CN114317375B

CN114317375B - 马氏芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN114317375B
Application number: CN202210046544.6A
Authority: CN
Inventors: 钟凯; 钟一馨; 邹雨珂; 白津榕; 吴艳萍; 高鸿
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2042-01-14
Also published as: CN114317375A

Abstract

本发明公开了一种马氏芽孢杆菌及其应用，该马氏芽孢杆菌(B.marcorestinctum)YC‑1保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No.M 20211678。本发明提供的马氏芽孢杆菌YC‑1，其活性较好且生长较快，具有硝酸盐还原能力，能应用于发酵芽菜。将马氏芽孢杆菌YC‑1应用于发酵芽菜，其制作方法是以新鲜芥菜为原料，经过划条、晾晒、盐渍、脱盐、标糖、添加辅料，再接种马氏芽孢杆菌YC‑1进行发酵，得到发酵芽菜。该方法提升了芽菜香气和发酵质量，获得风味品质优于自然发酵的芽菜产品，降低了自然发酵的亚硝酸盐含量，提高了产品的安全性。

Description

马氏芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种马氏芽孢杆菌及其应用。

背景技术

宜宾芽菜（以下简称芽菜），与内江大头菜、涪陵榨菜、南充冬菜并称为“四大腌菜”，芽菜是以当地特有的变种芥菜二平桩为原料，经过划条、晾晒、盐渍、脱盐、标糖等工艺制成的一类发酵蔬菜制品。芽菜富含多种氨基酸、有机酸、还原糖、挥发性风味物质等营养成分，更以“脆、嫩、鲜、香”的口感受到广大消费者的喜爱。

但是，由于制作芽菜要经过长时间的盐渍，所以芽菜的含盐量较高，而较高的盐环境有利于蔬菜中的硝酸盐在一些硝酸盐还原细菌和酶的作用下，转变成亚硝酸盐。亚硝酸盐具有中毒性和致癌性，一是亚硝酸盐能使血液中的低铁血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白，从而失去携氧能力；二是亚硝酸盐易与胺合成致癌物质亚硝胺。目前，亚硝酸盐含量已成为发酵蔬菜制品食用安全的主要衡量指标，芽菜作为高盐制品，具有相当的安全隐患，所以找到一种能对芽菜中的亚硝酸盐有效降低的方法尤为重要。

随着科技的发展与进步，越来越多的研究表明芽孢杆菌作为一种益生菌，在发酵制品中起着至关重要的作用，有着自然发酵不可比拟的优势，如：缩短发酵周期，优化产品品质，控制产品一致性，提高产品安全性等等。而目前还未发现将芽孢杆菌应用于芽菜发酵的研究。

发明内容

基于此，本申请从四川传统发酵芽菜中分离出来一种菌株，经分子生物学、系统进化分析和形态学分析、生理生化特征分析鉴定为马氏芽孢杆菌，命名为B. marcorestinctum YC-1，其16S rRNA序列已存入NCBI数据库，GenBank登录号为OM 033504，该菌种于2021年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），详细地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC No. M 20211678。马氏芽孢杆菌YC-1的活性较好且生长较快，能用于芽菜发酵，且目前没有马氏芽孢杆菌应用于芽菜发酵的研究。

将马氏芽孢杆菌YC-1应用于发酵芽菜，其制作方法是以新鲜芥菜为原料，经过划条、晾晒、盐渍、脱盐、标糖、添加辅料，再接种马氏芽孢杆菌YC-1进行发酵，得到发酵芽菜。该方法提升了芽菜香气和发酵质量，获得风味品质优于自然发酵的芽菜产品，降低了自然发酵的亚硝酸盐含量，提高了产品的安全性。

本申请提供的一种发酵芽菜的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1. 将马氏芽孢杆菌YC-1进行培养得到菌悬液；

步骤S2. 将新鲜无害的芥菜划条，于室温条件下自然风干、晾晒20~30h；

步骤S3. 在晾晒后的芥菜中加入食盐，腌制20~30h；

步骤S4. 腌制后将芥菜进行淘洗，自然风干20~30h后，加入红糖水；

步骤S5. 再将辅料加入芥菜，拌和均匀；

步骤S6. 将芥菜装入玻璃坛，并在芥菜表面均匀喷洒马氏芽孢杆菌YC-1菌悬液；

步骤S7. 将喷洒过菌悬液的芥菜层层压紧，坛口压紧、密闭、避光，放置在室温条件下，连续发酵，得到发酵芽菜。

在本申请公开的发酵芽菜的制备方法中，所述步骤S1中，马氏芽孢杆菌YC-1的培养方法为：将马氏芽孢杆菌YC-1采用划线法在营养琼脂固体培养基上接种，并在30~40℃条件下，于恒温培养箱培养20~30h获得单菌落，将单菌落接种在营养肉汤液体培养基中，于30~40℃、100~150r/min条件下振荡培养10~20h得到菌悬液。

