现代农业的快速发展，特别是绿色有机农业种植面积不断扩大，将特定微生物菌融入到农业生产中来，已成为当今政府及企业所关注的热点问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种地衣芽孢杆菌新菌株及其应用。
为了实现本发明目的，本发明提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)CLIMAX-VBL是从农作物根部土壤中分离、提纯、复壮而得，该菌株能够显著提高农作物产量和抗逆能力，显著降低作物病害。研究分析，地衣芽孢杆菌是一种在健康的农作物土壤微生态环境中占据优势的菌群，它可以产生包括几丁质酶、抗菌蛋白、多肽类、苯乙酸类等抗菌物质，并通过作用于病原菌提高植物的抗病力。同时，地衣芽孢杆菌具有嗜热特性，在植物快速生长期间，该菌群繁殖迅速，有效改善土壤根际环境(提高土壤透气、保水和保肥性能)，促进植物根系生长。地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL可分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，有效促进土壤有机物的降解和利用。菌株CLIMAX-VBL现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.12499，保藏日期2016年5月25日。
菌株CLIMAX-VBL通过培养特征、显微形态特征、生理生化特征和遗传特征，确定该菌株符合地衣芽孢杆菌的特征。
本发明的地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL可制备成菌剂，其中，菌株CLIMAX-VBL的活菌数可为2亿/克以上，优选为10亿/克以上，更优选为100亿/克。
本发明提供的含有地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的菌剂，可按如下液体发酵的方式进行制备：
将保存于冻干管中的菌株CLIMAX-VBL接入到肉汤培养基的固体斜面中，在30-32℃下培养24-48小时；然后挑取菌落接入PDA固体斜面中，在30-32℃下培养3-7天；然后挑取菌落接入到经过灭菌的液体培养基中，在30±1℃、150-200r/min条件下培养36-48小时，获得菌株CLIMAX-VBL的发酵液，将发酵液直接作为液体菌剂，其中地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的活菌数为10亿/克以上。
所述液体培养基含有如下重量份的组分：蔗糖20份、氯化钠5份、蛋白胨20份、硫酸镁5份、磷酸二氢钾3份和水1000份。
本发明提供的含有地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的菌剂，还可以按如下液体发酵+固体吸附的方式进行制备：按照上述方法制备菌株CLIMAX-VBL的发酵液，将发酵液与固体吸附剂按1：4-8的重量比混合，干燥后进行活菌数检测，即得菌株CLIMAX-VBL的固体菌剂。其中，地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的活菌数为2亿/克以上；所述固体吸附剂为草炭、沸石或(轻质)碳酸钙等中的至少一种。
本发明提供的含有地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的菌剂，进一步可按如下液体发酵+离心喷雾干燥的方式进行制备：按照上述方法制备菌株CLIMAX-VBL的发酵液，向发酵液中加入可湿性固形物(如麦芽糊粉、葡萄糖、环糊精等)，调整到含水量90％以内，采用离心喷雾干燥的方式蒸发水分，制成菌粉，然后进行活菌数检测，即得。其中地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的活菌数为100亿/克以上。
本发明还提供所述地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL或上述制备的菌剂在提高农作物产量、抗逆能力以及提高土壤肥力等方面的应用。
本发明还提供所述地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL或上述制备的菌剂在在制备种子处理剂、肥料增效剂、菌肥以及喷灌剂中的应用。
