CN114891648B - 宛氏拟青霉、其组合物及应用 - Google Patents

宛氏拟青霉、其组合物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于白酒酿造的宛氏拟青霉菌，菌剂及其组合物在发酵白酒中的应用。本发明提供的宛氏拟青霉菌具有高产糖化酶和高产α‑淀粉酶活力的能力，产四甲基吡嗪和2‑甲基丁酸乙酯等白酒风味物质含量高，同时又具有耐高温能力强等特性。该菌株可用于发酵生产白酒，提高白酒出酒率、总酸、总酯和四甲基吡嗪等含量，提高白酒的口感和风味。

Description

宛氏拟青霉、其组合物及应用
技术领域
本发明属于白酒酿造领域，具体地说涉及一种宛氏拟青霉菌，以及该宛氏拟青霉菌在白酒生产中的应用。
背景技术
白酒发酵过程中复杂的微生物种群是决定白酒风味特征的重要因素(任聪，等.微生物学报,2017,57(6):885-898)。霉菌能够分泌多种酶类分解原料，为微生物提供发酵代谢底物，同时可生成各种代谢产物，对白酒风味形成有重要贡献(WU Q,等.InternationalJournal of Food Microbiology,2015,200:39-46)。白酒生产中主要的功能霉菌包括毛霉、曲霉等。在酱香型白酒的酿造过程制曲、堆积发酵和窖池发酵中，宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)是优势霉菌之一(沈怡方.白酒生产技术全书[M].北京：中国轻工业出版社，1998；陈笔.江南大学硕士论文,2014,13-16)。
研究表明宛氏拟青霉具有高糖化酶活力，能够降解原料中的淀粉(CHEN B,等.International Journal of Food Microbiology,2014,179(6):80-84)。班世栋(贵州大学硕士论文，2015)从酱香型大曲中分离到1株宛氏拟青霉，接种在麸皮固体培养基中发酵测定的糖化酶活性小于700u/g,纤维素霉活小于8.5u/g。龙凯等(中草药，2019，50(15):3637-3641)报道了半夏曲中占优势的宛氏拟青霉具有产淀粉酶和蛋白酶的能力。P.variotii还能够产生菊粉酶、糖化酶等多种酶类，高兆建等(食品科学，2019,40(8)：94-101)从宛氏拟青霉XS27发酵液中分离纯化菊粉酶，并对其酶学特性进行研究。从宛氏拟青霉XS27发酵液中分离纯化的菊粉酶在强酸高热的环境下具有强活性和稳定性，对表面活性剂乙醇有高耐受性，适合于果葡糖浆的工业化生产。
宛氏拟青霉在制曲工艺、堆积工艺以及兼性条件下分别进行纯种固态发酵，能代谢生成酸、醇、醛、酮、酯及芳香族化合物等多种物质，发酵产生多种风味物质和风味前体物质，是酱香型白酒中众多呈香呈味物质中的组成部分(杨帆,等.酿酒科技,2011,7:41-46)。其中，四甲基吡嗪具有烘烤香气、甜香，2-甲基丁酸乙酯具有水果香气，它们均是中国白酒中的重要香气化合物之一(张颖等，食品工业科技，2021，网络版；马宇等，食品科学，2019，40(20)：241-248；范来文等，食品科学，2013，34(4)：135-139)。酸是白酒发酵过程的产物，是赋予酒体愉快香气的重要成分，同时也是生成对应酯类的前驱物质(汤道文,等.酿酒科技,2006,140(2):97-98)。有研究表明，理化指标中总酸与白酒香气强度、香气协调性呈正相关，相关性最强。即通常情况下，总酸和总酯越高，香气越好，滋味与典型性亦越好，白酒的总体质量越好(张健，等，食品科学，2010，31(10))。大曲的质量与白酒的出酒率和白酒的品质直接相关。通过提高大曲的淀粉酶和糖化酶等活性以及大曲风味物质含量，可以显著提高大曲的出酒率和原酒的品质。
中国专利(CN202010448141.5)公布了一种包含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、宛氏拟青霉菌、米曲霉和宛氏拟青霉的复合微生物菌剂及其在生产酱香型白酒中的应用。中国专利(CN201911039157.4)公布了涉及宛氏拟青霉FN89可以在极低pH环境下有效降解木质纤维素生物质预处理所产生的糠醛等抑制物的菌株及应用。中国专利(CN202010307768.9)公布了一种利用酱香型白酒酒糟发酵有机肥的生产工艺。中国专利(CN201710429248.3)公布了一种宛氏拟青霉粉剂及其制备方法和应用。中国专利(CN201010253652.8)公布了一种宛氏拟青霉菌株及其在在降解甲醛方面的应用。中国专利(CN201410130198.5)公布了一种宛氏拟青霉菌株及其在加快纤维素的降解、促进酒渣堆肥腐熟方面的应用。
