CN112940954A - 一株高产酯异常威克汉姆酵母及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产酯的异常威克汉姆酵母及其在泡菜中的应用，属于微生物技术领域。所述菌株为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YYB24，于2020年8月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.20577。该菌具有较强的产酯能力且发酵性能优良。接种该菌发酵使泡菜感官得分明显提高，酯类物质种类增加了10种，相对含量提高了146.45%，苯乙醇、长叶烯等泡菜重要风味物质的相对含量也有明显的提高，结果表明异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YYB24应用于泡菜生产具有巨大的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株从四川传统家庭自制泡菜中分离筛选出的产酯能力较强的异常威克汉姆酵母及其在泡菜中的应用。
背景技术
四川泡菜是指以新鲜蔬菜为主要原料，添加或不添加辅料，经食用盐或食用盐水渍制等工艺加工而成的蔬菜制品，咸酸适口，具有抗氧化、健脾开胃、防止动脉硬化等功效。近年来，四川泡菜产业发展迅速，形成了眉山东坡、成都新繁等泡菜产业集群，泡菜产品远销多个国家和地区，深受广大消费者喜爱。虽然泡菜产业的发展取得了较好成绩，但仍存在着一些问题。如在泡菜加工过程中，为使泡菜呈现更好风味，泡菜企业往往会添加香精香料。而在生活水平日益提高的今天，消费者对食品品质也有了更高的要求。香精香料等食品加工过程中重要的人工合成类食品添加剂已逐渐不被消费者所接受。此外，不同批次间香料的品质波动也会造成泡菜产品品质差异。风味作为泡菜至关重要的评价指标，其优劣与泡菜产品品质甚至行业发展都息息相关。因此，如何在减少香精香料添加量的同时保证其风味品质是值得研究和探讨的问题。
一些微生物能利用简单的营养物质代谢产生风味物质，对发酵食品的增香提质有着重要作用。在泡菜发酵过程中，部分酵母菌能代谢产生酯类物质，对泡菜风味贡献较大。如乙酸乙酯具有果香味，辛酸乙酯具有酒香味，乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯则呈花香味，这些酯类物质作用下使泡菜风味更加柔和、丰富。这些由酵母菌代谢产生的酯类物质属于天然食品添加剂，易于被消费者接受，具有市场竞争力。
已有报道中，产酯酵母多分离筛选自酒曲酒醅、酱醪及果汁果酒中。彭东等（彭东2020）从高盐稀态酱醪中筛选到一株产酯能力较强的平滑假丝酵母，该酵母菌在豆芽汁培养基中总酯产量为1.46 g/L。蔡雪梅等（蔡雪梅 2017）从酱香型白酒酒糟中筛选到一株总酯产量为4.028g/L的毕赤酵母。张亭妍等（张亭妍 2020）从老酵子中筛选得到一株总酯产量为355.2 mg/L的异常威克汉姆酵母并将其用于馒头的制作，使馒头中醇类、酯类风味物质含量分别提高了11.27%、8.85%。未见从泡菜中筛选高产酯酵母并接种发酵泡菜的报道。泡菜发酵是一个高盐、高酸的环境，源自泡菜中酵母菌经长期的自然筛选具有更强的环境适应性，更适合于泡菜发酵。因此，以四川传统家庭自制泡菜水为样品源，从中筛选出产酯能力强、发酵性能优良的酵母菌，对改善泡菜风味、减少香精香料的使用以及解决因香辛料差异而引起的泡菜品质波动问题具有重要的现实意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一株泡菜中高产酯的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YYB24及其应用。
本发明所提供的菌株为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YYB24，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No.20577，保藏日期为2020年8月28日。
本发明提供泡菜中产酯酵母菌的分离、筛选、鉴定及应用。
将泡菜水样品10倍系列稀释后，吸取适宜稀释度样液涂布于马铃薯琼脂培养基（PDA）平板，28℃培养72h后，挑取具有酵母菌典型菌落特征的菌落进行多次平板划线纯化，保存备用。
将上述获得的酵母菌进行产酯初筛，取一环菌落接于装有5mL萝卜汁培养基的试管中，28℃培养72h后，采用嗅闻法筛选菌株。
用无菌生理盐水调整初筛所获酵母菌的菌体浓度为108CFU/mL，以2%接种量接种至萝卜汁培养基中，28℃培养72h后，采用回流皂化法筛选出一株产酯能力较强的酵母菌，编号为YYB24，该菌株于萝卜汁培养基中发酵72h后，总酯产量达3.32g/L。
