CN113322284B - 一种降低秸秆中重金属生物有效性的方法及其应用 - Google Patents

一种降低秸秆中重金属生物有效性的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及环保技术领域，提供了一种降低植物秸秆中重金属生物有效性的方法，利用棘孢木霉T‑1对植物秸秆进行发酵。本发明利用棘孢木霉T‑1菌株可以降低植物秸秆中镉、铜、锌、锰等重金属的总量和生物有效性，使重金属由酸弱酸提取态向植物难利用形态转化，降低植物秸秆中重金属的潜在释放风险。

Description

一种降低秸秆中重金属生物有效性的方法及其应用
技术领域
本发明涉及环保技术领域，具体涉及一种降低秸秆中重金属生物有效性的方法及其应用。
背景技术
近年来，我国农田土壤重金属污染问题引起了全社会的关注。据2014年全国土壤污染状况调查公报显示，全国耕地土壤中重金属等污染物点位超标率达19.4％。在重金属污染农田土壤中，由于重金属的生物有效性较强，其很容易被作物根系吸收进入作物体内，且作物秸秆对重金属的吸收累积量要远远高于籽实部分，以水稻为例，其地上部营养器官吸收的镉绝大部分都累积在秸秆中。发明人前期在浙江和湖南等地调查发现，中度镉污染农田种植水稻秸秆中镉的平均含量分别8.78mg/kg和20.37mg/kg，按当地稻谷平均亩产量700kg和稻草：稻谷比1:1估算，每年水稻秸秆可从土壤带出镉量约有92g/hm2和214g/hm2。有学者对湖南某地农田长期监测表明，水稻秸秆单次从土壤中转移富集的镉量高达395g/hm2～768g/hm2。当明，我国秸秆年产量位居世界第一，其中水稻秸秆年产量高达2.29亿吨，秸秆直接还田比例达35％以上。作物秸秆原料所含有的重金属元素生物有效性较高，重金属污染作物秸秆还田把营养物质等带入土壤的同时也把作物中吸收的大部分重金属重新归还到稻田土壤中。因此，如何解决作物秸秆中重金属含量超标和生物有效性高等问题，对秸秆循环利用具有重要的实际应用价值。
目前，针对高重金属含量的作物秸秆的处理技术主要包括焚烧、热解、气化和压缩填埋等，然而这些处理技术存在诸多缺点，如焚烧污染大气、热解和气化消耗能源且重金属可能挥发污染大气等。秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，微生物在秸秆转化中有用途多、营养价值高、周期短、可再生等优点。例如，木霉属丝状真菌具有木质纤维素降解能力，常被用于作物秸秆转化。但目前为止，利用木霉属丝状真菌降低秸秆重金属生物有效性的发明还鲜有公开。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种降低秸秆中重金属生物有效性的方法及其应用，利用棘孢木霉T-1菌株可以降低植物秸秆中镉、铜、锌、锰等重金属的总量和生物有效性，使重金属由酸弱酸提取态向植物难利用形态转化，降低植物秸秆中重金属的潜在释放风险。
为解决以上技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种降低秸秆中重金属生物有效性的方法，利用棘孢木霉T-1对植物秸秆进行发酵。
优选的，所述棘孢木霉T-1为棘孢木霉T-1的孢子悬液。
优选的，所述植物秸秆在发酵前烘干粉碎。
优选的，所述烘干的温度为55℃-65℃。
优选的，所述粉碎后植物秸秆的粒径为75μm-154μm。
优选的，所述发酵方式为分批次深层液体发酵。
优选的，所述秸秆发酵的培养基由植物秸秆和Mandel培养液组成；所述Mandel培养液由以下成分组成：NaNO32g/L、KH2PO41.5g/L、CaCl20.3g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、MnSO4·H2O 0.0016g/L、ZnSO4·H2O 0.0014g/L、CoCl20.0005g/L，pH＝5.5。
优选的，所述植物秸秆与所述Mandel培养液的比例为0.5-1.5％(w/v)。
优选的，所述棘孢木霉T-1的接种量为105-107个孢子/mL发酵培养基。
本发明还提供了上述方法在降低重金属污染中的应用。
本发明提供了一种降低秸秆中重金属生物有效性的方法，利用棘孢木霉T-1菌株对植物秸秆进行发酵，可以降低植物秸秆中镉、铜、锌、锰等重金属的总量和生物有效性，使重金属由酸弱酸提取态向植物难利用形态转化，降低植物秸秆中重金属的潜在释放风险。