本发明还提供一种种子处理剂，含有如下重量份的组分：上述制备的菌株CLIMAX-VBL固体菌剂30-90份、粘土5-30份、麦饭石5-20份、农用稀土0-40份和硫酸锌0-10份；其中所述粘土为沸石粉、膨润土、凹凸棒石粘土等中的至少一种。
本发明还提供一种微生物菌肥，含有如下重量份的组分：上述制备的菌株CLIMAX-VBL固体菌剂0.2-30份、有机肥30-100份、腐植酸粉10-50份和氮磷钾元素0-50份。
本发明还提供一种喷灌剂，含有如下重量份的组分：上述制备的地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL液体菌剂50-400份、氨基酸液300-600份、磷酸二氢钾10-200份、硼酸10-50份、一水硫酸锰10-60份、七水硫酸锌10-50份、尿素20-150份、农用稀土0-50份和少量表面活性剂。
其中，所述氨基酸液中各成分的质量百分含量如下：天冬氨酸3.41％、丝氨酸5.22％、谷氨酸7.15％、苏氨酸3.00％、甘氨酸2.36％、精氨酸2.34％、丙氨酸2.48％、酪氨酸0.48％、脯氨酸3.84％、缬氨酸5.38％、苯丙氨酸0.38％、异亮氨酸1.57％、亮氨酸3.16％、组氨酸0.84％、赖氨酸1.88％、蛋氨酸0.35％和胱氨酸2.64％。所述氨基酸液以水配制。也可由天然动植物成分经水解、脱盐制成。
所述表面活性剂包括烷基糖苷、聚山梨酯和聚醚改性聚硅氧烷等中的至少一种。当所述表面活性剂为烷基糖苷时，烷基糖苷的添加量为所述喷灌剂总重的5-15％；当所述表面活性剂为聚醚改性聚硅氧烷时，聚醚改性聚硅氧烷的添加量为所述喷灌剂总重的0.1-0.5％；当所述表面活性剂为聚山梨酯时，聚山梨酯的添加量为所述喷灌剂总重的1-5％，优选聚山梨酯80。
所述喷灌剂可按如下方法进行制备：先将氨基酸液300-600份、磷酸二氢钾10-200份、硼酸10-50份、一水硫酸锰10-60份、七水硫酸锌10-50份、尿素20-150份、农用稀土0-50份和少量表面活性剂在60-80℃的反应罐中进行搅拌混合30-60分钟，待温度降至25℃以下，加入地衣芽孢杆菌液体菌剂50-400份，在常温下搅拌5-10分钟，即得。
本发明具有以下优点：
(一)本发明提供一种高活性、耐高温、抗病害的地衣芽孢杆菌菌株CLIMAX-VBL，其具有十分显著的抗病和提高土壤肥力性能。
(二)本发明的地衣芽孢杆菌可采用液体发酵、液体发酵+固体吸附、液体发酵+离心喷雾干燥三种方法进行制造增殖，制成液体或固体菌剂，具有产孢量高、代谢产物量大，其产品的生物活性更好，保存期更长的优点。
(三)菌株CLIMAX-VBL经过工业化生产，具有广阔应用前景，可以用于配置多种肥料产品，并可用于苗床、灌根、配肥(制作生物有机肥)等用途。本发明对苗床、灌根、配肥三种应用提供了可行的方案，并且获得良好的实际应用效果。可有效解决我国目前土壤肥力日益低下、农作物的多种植障碍(如土壤传播病害、连作障碍、根际微生态环境被破坏等)问题。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
若无特别说明，本发明中所述的“份”是指“重量份”。
实施例1地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的菌学特征
菌株CLIMAX-VBL是从农作物根部土壤中分离、提纯、复壮而得，它的形态特征如下：细胞杆状，革兰氏染色阳性，大小为(0.6-0.8μm)×(2.0-3.5μm)。芽孢端生或偏端生，柱形，孢囊不膨大。在肉汤培养基上，菌落圆形，湿润，边缘整齐，有红色色素。
生理生化特征如下：接触酶、氧化酶、淀粉酶试验呈阳性反应；厌氧生长；可利用丙酸盐；卵磷脂酶试验呈阴性反应。
实施例2地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的鉴定
通过对菌株CLIMAX-VBL 16S rDNA序列进行测定，将测序结果在GenBank中进行比对，发现与其它已公布的地衣芽孢杆菌的16S rDNA的序列同源性较高。
通过上述形态特征、生理生态特征和16S rDNA序列分析，可以确定分离到的确为地衣芽孢杆菌的新菌株。
实施例3地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL菌剂的制备(液体发酵方式)
