CN109601965B - 一种利用中度嗜盐菌混合菌株发酵鱼肉酱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用中度嗜盐菌混合菌株发酵鱼肉酱的方法，属于利用混合菌株发酵水产品固态发酵技术领域。利用中度嗜盐菌混合发酵剂作为生产发酵剂生产鱼肉酱，通过发酵鱼肉酱的理化指标评价和感官评价，研究混合发酵剂比例、接种量、发酵温度，发酵时间和盐度对鱼肉酱的影响，使得鱼肉酱具有发酵时间短、盐度较低、安全性高和风味与营养价值较高的特性。利用此混合发酵剂能够得到风味较好的鱼肉酱发酵制品。
Description
技术领域
本发明涉及中度嗜盐菌混合菌株发酵的方法，属于利用混合菌株发酵水产品固态发酵技术领域。
背景技术
我国淡水养殖业发展迅速，但加工业发展中相对滞后。因此开发适合国内消费市场需求的淡水鱼产品，对推动淡水鱼产业健康发展具有重要的现实意义。目前，发酵水产品中氨基酸含量丰富，营养价值高，深受消费者喜爱，但对于发酵产品又存在着发酵时间长、含盐量高和发酵不稳定等问题。中度嗜盐菌是一种在NaCl浓度为0.5mol/L到2.5mol/L之间生长最佳的极端微生物。与轻度嗜盐菌相比，中度嗜盐菌能够在高盐环境中生长，从而减少发酵过程中杂菌污染。与极端嗜盐古菌相比，中度嗜盐菌比嗜盐古菌的嗜盐范围宽，分布及来源更广泛、对营养物质要求也更低、更容易适应生存环境，在实际生产中更容易被应用。有些中度嗜盐菌又有较强的产胞外蛋白酶特性。本发明将利用中度嗜盐菌混合菌株发酵鱼肉酱，得到发酵时间短，盐度较低和风味和营养价值较高的鱼肉酱产品。为水产品发酵品质的提升提供了理论基础和方法。
发明内容
本发明利用中度嗜盐菌，结合菌株的优良发酵特性，采用混合菌株发酵法生产鱼肉风味酱。该方法可有效提高的风味和营养价值。
本发明提供如下技术方案：一种利用中度嗜盐菌混合菌株发酵鱼肉酱的方法。本发明包括原料的处理、混合菌株的制备与添加、鱼肉酱的发酵、氨基酸态氮的测定、感官评定等程序，具体生产工艺如下：
一种利用中度嗜盐菌混合菌株发酵的方法，按照下述步骤进行：
(1)原料的处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐5～20％(w/w)，在发酵前放置在4℃冰箱内5～24h。
(2)混合菌株的制备：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillus hwajinpoensis分别接种在不同的培养基上活化培养，重复操作三次。将培养的菌种菌液于4℃、10000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中。最后将菌液浓度调整到105～106CFU/mL，将菌液于4℃保存，并于24h内使用。
(3)发酵剂的添加：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillus hwajinpoensis菌株按菌数比例(1～3):(1～3):(1～3)进行混合制备成混合发酵剂，再按最终添加量(104～107CFU/g)将混合发酵剂混入到预处理过的原料鱼中，使最终菌数达到添加要求即可；或3株菌株分别加入到原料鱼中，最终菌数符合添加比例(1～3):(1～3):(1～3)和最终添加量(104～107CFU/g)亦可；
(4)鱼肉酱发酵：把步骤(3)得到的混合物料在温度28～40℃下保温发酵5～30d；
将发酵好的置于-20℃冰箱中备用。
(5)鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的5～30d内，每隔2～30d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌1～5min，搅拌结束后静置透气10～120s。
(6)鱼肉酱熟制：将步骤(4)得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸20～40min至鱼肉酱熟透。
(7)鱼肉酱灭菌：将步骤(6)熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌15～20min，即得鱼肉酱成品。
(8)产品发酵理化指标的评价：氨基酸态氮含量评价，方法参照GB5009.235-2016酸度计法。挥发性盐基氮含量评价，方法参照GB5009.228-2016微量扩散法。组胺含量的测定，方法参照GB5009.208-2016分光光度法。
(8)感官评定：由10人组成感官评定小组，评定前需对小组成员进行风味培训。评分包括0～9十个分数，对鱼肉酱的鱼味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行整体风味的综合评分。