菌株YYB24形态鉴定：肉眼观察菌落呈圆形、不透明、白色、湿润光滑、边缘整齐的形态。
菌株YYB24分子鉴定：提取菌株DNA，并对其26S rDNA进行扩增，电泳检测合格后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。
将该菌株的26S rDNA 基因测序结果与GenBank数据库中序列进行Blast同源性对比，该菌株序列与菌株Wickerhamomyces anomalus基因序列高度同源，结合形态学特征最终将菌株YYB24鉴定为异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus。
对菌株YYB24进行耐酸、耐盐试验，结果显示菌株YYB24具有较强的盐耐受能力和酸耐受能力，能耐受14%左右的盐度，在pH2.5的马铃薯肉汤培养基（PDB）中仍能生长。
将菌株YYB24按0.2%接种量接种发酵泡菜，结果显示接种菌株YYB24发酵的泡菜风味明显优于自然发酵泡菜，泡菜中挥发性风味物质（尤其是酯类物质）的种类及相对含量均有所提高。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：首次从四川传统家庭自制泡菜中筛选获得高产酯的异常威克汉姆酵母，并证实了其具有良好发酵性能；接种菌株YYB24发酵后，泡菜中酯类物质的种类增加了10种，相对含量提高了146.45%，此外，泡菜中的苯乙醇、2-甲基-1-丁醇、长叶烯等物质的含量也有明显的增加，其中苯乙醇具有独特的紫罗兰及玫瑰香气，长叶烯是一种重要的天然香料，对食品风味的形成具有重要作用；由此可知，异常威克汉姆酵母YYB24提高泡菜品质，在泡菜发酵中具有良好的应用潜力。
附图说明
图1为菌株YYB24的菌落和细胞形态图。
图2为菌株YYB24的系统发育树。
图3为菌株YYB24盐耐受曲线。
图4为菌株YYB24酸耐受曲线。
具体实施方式
下述实施例中各培养基的配方如下：
马铃薯琼脂培养基（PDA）：马铃薯浸出粉6.0 g、葡萄糖20.0 g、氯霉素0.1 g、琼脂20g，pH值5.4-5.8，溶解于1000 mL蒸馏水，121 ℃灭菌20min。
马铃薯肉汤培养基（PDB）：马铃薯浸出粉6.0 g、葡萄糖20.0 g、氯霉素0.1 g，pH值5.4-5.8，溶解于1000 mL蒸馏水，121 ℃灭菌20min。
萝卜汁培养基：白萝卜与蒸馏水1:1混合打浆，四层纱布过滤后，添加盐3%、葡萄糖2%、乳酸调至pH4.0、115℃灭菌15min。
实例1：泡菜中产酯酵母菌的筛选鉴定
1）泡菜中酵母菌的分离纯化：用无菌生理盐水对泡菜水样品进行10倍系列梯度稀释，吸取200μL 10-2、10-3两个稀释度样品于PDA平板，无菌涂布棒涂布均匀，同时取样品原液划线，28℃培养72h后，挑取形态不同的菌落于PDA平板反复划线，直至得到单菌落。将纯化后的菌种于30%甘油中冻存。
2) 产酯酵母菌的初筛：用无菌接种环挑取一环冻存于甘油管中的菌液划线于PDA平板，28℃培养72h后，挑取一环单菌落于装有5mL萝卜汁培养基的试管中，混合均匀，28℃培养72h后，采用嗅闻香的方式初步淘汰不产酯及产酯能力较弱的酵母菌。结果以“-”（无香）、“+”（微香）、“++”（较香）及“+++”（香气浓郁）表示。
3) 产酯酵母菌的复筛：选择初筛结果为“++”及“+++”的菌株进行复筛。将冻存于甘油管中的菌液于PDB中活化，28℃培养至菌体密度为108CFU/mL，8000r/min离心10min收集菌体，用无菌生理盐水反复洗涤2~3次后，加入等量无菌生理盐水重悬菌体，按2%接种量接种于装有20mL萝卜汁培养基的三角瓶中，28℃培养72h后，采用回流皂化法测定发酵液中总酯含量，每株菌做3个平行。
28℃发酵72h后，接种菌株YYB24的发酵液中总酯含量最高，为3.32g/L，因此，选择菌株YYB24进行后续实验。
4) 菌株YYB24鉴定
形态鉴定：用无菌接种环挑取一环冻存于甘油管中菌液划线于PDA平板，28℃培养72h后，肉眼观察其菌落形态，光学显微镜下观察其细胞形态。菌株YYB24菌落、细胞形态如图1所示。
分子鉴定：将筛选所得菌株接种于装有5mL PDB的试管中，28 ℃静置培养16h，收获菌体。采用擎科梓熙生物技术有限公司的真菌直扩试剂盒，使用26S rDNA的通用引物(NL1:5’-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3’;NL4:5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)扩增26S rDNA全长序列。PCR产物经检验合格后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，BLAST进行同源性比对，并运用MEGA5.0构建系统发育树。