将保存于冻干管中的菌株CLIMAX-VBL接入到肉汤培养基的固体斜面中，在32℃下培养24小时；然后挑取菌落接入PDA固体斜面中，在32℃下培养3-7天；然后挑取菌落接入到经过灭菌的液体培养基中，在32℃、150r/min条件下培养3天，获得菌株CLIMAX-VBL的发酵液，将发酵液直接作为液体菌剂，其中地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的活菌数为10亿/克以上。
所述液体培养基含有如下重量份的组分：蔗糖20份、氯化钠5份、蛋白胨20份、硫酸镁5份、磷酸二氢钾3份和水1000份。
实施例4地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL菌剂的制备(液体发酵+固体吸附方式)
按照实施例3方法制备菌株CLIMAX-VBL的发酵液，将发酵液与固体吸附剂按1:4的重量比混合，干燥后经过平板计数法进行有效活菌数检测合格后作为地衣芽孢杆菌原菌制剂包装入库保存。其中，地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的活菌数为6亿/克以上。
所述固体吸附剂为草炭、沸石或(轻质)碳酸钙中的至少一种。
实施例5地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL菌剂的制备(液体发酵+固体吸附方式)
按照实施例3方法制备菌株CLIMAX-VBL的发酵液，将发酵液与固体吸附剂按1:6的重量比混合，干燥后经过平板计数法进行有效活菌数检测合格后作为地衣芽孢杆菌原菌制剂包装入库保存。其中，地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的活菌数为4亿/克以上。
所述固体吸附剂为草炭、沸石或(轻质)碳酸钙中的至少一种。
实施例6地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL菌剂的制备(液体发酵+固体吸附方式)
按照实施例3方法制备菌株CLIMAX-VBL的发酵液，将发酵液与固体吸附剂按1:8的重量比混合，干燥后经过平板计数法进行有效活菌数检测合格后作为地衣芽孢杆菌原菌制剂包装入库保存。其中，地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的活菌数为8亿/克以上。
所述固体吸附剂为草炭、沸石或(轻质)碳酸钙中的至少一种。
实施例7地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL菌剂的制备(液体发酵+离心喷雾干燥方式)
按照实施例3方法制备菌株CLIMAX-VBL的发酵液，向发酵液中加入可湿性固形物(如麦芽糊粉等原料)，调整到含水量90％以内，采用离心喷雾干燥机快速蒸发水分，制成干燥菌粉，经过平板计数法进行有效活菌数检测合格后作为地衣芽孢杆菌原菌制剂包装入库保存。其中，地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的活菌数为100亿/克以上。
实施例8含有地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的种子处理剂
实施例4制备的菌株CLIMAX-VBL固体菌剂30份、粘土5份和麦饭石5份，以上原料充分混合均匀即得。
其中所述粘土为沸石粉、膨润土、凹凸棒石粘土中的至少一种。
实施例9含有地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的种子处理剂
实施例5制备的菌株CLIMAX-VBL固体菌剂60份、粘土20份、麦饭石10份、农用稀土10份和硫酸锌5份，以上原料充分混合均匀即得。
其中所述粘土为沸石粉、膨润土、凹凸棒石粘土中的至少一种。
实施例10含有地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的种子处理剂
实施例6制备的菌株CLIMAX-VBL固体菌剂90份、粘土30份、麦饭石20份、农用稀土40份和硫酸锌10份，以上原料充分混合均匀即得。
其中所述粘土为沸石粉、膨润土、凹凸棒石粘土中的至少一种。
实施例11含有地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的微生物菌肥