本发明提供的中度嗜盐菌JD(Bacillus aquimaris JD)，已经于2018年9月27日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC NO.16541，建议的分类命名：海水芽孢杆菌Bacillus aquimaris。
本发明提供的中度嗜盐菌JD(Bacillus hwajinpoensis JD)，已经于2018年9月27日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC NO.16542，建议的分类命名：花津滩芽孢杆菌Bacillus hwajinpoensis。
本发明提供的中度嗜盐菌JD(Halobacillus faecis JD)，该中度嗜盐菌菌株已经于2018年9月27日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC NO.16543，建议的分类命名：沉泥喜盐芽孢杆菌Halobacillus faecis。
将上述混合发酵剂在发酵中的接种比例、接种量、发酵时间、发酵温度、加盐量等发酵工艺进行了优化，综合发酵鱼酱的理化指标评价和感官评价对最终鱼肉酱品质进行了综合评价。此方法获得的鱼肉酱发酵时间短，盐度较低，氨基酸态氮含量较高，滋味鲜美，营养价值丰富，挥发性盐基氮的含量低于欧盟标准，组胺的含量远低于国家标准，是一种品质和安全性高的的发酵鱼肉酱产品。
附图说明
图1为中度嗜盐菌Bacillus aquimaris JD菌落形态；
图2为中度嗜盐菌Bacillus aquimaris JD的16SrRNA序列构建的系统发育树。注：zzy8为本发明中度嗜盐菌Bacillus aquimaris JD。
图3为中度嗜盐菌Bacillus hwajinpoensis JD菌落形态；
图4为中度嗜盐菌Bacillus hwajinpoensis JD的16SrRNA序列构建的系统发育树。注：zzy9为本发明中度嗜盐菌Bacillus hwajinpoensis JD。
图5为中度嗜盐菌Halobacillus faecis JD菌落形态；
图6为中度嗜盐菌Halobacillus faecis JD的16SrRNA序列构建的系统发育树。注：zzy5为本发明中度嗜盐菌Halobacillus faecis。
具体实施方式
(一)菌株海水芽孢杆菌Bacillus aquimaris。
1.菌株的分离筛选：
以传统发酵的新鲜虾酱为原材料，虾酱来源于河北省唐山市丰南区黑沿子镇渔民自制虾酱，从虾酱中分离筛选中度嗜盐菌。中度嗜盐菌的分离和纯化使用添加1％脱脂乳粉的Gibbons培养基，将无菌水按一定倍数稀释后的虾酱涂布于固体Gibbons培养基上，30℃培养48h，挑取具有典型特征的菌落，继续在添加1％脱脂乳粉的固体Gibbons培养基上进行多次分离纯化，获得纯培养产蛋白酶的嗜盐菌菌株。将分离并纯化后的菌株接种到Gibbons斜面上，30℃培养48h，置于4℃冰箱短期保藏备用。
2.菌株的鉴定
2.1菌株的形态特征
菌落淡黄色、表面光滑、边缘整齐、不透明、菌落致密，革兰氏染色为阴性，菌体呈杆状。在液体Gibbons培养基中培养24h后，菌液浑浊。
2.2菌株的生理特征
该菌株在NaCl浓度为0～15％时均可进行生长；在pH为7～9时，生长较快；在温度范围为25℃～43℃都能进行良好生长；
2.3分子生物学鉴定
对分离筛选出的中度嗜盐菌经16SrRNA测序，基因序列经操作整理后，在Ezbiocloud中检索，确定为(Bacillus aquimaris)。根据检索到的同源菌株，应用DNAStar软件的Mege5.1程序，构建生物进化关系树如图2。
该中度嗜盐菌菌株已经于2018年9月27日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC NO.16541，建议的分类命名：海水芽孢杆菌Bacillus aquimaris。
(二)菌株花津滩芽孢杆菌Bacillus hwajinpoensis。
1、菌株的分离筛选：
以传统发酵的新鲜虾酱为原材料，虾酱来源于河北省唐山市丰南区黑沿子镇渔民自制虾酱，从虾酱中分离筛选中度嗜盐菌。中度嗜盐菌的分离和纯化使用添加1％脱脂乳粉的Gibbons培养基，将无菌水按一定倍数稀释后的虾酱涂布于固体Gibbons培养基上，30℃培养48h，挑取具有典型特征的菌落，继续在添加1％脱脂乳粉的固体Gibbons培养基上进行多次分离纯化，获得纯培养产蛋白酶的嗜盐菌菌株。将分离并纯化后的菌株接种到Gibbons斜面上，30℃培养48h，置于4℃冰箱短期保藏备用。
2、菌株的鉴定
2.1菌株的形态特征
菌落呈橘黄色、表面光滑、边缘整齐、不透明、菌落致密，革兰氏染色为阳性，菌体呈杆状。在液体Gibbons培养基中培养24h后，菌液浑浊。
2.2菌株的生理特征
该菌株在NaCl浓度为0～20％时均可进行生长；在pH为7～9时，生长较快；在温度范围为25℃～43℃都能进行良好生长；
2.3分子生物学鉴定