生物保藏说明
本发明所述的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)T-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.9722，保藏日期为2014年9月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
本发明提供了一种降低秸秆中重金属生物有效性的方法，利用棘孢木霉T-1对植物秸秆进行发酵。所述棘孢木霉T-1通过发酵降解秸秆中的木质素、纤维素等，从而改变秸秆内源重金属形态变化。
本发明中，所述棘孢木霉T-1已于专利文献CN104450530A中公开，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9722。本发明中，所述棘孢木霉T-1为棘孢木霉T-1的孢子悬液。本发明中，所述孢子悬液的制备方法并没有特殊限定，本发明具体实施例中所述孢子悬液的制备优选的包括以下步骤：
将棘孢木霉T-1接种在PDA平板上，恒温培养后收集孢子沉淀，悬浮清洗离心后用无菌水重悬孢子，即得所述孢子悬液。
本发明中，所述PDA平板培养基优选为马铃薯培养基(PDA)(L-1)，其配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g。具体制备方法为：马铃薯洗净去皮切成小块，加1L水煮沸半个小时，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖，充分溶解后分装，加入2％琼脂，115℃高压灭菌30min。本发明中，所述棘孢木霉T-1恒温培养的温度优选为25-30℃，更优选为28℃；所述棘孢木霉T-1恒温培养的时间优选为3-5天，更优选为4天。本发明对所述收集孢子沉淀的方法并没有特殊限定，优选的采用灭菌的0.1％(v/v)Tween 80溶液将孢子从PDA平板上洗下，经灭菌的三层擦镜纸过滤后收集孢子于灭菌的50mL离心管，离心即得所述孢子沉淀。本发明中，所述悬浮清洗的溶液优选为0.1％Tween 80溶液；所述0.1％Tween 80溶液能够防止孢子聚集成团，更好的分散孢子溶液，便于精确接种计数。
本发明中，所述植物秸秆在发酵前烘干粉碎；所述烘干的温度优选为55℃-65℃，更优选为60℃。本发明中，所述粉碎后植物秸秆的粒径优选为75μm-154μm，更优选为90μm-150μm，最优选为100μm-140μm。本发明对所述烘干和粉碎的方式并没有特殊限定，采用本领域常规的烘干和粉碎方式即可。
本发明中，所述秸秆发酵的培养基由植物秸秆和Mandel培养液组成；所述Mandel培养液由以下成分组成：NaNO32g/L、KH2PO41.5g/L、CaCl20.3g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、MnSO4·H2O 0.0016g/L、ZnSO4·H2O 0.0014g/L、CoCl20.0005g/L，pH＝5.5。本发明中，所述秸秆发酵的培养基是将植物秸秆粉碎烘干后与Mandel培养液混合；所述植物秸秆与所述Mandel培养液的比例优选为0.5％-1.5％(w/v)，更优选为0.9％-1.1％(w/v)。
本发明中，所述发酵优选的包括以下步骤：将棘孢木霉的孢子悬液接种于秸秆发酵培养基中，经分批次深层液体发酵培养后，离心得上清液体和残留固体。本发明中，所述棘孢木霉T-1孢子悬液的接种量优选为105-107个孢子/mL发酵培养基，更优选为106个孢子/mL发酵培养基。本发明中，所述分批次深层液体发酵优选的在恒温摇床中进行；所述恒温摇床的温度优选为25℃-30℃，更优选为28℃；所述恒温摇床的转速优选为190rpm-210rpm，更优选为200rpm。本发明中，所述发酵培养的时间优选为3-16天，更优选为5-13天。本发明中，所述离心的转速优选为11000rpm-12500rpm，更优选为12000rpm；所述离心的时间优选为1-2min。本发明中，所述残留固体优选的进行清洗和烘干；所述清洗优选的采用去离子水，所述清洗的次数优选为2-3次；所述烘干的温度优选为55℃-65℃，更优选为60℃，所述烘干的时间优选为12-48h，更优选为15-40h。
