CN115504830B - 一种微生物发酵的生物腐植酸、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微生物发酵的生物腐植酸、制备方法及应用，涉及农业生物技术领域。本发明的腐植酸由包括以下重量份的原料制成：褐煤80‑90份，复合微生物菌剂1‑3份以及辅料10‑20份；所述复合微生物菌剂由短短芽孢菌株菌剂与争论贪噬菌株菌剂以活菌数比例1‑2：1‑2混合配制而成；其中，所述短短芽孢菌为保藏编号CGMCC No.21853的菌株，所述争论贪噬菌为保藏编号CGMCC No.21852的菌株。与目前市场上常用的碱提矿源腐植酸相比，本发明的腐植酸在钝化重金属、不同pH下溶解度，对土壤团粒结构形成及抗硬水稳定性方面的性能更好，同时该生物腐殖酸具有能促进植物生长的作用。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，尤其是涉及一种微生物发酵的生物腐植酸、制备方法及应用。
背景技术
腐植酸(humic acid，HA)自然界中广泛存在的大分子有机物质，又称胡敏酸，是动植物遗骸(主要是植物的遗骸)经过微生物的分解和转化，再经过一系列的物理化学反应而生成的具有胶体性质和多位空间结构的高分子化合物(张远琴等，2021)。腐植酸的结构和组成相当复杂，基本结构包含核、桥键和官能团，其中官能团主要有羧基、酚羟基、磺酸基等，多种官能团决定了腐植酸具有多种性能，如离子交换、吸附、催化等。腐植酸的分子量从几百到几百万，外观为黑色或棕色粉粒状，大多难溶于水，呈弱酸性。
HA是腐殖质的重要组成部分之一(董珊珊等，2017)，由于HA本身是土壤的重要组成部分，同时兼具独特的结构和功能，自上世纪中叶以来以HA作为原料的新型肥料产品研发和应用，受到了全世界的关注。在农业上，腐植酸主要用于促进作物生长、改良土壤环境、增强植物抗逆性、改善作物品质、腐植酸肥料和农药防治病虫等。Arancon等(2006)把腐植酸用于温室中的万寿菊、胡椒、草莓等作物的生长，发现腐植酸能明显促进作物的根系生长，并增加了作物的产量。马斌等(2016)的研究表明，连续多年施用褐煤腐植酸可改善土壤微生态环境，促进土壤碳、氮循环，提高土壤质量，很好地验证了腐植酸在土壤污染修复方面的优越性；张敬敏等(2010)研究表明腐植酸能有效改善土壤结构，增加土壤团聚体数量，提高土壤保水保肥能力。
腐植酸因其形成、来源方式、溶解度的不同，可以分为不同的类型。以腐植酸的形成方式分为天然腐植酸和人工腐植酸，前者包括土壤腐植酸、水体腐植酸、煤类腐植酸；后者包括生物发酵腐植酸、化学合成腐植酸和氧化再生腐植酸。按照提取原料的不同分为矿源腐植酸和生化腐植酸，矿源腐植酸是从褐煤、风化煤中直接提取出来，其组成结构单一；生化腐植酸是从农产品废弃物秸秆、稻草、废渣、糠鼓等进行降解而得到一些小分子化合物，除了芳香族轻基梭酸外还包含水溶性碳水化合物、核酸、氨基酸、蛋白质、糖酸类物质成分，组成较复杂。按腐植酸在溶剂中的溶解度不同分为黄腐酸(Fulvic acid)、棕腐酸(Hymotometanic acid)和黑腐酸(Humic acid)，其中黄腐酸是构成土壤腐殖质的核心成分，是土壤中好的腐植酸成分，是形成土壤团粒结构的核心物质。试验表明，黄腐酸能提高肥料中氮、磷、钾养分的利用率20％以上。