对分离筛选出的中度嗜盐菌经16SrRNA测序，基因序列经操作整理后，在Ezbiocloud中检索，确定为(Bacillus hwajinpoensis)。根据检索到的同源菌株，应用DNAStar软件的Mege5.1程序，构建生物进化关系树如图2。
该中度嗜盐菌菌株已经于2018年9月27日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC NO.16542，建议的分类命名：花津滩芽孢杆菌Bacillushwajinpoensis。
(三)菌株沉泥喜盐芽孢杆菌Halobacillus faecis。
1、菌株的分离筛选：
以传统发酵的新鲜虾酱为菌株采样源，虾酱来源于河北省唐山市丰南区黑沿子镇渔民传统法自制虾酱，从虾酱中分离筛选中度嗜盐菌。中度嗜盐菌的分离和纯化使用添加1％脱脂乳粉的Gibbons培养基，将无菌水按一定倍数稀释后的虾酱涂布于固体Gibbons培养基上，30℃培养48h，挑取具有典型特征的菌落，继续在添加1％脱脂乳粉的固体Gibbons培养基上进行多次分离纯化，获得纯培养产蛋白酶的嗜盐菌菌株。将分离并纯化后的菌株接种到Gibbons斜面上，30℃培养48h，置于4℃冰箱短期保藏备用。
2、菌株的鉴定
a)菌株的形态特征
菌落呈浅黄色、表面光滑、边缘整齐、不透明、菌落致密，革兰氏染色为阳性，菌体呈杆状。在液体Gibbons培养基中培养24h后，菌液浑浊。
2.2菌株的生理特征
该菌株在NaCl浓度为0～15％时均可进行生长；在pH为7～9时，生长较快；在温度范围为25℃～43℃都能进行良好生长；
2.3分子生物学鉴定
对分离筛选出的中度嗜盐菌经16SrRNA测序，基因序列经操作整理后，在Ezbiocloud中检索，确定为(Halobacillus faecis)。根据检索到的同源菌株，应用DNAStar软件的Mege5.1程序，构建生物进化关系树如图2。
该中度嗜盐菌菌株已经于2018年9月27日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC NO.16543，建议的分类命名：沉泥喜盐芽孢杆菌Halobacillusfaecis。
实施例1：
一种利用中度嗜盐菌混合菌株发酵鱼肉酱的方法，按照下述步骤进行：
(1)原料的处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐12％(m/m)，在发酵前放置在4℃冰箱内24h。
(2)混合菌株的制备：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillushwajinpoensis分别接种在不同的培养基上活化培养，重复操作三次。将培养的菌种菌液于4℃、10000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中。最后将菌液浓度调整到105～106CFU/mL，将菌液于4℃保存，并于24h内使用。
(3)发酵剂的添加：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillushwajinpoensis菌株按菌数比例2:1:1进行混合制备成混合发酵剂，再按最终添加量104CFU/g将混合发酵剂混入到预处理过的原料鱼中，使最终菌数达到添加要求即可；或3株菌株分别加入到原料鱼中，最终菌数符合添加比例2:1:1和最终添加量104CFU/g亦可；
(4)鱼肉酱发酵：把步骤(3)得到的混合物料在温度40℃下保温发酵5d；将发酵好的置于-20℃冰箱中备用。
(5)鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的5～30d内，每隔5d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌2min，搅拌结束后静置透气30s。
(6)鱼肉酱熟制：将步骤(4)得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸20min至鱼肉酱熟透。
(7)鱼肉酱灭菌：将步骤(6)熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌15min，即得鱼肉酱成品。
(8)产品发酵理化指标的评价：氨基酸态氮含量评价，方法参照GB5009.235-2016酸度计法。挥发性盐基氮含量评价，方法参照GB5009.228-2016微量扩散法。组胺含量的测定，方法参照GB5009.208-2016分光光度法。
(9)感官评定：由10人组成感官评定小组，评定前需对小组成员进行风味培训。评分包括0～9十个分数，对鱼肉酱的鱼味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行整体风味的综合评分。
(10)鱼肉酱的理化指标和感官评价