在本申请公开的发酵芽菜的制备方法中，所述菌悬液的浓度为10⁷~10⁹CFU/mL。

在本申请公开的发酵芽菜的制备方法中，所述步骤S3中，食盐的加入量不低于芥菜质量分数的12％。

在本申请公开的发酵芽菜的制备方法中，所述步骤S4中，加入红糖水，使芥菜着色均匀，其中，红糖的加入量为芥菜质量分数的10~20%。

在本申请公开的发酵芽菜的制备方法中，所述步骤S5中，辅料为八角、山奈、肉桂和花椒，其加入量分别为芥菜质量分数的5~15%、2~8%、2~8%、1~3%。

在本申请公开的发酵芽菜的制备方法中，所述步骤S6中，菌悬液的喷洒量为芥菜质量分数的5%~15%。

在本申请公开的发酵芽菜的制备方法中，所述步骤S7中，芥菜的发酵时间不少于3个月。

发明的有益效果是：

本发明提供了一种马氏芽孢杆菌，该马氏芽孢杆菌（B. marcorestinctum）YC-1从四川传统发酵芽菜中分离出来，其活性较好且生长较快，具有硝酸盐还原能力，能用于芽菜发酵，接种马氏芽孢杆菌YC-1的发酵芽菜在发酵3个月后亚硝酸盐低于3mg/kg，明显小于自然发酵芽菜中亚硝酸盐的含量，提升了芽菜香气和发酵质量，获得风味品质优于自然发酵的芽菜产品，降低了自然发酵的亚硝酸盐含量，提高了产品的安全性。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请提供的马氏芽孢杆菌YC-1的16S rDNA系统发育树；

图2为本申请提供的马氏芽孢杆菌YC-1的革兰氏染色示图；

图3为本申请提供的马氏芽孢杆菌YC-1的扫描电镜观察结果图；

图4为本申请的芽菜连续发酵3个月的pH含量变化图；

图5为本申请的芽菜连续发酵3个月的总酸含量变化图；

图6为本申请的芽菜连续发酵3个月的亚硝酸盐浓度变化图。

具体实施方式

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。

在本申请中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。

本申请从四川传统发酵芽菜中分离出来一种菌株，经鉴定为马氏芽孢杆菌，命名为B. marcorestinctum YC-1，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No.M 20211678。马氏芽孢杆菌YC-1的活性较好且生长较快，能应用于发酵芽菜，其制作方法是以新鲜芥菜为原料，经过划条、晾晒、盐渍、脱盐、标糖、添加辅料，再接种马氏芽孢杆菌YC-1进行发酵，得到发酵芽菜，该方法提升了芽菜香气和发酵质量，获得风味品质优于自然发酵的芽菜产品，降低了自然发酵的亚硝酸盐含量，提高了产品的安全性。

实施例中所述的室温具有本技术领域公知的含义，一般是指25±2℃。

下面对本发明的实施例进行详细说明。

实施例1

本申请提供一种马氏芽孢杆菌（B. marcorestinctum）YC-1，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No. M 20211678。

具体地，该菌株从四川传统发酵芽菜中分离筛选得到，对其进行16S rDNA测序构建16S rDNA系统发育树、形态学和生理生化特征分析鉴定。

该菌株的生理生化结果如表1所示，该菌株能利用葡萄糖和葡萄糖（产气）且具有硝酸盐还原能力。

备注：“+”为利用，“-”为不利用

请参见图1所示，该菌株进行16S rDNA测序构建的16S rDNA系统发育树，结果表明该菌株与马氏芽孢杆菌处于同一分支。

请参见图2、3所示，由图2的镜检结果与图3的扫描电镜结果佐证本申请提供的菌株为马氏芽孢杆菌。

该菌株经分子生物学、系统进化分析和形态学分析、生理生化特征分析鉴定为马氏芽孢杆菌，命名为B. marcorestinctum YC-1。马氏芽孢杆菌YC-1的16S rRNA序列已存入NCBI数据库，GenBank登录号为OM 033504。马氏芽孢杆菌YC-1于2021年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），详细地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC No. M 20211678。