目前常见的生产提取腐植酸的方法主要有：酸提取法、碱提取法、化学氧化法、微生物溶解法。酸提取法应用鲜见报道，该方法主要用于提取可溶性黄腐酸以及对原料的脱灰预处理，主要原理是无机酸中的H+夺取腐植酸盐中金属离子(Ca2+、Mg2+、Al3+等)，破坏了其与酸性官能团的结合，再经过滤、洗涤、干燥即可达到提取黄腐酸生成腐植酸的目的。酸提取法的优势在于操作简单、生产效率高，但是存在纯度低、杂质含量高且难以洗净的弊端，且酸洗过程损失了大量的黄腐酸，对后续的应用带来较大影响。碱提取法(碱溶酸析法)是腐植酸提取的经典方法，也是目前市场上矿源腐植酸的常用提取方法，其原理是将样品溶解于碱溶液中，腐植酸的羧基(-COOH)、酚羟基(-OH)等酸性含氧功能团首先与碱类物质反应生成可溶性腐植酸盐，过滤，利用腐植酸不溶于酸性溶液的特性，向滤液中加酸调节pH<2，固液分离，所得沉淀即为所提取的腐植酸，从而达到提纯、分离腐植酸的目的。此方法较酸提取法而言所得产品中杂质含量减少，剔除了样品中的金属离子，但由于NaOH会与煤中的钙、镁等盐类反应生成Ca(OH)2和Mg(OH)2，增加了碱耗(煤中腐植酸产率测定方法，2001)，相应地增加了腐植酸提取的成本；而用Na4P2O7提取则会导致腐植酸的性质发生变化。化学氧化法是利用氧化剂对原料进行氧化处理。硝酸氧化法中硝酸是强氧化剂，虽然可以显著提高腐植酸的产率，但硝基腐植酸应用具有一定的局限性且此法有一定的危险性，容易产生NOx等污染物，后续处理酸污染问题难以解决，从而限制了硝酸氧化提取腐植酸技术的推广；H2O2氧化法提取腐植酸虽具有反应快、操作简单、价格低廉、效率高、被还原后产物无二次污染等优点，但H2O2化学性质不稳定，受热易分解导致利用效率不高，限制了其工业应用。微生物提取法是利用真菌、细菌等微生物的分解转化能力对样品进行降解，作用来源主要是微生物分泌的活性物质，这些活性物质可以将腐植酸大分子降解为小分子，提高腐植酸的活性，利于腐植酸的提取。
目前市场上常用的腐植酸产品为碱提矿源腐植酸，由于pH较高，施用时容易产生烧苗现象；市场上售卖的矿源腐植酸产品主要包括腐植酸钾、黄腐酸钾、腐植酸水溶肥、腐植酸尿素、腐植酸复合肥等，其主要采用的是煤炭腐植酸故又称矿源腐植酸，但矿源腐植酸不易提取且在实际应用上有一定限制，同时其产物浓度不高且腐植酸成分较单一，相对分子质量较大，难溶于水；其与微肥结合有较大的技术难度，二者容易生成水不溶物；矿源腐植酸有一个最大的指标就是是否抗硬水，因为很多地区灌溉用水含钙镁高，不抗硬水的腐植酸会沉淀，堵滴管。建设绿色无污染的腐植酸生产工艺和开发复配性较高的腐植酸产品逐渐成为近年来的研究热点。
生物腐植酸是指以生物质为原料，采用生物技术(主要指发酵法)制备的腐植酸类产品，其成分极其复杂，除富含黄腐酸等腐植酸成分外，还含有氨基酸、酶、有益微生物、维生素、微量元素等，具有促进植物生长，增强植物抗逆能力、改良土壤和提高产品品质的作用，生物腐植酸分子量小，功能团多，生物活性强，具有很好的农业应用效果。而我国煤腐植酸资源较为丰富，原生腐植酸含量可达10％～80％，具有较高生物活性，因其煤化程度低，稠环结构少，脂肪链状结构多，含有更多类木质素结构，结构更趋近于原始植物残体，使其易于被微生物降解。因此，可以通过微生物发酵转化褐煤生产腐植酸。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物发酵的生物腐植酸、制备方法及应用，本发明通过利用2种可高效降解褐煤的微生物菌株与褐煤和其他辅料进行复配、混合发酵制备得到一种新的生物腐殖酸产品。与传统的碱性矿源腐植酸相比，本发明的生物腐殖酸产品在对改善土壤疏松度、土壤团粒结构、抗硬水沉淀、重金属铬的钝化以及对植物的促生性方面具有很大的优势。