本工艺发酵鱼肉酱的氨基酸态的含量为0.311g/100g；挥发性盐基氮含量为7.54mg/100g，低于欧盟标准35mg/100g；组胺含量为1.69mg/100g，远低于食品安全国家标准鱼类中组胺的含量20mg/100g；感官评价的综合得分为5.79。本鱼肉酱中原料中固有的土腥味大大减少，略有腥味，鲜味略显不足，与未发酵原料相比，风味有显著提升。
实施例2：
一种利用中度嗜盐菌混合菌株发酵鱼肉酱的方法，按照下述步骤进行：
(1)原料的处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐12％(m/m)，在发酵前放置在4℃冰箱内24h。
(2)混合菌株的制备：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillushwajinpoensis分别接种在不同的培养基上活化培养，重复操作三次。将培养的菌种菌液于4℃、10000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中。最后将菌液浓度调整到105～106CFU/mL，将菌液于4℃保存，并于24h内使用。
(3)发酵剂的添加：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillushwajinpoensis菌株按菌数比例1:1:1进行混合制备成混合发酵剂，再按最终添加量106CFU/g将混合发酵剂混入到预处理过的原料鱼中，使最终菌数达到添加要求即可；或3株菌株分别加入到原料鱼中，最终菌数符合添加比例1:1:1和最终添加量106CFU/g亦可；
(4)鱼肉酱发酵：把步骤(3)得到的混合物料在温度37℃下保温发酵15d；将发酵好的置于-20℃冰箱中备用。
(5)鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的5～30d内，每隔5d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌2min，搅拌结束后静置透气30s。
(6)鱼肉酱熟制：将步骤(4)得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸20min至鱼肉酱熟透。
(7)鱼肉酱灭菌：将步骤(6)熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌15min，即得鱼肉酱成品。
(8)产品发酵理化指标的评价：氨基酸态氮含量评价，方法参照GB5009.235-2016酸度计法。挥发性盐基氮含量评价，方法参照GB5009.228-2016微量扩散法。组胺含量的测定，方法参照GB5009.208-2016分光光度法。
(9)感官评定：由10人组成感官评定小组，评定前需对小组成员进行风味培训。评分包括0～9十个分数，对鱼肉酱的鱼味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行整体风味的综合评分。
(10)鱼肉酱的理化指标和感官评价
本工艺发酵鱼肉酱的氨基酸态的含量为0.519g/100g；挥发性盐基氮含量为23.86mg/100g，低于欧盟标准35mg/100g；组胺含量为2.17mg/100g，远低于食品安全国家标准鱼类中组胺的含量20mg/100g；感官评价的综合得分为7.20。本鱼肉酱中原料中固有的土腥味几乎没有，无不良气味，滋味鲜美，氨基酸态氮含量较高，营养价值较为丰富，安全性也较高。
实施例3：
一种利用中度嗜盐菌混合菌株发酵鱼肉酱的方法，按照下述步骤进行：
(1)原料的处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐14％(m/m)，在发酵前放置在4℃冰箱内24h。
(2)混合菌株的制备：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillushwajinpoensis分别接种在不同的培养基上活化培养，重复操作三次。将培养的菌种菌液于4℃、10000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中。最后将菌液浓度调整到105～106CFU/mL，将菌液于4℃保存，并于24h内使用。
(3)发酵剂的添加：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillushwajinpoensis菌株按菌数比例1:1:1进行混合制备成混合发酵剂，再按最终添加量105CFU/g将混合发酵剂混入到预处理过的原料鱼中，使最终菌数达到添加要求即可；或3株菌株分别加入到原料鱼中，最终菌数符合添加比例1:1:1和最终添加量105CFU/g亦可；
(4)鱼肉酱发酵：把步骤(3)得到的混合物料在温度31℃下保温发酵15d；将发酵好的置于-20℃冰箱中备用。