目前已有宛氏拟青霉菌在白酒上应用的报道，但是，目前的宛氏拟青霉菌缺乏兼具产糖化酶和α-淀粉酶活性高、产四甲基吡嗪等白酒酱香风味物质能力强、耐受性好的宛氏拟青霉菌，无法解决传统高温大曲生产中经常出现的液化酶和糖化酶活性偏低、酱香味不浓等问题。
再者，单一的宛氏拟青霉菌在发酵时，糖化力和四甲基吡嗪等风味物质含量还稍低。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株宛氏拟青霉菌菌株，该菌株兼具产糖化酶活性和α-淀粉酶活性高，产四甲基吡嗪等白酒风味能力好、具有较强耐高温能力、可用于高温制曲和发酵生产白酒。
本发明的另一个目的是提供含有宛氏拟青霉菌的菌剂。
本发明的另一个目的是提供宛氏拟青霉菌发酵白酒的方法。
本发明的再一个目的是提供制备宛氏拟青霉菌固体菌剂的方法。
本发明的再一个目的是提供一种宛氏拟青霉菌及菌剂在制备强化大曲和发酵白酒中的应用。
本发明公开了一株新的宛氏拟青霉菌，其特征在于,该菌株为宛氏拟青霉P3株(Paecilomyces variotii P3)，保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2022798。保藏日期是2022年6月6日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctcc@whu.edu.cn。
宛氏拟青霉菌P3菌株是从湖北省某白酒工厂发酵基质中经分离筛选获得。该菌株有如下特征：宛氏拟青霉菌P3在小麦粉固体发酵培养基中产糖化酶活性达4156.1U/g，α-淀粉酶活性达1025.9U/g。该菌株对高温具有较强的耐受性。该菌株在小麦粉固体发酵培养基中产四甲基吡嗪的含量达27.32mg/kg，添加该菌株酿造的白酒原酒烤香突出，香味谐调，口感好。
宛氏拟青霉菌P3株形态特征是：菌落表面呈粉末状，初生菌落颜色为黄色，后期后为棕色，菌落直径1-3cm，产分生孢子，分生孢子梗和小梗呈扫帚状分支。
宛氏拟青霉菌P3株生长特征是：土豆培养基平板上划线接种，分别在37℃-50℃下培养均生长良好。
宛氏拟青霉菌P3株真菌的ITS rDNA序列分析显示：宛氏拟青霉菌P3株与Paecilomyces variotii CICC 41447菌株的同源性大于99％。
本发明还公开了一种含宛氏拟青霉菌P3的菌剂，该菌剂主要成份是宛氏拟青霉菌P3株及其胞外产物和发酵基质。
本发明还公开了宛氏拟青霉菌P3及其微生物菌剂在高温大曲和发酵白酒中的应用。
在本发明中采用的参比菌株宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)CICC 41447登载于中国工业微生物菌种保藏管理中心目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。枯草芽孢杆菌CCTCC M2017466为一株专利菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，专利名称为枯草芽孢杆菌及其在酱香风味白酒中的应用，专利申请号CN201710852757.7。研究者可依法从保藏中心获取。
本发明公开的菌剂为固态或液态。优先的，本发明公开的P3芽孢杆菌菌剂为固态。
本发明还公开了制备固态菌剂的方法，包括如下步骤：
(1)P3菌种活化：用接种环挑取一环P3菌种接种于土豆斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养20-24h。
(2)种子液的制备：挑取一环经活化的P3菌株接入装有80mL土豆三角瓶液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养24h备用。
(3)固体发酵培养基制备：按小麦粉50％，玉米粉20％，米糠20％，豆粕10％，料：水＝1:0.8，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料盒中，121℃灭菌30min后冷却待用。