本发明提供的技术方案如下：
在一个方面，本发明提供了一种微生物发酵的生物腐植酸，其由包括以下重量份的原料制成：褐煤80-90份，复合微生物菌剂3份以及辅料10-20份；
所述复合微生物菌剂由短短芽孢菌株(Brevibacillus brevis)菌剂与争论贪噬菌株(Variovorax paradoxus)菌剂以活菌数比例1-2：1-2混合配制而成；
其中，所述短短芽孢菌为保藏编号CGMCC No.21853的菌株，所述争论贪噬菌为保藏编号CGMCC No.21852的菌株。
在一个实施方案中，所述辅料包括葡萄糖和豆粕；优选地，所述葡萄糖和酵母粉的质量比为5：1。
在一个实施方案中，所述辅料还可包括麦麸、玉米渣、水稻壳等一种或多种。
在本发明的优选方案中，所述辅料经过筛网筛选，筛选后与其他原料进行混合，混合均匀。可选地，本发明的生物腐植酸还可包括无机盐、微量元素中的任一种。
在一个实施方案中，将褐煤为风化褐煤；优选地，所述风化褐煤为粉碎成60-100目，优选80目的褐煤细粉。
在另一个方面，本发明提供了所述生物腐植酸的制备方法，所述方法包括将上述原料组分混合后进行发酵得到微生物发酵的生物腐植酸。
在一个实施方案中，所述发酵的条件为25-32℃发酵160小时以上。
在一个实施方案中，所述发酵采用的培养基为缺素R2A培养基；所述培养基的pH为6.5-7.5；所述缺素R2A培养基的组成为：酵母粉0.5g、蛋白脉0.5g、葡萄糖0.5g、磷酸氢二钾0.3g、丙酮酸钠0.3g、七水硫酸镁0.05g、水1L。
在一个实施方案中，所述方法还包括将微生物发酵得到的物料干燥至含水率小于等于30％以获得生物腐植酸产品。
在一个实施方案中，所述短短芽孢菌株(Brevibacillus brevis)菌剂与争论贪噬菌株(Variovorax paradoxus)菌剂为菌粉或菌体，由以下方法制备得到：分别将短短芽孢菌株与争论贪噬菌株菌株经过斜面培养、种子培养以及发酵培养(例如在R2A液体中)，获得发酵培养物；然后，将发酵培养物离心，收集沉淀，经喷雾干燥，得到各种微生物菌体或菌粉。
在另一个方面，本发明还提供了一种微生物发酵的腐植酸生物肥，所述腐植酸生物肥包括尿素和前述的生物腐植酸；
优选地，所述尿素与所述生物腐植酸的份数比为100：1-5份。
在一个实施方案中，所述微生物发酵的腐植酸生物肥还包括农业上使用的其他肥料组分，例如磷酸二铵、磷酸二氢钾和硝酸钾等中的一种或多种。
本发明针对所制备得到的生物腐植酸产品与传统的碱性矿源腐植酸在对改善土壤疏松度、土壤团粒结构、抗硬水沉淀、重金属铬的钝化、pH中性条件下的水溶性、和对玉米植物的促生性方面进行了对比研究。结果表明与目前市场上的矿源腐植酸相比，生物腐植酸产品的钝化重金属能力、在不同pH下溶解度，对土壤团粒结构形成及抗硬水稳定性更好，同时研究发现该生物腐植酸更优秀的具有能促进植物生长的作用。
在另一个方面，本发明提供了所述的生物腐植酸或所述的腐植酸生物肥在改善土壤结构或土壤修复中的应用。本发明产品可用于增加土壤团聚体含量、抑制水土流失、提高土壤肥力。
在另一个方面，本发明提供了所述的生物腐植酸或所述的腐植酸生物肥在钝化金属中的应用。
在另一个方面，本发明提供了所述的生物腐植酸或所述的腐植酸生物肥在植物防病促生长中的应用。
本发明涉及的生物信息的保藏说明：
