CN108441435A - 一株醋酸菌及其在快速发酵果汁中的应用 - Google Patents

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史劲松
张晓娟
张旦旦
陆震鸣
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G3/00—Preparation of other alcoholic beverages
    • C12G3/02—Preparation of other alcoholic beverages by fermentation

Abstract

本发明公开了一株巴斯德醋酸菌及其在发酵果蔬汁制作中的应用。本发明提供了一株巴斯德醋酸菌Acetobactor pasteurianus APA03，其保藏号CGMCC No.12930。本发明的实验证明了，从腐烂葡萄皮中，通过含有6％的乙醇的选择性增值培养基富集，分离纯化到的巴斯德醋酸菌APA03对人工接种的发酵果蔬汁发酵过程中积累的乙醇有显著的降低能力，具有较好的产酸能力。在发酵果蔬汁制作中能够在短时间内消耗乙醇，改善果蔬汁的口感，增加有机酸含量，在作为发酵果蔬汁制作方面具有潜在的应用价值。

Description

一株醋酸菌及其在快速发酵果汁中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株巴斯德醋酸菌及其在发酵果蔬汁中的应用。
背景技术
发酵果蔬类饮料制品由于经过发酵过程，在营养成分结构以及风味等方面都有显著改善。近年来，起源于日本，发扬于台湾，而后在大陆得到广泛喜爱的蔬果类酵素饮品风靡市场，成为了高端的发酵果蔬制品的典范。蔬果酵素的发酵过程是以新鲜蔬菜、水果等植物为原料，经不同种类微生物多轮次发酵而制得的微生物制品，含有短链脂肪酸、寡糖、有机酸等大量生理活性物质，具有调理肠胃、抗衰老、抗氧化、提高机体免疫力、调节血脂等生理作用。传统的酵素采用天然发酵工艺，即不进行人工纯种接种，发酵周期通常大于1年。这种生产方式存在的问题在于发酵过程不可控，易受到杂菌甚至致病菌的污染，且周期过长导致生产成本过高等。而现代工艺采用人工接种微生物的方法，通常为酵母菌和乳酸菌等，在很大程度上使得发酵过程安全可控，发酵程度高，蔬果原料生物转化彻底，并且显著缩短了发酵周期。然而缺点在于短时间的发酵过程导致乙醇显著积累，无法在短时间内被消耗。
发明内容
针对上述问题，本发明的一个目的是提供一株巴斯德醋酸菌Acetobactorpasteurianus APA03。本发明公开的巴斯德醋酸菌G3-2于2016年9月5日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.12930，分类命名为巴斯德醋酸菌(Acetobactorpasteurianus)。
上述的巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在作为发酵果蔬汁添加剂或制备发酵果蔬汁添加剂中的应用。
上述的巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在发酵果蔬汁中的应用。
上述应用中，所述果蔬汁按照包括如下的方法制备：将质量百分含量分别为25-30％的包括苹果、芒果、菠萝、木瓜等水果果浆与3-5％的白糖混合，加入无菌水，得到稀释果蔬汁。
本发明的另一个目的是提供一种深度发酵果蔬汁、降低乙醇含量的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)、果蔬汁按照包括如下的方法制备：将质量百分含量为25-30％的包括苹果、芒果、菠萝、木瓜等水果果浆与3-5％的白糖混合，加入无菌水，得到稀释果蔬汁。
2)、将酵母菌、黑曲霉、乳酸菌等微生物接入所述果蔬汁中，发酵，得到发酵后果蔬汁。
3)、上述的巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930以巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930种子液接入，所述巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930种子液中菌含量大于等于108cfu/g。
4)、所述巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930种子液按照体积百分含量0.5％-1％接入果蔬汁中，其巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930种子液中菌含量大于等于108cfu/g。
上述巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930种子液按照包括如下步骤的方法进行：将所述巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930在肉汤固体培养基30℃旋转式摇床220转/分钟培养24h，收集菌体，将其重悬于水中；
本发明的实验证明了，菌株CGMCC No.12930在混合蔬果发酵中不仅能够在短时间内有效降低乙醇含量至0.5％以下，同时能够进一步降低发酵果蔬汁pH，积累有机酸，改善果蔬汁的气味、色泽及口感，在发酵果蔬汁饮料制作方面具有潜在的应用价值。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930的获得
1、分离纯化
以腐烂的葡萄皮为来源，经过6％的乙醇为耐酒精选择增值培养条件，经分离纯化到醋酸菌G3-2，经鉴定为巴斯德醋酸菌，具体如下：
称取10g烂的葡萄皮样品加入灭菌的90ml蒸馏水中，利用漩涡振荡器震荡30s，取10ml上清液，加入250mL含有增殖培养基三角瓶中(葡萄糖1％、酵母膏1％、无水乙醇6％vol)，30℃、150r/min振荡培养48h后进行10倍梯度稀释，然后分别取10-1、10-3和10-5倍样品稀释液涂布在肉汤固体培养基上，放置于培养箱培养48h，挑取单菌落，进行摇瓶培养。吸取5mL无菌体的培养液，以0.1mol/L氢氧化钠中和至pH值为7.0，再将中和的溶液煮沸，加入8％氯化铁溶液数滴，形成红褐色沉淀者暂定为醋酸菌。将筛选出的醋酸菌分别接种于含有乙醇的培养基中(葡萄糖1％，酵母膏1％，无水乙醇6％vol)，于恒温箱30℃培养3d后，采用碱式滴定法(以醋酸计)测其产酸量，获得的产酸能力最强的菌种编号为G3-2。
2.对得到的菌株CGMCC No.12930进行生理生化试验，结果见表1。
表1菌株G3-2生理生化试验
3.菌株CGMCC No.12930的分子鉴定
反应在50μm体系中进行：10×bufer5.0μm，dNTP1.0μm，fDI 1.0μm，rDI 1.0μm，模板1.0μm，Taq DNA Polymeras0.5μm，ddH20 39.5μm。
16S rDNA通用正向引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16S rDNA通用返向引物5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′。PCR反应条件为95℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min；共循环30次后，72℃延伸10min，4℃保存，并用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增出所需的片断。测序后，将菌株G3-2和应用Blast检索到的与之有较高的同源性菌株的16S rDNA序列比较分析，并构建系统发育树，确定菌株的与(pasteurianus-Acetobacter)基因序列相似性很高，基本可确定CGMCC No.12930为巴斯德醋酸杆菌(pasteurianus-Acetobacter)。
实施例2、醋酸菌CGMCC No.12930的培养条件以及在果蔬发酵液中的施加方式
1.醋酸菌CGMCC No.12930的种子培养条件
葡萄糖：10g，蛋白胨：10g，牛肉膏：10g，酵母粉：5g，硫酸二氢钾2g，硫酸镁0.58g，pH7.0(1000m1)37℃，旋转摇床220转/分钟培养24h。
2.在酵素发酵液中的施加方式
酵素发酵液经过前期酵母菌，黑曲霉，乳酸菌等微生物发酵后，添加1.5％的蔗糖，以1％的接种量接种上述巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930种子液，通气发酵3-5天，乙醇含量和pH将显著下降。
实施例3、经菌株CGMCC No.12930处理后的酵素有机酸及乙醇含量变化
表2发酵上清液的中有机酸和乙醇含量变化
样品 乳酸g/L 乙酸g/L 柠檬酸g/L 乙醇vol％
不加醋酸菌 717.0±4.3 1504.8±28.8 3.6±1.0 6.22±0.82
市售酿食醋用醋酸菌 1389.4±81.3 2617.5±67.4 6.1±0.3 3.93±0.32
市售果醋用醋酸菌 743.5±1.5 1828.4±8.5 16.7±0.0 4.20±0.41
巴斯德醋酸菌G3-2 2719.9±20.1 4217.7±62.0 - 0.45±0.05