(4)固体菌剂培养：按3-5％接种量接入预先培养好的P3种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置37℃恒温培养箱中培养3天，每12h搅拌一次。
(5)干燥及粉碎：将上述发酵完毕的P3固体培养物置于50℃烘箱中烘至含水率12％-15％，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置干燥、阴凉处或冰箱保鲜层中保藏。取样采用稀释平板测数法检测样品中P3菌种的活菌数达1-5亿cfu/克。
(6)包装：将枯草芽孢杆菌CCTCC M2017466与P3按活菌数比＝10:1比例混合后装塑料袋封口制成P3酿酒菌剂组合物。
本发明的优点：
1、本发明提供的宛氏拟青霉P3株是一株新的菌株，该菌株具有较强的耐高温生长能力。该菌株在50℃下仍能生长良好，与37℃培养温度相比，其相对生长量达到65.8％，比标准菌株CICC 41447高13.0％。
2、宛氏拟青霉P3株产糖化酶和α-淀粉酶活性高。P3菌株固态发酵产糖化酶活力达4156.1U/g，是标准菌株CICC 41447的1.62倍。P3株产的α-淀粉酶活性达1025.9U/g，是标准菌株CICC 41447的1.59倍。
3、宛氏拟青霉P3株产四甲基吡嗪和2-甲基丁酸乙酯含量高，在小麦粉固体发酵培养基中产四甲基吡嗪的含量达27.32mg/kg，比标准菌株CICC 41447提高16.7％；产2-甲基丁酸乙酯含量达4.88mg/kg，比标准菌株CICC 41447提高28.1％。宛氏拟青霉制备的强化曲产乙酸能力强，达428.17mg/kg，比标准菌株高18.6％。
4、接种宛氏拟青霉菌P3株及其组合物制备的高温强化大曲糖化力和四甲基吡嗪等风味物质含量显著提升。
5、接种宛氏拟青霉P3组合物的强化大曲发酵的白酒出酒率和四甲基吡嗪、2-甲基丁酸乙酯含量高，感官评价好，其出酒率、四甲基吡嗪和2-甲基丁酸乙酯含量分别比接种标准菌株组的白酒提高7.1％、18.5％和26.9％。
即宛氏拟青霉菌P3株与标准菌株CICC 41447相比具有较高的耐高温能力以及产糖化酶活性高、产白酒风味成分四甲基吡嗪、2-甲基丁酸乙酯和产乙酸等有机酸能力强、发酵白酒白酒出酒率高、风味好，具有提高白酒的品质等特点。
附图说明
图1是宛氏拟青霉菌P3菌株的系统发育树图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例
实施例1宛氏拟青霉耐受性好、产糖化酶活力和淀粉酶活力高的P3菌株的分离、鉴定
1.1宛氏拟青霉菌P3菌株的分离:从湖北省某白酒厂采集大曲和酒醅样品，称取样品10g，加至装有90mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀后、稀释后，取10-2、10-3、10-4、10-5三个稀释梯度涂布到马丁-孟加拉红平板上，每个稀释梯度做3个重复，置50℃恒温培养箱中培养60h后，观察菌落生长情况。用灭菌的牙签挑取长有淡黄色孢子的单菌落30株，分别点种到玉米淀粉蛋白胨平板上，50℃培养培养40h后观察测定菌落周围透明圈的大小,选取透明圈较大的12个菌株(表1)进行划线分离纯化后用于进一步培养和测定酶活。
选取如表1所示的透明圈较大的12个菌株，先接种到土豆培养基(PDA)平板上进行菌种扩大培养后，再分别接种于三角瓶小麦粉固态发酵培养基中，置40℃恒温培养箱中好氧发酵72h，发酵完成后将菌剂置于烘箱中，50℃烘干至水分12％-15％之间保存，用于酶活性测定。α-淀粉酶活性(40℃，pH＝5.6的条件下，10分钟内将1g淀粉-碘液吸光度降低10％的酶量为一个酶活力单位U)和糖化酶活性(55℃，pH＝6.0的条件下，每小时水解可溶性淀粉产生1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位U)的测定方法参照《现代白酒酿造微生物学》(p425-p427)。12株真菌的淀粉酶和糖化酶活性测定结果如表2所示。
采用此方法经筛选后获得1株在小麦粉固体发酵培养基中能产生较高淀粉酶和糖化酶活性的耐高温霉菌，菌株编号为P3,其在小麦粉发酵培养基中的α-淀粉酶和糖化酶活性分别达1025.9U/g和4156.1U/g(表2)。
表1宛氏拟青霉在玉米淀粉蛋白胨平板上的透明圈值
表2不同宛氏拟青霉菌株产α-淀粉酶、糖化酶活性测定结果