本发明涉及的2个菌株属于已经在保藏机构保藏并且在向我国提交的专利申请的申请日前已在专利公报中公布或已授权的生物材料。具体信息如下：短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)SZ-2，该菌株已于2021年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.21853；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。经保藏中心于2021年3月1日检测为存活菌株。争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)XJ-4，该菌株已于2022年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCC No.21852；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。经保藏中心于2021年3月1日检测为存活菌株。
有益效果：
本发明提供了一种全新的生物腐植酸，其利用2种微生物菌株构成的复合菌剂对褐煤进行混合发酵，制备得到了一种富含多重生物刺激素技术(简称MBT)的腐植酸产品，该产品在pH＝7.0和pH＝5.0时溶解性好，无明显颗粒，可有效避免了矿源腐植酸在农业应用上的局限性，可以更好地与肥料进行复配；并且具有较好的硬水稳定性，更利于植物吸收。此外，该生物腐植酸具有良好的钝化重金属能力和改善土壤结构和性能的能力，可用于增加土壤团聚体含量、抑制水土流失、提高土壤肥力。进一步地，该产品对植物的生长发育也有较好的促进效果。本发明的生物腐植酸产品在各个方面的效果显著优于现有技术中的矿源腐殖酸。
本发明的制备方法简单、高效，并且从褐煤中回收腐植酸的效率高，与化学方法相比，不产生污染物、更加绿色环保。本发明提高了褐煤资源的利用率，实现了对褐煤高效的可持续利用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的微生物发酵腐植酸产品与矿源腐植酸在不同pH下的溶解性；
图2为本发明提供的显微镜下(10X)矿源腐植酸与微生物发酵腐植酸在pH 7.0的溶解情况(a：矿源腐植酸；b：发酵腐植酸)；
图3为本发明提供的微生物发酵腐植酸产品与矿源腐植酸在硬水中的稳定性；
图4为本发明提供的不同腐植酸在不同浓度下对玉米生长的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
微生物发酵的生物腐植酸的制备：
(1)取以下重量份的原料：风化褐煤85份，复合微生物菌剂3份以及辅料12份；所述辅料包括葡萄糖和酵母粉，质量比为5：1。
所述复合微生物菌剂由短短芽孢菌株(Brevibacillus brevis)菌剂与争论贪噬菌株(Variovorax paradoxus)菌剂以活菌数比例1:1混合配制而成；
所述短短芽孢菌为保藏编号CGMCC No.21853的菌株，所述争论贪噬菌为保藏编号CGMCC No.21852的菌株，二者均已经在保藏单位进行了保藏。
(2)将风化褐煤粉碎成80目的褐煤细粉；将所述辅料经过筛网筛选，与复合微生物菌剂进行混合均匀。
(3)将步骤(2)获得的混合物在发酵培养基中于26℃发酵168小时；发酵采用的培养基为缺素R2A培养基；所述培养基的pH为6.5-7.5；所述缺素R2A培养基的组成为：酵母粉0.5g、蛋白脉0.5g、葡萄糖0.5g、磷酸氢二钾0.3g、丙酮酸钠0.3g、七水硫酸镁0.05g、水1L。
(4)将发酵得到的物料干燥至含水率30％获得微生物发酵腐植酸产品。