菌株YYB24经26S rDNA序列测定，获得如下序列：
GAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTAGCACCTTCGGTGTTCGAGTTGTAATTTGAAGATGGTAACCTTGGGTTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTCTGATGAGATGCCCATTCCTATGTAAGGTGCTATCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTAGATCAGACTTGGTGTTTTACGATTATCTTCTCTTCTTGAGTTGTGCACTCGTATTTCACTGGGCCAGCATCGATTCGGATGGCAAGATAATGGCAGTTGAATGTGGCTTCACTTCGGTGGAGTGTTATAGCTTCTGCTGATATTGCCTGTCTGGATCGAGGGCTGCGTCTTTTGACTAGGATGCTGGCGTAATGATCTAATGCCGCCCG
将序列导入NCBI进行BLAST同源性比对，结果显示，菌株YYB24与异常威克汉姆酵母相似度达100%。结合形态学特征，将菌株YYB24鉴定为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。将其26S rDNA序列上传NCBI，获得登录号MT998618。
实例2：菌株YYB24发酵性能测试
1) 耐盐能力：将供试菌株活化后在PDB中28℃培养18h，按2%接种量分别接入盐浓度为0%、2%、4%、6%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%的PDB中，28℃培养72h，测定发酵液OD值。
经测定菌株YYB24具有较强的盐耐受能力，能耐受14%左右的盐浓度，其盐耐受曲线见图3。
2) 耐酸能力：将菌株YYB24活化后在PDB中28℃培养18h，按2%接种量分别接入pH为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的PDB中，28℃培养72h，测定发酵液OD值。
经测定，菌株YYB24具有较强的酸耐受能力，在pH2.5的PDB中仍能生长，其酸耐受曲线见图4。
实例3：菌株YYB24在泡菜发酵中的应用
1) 泡菜的制作：将新鲜萝卜清洗、沥干，切分为长宽高约为2~4cm的块状后置于泡菜坛中，与6%盐水1:1（w/v）混合，按盐水体积0.2%接种菌株YYB24或不接种，密封后，于30℃发酵5d。
2) 感官评定：选取10名具有食品专业背景的研究生组成感官鉴评小组，按照表1感官评分标准，对不同处理组泡菜的色泽与形态、香气、质地、滋味进行打分（总体得分=色泽与形态×20%+香气×20%+质地×30%+滋味×30%）。
表1 泡菜感官评分标准
泡菜感官得分结果如表2所示。由表2可知，接种菌株YYB24发酵的泡菜在各感官指标方面均优于自然发酵泡菜，在滋味方面差异极显著（P＜0.01），总体感官得分显著高于自然发酵泡菜（P＜0.01）。说明产酯异常威克汉姆酵母YYB24在提升泡菜感官品质方面具有重要作用。
表2 泡菜感官得分
| 组别 | 色泽与形态 | 香气 | 质地 | 滋味 | 总分 |
| YYB24 | 1.68±0.13<sup>a</sup> | 1.8±0.12<sup>a</sup> | 2.73±0.20<sup>a</sup> | 2.82±0.19<sup>a</sup> | 9.03±0.34<sup>a</sup> |
| 自然发酵 | 1.58±0.06<sup>a</sup> | 1.7±0.10<sup>a</sup> | 2.55±0.15<sup>a</sup> | 2.52±0.15<sup>b</sup> | 8.35±0.17<sup>b</sup> |
注：同列小写字母不同表示差异显著
3) 泡菜挥发性风味物质测定：采用顶空固相微萃取-气质联用仪（HS-SPME-GC-MS）测定自然发酵泡菜及接种菌株YYB24发酵泡菜的挥发性风味物质，测定结果表明，接种菌株YYB24发酵泡菜中测得挥发性风味物质42种，主要为烯烃类、醇类、醛类和酯类，自然发酵泡菜中34种，主要为醇类、醛类及硫化物。接种菌株YYB24发酵后，泡菜中酯类物质的种类增加了10种，相对含量提高了146.45%。此外，泡菜中的苯乙醇、2-甲基-1-丁醇、长叶烯等物质的含量也有明显的增加，其中苯乙醇具有独特的紫罗兰及玫瑰香气，长叶烯是一种重要的天然香料，对食品风味的形成具有重要作用。由此可知，异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YYB24能改善泡菜风味，将其应用于泡菜发酵具有巨大生产潜力。