本发明人将分离的一株新的宛氏拟青霉菌P3株(Paecilomyces variotii P3)保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2022798，保藏日期是2022年6月6日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctcc@whu.edu.cn。
1.2宛氏拟青霉菌P3株的鉴定：通过形态特征观察、真菌ITS rDNA基因序列分析结果对P3进行鉴定。在鉴定中，本实验选择宛氏拟青霉Paecilomyces variotii CICC 414471菌株作为对照菌株。宛氏拟青霉为常用普通微生物菌种，登载于中国工业菌种保藏中心目录中，处于公开状态，科学工作者可向保藏中心索取。
1.2.1宛氏拟青霉菌P3株形态特征是：菌落表面呈粉末状，初生菌落颜色为黄色，后期后为棕色，菌落直径1-3cm，产分生孢子，分生孢子梗和小梗呈扫帚状分支。
1.2.2通过真菌ITS rDNA序列分析进行系统发育地位鉴定：
挑取分离获得的真菌单菌落接种于PDA液体培养基中，37℃、170rpm摇床培养24h。收集菌体，按照真菌DNA抽屉试剂盒步骤提取DNA，完成后置于-20℃冰箱中保存备用。
PCR扩增ITS rDNA，采用真菌ITS rDNA的通用引物，上游引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)，下游引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，PCR扩增真菌的ITS rDNA序列。PCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火70s，72℃延伸90s，循环次数为30次；最后72℃延伸10min。
PCR产物的检测：吸取5μL PCR产物，利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。选择600bp左右的ITSrDNA PCR产物送至GENEWIZ(苏州)测序公司测序。测序长度600bp左右，测序结果采DNAStar软件进行人工校对。校正以后的序列在NCBI(national center forbiotechnology information)的核酸序列数据库中进行同源序列搜索，比较测试菌株和已知真菌菌株之间的亲缘关系及其系统地位，用MEGA软件采取邻接法构建系统发育树。
在Genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，P3与Paecilomyces variotiiCICC 41447的同源性超过99％，符合Kuttzman&Robnett所定的同种内不同菌株见差异不超过1％的标准。图1是根据ITS rDNA序列所做的系统发育树。
根据ITS rDNA序列比对结果，并结合真菌的菌落形态和显微镜下观察菌丝、产孢结构等细胞形态，参照《真菌鉴定手册》、《常见与常用真菌》等文献，可鉴定P3菌株为宛氏拟青霉。
实施例2宛氏拟青霉P3抗性能力比较分析
2.1宛氏拟青霉P3耐酸生长能力测定
使用硫酸分别调节土豆液体培养基pH至4.0、4.5、5.0、6.0。将菌株P3和标准菌株CICC 41447的种子液分别转接到不同pH的土豆液体培养基中，置于37℃、170rpm摇瓶培养24h，各取50mL菌液，5000rpm离心15分钟后弃上清，收集菌体置于105℃烘箱中烘干至恒重后进行称重，测定不同pH培养时的生物量。从表6可以看出，2株宛氏拟青霉菌在pH4.0的土豆培养基中均有一定生长，但P3菌株在pH4.0下的生物量明显高于标准菌株CICC 41447，表明P3株耐酸生长能力明显高于CICC 41447菌株。
表3宛氏拟青霉菌P3与标准菌株CICC 41447耐酸生长能力比较干重(g/L)
2.2宛氏拟青霉P3耐高温生长能力测定
将培养的两种宛氏拟青霉菌种子液按相同比例分别接种至PDA液体培养基中，分别在37℃、45℃和50℃下180rpm摇床培养24h，各取50mL菌液离心后收集菌体，烘干后测定各样品的生物量。检测结果见表7，结果表明P3菌株具有很强的耐高温性，与37℃培养的生长量相比，45℃和50℃下的相对生长量分别达85.0％和65.8％，其耐高温能力比标准菌株CICC 41447好。