实施例2
与实施例1基本相同，不同之处在于，原料：风化褐煤80份，复合微生物菌剂1份以及辅料19份；所述辅料包括葡萄糖和酵母粉，质量比为5：1。所述复合微生物菌剂由短短芽孢菌株(Brevibacillus brevis)菌剂与争论贪噬菌株(Variovorax paradoxus)菌剂以活菌数比例1:2混合配制而成。
实施例3
与实施例1基本相同，不同之处在于，原料：风化褐煤80份，复合微生物菌剂2份以及辅料18份；所述辅料包括葡萄糖和酵母粉，质量比为5：1。所述复合微生物菌剂由短短芽孢菌株(Brevibacillus brevis)菌剂与争论贪噬菌株(Variovorax paradoxus)菌剂以活菌数比例2:1混合配制而成。
实施例4
将尿素与实施例1制备得到的微生物发酵腐植酸产品按照95份：5份的质量比混合制得微生物发酵的腐植酸生物肥。
效果例：本发明微生物发酵的生物腐植酸的性能
以实施例1的微生物发酵产品为例，研究本发明产品的性能。本发明的实施例2-3以及在本发明设置范围内的其他实施例均能够实现与实施例1类似的性能与效果，在本发明中以实施例1为代表进行举例说明。
1.微生物发酵的生物腐植酸产品(MBT)在不同条件下溶解性
腐植酸要求能抗一定的酸性，pH小于4一般会絮凝沉淀，在pH大于4的情况下不絮凝，原液体系即便是偏酸的环境也能保持稳定，用弱酸性水稀释液也不会沉淀。所以生产含腐植酸水溶肥料水剂产品，一定要调节好水剂产品的pH，既利于腐植酸的溶解，对土壤酸碱环境也有所改善，更加利于农作物生长。
1.1利用不同方法测定微生物发酵的生物腐植酸产品(MBT)溶解性
将矿源腐植酸(市场上常用的腐殖酸产品，pH＝12)与微生物发酵的生物腐植酸产品(MBT)进行腐植酸含量测定，用水稀释到相同浓度，将腐殖酸调至pH＝5，观察二者溶解情况。
将矿源腐植酸与微生物发酵的生物腐植酸产品(MBT)进行含量测定，吸取等量矿源腐植酸与微生物发酵的生物腐植酸产品(MBT)于离心管中，用金属浴将液体蒸干，然后将二者稀释到液体浓度为10％，在pH 7.0条件下，显微镜下观察两种腐植酸溶液的溶解情况。
1.2不同方法测定腐植酸溶解性的结果
图1为微生物发酵的腐植酸(MBT)和矿源腐植酸在不同PH的溶解性，图2为显微镜下(10X)矿源腐植酸与微生物发酵腐植酸在pH 7.0的溶解情况。
由图1可以直观的看到，在pH 5.0时微生物发酵腐植酸MBT溶液均匀、无明显颗粒，矿源腐植酸出现大量明显的颗粒，表明微生物发酵的腐植酸(MBT)可在碱性和弱酸性条件下均保持稳定，可适用的复杂土壤环境更广；由图2可以看出，在蒸干液体后稀释到同一浓度后，pH＝7.0的条件下，显微镜下微生物发酵的腐植酸(MBT)溶液均匀、无明显颗粒，矿源腐植酸出现大量明显的颗粒。由此可以表明，微生物发酵的腐植酸(MBT)的溶解度在pH＝7.0和pH 5.0时明显优于矿源腐植酸，可有效避免了矿源腐植酸在农业应用上的局限性，可以更好的与肥料进行复配，不会因pH过高对植物造成影响，在pH中性时，也不会因溶解度过低，影响使用效果。
2.微生物发酵的生物腐植酸产品(MBT)的抗硬水性能(稳定性)实验
腐植酸需要有一定的抗硬水能力，抗硬水能力也代表了腐植酸的抗盐能力，特別是对二价金属离子的抗絮凝能力，抗硬水能力能力强才能和其他营养元素和平共处，不会分层而沉淀，因此在生产含腐植酸水溶肥料水剂产品时，水质不能过硬。
2.1微生物发酵的生物腐植酸产品(MBT)的抗硬水性能(稳定性)实验