本发明中，所述发酵完成后还包括对所述上清液体和残留固体中重金属含量的检测。本发明中，所述检测的方法优选为氯化钙提取法和BCR形态分级法。
本发明还提供了上述降低秸秆中重金属生物有效性的方法在降低重金属污染中的应用。
下面结合部分实施例对本发明做进一步说明，本发明实施例中，所述试剂或装置均为本领域常规市售产品。
实施例1
(1)将棘孢木霉T-1接种在PDA平板上，于28℃恒温培养3天，用灭菌的0.1％(v/v)Tween 80溶液将孢子洗下，经灭菌的三层擦镜纸过滤后收集孢子于灭菌的50mL离心管，离心收集孢子沉淀，加入10mL 0.1％Tween 80将孢子沉淀重新悬浮清洗一次，离心去上清后加入5mL无菌水重悬孢子，制成孢子悬液。
所述PDA平板培养基为马铃薯培养基(PDA)(L-1)，其具体制备方法为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，马铃薯洗净去皮切成小块，加1L水煮沸半个小时，纱布过滤，再加15g葡萄糖，充分溶解后分装，加入2％琼脂，115℃高压灭菌30min。
(2)秸秆发酵培养基：将重金属污染水稻秸秆60℃烘干后粉碎过筛至粒径为75μm，以1％(w/v)的比例加入Mandel培养液，121℃高压灭菌30min。
所述Mandel培养液(L-1)：NaNO32 g、KH2PO41.5 g、CaCl20.3 g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.005g、MnSO4·H2O 0.0016g、ZnSO4·H2O 0.0014g、CoCl20.0005 g，pH＝5.5。
(3)将上述步骤(1)棘孢木霉T-1孢子以106个mL-1的浓度接种于含上述步骤(2)秸秆发酵培养基的三角瓶中进行分批次深层液体发酵，三角瓶置于28℃恒温摇床中，以200rpm的转速培养16天后，用12000rpm高速离心1min后，取上清液体；残留固体用去离子水清洗3次后，于烘箱内60℃烘干24h，得干燥固体。
(4)取上述步骤(3)上清液体和干燥固体，用65％HNO3和30％H2O2(v/v＝3：1)混合酸消煮定容后测定其中重金属含量。
实施例2
(1)将棘孢木霉T-1接种在PDA平板上，于28℃恒温培养5天，用灭菌的0.1％(v/v)Tween 80溶液将孢子洗下，经灭菌的三层擦镜纸过滤后收集孢子于灭菌的50mL离心管，离心收集孢子沉淀，加入10mL 0.1％Tween 80将孢子沉淀重新悬浮清洗一次，离心去上清后加入5mL无菌水重悬孢子，制成孢子悬液。
所述PDA平板培养基为马铃薯培养基(PDA)(L-1)，其具体制备方法为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，马铃薯洗净去皮切成小块，加1L水煮沸半个小时，纱布过滤，再加15g葡萄糖，充分溶解后分装，加入2％琼脂，115℃高压灭菌30min。
(2)秸秆发酵培养基：将重金属污染水稻秸秆60℃烘干后粉碎过筛至粒径为154μm，以1.5％(w/v)的比例加入Mandel培养液，121℃高压灭菌30min。
所述Mandel培养液(L-1)：NaNO32 g、KH2PO41.5 g、CaCl20.3 g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.005g、MnSO4·H2O 0.0016g、ZnSO4·H2O 0.0014g、CoCl20.0005 g，pH＝5.5。
(3)将上述步骤(1)棘孢木霉T-1孢子以106个mL-1的浓度接种于含上述步骤(2)秸秆发酵培养基的三角瓶中进行分批次深层液体发酵，三角瓶置于28℃恒温摇床中，以200rpm的转速培养5天后，用12000rpm高速离心1min后，取上清液体；残留固体用去离子水清洗2次后，于烘箱内60℃烘干48h，得干燥固体。
(4)取上述步骤(3)上清液体和干燥固体，用65％HNO3和30％H2O2(v/v＝3：1)混合酸消煮定容后测定其中重金属含量。
实施例3
(1)将棘孢木霉T-1接种在PDA平板上，于28℃恒温培养4天，用灭菌的0.1％(v/v)Tween 80溶液将孢子洗下，经灭菌的三层擦镜纸过滤后收集孢子于灭菌的50mL离心管，离心收集孢子沉淀，加入10mL 0.1％Tween 80将孢子沉淀重新悬浮清洗一次，离心去上清后加入5mL无菌水重悬孢子，制成孢子悬液。