表4 P3与标准菌株CICC 41447的耐高温生长能力测定结果(g/L)
实施例3、宛氏拟青霉P3株固态发酵产四甲基吡嗪等含量测定
将宛氏拟青霉菌P3株及参比菌株CICC 41447经PDA液体培养基培养好后，按5％接种量分别接种于小麦粉固体培养基中(小麦经粉碎后按料水比1:0.8加水混合均匀，分装到三角瓶中，121℃，灭菌30min)，37℃发酵3d。取发酵样品经顶空固相微萃取处理后用于气相-质谱(GC-MS)分析风味组分。气质样品制备：将5g纯种固态样品加入20ml超纯水中，加入0.85％NaCl和1％CaCl2，震荡混匀后冰浴超声30min，然后将超声后的混合液于4℃，8000r离心5min，取上清液。20mL顶空瓶中加入上清液8mL于,加入3gNaCl饱和，再加入10uL混合内标(丙酸辛酯60.44ug/L；L-薄荷醇,终浓度为125.41ug/L)待测。顶空固相微萃取条件：50℃预热5min，吸附萃取45min，解析20min。顶空萃取装置置于50℃恒温条件中进行萃取。样品的GC-MS分析结果表明(表5)：接种P3株的固态发酵小麦培养基产生的白酒健康因子四甲基吡嗪和风味物质乙酸、异丁酸、2-甲基丁酸乙酯的含量均显著高于标准菌株CICC 41447。其中，P3株产四甲基吡嗪和2-甲基丁酸乙酯的含量分别比对照菌株CICC 41447高16.7％和28.1％。
表5两株宛氏拟青霉菌固态发酵产物的GC-MS分析结果
实施例4宛氏拟青霉P3酿酒菌剂的制备方法
按照如下步骤进行：
(1)P3菌种活化：用接种环挑取一环P3菌种接种于土豆斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养20-24h。
(2)种子液的制备：挑取一环经活化的P3菌株接入装有80mL土豆三角瓶液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养24h备用。
(3)固体发酵培养基制备：按小麦粉50％，玉米粉20％，米糠20％，豆粕10％，料：水＝1:0.8，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料盒中，121℃灭菌30min后冷却待用。
(4)固体菌剂培养：按3-5％接种量接入预先培养好的P3种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置37℃恒温培养箱中培养3天，每12h搅拌一次。
(5)干燥及粉碎：将上述发酵完毕的P3固体培养物置于50℃烘箱中烘至含水率12％-15％，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置干燥、阴凉处或冰箱保鲜层中保藏。取样采用稀释平板测数法检测样品中P3菌种的活菌数达1-5亿cfu/克。
(6)包装：将枯草芽孢杆菌CCTCC M2017466与P3按活菌数比＝10:1比例混合后装塑料袋封口制成P3酿酒菌剂组合物。
实施例5宛氏拟青霉P3酿酒菌剂组合物在生产白酒高温强化大曲中的应用
某白酒企业制曲车间采用小麦为制曲原料，按照高温大曲的生产方法生产，将枯草芽孢杆菌CCTCC M2017466与宛氏拟青霉P3酿酒菌剂分别按0:0、1:0、10:1、1:1、1:10和0:1的菌数比混合接种母曲，制备成强化大曲，具体方法：每组制曲小麦用量150Kg，料水比1:0.4。对照组(0:0)只接种5％的母曲粉，5个实验组按照母曲重量的0.1％分别添加枯草芽孢杆菌CCTCC M2017466和宛氏拟青霉P3及其组合物菌剂(表6)，每个处理三个平行样。按照白酒高温大曲生产的方法，大曲压块后在曲房中经45天发酵后，测定大曲的理化指标及风味物质含量。液化力和糖化力测定方法参照相关白酒企业标准执行。
从表6中可以看出，与不接种菌剂的对照组相比，接种单一P3组(0:1)的大曲的四甲基吡嗪等含量和糖化力活性显著提升，但液化力变化不明显。当枯草芽孢杆菌CCTCCM2017466与宛氏拟青霉P3菌数按10:1混合接种时，制备的强化曲的液化力和糖化力均处于较高活性，大曲的风味物质含量最均衡，己酸含量最高。表明在枯草芽孢杆菌中添加一定比例的P3酿酒菌剂后，对于提高大曲的液化力、糖化力和四甲基吡嗪、4-甲基愈创木酚、己酸等白酒风味物质含量具有明显的促进作用。
表6枯草芽孢杆菌M2017466与P3不同比例混合接种的强化大曲分析测定结果