将微生物发酵的生物腐植酸(MBT)和矿源腐植酸用标准硬水进行配置，配制成含量相同的溶液，摇匀静置10分钟，观察其抗硬水性能，即在硬水中稳定性。
2.2微生物发酵的生物腐植酸产品(MBT)的抗硬水性能(稳定性)实验结果
图3为微生物发酵的生物腐植酸(MBT)和矿源腐植酸在硬水中的稳定性，由图3可以看出，微生物发酵的生物腐植酸(MBT)和矿源腐植酸用标准硬水进行等量含量配置，静置10min后，矿源腐植酸溶液底部出现大量絮凝物，且絮凝物的量明显多于微生物发酵的生物腐植酸(MBT)，表明微生物发酵的生物腐植酸(MBT)的硬水稳定性能优于矿源腐植酸，硬水稳定性能越好表明该物质更利于植物吸收，在同等条件下可减少微生物发酵的生物腐植酸(MBT)的用量，节约农民经济成本。
3.微生物发酵的生物腐植酸产品(MBT)钝化重金属能力测定
将微生物发酵的生物腐植酸(MBT)和矿源腐植酸分别配置成100ppm、200ppm、500ppm的液体置于6个250mL锥形瓶中，加入200ppm cd(镉)溶液，置于30℃，200r/min的摇床中进行反应，一周后用原子吸收法测定cd的含量，设置200ppm cd溶液为空白对照。
下降率％＝[处理组原子吸收结果-空白组(CK)原子吸收结果]/空白组(CK)原子吸收结果*100％；
注：下降率值越大，其钝化重金属能力越强。
3.1MBT钝化重金属能力测定结果
表1.MBT钝化重金属能力测定结果
由表1可以看到，100ppm、200ppm、500ppm微生物发酵腐植酸(MBT)与200ppm cd溶液混合经原子吸收测定后其下降率结果分别为14.19％、23.67％、58.44％；100ppm、200ppm、500ppm矿源腐植酸与200ppm cd溶液混合经原子吸收测定后其下降率结果分别为6.62％、14.24％、44.93％。100ppm MBT腐植酸其钝化重金属的能力与200ppm矿源腐植酸差异不大，微生物发酵腐植酸(MBT)钝化重金属能力可达58.44％，表明不同浓度的微生物发酵腐植酸(MBT)钝化重金属能力均高于对应浓度的矿源腐植酸，微生物发酵腐植酸(MBT)具有良好的钝化重金属能力。
4.微生物发酵的生物腐植酸产品(MBT)对土壤物理性能的影响
4.1MBT腐殖酸对土壤疏松度的影响
称量5份30g土放置在100mL量筒中，分别加入土壤体积0.3％的相同浓度微生物发酵腐植酸(MBT)和矿源腐殖酸，混匀后观察此时土在量筒中的体积为V1，加水50mL并摇匀，用水冲洗量筒边缘并补水至100mL处，保鲜膜封口后静置，使土样慢慢沉降，30天后分别记录土样在量筒中的体积V2，设置只加入水的等重土样(CK)。松土效果以V2和V1比值的大小衡量，比值越大松土效果越好。
4.2MBT腐殖酸对土壤团粒结构的影响
称量5份50g复垦土壤(取自鄂尔多斯市)分别加入适量等体积的相同浓度微生物发酵腐植酸(MBT)、矿源腐殖酸和水混合均匀，其中微生物发酵腐植酸(MBT)、矿源腐殖酸设置两个重复，设置加水土壤为空白对照组，土壤室温静置培养30d，自然风干后将样品放置于孔径自上而下分别为2、1、0.5、0.25mm的各级筛上，先用水缓慢湿润5min后，再放入圆柱筒的水中进行筛分。湿筛完成后将各筛层上的土样转移进已称重的烧杯中，圆柱筒中水土悬浊液过0.106mm筛，将筛上土样淋洗进烧杯，105℃烘干12h称重，计算各级团聚体数量。从而获得＞2mm、1-2mm、0.5-1mm、0.25-0.5mm和<0.25mm五个级別的土壤团聚体。
各级团聚体％＝各级团聚体的烘干重(g)/土样的烘干重(g)。