所述PDA平板培养基为马铃薯培养基(PDA)(L-1)，其具体制备方法为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，马铃薯洗净去皮切成小块，加1L水煮沸半个小时，纱布过滤，再加15g葡萄糖，充分溶解后分装，加入2％琼脂，115℃高压灭菌30min。
(2)秸秆发酵培养基：将重金属污染水稻秸秆60℃烘干后粉碎过筛至粒径为90μm，以0.9％(w/v)的比例加入Mandel培养液，121℃高压灭菌30min。
所述Mandel培养液(L-1)：NaNO32 g、KH2PO41.5 g、CaCl20.3 g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.005g、MnSO4·H2O 0.0016g、ZnSO4·H2O 0.0014g、CoCl20.0005 g，pH＝5.5。
(3)将上述步骤(1)棘孢木霉T-1孢子以106个mL-1的浓度接种于含上述步骤(2)秸秆发酵培养基的三角瓶中进行分批次深层液体发酵，三角瓶置于28℃恒温摇床中，以200rpm的转速培养10天后，用12000rpm高速离心1min后，取上清液体；残留固体用去离子水清洗3次后，于烘箱内60℃烘干12h，得干燥固体。
(4)取上述步骤(3)干燥固体，用65％HNO3和30％H2O2(v/v＝3：1)混合酸消煮定容后测定其中重金属含量。
实施例4
采用0.1M氯化钙提取法分别测定分析实施例1中发酵前和发酵后水稻秸秆中重金属，观察其有效性的变化，具体操作步骤如下：
采用百分之一天平准确称取原始水稻秸秆2.50g于100mL离心管中，加入25mL0.1M CaCl2溶液(固液比为1:10)，室温下振荡1h，在3500g下离心20min，用定量滤纸过滤上清液，用电感耦合离子质谱仪测定上清液中的重金属浓度，得到棘孢木霉T-1处理前水稻秸秆中各重金属总量和有效性含量。
用百分之一天平准确称取实施例1步骤(3)干燥固体2.50g于100mL离心管中，加入25mL 0.1MCaCl2溶液(固液比为1:10)，室温下振荡1h，在3500g下离心20min，用定量滤纸过滤上清液，最后用电感耦合离子质谱仪测定上清液中的重金属的浓度，得到棘孢木霉T-1处理后水稻秸秆中各重金属总量和有效性含量。
按如下公式计算棘孢木霉T-1对水稻秸秆中重金属总量去除率和重金属有效性含量的降低幅度，计算结果如表1和表2所示。
去除率(％)＝(原水稻秸秆重金属总量—棘孢木霉T-1处理后水稻秸秆重金属总量)/原水稻秸秆重金属总量Х100％；
降低幅度(％)＝(原水稻秸秆重金属有效性含量—棘孢木霉T-1处理后水稻秸秆重金属有效性含量)/原水稻秸秆重金属有效性含量Х100％。
表1棘孢木霉T-1处理前后水稻秸秆中重金属总量变化情况(mg kg-1)
水稻秸秆 镉 铜 锰 锌
处理前 15.71±0.06 3.24±0.05 341.03±3.21 88.97±0.01
处理后 12.68±0.06 3.11±0.06 200.98±21.42 54.45±0.98
去除率(％) 19.30 4.03 41.06 38.80
表2棘孢木霉T-1处理前后水稻秸秆中重金属有效性含量变化情况(mg kg-1)
水稻秸秆 镉 铜 锰 锌
处理前 9.05±0.07 1.08±0.01 208.25±4.31 60.78±0.85
处理后 6.95±0.15 0.50±0.00 90.48±0.92 29.58±0.36
降低幅度(％) 23.17 53.95 56.55 51.34
从表1和表2可以看出，处理后即经过微生物发酵后秸秆残体中重金属的有效性含量相较于处理前即未经发酵秸秆中重金属的有效性含量显著降低，即采用本发明所述方法棘孢木霉T-1处理可以显著降低水稻秸秆中重金属镉、锰、锌的总量和生物有效性。
实施例5
采用BCR形态分级法测定分析棘孢木霉T-1处理前后水稻秸秆的重金属形态转化的变化，其中，棘孢木霉T-1处理前水稻秸秆样品为实施例1中原始水稻秸秆，棘孢木霉T-1处理后水稻秸秆样品为实施例1步骤(3)得到的干燥固体。BCR形态分级法的具体操作步骤具体如下：