实施例6接种宛氏拟青霉P3酿酒菌剂组合物的强化大曲在提高浓酱兼香型白酒出酒率和酒品质量中的应用
6.1试验方法
将上述实施例5中生产的P3酿酒菌剂组合物组及CICC 41447酿酒菌剂组合物组宛氏拟青霉强化大曲应用于某白酒企业进行酿酒效果比较，按照浓酱兼香型白酒酿酒工艺，酿酒车间蒸馏后的酒醅摊凉后按照220kg/组分堆，对照组为接种普通高温大曲组，两个实验组分别接种实施例5中生产的P3和CICC 41447组合物强化大曲，三组添加大曲的比例均为投料量的10％。接种后进行高温堆积发酵3-4天，堆料温度达48℃后入池发酵30d，取样蒸馏。每个处理三个平行样。对蒸馏的样品中的醇类、酸类、酯类等成分含量进行气相色谱分析。
6.2酒质色谱分析结果及感官品评
由表7可以看出：接种P3强化大曲的实验组原酒的酒精度可达58.9％，比CICC41447组提高了7.1％。P3组原酒中的四甲基吡嗪、总酸、总酯的含量分别较CICC 41447组提高了18.5％、8.1％和5.3％，对提高原酒的酱香风味和改善口感作用明显。表明酒醅中添加含P3的强化大曲对于提高原酒出酒率和原酒品质量有明显促进作用。
表7发酵酒醅蒸馏酒样中各成分气相色谱分析结果
感官品评对比为：对照组酒样分数在85-90，评语是较醇厚、酒体较丰满；CICC41447组酒样分数在90-95,评语为醇厚、酒体较丰满；P3组酒样分数在95-100，评语为醇厚丰满、酱香突出，浓酱香味谐调。表明使用含宛氏拟青霉菌P3酿酒菌剂组合物的强化大曲不仅可以显著提高出酒率，还可以明显改善酒质，由于总酸、总酯和四甲基吡嗪等白酒的主要香味成分含量的增加，使白酒中的香风味得到加强，香气更加协调，口感更佳。

Claims (7)

1.一株兼具产糖化酶活性和α-淀粉酶活性的宛氏拟青霉P3株(Paecilomycesvariotii)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2022798。
2.一种含权利要求1中所述的宛氏拟青霉菌P3株的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为宛氏拟青霉菌P3菌体及其代谢产物。
3.一种含有权利要求1所示的宛氏拟青霉菌P3株的强化大曲，按重量百分比，宛氏拟青霉菌P3菌剂的加量是母曲的0.1％。
4.根据权利要求2中所述的微生物菌剂，其特征在于所述的菌剂为固态菌剂。
5.制备权利要求2中所述的菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)P3菌种活化：用接种环挑取一环P3菌种接种于土豆斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养20-24h；
(2)种子液的制备：挑取一环经活化的P3菌株接入装有80mL土豆三角瓶液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养24h备用；
(3)固体发酵培养基制备：按小麦粉50％，玉米粉20％，米糠20％，豆粕10％，料：水＝1:0.8，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料盒中，121℃灭菌30min后冷却待用；
(4)固体菌剂培养：按3-5％接种量接入预先培养好的P3种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置37℃恒温培养箱中培养3天，每12h搅拌一次；
(5)干燥及粉碎：将上述发酵完毕的P3固体培养物置于50℃烘箱中烘至含水率12％-15％，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置干燥、阴凉处或冰箱保鲜层中保藏，取样采用稀释平板测数法检测样品中P3菌种的活菌数达1-5亿cfu/克；
(6)包装：将枯草芽孢杆菌CCTCC M2017466与P3按活菌数比＝10:1比例混合后装塑料袋封口制成P3酿酒菌剂组合物。
6.权利要求2所述的宛氏拟青霉菌P3菌剂在白酒酿造中的应用。
7.权利要求3中所述的含有P3及其组合物的强化大曲在白酒酿造中的应用。
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