(5)鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的5～30d内，每隔5d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌2min，搅拌结束后静置透气30s。
(6)鱼肉酱熟制：将步骤(4)得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸20min至鱼肉酱熟透。
(7)鱼肉酱灭菌：将步骤(6)熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌15min，即得鱼肉酱成品。
(8)产品发酵理化指标的评价：氨基酸态氮含量评价，方法参照GB5009.235-2016酸度计法。挥发性盐基氮含量评价，方法参照GB5009.228-2016微量扩散法。组胺含量的测定，方法参照GB5009.208-2016分光光度法。
(9)感官评定：由10人组成感官评定小组，评定前需对小组成员进行风味培训。评分包括0～9十个分数，对鱼肉酱的鱼味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行整体风味的综合评分。
(10)鱼肉酱的理化指标和感官评价
本工艺发酵鱼肉酱的氨基酸态的含量为0.476g/100g；挥发性盐基氮含量为20.11mg/100g，低于欧盟标准35mg/100g；组胺含量为1.92mg/100g，远低于食品安全国家标准鱼类中组胺的含量20mg/100g；感官评价的综合得分为6.62。本鱼肉酱中鱼原料中固有的土腥味几乎没有，无不良气味，滋味鲜美，氨基酸态氮含量较高，营养价值较为丰富，安全性较高。
实施例4：
一种利用中度嗜盐菌混合菌株发酵鱼肉酱的方法，按照下述步骤进行：
(1)原料的处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐20％(m/m)，在发酵前放置在4℃冰箱内24h。
(2)混合菌株的制备：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillus hwajinpoensis分别接种在不同的培养基上活化培养，重复操作三次。将培养的菌种菌液于4℃、10000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中。最后将菌液浓度调整到105～106CFU/mL，将菌液于4℃保存，并于24h内使用。
(3)发酵剂的添加：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillus hwajinpoensis菌株按菌数比例3:1:1进行混合制备成混合发酵剂，再按最终添加量107CFU/g将混合发酵剂混入到预处理过的原料鱼中，使最终菌数达到添加要求即可；或3株菌株分别加入到原料鱼中，最终菌数符合添加比例3:1:1和最终添加量107CFU/g亦可；
(4)鱼肉酱发酵：把步骤(3)得到的混合物料在温度40℃下保温发酵30d；将发酵好的置于-20℃冰箱中备用。
(5)鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的5～30d内，每隔5d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌2min，搅拌结束后静置透气30s。
(6)鱼肉酱熟制：将步骤(4)得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸20min至鱼肉酱熟透。
(7)鱼肉酱灭菌：将步骤(6)熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌15min，即得鱼肉酱成品。
(8)产品发酵理化指标的评价：氨基酸态氮含量评价，方法参照GB5009.235-2016酸度计法。挥发性盐基氮含量评价，方法参照GB5009.228-2016微量扩散法。组胺含量的测定，方法参照GB5009.208-2016分光光度法。
(9)感官评定：由10人组成感官评定小组，评定前需对小组成员进行风味培训。评分包括0～9十个分数，对鱼肉酱的鱼味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行整体风味的综合评分。
(10)鱼肉酱的理化指标和感官评价
本工艺发酵鱼肉酱的氨基酸态的含量为0.621g/100g；挥发性盐基氮含量为39.81mg/100g，高于欧盟标准35mg/100g；组胺含量为6.98mg/100g，远低于食品安全国家标准鱼类中组胺的含量20mg/100g；感官评价的综合得分为5.87。本鱼肉酱中几乎没有原料中固有的土腥味几乎没有，有不良气味产生，鱼酱有明显的氨味。
实施例5：
一种利用中度嗜盐菌混合菌株发酵鱼肉酱的方法，按照下述步骤进行：
(1)原料的处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐5％(m/m)，在发酵前放置在4℃冰箱内24h。