第一步(弱酸提取态)：称取1.000g水稻秸秆样品于100mL离心管中，加入0.11mol/LCH3COOH提取液40mL，250r/min室温下振荡16h后，3500g离心20min，倾出上层清液于聚乙烯瓶中，保存于4℃冰箱中待测。加入20mL去离子水清洗残余物，振荡20min后在室温下离心，弃去上层溶液。
第二步(可还原态)：向第一步提取后的残余物中加入0.5mol/LNH2OHHCl提取液40mL，250r/min室温下振荡16h后，3500g离心20min，倾出上层清液于聚乙烯瓶中，保存于4℃冰箱中待测。加入20mL去离子水清洗残余物，振荡20min后在室温下离心，弃去上层溶液。
第三步(可氧化态)：向第二步提取后的残余物中缓慢加入10mLH2O2，盖上表面皿，室温下消解1h，期间间歇性的手摇，避免引起过于剧烈的反应。之后再放到85±2℃的水浴中进行消化1h，进行间歇性的手摇振荡半小时后，打开盖子继续加热至溶液减少3mL以下。再添加10mLH2O2，盖上盖子，重复上述步骤直至溶液减少到1mL左右。冷却后加入1mol/LNH4OAc提取液50mL，250r/min室温下振荡16h，尽可能减少添加浸提液和开始振荡的时间。浸提完之后，3500g离心20min，倾出上层清液于聚乙烯瓶中，保存于4℃冰箱中待测。加入20mL去离子水清洗残余物，振荡20min后在室温下离心，提取下层残渣。
第四步(残渣态)：冷冻干燥第三步提取的残渣，混匀样品后称取0.2000g的残渣到聚四氟乙烯管中，加入4mL浓HNO3，2mLHF及1mLH2O2,置于CEMMars6微波消解仪中，于210℃下消煮50min，然后置于排酸板中于140℃排酸至液体剩余至1mL左右，过滤并移至容量瓶中用去离子水定容，保存于4℃冰箱中待测。
采用电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)测定以上四个步骤中的待测液中重金属的含量。
经测定分析，棘孢木霉T-1处理前后水稻秸秆中重金属的BCR形态百分比含量变化情况如表3所示。
表3棘孢木霉T-1处理前后水稻秸秆中重金属形态百分比含量变化情况(％)
Figure BDA0003046984140000091
从表3中可以看出，原始水稻秸秆中重金属镉、铜、锰、锌等容易被植物或微生物吸收利用，产生毒性的可交换态百分比含量最高，说明其潜在环境释放风险较高。而经过本发明方法处理后，水稻秸秆中弱酸提取态百分比含量有所下降，使其转化为植物较难利用的可氧化态或残渣态，进而使秸秆中重金属的潜在释放风险降低，秸秆中重金属不容易释放到环境中，即同时减少了环境中重金属的含量。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种降低秸秆中重金属生物有效性的方法，其特征在于，利用棘孢木霉T-1对植物秸秆进行发酵；所述棘孢木霉T-1的接种量为105-107个孢子/mL发酵培养基；
所述秸秆发酵的培养基由植物秸秆和Mandel培养液组成；所述Mandel培养液由以下成分组成：NaNO32g/L、KH2PO41.5g/L、CaCl20.3g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、MnSO4·H2O 0.0016g/L、ZnSO4·H2O 0.0014g/L、CoCl20.0005g/L，pH＝5.5；所述植物秸秆与所述Mandel培养液的比例为0.5-1.5％(w/v)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述棘孢木霉T-1为棘孢木霉T-1的孢子悬液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物秸秆在发酵前烘干粉碎。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述烘干的温度为55℃-65℃。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述粉碎后植物秸秆的粒径为75μm-154μm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵方式为分批次深层液体发酵。
7.权利要求1-6任意一项所述的方法在降低重金属污染中的应用。
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