以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一株高产酯异常威克汉姆酵母及其应用
<141> 2021-01-19
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 585
<212> DNA
<213> 异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)
<400> 1
gaggaaaaga aaccaacagg gattgcctca gtaacggcga gtgaagcggc aaaagctcaa 60
atttgaaatc tagcaccttc ggtgttcgag ttgtaatttg aagatggtaa ccttgggttt 120
ggctcttgtc tatgttcctt ggaacaggac gtcatagagg gtgagaatcc cgtctgatga 180
gatgcccatt cctatgtaag gtgctatcga agagtcgagt tgtttgggaa tgcagctcta 240
agtgggtggt aaattccatc taaagctaaa tattggcgag agaccgatag cgaacaagta 300
cagtgatgga aagatgaaaa gaactttgaa aagagagtga aaaagtacgt gaaattgttg 360
aaagggaagg gcattagatc agacttggtg ttttacgatt atcttctctt cttgagttgt 420
gcactcgtat ttcactgggc cagcatcgat tcggatggca agataatggc agttgaatgt 480
ggcttcactt cggtggagtg ttatagcttc tgctgatatt gcctgtctgg atcgagggct 540
gcgtcttttg actaggatgc tggcgtaatg atctaatgcc gcccg 585
Claims (3)
1.一株产酯的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YYB24，其特征在于：保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.20577的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。
2.根据权利要求1所述产酯的异常威克汉姆酵母，其特征在于：所述异常威克汉姆酵母分离自四川传统家庭自制泡菜并应用于泡菜发酵。
3.根据权利要求2所述的异常威克汉姆酵母的应用，其特征在于：异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YYB24应用于泡菜发酵，将异常威克汉姆酵母种子液按0.2%接种量接种至泡菜盐水中，混合均匀后加入2~4cm的块状新鲜萝卜，于30℃发酵5d制得接种发酵泡菜，并以自然发酵泡菜为对比，结果表明，接种异常威克汉姆酵母发酵泡菜的感官品质明显优于自然发酵泡菜，气质联用仪测得接种异常威克汉姆酵母发酵泡菜中挥发性风味物质42种，自然发酵泡菜34种，接种异常威克汉姆酵母使泡菜中酯类物质的种类增加了10种，相对含量提高了146.45%，此外，泡菜中的苯乙醇、2-甲基-1-丁醇、长叶烯等物质的含量也有明显的增加，表明异常威克汉姆酵母能提高泡菜风味品质，具有潜在应用价值。
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|---|---|---|---|---|
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| CN114410546A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-04-29 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一株产酯增香的威尼斯不动杆菌及其在海水鱼发酵制品中的应用 |
-
2021
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