马氏芽孢杆菌YC-1的活性较好且生长较快，能利用葡萄糖和葡萄糖（产气）且具有硝酸盐还原能力，能应用于发酵芽菜。

实施例2

本申请提供一种发酵芽菜的制备方法，该方法采用上述马氏芽孢杆菌YC-1进行发酵，得到发酵芽菜，具体包括以下步骤：

步骤S1. 将马氏芽孢杆菌YC-1进行培养得到菌悬液；

步骤S2. 将新鲜无害的芥菜（二平桩）划条，于室温条件下自然风干、晾晒20~30h；

步骤S3. 在晾晒后的芥菜中加入食盐，腌制20~30h；

步骤S5. 再将辅料加入芥菜，拌和均匀；

具体地，步骤S1中，马氏芽孢杆菌YC-1的培养方法为：将马氏芽孢杆菌YC-1采用划线法在营养琼脂固体培养基（NA）上接种，并在30~40℃条件下，于恒温培养箱培养20~30h获得单菌落，将单菌落接种在营养肉汤液体培养基（NB）中，于30~40℃、100~150r/min条件下振荡培养10~20h得到菌悬液。

其中，马氏芽孢杆菌YC-1的培养温度可以为30℃、35℃、37℃、40℃，优选为37℃。

马氏芽孢杆菌YC-1在NA培养基上的培养时间可以为20h、22h、24h、28h、30h，优选为24h。

马氏芽孢杆菌YC-1在NB培养基上振荡培养的时间可以为10h、14h、16h、18h、20h，转速可以为100r/min、120r/min、150r/min，优选为120r/min下振荡培养16h。

具体地，以NB液体培养基作为空白对照，在600nm测定菌悬液的OD₆₀₀值，并且通过涂布平板法计数，获得马氏芽孢杆菌YC-1菌悬液的浓度。马氏芽孢杆菌YC-1菌悬液的浓度为10⁷~10⁹CFU/mL，具体可以为10⁷CFU/mL、10⁸CFU/mL、10⁹CFU/mL，优选为10⁸CFU/mL。

具体地，步骤S2中，芥菜的晾晒时间可以为20h、24h、28h、30h，优选为24h。

具体地，步骤S3中，在芥菜中加入食盐，进行腌制，食盐的加入量不低于芥菜质量分数的12％，具体可以为12%、15%、18%等，其腌制时间可以为20h、24h、28h、30h。优选为：在芥菜中加入质量分数为15%的食盐，腌制24h。

具体地，步骤S4中，将芥菜进行淘洗脱盐，降低其盐含量，避免在较高的盐环境下，芽菜中的硝酸盐转变成亚硝酸盐。芥菜脱盐后自然风干，其风干时间可以为20h、24h、28h、30h，优选为24h。芥菜风干后加入红糖水，红糖水应熬制得颜色和香味相适宜，并使芽菜着色均匀。其中，红糖的加入量为芥菜质量分数的10~20%，具体可以为10%、12%、15%、18%、20%，优选为15%。

具体地，步骤S5中，辅料为八角、山奈、肉桂和花椒。其中，八角的加入量为芥菜质量分数的5~15%，具体可以为5%、8%、10%、12%、15%，优选为10%。山奈的加入量为芥菜质量分数的2~8%，具体可以为2%、5%、8%，优选为5%。肉桂的加入量为芥菜质量分数的2~8%，具体可以为2%、5%、8%，优选为5%。花椒的加入量为芥菜质量分数的1~3%，具体可以为1%、2%、3%，优选为2%。

具体地，步骤S6中，玻璃坛需要提前用沸水灭菌20min，后将拌和均匀的芽菜装入玻璃坛，在其表面喷洒准备好的马氏芽孢杆菌YC-1菌悬液，边喷洒边翻转芥菜，使其喷洒均匀。菌悬液的接种量为芥菜质量分数的5%~15%，具体可以为5%、8%、10%、12%、15%，优选为10%。

具体地，步骤S7中，芽菜的发酵时间不少于3个月，具体可以为3、5、8个月等。

本申请将马氏芽孢杆菌YC-1应用于发酵芽菜，其制作方法是以新鲜芥菜为原料，经过划条、晾晒、盐渍、脱盐、标糖、添加辅料，再接种马氏芽孢杆菌YC-1进行发酵，得到发酵芽菜。该方法提升了芽菜香气和发酵质量，获得风味品质优于自然发酵的芽菜产品，降低了自然发酵的亚硝酸盐含量，提高了产品的安全性。

