CN114621880A - 一株产酯的异常威克汉姆酵母及其在白酒大曲中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株产酯酵母异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）SAU‑F4及其应用，属微生物技术领域。从白酒大曲中分离得到一株产酯异常威克汉姆酵母，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No.23919，保藏日期为2021年11月15日。菌株SAU‑F4以高粱糖化液作为产酯培养基28℃静置培养4天后发酵液总酯含量为2.21 g/L；SAU‑F4的最适生长pH为4.0，能在pH为3.0的环境中良好生长，最高耐受SO2浓度为0.2 g/L；最高耐受35%葡萄糖，将菌株SAU‑F4应用于白酒大曲的强化实验，试验组白酒大曲中总酯含量提高了12.87%。菌株SAU‑F4在白酒大曲、发酵调味品中具有良好的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株从白酒大曲中分离得到的产酯异常威克汉姆酵母特性及其应用。
背景技术
产酯酵母又称生香酵母，主要属于产膜酵母或假丝酵母，其中大多数为异常汉逊酵母，具有较强的氧化能力和产酯能力，能产生以酯类物质为主体的香气成分，在发酵食品中应用广阔，特别是在白酒生产，酱油、醋等发酵调味品生产中产酯酵母作为主要发酵菌种之一对于其独特的风味的形成至关重要；生产白酒时，可以利用产酯酵母提高酒的主体香含量，如乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯等，以及乙酸甲酯、辛酸乙酯等次要香味物质；不同香型的白酒其酯类物质的含量及比例都有差别，如浓香型白酒具有以己酸乙酯为主体的复合香气，清香型白酒主体香气为乙酸乙酯；由此可见酯类物质是影响白酒风味的主要因素之一，白酒作为世界六大蒸馏酒之一，在中国占据广阔的市场，具有十分重要的经济价值，围绕如何提高白酒中的酯类物质含量是白酒行业生产者，研究者普遍关心的问题。
采用产酯酵母作为发酵菌种对白酒大曲发酵进行强化，可以提高白酒酒醅中的酯类等风味组分，最终提高白酒的品质，目前已筛选得到的应用于白酒发酵的产酯酵母菌很多，如发明专利CN201510468068.7公开了一株高产4-乙烯基愈创木酚和乙酸乙酯的异常毕氏酵母菌及其应用发明内容，液体培养基发酵后4-乙烯基愈创木酚浓度达到16.48mg/L，这2种物质主要属于酱香型白酒的主体成分；发明专利CN202111509846.4筛选得到的酵母菌株能够产生61种风味物质；陆振群从优质酒曲中筛选11株生香酵母，其中产酯最高的菌株S8在发酵液中总酯含量达到1.78g/L；本发明专利中异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus SAU-F4以高粱糖化液体为产酯培养基，总酯含量可以达到2.21 g/L，菌株SAU-F4在白酒大曲、发酵调味品中的应用具有巨大的潜力。
发明内容
本发明主要目的是从白酒大曲中筛选得到一株产酯酵母并对其应用进行初步探索，本发明丰富了白酒大曲发酵中的生香菌株资源。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
本发明提供一株产酯异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus SAU-F4，已于2021年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No. 23919。
所述的异常威克汉姆酵母分离于白酒大曲，经初筛、复筛、纯化后得到纯菌，具有较强的产酯能力。
所述异常威克汉姆酵母SAU-F4培养特征为：菌落圆形，乳白，凸起，边缘整齐，质地细腻有光泽，有较强的酒香味。
所述异常威克汉姆酵母SAU-F4在显微镜下的菌体形态特征为：椭圆形或近圆形，一端或多端出芽生殖，美蓝染色大部分细胞不被染成蓝色，成熟细胞内可见液泡。
所述异常威克汉姆酵母生物学特征为：SAU-F4最适生长pH为4.0（图4），且在pH3.0的环境中也能良好生长（图5）；最高耐受葡萄糖浓度为35%（图6）。
所述异常威克汉姆酵母SAU-F4以高粱糖化液体作产酯培养基，28℃静置培养4天后总酯含量为2.21 g/L。
附图说明
附图1为菌株SAU-F4透明圈图。
附图2为菌株SAU-F4的菌落和细胞形态图。
附图3为菌株SAU-F4的系统发育树。
附图4为菌株SAU-F4的酸度耐受性。
附图5为菌株SAU-F4的乙醇耐受性。
附图6为菌株SAU-F4的葡萄糖耐受性。
具体实施方式
下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得；所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