4.3微生物发酵的生物腐植酸产品(MBT)对土壤物理性能影响的实验结果
4.3.1MBT腐殖酸对土壤疏松度的影响结果
表2.不同腐殖酸处理对土壤的疏松效果
从表中数据可以看出，空白土样(CK)的土壤高度并无明显变化，但混有腐殖酸的土壤的高度明显有所变化，这是因为腐植酸本身为有机质，具有吸水、改良土壤的作用；相比CK，MBT-1、MBT-2、矿源-1和矿源-2的松土效果明显较好，其中MBT-1和MBT-2的松土效果最好，因为MBT是利用微生物和褐煤混合后进行发酵所得到生物腐殖酸，MBT中含有微生物，而微生物本身为土壤调理剂，且由于MBT的pH值不高，不会抑制微生物或者土壤中本来就存在的微生物的生命活动，甚至可使微生物在土壤中的活动加强，微生物通过自身的代谢作用可改变土壤状况从而达到松土的效果，加上MBT本质为腐殖酸具有吸水溶胀的特性，与微生物的综合作用后使其松土效果更为明显，矿源腐殖酸由于pH值较高不利于微生物生长故其松土效果不如MBT。
4.3.2MBT腐殖酸对土壤团粒结构的影响结果
表3.不同腐殖酸处理对对土壤团粒结构的影响结果
注：P1-P5分别表示了五个立级的团聚体：>2mm、1-2mm、0.5-1mm、0.25-0.5mm和<0.25mm，下同。
由表3可见，添加了不同腐殖酸的复垦土壤的土壤粒径分布在P1(>2mm)范围中明显高于空白对照，说明腐殖酸增加土壤团聚体有一定作用，但不同腐殖酸对增加土壤团聚体的作用有一定差别：在微生物发酵腐殖酸处理的复垦土壤中有87.21％、88.62％的土壤颗粒粒径大于0.25mm，矿源腐殖酸处理的复垦土壤中大于0.25mm粒径的土壤颗粒含量85.72％、86.35％，微生物发酵腐殖酸处理中大于0.25mm粒径的土壤颗粒含量均高于矿源腐殖酸处理的复垦土壤，由于粒径大于0.25mm的土壤颗粒称为大团聚体，其对于抑制水土流失、提高土壤肥力、防止土壤盐碱化过程具有重要意义，因此微生物发酵腐殖酸在增加土壤团聚体含量、抑制水土流失、提高土壤肥力等方面的作用要强于矿源腐殖酸。
5.植物促生对比试验
(1)取大小均匀、颗粒饱满的玉米种子播种于装有蛭石的盆栽中，每盆栽种6粒(同一深度)；
(2)设置500ppm、250ppm、100ppm和50ppm四个不同浓度的微生物发酵腐植酸(F)腐植酸和矿源腐植酸(K)处理的对比试验，和水处理的空白对照(CK)，共计9个不同处理；
(3)在实验过程中，按照玉米生长要求，适时、适量的浇灌等量的不同浓度的两种腐植酸液体或水；
(4)玉米生长21天后，将不同组别的玉米茎叶部和根部剪下，放入已烘干的培养皿，置于烘箱进行烘干(105℃杀青，85℃烘干至恒重)，记录不同组别玉米植株干重，比较实验结果。
5.1植物促生测定结果
玉米生长21天后，拍照记录不同组别玉米植株间的区别，对不同组别玉米进行对玉米茎叶部和根部进行烘干处理，结果如图4和表4。
表4.不同腐植酸在不同浓度下对玉米茎叶干重的影响
从图4可以看出，浇灌50ppm、100ppm浓度的矿源腐殖酸的玉米与浇灌水的玉米长势相似，在浇灌250ppm、500ppm浓度的矿源腐殖酸的玉米长势会比CK好，但长势不及浇灌250ppm、500ppm浓度微生物发酵腐植酸MBT的玉米；在浇灌不同浓度的微生物发酵腐植酸MBT的玉米与单纯浇水及浇灌的矿源腐植酸玉米长势更好，叶面更加翠绿。
从表4可见：①用不同浓度的腐殖酸发酵液浇灌的玉米烘干后干重比单纯浇水的玉米干重高；②浇灌不同浓度的微生物发酵腐植酸MBT的玉米烘干后干重均明显高于浇灌对应浓度的矿源腐植酸玉米，且浇灌500ppm的矿源腐植酸玉米干重成下降趋势，表明500ppm的矿源腐植酸对玉米的生长可能存在抑制作用。