实施例4制备的菌株CLIMAX-VBL固体菌剂0.2份、有机肥30份和腐植酸粉10份，以上原料充分混合均匀即得。
实施例12含有地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的微生物菌肥
实施例5制备的菌株CLIMAX-VBL固体菌剂20份、有机肥80份、腐植酸粉30份和氮磷钾元素25份，以上原料充分混合均匀即得。
实施例13含有地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的微生物菌肥
实施例6制备的菌株CLIMAX-VBL固体菌剂30份、有机肥100份、腐植酸粉50份和氮磷钾元素50份，以上原料充分混合均匀即得。
实施例14含有地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的喷灌剂
先将氨基酸液300份、磷酸二氢钾10份、硼酸10份、一水硫酸锰10份、七水硫酸锌10份、尿素20份和聚山梨酯80型3份，在60-80℃的反应罐中进行搅拌混合30-60分钟，待温度降至25℃以下，加入实施例3制备的地衣芽孢杆菌液体菌剂50份，在常温下搅拌5-10分钟，即得。
实施例15含有地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的喷灌剂
先将氨基酸液450份、磷酸二氢钾100份、硼酸30份、一水硫酸锰35份、七水硫酸锌30份、尿素100份、农用稀土25份和聚山梨酯80型5份，在60-80℃的反应罐中进行搅拌混合30-60分钟，待温度降至25℃以下，加入实施例3制备的地衣芽孢杆菌液体菌剂200份，在常温下搅拌5-10分钟，即得。
实施例16含有地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的喷灌剂
先将氨基酸液600份、磷酸二氢钾200份、硼酸50份、一水硫酸锰60份、七水硫酸锌50份、尿素150份、农用稀土50份和聚山梨酯80型10份，在60-80℃的反应罐中进行搅拌混合30-60分钟，待温度降至25℃以下，加入实施例3制备的地衣芽孢杆菌液体菌剂400份，在常温下搅拌5-10分钟，即得。
其中，实施例14-16中所用氨基酸液中各成分的质量百分含量如下：天冬氨酸3.41％、丝氨酸5.22％、谷氨酸7.15％、苏氨酸3.00％、甘氨酸2.36％、精氨酸2.34％、丙氨酸2.48％、酪氨酸0.48％、脯氨酸3.84％、缬氨酸5.38％、苯丙氨酸0.38％、异亮氨酸1.57％、亮氨酸3.16％、组氨酸0.84％、赖氨酸1.88％、蛋氨酸0.35％和胱氨酸2.64％。所述氨基酸液以水配制。也可由天然动植物成分经水解、脱盐制成。
试验例1种子处理剂
在水稻播种前，用实施例9的种子处理剂对水稻种子进行浸泡/拌种处理，每亩用量的稻种使用20克加5公斤水搅匀后进行浸种，在播种后2周左右进行调查发现，秧苗健壮，苗高增加3-5厘米，根长增加1.2-1.8厘米，单株分蘖增加60％，大田生长旺盛，结实率和千粒重分别增加1.1％和2.0％，产量平均增加7.8％，与此同时，还具有防治水稻稻瘟病效果，经田间实际应用，防治效果可达50％以上。实施例8和10的种子处理剂具有类似的效果。
试验例2微生物菌肥
在底肥期，每亩辣椒均匀沟施50公斤实施例12的菌肥。与实施例12配方相同，但不含地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL原菌制剂的对照相比，施用后能提前采收3-5天，增产幅度达16.2％，且显著提高商品性能，着色好、光泽好、辣味香浓。实施例11和13的菌肥具有类似的效果。
试验例3喷灌剂
在西红柿定植缓苗后和快速生长期各喷施并结合根灌实施例15的喷灌剂，其中，每次200毫升按照1:75配水，结合每亩用5公斤按照比水1：200进行灌根。经过跟踪调查，对番茄灰霉病具有良好的抑制作用，平均增产12-16％，最高可达25％，且西红柿的商品性能显著提高，个头均匀，果色健康，单个果重显著增加，具有良好的经济效益。实施例13和16的喷灌剂具有类似的效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)新菌株CLIMAX-VBL，其保藏号为CGMCCNo.12499。
2.含有权利要求1所述地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的菌剂。