下述实施例对本发明的具体实施做进一步说明，但并不仅限于此实施例。
下诉实例中各培养基配方如下：
富集培养基：10°Bx麦芽汁121 ℃灭菌20 min后，无菌环境中分别加入无菌的孟加拉红（0.03 g/L），青毒素（氨苯西林钠，50 μg/mL），氯霉素（100 mg/L）；
马铃薯琼脂培养基（PDA，加氯霉素）：马铃薯浸出粉6.0 g、葡萄糖20.0 g、氯霉素0.1 g、琼脂20 g，pH自然，溶解于1000 mL蒸馏水，121 ℃灭菌20 min；
产香初筛培养基：马铃薯浸出粉6.0 g、葡萄糖20.0 g、氯霉素0.1 g、4 g三丁酸甘油酯，琼脂20 g，pH自然，溶解于1000 mL蒸馏水，121 ℃灭菌20 min；
发酵产酯培养基（高粱糖化液）：取150 g高粱粉于2 L烧杯中，加入少量自来水，搅成糊状，再加热水600 mL，搅匀，调pH值为6.0〜6.5，加入α-淀粉酶和糖化酶经液化和糖化后取上清液将其糖度调到8° Bx备用；
酵母膏胨葡萄糖培养基（YPD）：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，溶解于1000mL蒸馏水，121 ℃灭菌20 min；
酒精发酵培养基（去皮高粱糖化液）：取去皮高粱粉一份，加自来水五份蒸煮1h~2h，按使用说明加入淀粉酶液化，液化后补加60 ℃水一份，加入原料量的5%糖化酶（5万活力单位），搅拌均匀，在60 ℃糖化3 h～4 h，用稀碘液试之不显蓝色，再加热至90 ℃，用细白布过滤，测量溶液的糖度并调整为7°Be后使用。
实施例1：白酒曲中产酯酵母的筛选。
（1）白酒曲中酵母菌的分离纯化：将4种白酒大曲样品打成粉末，分别称取2.50 g曲粉于100 mL富集培养基中，30±1 ℃，150 rpm恒温揺床富集48 h，转接一次，相同条件再次富集48 h；加入少量无菌玻璃珠，将菌体打散；血球计数板计菌体浓度，将富集液适当稀释后涂布于PDA平板培养基上，30±1 ℃的恒温培养箱中培养48 h，挑取形态不同的菌株在PDA平板上反复划线分离得到纯菌株，将纯化后的菌株转接至YPD斜面培养基，4℃保存备用。
（2）产酯酵母菌的初筛：将从大曲中分离得到的产酯酵母菌活化后，采用点种的方式接种到产香初筛培养基上，30 ℃培养48 h，每株菌设置3个平行对照组，测量菌落直径d及透明圈直径D，计算D/d值（透明圈见图1），选择D/d值较大的作为复筛出发菌株。
（3）产酯酵母菌的复筛：对复筛菌株进行活化，接种在YPD液体活化培养基中，震荡培养24 h后，将细胞数稀释到10-7 CFU/mL，按10%的接种量接种于装有100 mL发酵产酯培养基的三角瓶中，28℃恒温静置培养4 天，每株菌设置3个平行对照组，检测总酯含量（参考GB/T 10345-2007）。
28℃发酵4 天后，接种菌株SAU-F4的发酵液中总酯含量最高，为2.21 g/L，因此，选择菌株SAU-F4进行后续实验。
(4)菌株SAU-F4鉴定：
形态鉴定：将菌株SAU-F4于PDA平板上划线，28°C培养5 天观察，按照颜色、大小、隆起状况、边缘形状等记录其菌落形态特征；同时挑取平板上单菌落制作水浸片，显微镜观察记录其形状、颜色、大小等，滴加美蓝染液以便更清晰地观察活菌细胞形态；菌株SAU-F4菌落、细胞形态如图2所示。
分子鉴定：将SAU-F4菌株画线接种于PDA平板上活化，28℃恒温培养24 h，采用擎科梓熙生物技术有限公司的真菌直扩试剂盒，使用26S rDNA的通用引物(NL1:5’-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3’;NL4:5’-GGTCCGTGTTTCA AGACGG-3’)扩增26S rDNA全长序列，PCR产物经检验合格后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，BLAST进行同源性比对，并运用MEGA5.0构建系统发育树。
结果显示（见图3），菌株SAU-F4与异常威克汉姆酵母碱基对同源性99.29%，结合形态学特征，将菌株SAU-F4鉴定为异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus，菌株SAU-F4已于2021年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No. 23919。
实例2：产酯酵母异常威克汉姆酵母SAU-F4的耐受性测试。
（1）酸度耐受性实验：将活化后的SAU-F4菌株种子液接入含150 mLYPD液体培养基的三角瓶中，接种量为5%（1.7×106 cfu/mL），用乳酸分别调节培养基pH为2、3、4、5，28 ℃下恒温培养24 h后测定菌悬液600 nm处OD值，依据OD值大小判定生香酵母的耐受性；如图4所示，菌株SAU-F4最适生长pH为4.0，
（2）酒精耐受性实验：将活化后的SAU-F4种子液分别接入酒精含量（体积浓度）3%、6%、9%、12%、15%的YPD液体培养基中，28℃培养24h测定菌悬液在600 nm处的OD值；如图5所示乙醇含量对于SAU-F4菌株的抑制作用明显，12%的乙醇既可以显著抑制SAU-F4的生长。