综上可得，不管是玉米植株长势、叶面翠绿度还是植株干重，浇灌微生物发酵腐植酸MBT的玉米生长情况都要更好，表明微生物发酵腐植酸MBT对植物的生长具有较强促进的作用。
结论：本发明通过利用筛选到的两株可高效降解褐煤的短短芽孢菌株(Brevibacillusbrevis，保藏编号为：CGMCC No.21853)及争论贪噬菌(Variovorax paradoxus，保藏编号为：CGMCC No.21852)的复合菌剂与褐煤进行混合发酵，得到了一种工艺简单便捷、腐植酸回收率高的生物腐植酸产品(MBT)，通过研究发现该生物腐植酸产品(MBT)对改善土壤疏松度及土壤团粒结构具有一定作用，与目前市场上的矿源腐殖酸相比，其钝化重金属能力、在不同pH下溶解度及抗硬水稳定性更好，同时研究发现该生物腐殖酸(MBT)还具有能促进植物生长的作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (11)
1.一种微生物发酵的生物腐植酸，其特征在于，所述生物腐植酸由以下重量份的原料制成：褐煤80-90份，复合微生物菌剂1-3份以及辅料10-20份；
所述复合微生物菌剂由短短芽孢菌株（Brevibacillus brevis）菌剂与争论贪噬菌株（Variovorax paradoxus）菌剂以活菌数比例1-2：1-2混合配制而成；其中，所述短短芽孢菌为保藏编号CGMCC No.21853的菌株，所述争论贪噬菌为保藏编号CGMCC No.21852的菌株；
所述辅料由葡萄糖和酵母粉组成；所述葡萄糖和酵母粉的质量比为5：1。
2.根据权利要求1所述的生物腐植酸，其特征在于，所述褐煤为风化褐煤。
3.根据权利要求2所述的生物腐植酸，其特征在于，所述风化褐煤为粉碎成60-100目。
4.根据权利要求2所述的生物腐植酸，其特征在于，所述风化褐煤为80目的褐煤细粉。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的生物腐植酸的制备方法，其特征在于，包括将所述原料组分混合后进行发酵得到微生物发酵的生物腐植酸。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的条件为25-32℃发酵160小时以上。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵采用的培养基为缺素R2A培养基；所述培养基的pH为6.5-7.5；所述缺素R2A培养基的组成为：酵母粉0.5 g、蛋白脉0.5g、葡萄糖0.5 g、磷酸氢二钾0.3 g、丙酮酸钠0.3 g、七水硫酸镁0.05 g、水1L。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括将微生物发酵得到的物料干燥至含水率30%以下，获得生物腐植酸产品。
9.一种微生物发酵的腐植酸生物肥，其特征在于，所述腐植酸生物肥包括尿素和权利要求1-4中任一项所述的生物腐植酸；
所述尿素与所述生物腐植酸的质量比为100份：1-5份。
10.权利要求1-4中任一项所述的生物腐植酸或权利要求9所述的腐植酸生物肥在改善土壤结构或土壤修复中的应用。
11.权利要求1-4中任一项所述的生物腐植酸或权利要求9所述的腐植酸生物肥在钝化金属中的应用。
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