Claims (6)

1.一株巴斯德醋酸菌APA03，于2016年9月5日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12930，分类命名为巴斯德醋酸菌(Acetobactor pasteurianus)。
2.巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930在发酵果蔬汁中的应用方法，其特征为，以巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930种子液接入发酵果蔬汁，接入体积占发酵果蔬汁的0.5％-1％，所述巴斯德醋酸菌CGMCC No.12930种子液的菌含量大于等于108cfu/ml。
3.如权利要求2所述的应用方法，其特征为，所述发酵果蔬汁按照如下的方法制备：将水果果浆与水混合，体积比为25-30∶70-75，水果果浆可选自苹果、芒果、菠萝、木瓜中的一种或几种，加入白糖，白糖质量与水果果浆的体积比为3-5％，混合后经过酵母菌、芽孢杆菌、乳酸菌、黑曲霉等微生物单独或协同发酵后形成发酵果汁。
4.如权利要求2所述的应用方法，其特征为，将权利要求1所述的巴斯德醋酸菌CGMCCNo.12930接入所述果蔬汁中，补充混合液总体积0.5％-1％的白糖，继续发酵，得到深层发酵后的果蔬汁，降低其酒精度。
5.如权利要求4所述的方法，其特征为，所述继续发酵的条件为，30℃通风培养2-4天。
6.一种发酵果蔬汁添加剂，其活性成分为权利要求1所述的巴斯德醋酸菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液，可降低食品中乙醇的含量。
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