（3）糖度耐受性实验：将活化后的SAU-F4种子液分别接入葡萄糖含量15%、20%、25%、30%、35%的YPD液体培养基中，28℃培养24h测定菌悬液在600 nm处的OD值；如图6所示异常威克汉姆酵母在含30%葡萄糖的培养基中依然生长较为良好，其最高耐受葡萄糖浓度为35%。
实例3 菌株SAU-F4实验室模拟大曲发酵。
将原料小麦粉碎，将粉碎后的小麦与水混合，使其水分在38%左右，其中水分包含1%（v/w）的菌悬液（菌株SAU-F4 106 CFU/mL），将浸湿的小麦粉紧紧地压成一个长方体曲块（包包曲），每块重约4.5 kg，以不接种SAU-F4为空白对照组；随后，曲块被层层堆放在一个发酵室（恒温恒湿培养箱）中培养12天左右，培养过程中温度和湿度为：0~4天 42℃ 相对湿度大于90%，5~13天 55~60℃相对湿度大于90%，14-24天 45~50℃相对湿度低于80%，25~35天 室温 大曲水分低于14%，取样检测总酯含量。
经测定SAU-F4强化的试验组白酒大曲总酯含量为1921 μg/kg，而空白对照组总酯含量为1702 μg/kg，结果说明菌株SAU-F4提高了白酒大曲的酯类物质含量，异常威克汉姆酵母SAU-F4提高白酒大曲的品质，在白酒大曲发酵中具有良好的应用潜力。
以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一株产酯的异常威克汉姆酵母及其在白酒大曲中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 588
<212> DNA
<213> 异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)
<400> 1
ttctttcact gctgctgcgc ttattgcgcg gcgataaacc ttacacacat tgtctagttt 60
ttttgaactt tgctttgggt ggtgagcctg gcttactgcc caaaggtcta aacacatttt 120
ttttaatgtt aaaaccttta accaatagtc atgaaaattt ttaaccaaaa ttaaaatctt 180
caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tcgcaacgat gaagaacgca gcgaaatgcg 240
atacgtattg tgaattgcag attttcgtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcacc 300
ctctggtatt ccagagggta tgcctgtttg agcgtcattt ctctctcaaa ccttcgggtt 360
tggtattgag tgatactctg tcaagggtta acttgaaata ttgacttagc aagagtgtac 420
taataagcag tctttctgaa ataatgtatt aggttcttcc aactcgttat atcagctagg 480
caggtttaga agtattttag gctcggctta acaacaataa actaaaagtt tgacctcaaa 540
tcaggtagga ctacccgctg aacttaagca tatcaataag cggaggaa 588
Claims (4)
1.一株产酯的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）SAU-F4，其特征在于：保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No. 23919的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。
2.根据权利要求1所述产酯的异常威克汉姆酵母，其特征在于：所述异常威克汉姆酵母分离自白酒大曲并应用于白酒大曲发酵。
3.根据权利要求2所述的异常威克汉姆酵母的应用，其特征在于：将异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus SAU-F4按10%的接种量接种于发酵产酯培养基中，28℃恒温静置培养4天，检测总酯含量达到2.21 g/L。
4.根据权利要求2所述的异常威克汉姆酵母的应用，其特征在于：将异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus SAU-F4接种至白酒大曲，同未接种菌株SAU-F4的空白对照组对比，试验组白酒大曲中总酯含量提高了12.87%。
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