(2)混合菌株的制备：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillus hwajinpoensis分别接种在不同的培养基上活化培养，重复操作三次。将培养的菌种菌液于4℃、10000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中。最后将菌液浓度调整到105～106CFU/mL，将菌液于4℃保存，并于24h内使用。
(3)发酵剂的添加：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillus hwajinpoensis菌株按菌数比例2:2:1进行混合制备成混合发酵剂，再按最终添加量106CFU/g将混合发酵剂混入到预处理过的原料鱼中，使最终菌数达到添加要求即可；或3株菌株分别加入到原料鱼中，最终菌数符合添加比例2:2:1和最终添加量106CFU/g亦可；
(4)鱼肉酱发酵：把步骤(3)得到的混合物料在温度28℃下保温发酵5d；将发酵好的置于-20℃冰箱中备用。
(5)鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的5～30d内，每隔5d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌2min，搅拌结束后静置透气30s。
(6)鱼肉酱熟制：将步骤(4)得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸20min至鱼肉酱熟透。
(7)鱼肉酱灭菌：将步骤(6)熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌15min，即得鱼肉酱成品。
(8)产品发酵理化指标的评价：氨基酸态氮含量评价，方法参照GB5009.235-2016酸度计法。挥发性盐基氮含量评价，方法参照GB5009.228-2016微量扩散法。组胺含量的测定，方法参照GB5009.208-2016分光光度法。
(9)感官评定：由10人组成感官评定小组，评定前需对小组成员进行风味培训。评分包括0～9十个分数，对鱼肉酱的鱼味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行整体风味的综合评分。
(10)鱼肉酱的理化指标和感官评价
本工艺发酵鱼肉酱的氨基酸态的含量为0.362g/100g；挥发性盐基氮含量为6.49mg/100g，低于欧盟标准35mg/100g；组胺含量为1.13mg/100g，远低于食品安全国家标准鱼类中组胺的含量20mg/100g；感官评价的综合得分为6.11。本鱼肉酱中原料中固有的土腥味较少，略有不良风味。
实施例6：
一种利用中度嗜盐菌混合菌株发酵鱼肉酱的方法，按照下述步骤进行：
(1)原料的处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐16％(m/m)，在发酵前放置在4℃冰箱内24h。
(2)混合菌株的制备：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillus hwajinpoensis分别接种在不同的培养基上活化培养，重复操作三次。将培养的菌种菌液于4℃、10000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中。最后将菌液浓度调整到105～106菌株，将菌液于4℃保存，并于24h内使用。
(3)发酵剂的添加：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillus hwajinpoensis菌株按菌数比例2:1:1进行混合制备成混合发酵剂，再按最终添加量106CFU/g将混合发酵剂混入到预处理过的原料鱼中，使最终菌数达到添加要求即可；或3株菌株分别加入到原料鱼中，最终菌数符合添加比例2:1:1和最终添加量106CFU/g亦可；
(4)鱼肉酱发酵：把步骤(3)得到的混合物料在温度31℃下保温发酵20d；将发酵好的置于-20℃冰箱中备用。
(5)鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的5～30d内，每隔5d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌2min，搅拌结束后静置透气30s。
(6)鱼肉酱熟制：将步骤(4)得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸20min至鱼肉酱熟透。
(7)鱼肉酱灭菌：将步骤(6)熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌15min，即得鱼肉酱成品。