对照例1

芥菜自然发酵，得到发酵芽菜，即在实施例2中，不接种马氏芽孢杆菌YC-1的菌悬液，其余同实施例2。

实验例1

1、挥发性风味化合物的检测

对实施例2和对照例1贮藏连续发酵3个月的芽菜样品进行了挥发性风味化合物检测，结果如表2所示。

通过风味成分分析，实施例2的芽菜测得挥发性化合物种类更多。实施例2共测得40种挥发性化合物，包括酸类（2种）、醇类（6种）、醛类（7种）、酯类（7种）、烯烃类（18种）。对照例1共测得30种挥发性化合物，包括酸类（2种）、醇类（3种）、醛类（5种）、酯类（5种）、烯烃类（15种）。

实施例2测得的挥发性化合物含量更为丰富，总含量为24285.83 µg/100g，远高于对照例1测得的挥发性化合物总含量，14790.37µg/100g。实施例2中主要风味成分—醇类、酯类、烯烃类等的含量均高于对照例1，具体如：醇类物质中，γ-松油醇和芳樟醇含量丰富，为芽菜增添了清新的丁香花香和铃兰花香；酯类物质中，乙酸松油酯、乙酸橙花酯等提升了芽菜的柠檬香气和橙花香气，乙酸桂酯为芽菜增添了肉桂和花果交杂的香气；烯烃类物质含量的增加，如月桂烯、罗勒烯都提升了芽菜的柑橘香气，β-倍半水芹烯、β-雪松烯、Δ-杜松烯等的出现赋予了温和的草木混杂的香气。

2、发酵过程中pH、总酸、亚硝酸含量的测定

对实施例2和对照例1连续发酵过程的芽菜样品进行pH、总酸、亚硝酸盐含量测定，结果如图4~6所示。

请参见图4所示，实施例2与对照例1的芽菜在发酵3个月后，两者的pH值相差不大。

请参见图5所示，实施例2与对照例1的芽菜在发酵3个月后，实施例2接种发酵的总酸含量小于对照例1自然发酵的总酸含量。

请参见图6所示，实施例2接种发酵的芽菜在发酵3个月的亚硝酸盐含量为2.37mg/kg，明显小于对照例1，且远远小于国标中规定的腌渍蔬菜产品中最低的亚硝酸盐含量（20mg/kg）。

基于上述各实施例，本发明提供了一种马氏芽孢杆菌，该马氏芽孢杆菌（B. marcorestinctum）YC-1从四川传统发酵芽菜中分离出来，其活性较好且生长较快，具有硝酸盐还原能力，能用于芽菜发酵，接种马氏芽孢杆菌YC-1的发酵芽菜在发酵3个月后亚硝酸盐低于3mg/kg，明显小于自然发酵芽菜中亚硝酸盐的含量，提升了芽菜香气和发酵质量，获得风味品质优于自然发酵的芽菜产品，降低了自然发酵的亚硝酸盐含量，提高了产品的安全性。

以上仅为本发明的优选实施例而已，不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种马氏芽孢杆菌（B. marcorestinctum）YC-1，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No. M 20211678。

2.权利要求1所述的马氏芽孢杆菌YC-1在发酵芽菜中的应用。

3.一种发酵芽菜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1. 将权利要求1所述的马氏芽孢杆菌YC-1进行培养得到菌悬液；

步骤S3. 在晾晒后的芥菜中加入食盐，腌制20~30h；

步骤S5. 再将辅料加入芥菜，拌和均匀；

4.根据权利要求3所述发酵芽菜的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，马氏芽孢杆菌YC-1的培养方法为：将马氏芽孢杆菌YC-1采用划线法在营养琼脂固体培养基上接种，并在30~40℃条件下，于恒温培养箱培养20~30h获得单菌落，将单菌落接种在营养肉汤液体培养基中，于30~40℃、100~150r/min条件下振荡培养10~20h得到菌悬液。

5.根据权利要求4所述发酵芽菜的制备方法，其特征在于，所述菌悬液的浓度为10⁷~10⁹CFU/mL。

6.根据权利要求3所述发酵芽菜的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，食盐的加入量不低于芥菜质量分数的12％。

7.根据权利要求3所述发酵芽菜的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，加入红糖水，使芥菜着色均匀，其中，红糖的加入量为芥菜质量分数的10~20%。

8.根据权利要求3所述发酵芽菜的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中，辅料为八角、山奈、肉桂和花椒，其加入量分别为芥菜质量分数的5~15%、2~8%、2~8%、1~3%。

9.根据权利要求3所述发酵芽菜的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中，菌悬液的喷洒量为芥菜质量分数的5%~15%。

10.根据权利要求3所述发酵芽菜的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，芥菜的发酵时间不少于3个月。