3.权利要求2所述菌剂的制备方法，其特征在于，其中地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的活菌数为10亿/克以上；
制备方法如下：将保存于冻干管中的菌株CLIMAX-VBL接入到肉汤培养基的固体斜面中，在30-32℃下培养24-48小时；然后挑取菌落接入PDA固体斜面中，在30-32℃下培养3-7天；然后挑取菌落接入到经过灭菌的液体培养基中，在30-32℃、150-200r/min条件下培养36-48小时，获得菌株CLIMAX-VBL的发酵液；
其中，所述液体培养基含有如下重量份的组分：蔗糖20份、氯化钠5份、蛋白胨20份、硫酸镁5份、磷酸二氢钾3份和水1000份。
4.权利要求2所述菌剂的制备方法，其特征在于，其中地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的活菌数为2亿/克以上；
制备方法如下：S11、按照权利要求3所述方法制备菌株CLIMAX-VBL的发酵液；S12、将发酵液与固体吸附剂按1:4-8的重量比混合，干燥后进行活菌数检测，即得；
其中，所述固体吸附剂为草炭、沸石或碳酸钙中的至少一种。
5.权利要求2所述菌剂的制备方法，其特征在于，其中地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL的活菌数为100亿/克以上；
制备方法如下：S21、按照权利要求3所述方法制备菌株CLIMAX-VBL的发酵液；S22、向发酵液中加入可湿性固形物，调整到含水量90％以内，采用离心喷雾干燥的方式蒸发水分，制成菌粉，然后进行活菌数检测，即得；
其中，所述可湿性固形物包括麦芽糊粉、葡萄糖、环糊精。
6.权利要求1所述地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL或权利要求2所述菌剂在提高农作物产量、抗逆能力以及提高土壤肥力中的应用。
7.权利要求1所述地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL或权利要求2所述菌剂在制备种子处理剂、肥料增效剂、菌肥以及喷灌剂中的应用。
8.一种种子处理剂，其特征在于，含有如下重量份的组分：由权利要求4所述方法制备的地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL菌剂30-90份、粘土5-30份、麦饭石5-20份、农用稀土0-40份和硫酸锌0-10份；
其中所述粘土为沸石粉、膨润土、凹凸棒石粘土中的至少一种。
9.一种微生物菌肥，其特征在于，含有如下重量份的组分：由权利要求4所述方法制备的地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL菌剂0.2-30份、有机肥30-100份、腐植酸粉10-50份和氮磷钾元素0-50份。
10.一种喷灌剂，其特征在于，含有如下重量份的组分：由权利要求3所述方法制备的地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL液体菌剂50-400份、氨基酸液300-600份、磷酸二氢钾10-200份、硼酸10-50份、一水硫酸锰10-60份、七水硫酸锌10-50份、尿素20-150份、农用稀土0-50份和少量表面活性剂；
其中，所述氨基酸液中各成分的质量百分含量如下：天冬氨酸3.41％、丝氨酸5.22％、谷氨酸7.15％、苏氨酸3.00％、甘氨酸2.36％、精氨酸2.34％、丙氨酸2.48％、酪氨酸0.48％、脯氨酸3.84％、缬氨酸5.38％、苯丙氨酸0.38％、异亮氨酸1.57％、亮氨酸3.16％、组氨酸0.84％、赖氨酸1.88％、蛋氨酸0.35％和胱氨酸2.64％；
所述表面活性剂包括烷基糖苷、聚山梨酯和聚醚改性聚硅氧烷中的至少一种；当所述表面活性剂为烷基糖苷时，烷基糖苷的添加量为所述喷灌剂总重的5-15％；当所述表面活性剂为聚醚改性聚硅氧烷时，聚醚改性聚硅氧烷的添加量为所述喷灌剂总重的0.1-0.5％；当所述表面活性剂为聚山梨酯时，聚山梨酯的添加量为所述喷灌剂总重的1-5％。
11.根据权利要求10所述的喷灌剂，其特征在于，所述聚山梨酯为聚山梨酯80。
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