(8)产品发酵理化指标的评价：氨基酸态氮含量评价，方法参照GB5009.235-2016酸度计法。挥发性盐基氮含量评价，方法参照GB5009.228-2016微量扩散法。组胺含量的测定，方法参照GB5009.208-2016分光光度法。
(9)感官评定：由10人组成感官评定小组，评定前需对小组成员进行风味培训。评分包括0～9十个分数，对鱼肉酱的鱼味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行整体风味的综合评分。
(10)鱼肉酱的理化指标和感官评价
本工艺发酵鱼肉酱的氨基酸态的含量为0.501g/100g；挥发性盐基氮含量为23.17mg/100g，低于欧盟标准35mg/100g；组胺含量为2.48mg/100g，远低于食品安全国家标准鱼类中组胺的含量20mg/100g；感官评价的综合得分为6.94。本鱼肉酱中原料中固有的土腥味几乎没有，鲜味突出，滋味鲜美，偏咸，氨基酸态氮含量高，营养价值丰富，安全性高。
实施例7：
一种利用中度嗜盐菌混合菌株发酵鱼肉酱的方法，按照下述步骤进行：
(1)原料的处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐20％(m/m)，在发酵前放置在4℃冰箱内24h。
(2)混合菌株的制备：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillus hwajinpoensis分别接种在不同的培养基上活化培养，重复操作三次。将培养的菌种菌液于4℃、10000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中。最后将菌液浓度调整到105～106CFU/mL，将菌液于4℃保存，并于24h内使用。
(3)发酵剂的添加：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillus hwajinpoensis菌株按菌数比例2:2:1进行混合制备成混合发酵剂，再按最终添加量105CFU/g将混合发酵剂混入到预处理过的原料鱼中，使最终菌数达到添加要求即可；或3株菌株分别加入到原料鱼中，最终菌数符合添加比例2:2:1和最终添加量105CFU/g亦可；
(4)鱼肉酱发酵：把步骤(3)得到的混合物料在温度34℃下保温发酵10d；将发酵好的置于-20℃冰箱中备用。
(5)鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的5～30d内，每隔5d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌2min，搅拌结束后静置透气30s。
(6)鱼肉酱熟制：将步骤(4)得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸20min至鱼肉酱熟透。
(7)鱼肉酱灭菌：将步骤(6)熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌15min，即得鱼肉酱成品。
(8)产品发酵理化指标的评价：氨基酸态氮含量评价，方法参照GB5009.235-2016酸度计法。挥发性盐基氮含量评价，方法参照GB5009.228-2016微量扩散法。组胺含量的测定，方法参照GB5009.208-2016分光光度法。
(9)感官评定：由10人组成感官评定小组，评定前需对小组成员进行风味培训。评分包括0～9十个分数，对鱼肉酱的鱼味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行整体风味的综合评分。
(10)鱼肉酱的理化指标和感官评价
本工艺发酵鱼肉酱的氨基酸态的含量为0.287g/100g；挥发性盐基氮含量为16.23mg/100g，低于欧盟标准35mg/100g；组胺含量为1.88mg/100g，远低于食品安全国家标准鱼类中组胺的含量20mg/100g；感官评价的综合得分为5.97。本鱼肉酱中原料中固有的土腥味减少，腥味相对明显但安全性较高。
实施例8：
一种利用中度嗜盐菌混合菌株发酵鱼肉酱的方法，按照下述步骤进行：
(1)原料的处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐10％(m/m)，在发酵前放置在4℃冰箱内24h。
(2)混合菌株的制备：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillus hwajinpoensis分别接种在不同的培养基上活化培养，重复操作三次。将培养的菌种菌液于4℃、10000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中。最后将菌液浓度调整到105～106CFU/mL，将菌液于4℃保存，并于24h内使用。
(3)发酵剂的添加：将中度嗜盐菌混合菌种Halobacillus faecis、Bacillusaquimaris和Bacillus hwajinpoensis菌株按菌数比例1:1:3进行混合制备成混合发酵剂，再按最终添加量104CFU/g将混合发酵剂混入到预处理过的原料鱼中，使最终菌数达到添加要求即可；或3株菌株分别加入到原料鱼中，最终菌数符合添加比例1:1:3和最终添加量106CFU/g亦可；
(4)鱼肉酱发酵：把步骤(3)得到的混合物料在温度34℃下保温发酵15d；将发酵好的置于-20℃冰箱中备用。
(5)鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的5～30d内，每隔5d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌2min，搅拌结束后静置透气30s。
(6)鱼肉酱熟制：将步骤(4)得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸20min至鱼肉酱熟透。
(7)鱼肉酱灭菌：将步骤(6)熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌15min，即得鱼肉酱成品。
(8)产品发酵理化指标的评价：氨基酸态氮含量评价，方法参照GB5009.235-2016酸度计法。挥发性盐基氮含量评价，方法参照GB5009.228-2016微量扩散法。组胺含量的测定，方法参照GB5009.208-2016分光光度法。
(9)感官评定：由10人组成感官评定小组，评定前需对小组成员进行风味培训。评分包括0～9十个分数，对鱼肉酱的鱼味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行整体风味的综合评分。
(10)鱼肉酱的理化指标和感官评价
本工艺发酵鱼肉酱的氨基酸态的含量为0.549g/100g；挥发性盐基氮含量为21.90mg/100g，低于欧盟标准35mg/100g；组胺含量为1.97mg/100g，远低于食品安全国家标准鱼类中组胺的含量20mg/100g；感官评价的综合得分为6.34。本鱼肉酱中几乎没有原料中固有的土腥味，发酵味明显，鲜味较足，氨基酸态氮含量多，营养价值较高，安全性高。
Claims (1)
1.一种利用中度嗜盐菌混合菌株发酵鱼肉酱的方法，其特征在于：
（1）原料的预处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐5~20%（w/w），在发酵前放置在4 ℃冰箱内5~24 h；
（2）混合菌株的制备：将中度嗜盐菌菌种Halobacillus faecis JD CGMCC 16543、 Bacillus aquimaris JD CGMCC 16541和Bacillus hwajinpoensis JD CGMCC 16542分别接种在不同的培养基上活化培养，重复操作三次；将培养的菌种菌液于4℃、10000 r/min离心10 min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中；最后将菌液浓度调整到105-106CFU/mL，将菌液于4℃保存，并于24 h内使用；
（3）发酵剂的添加：将中度嗜盐菌菌种Halobacillus faecis JD CGMCC 16543、 Bacillus aquimaris JD CGMCC 16541和Bacillus hwajinpoensis JD CGMCC 16542菌株按菌数比例1~3:1~3:1~3进行混合制备成混合发酵剂，再按最终添加量104~107 CFU/g将混合发酵剂混入到预处理过的原料鱼中，使最终菌数达到添加要求即可；或3株菌株分别加入到原料鱼中，最终菌数符合添加比例1~3:1~3:1~3和最终添加量104~107 CFU/g亦可；
（4）鱼肉酱发酵：把步骤（3）得到的混合物料在温度28~40 ℃下保温发酵5~30 d；将发酵好的置于-20冰箱中备用；
（5）鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的5~30 d内，每隔2~30 d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌1-5 min，搅拌结束后静置透气10-120 s；
（6）鱼肉酱熟制：将步骤（4）得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸20-40 min至鱼肉酱熟透；（7）鱼肉酱灭菌：将步骤（6）熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌15-20 min，即得鱼肉酱成品。
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